一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法
阅读：2发布：2022-07-08
专利汇可以提供一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种基于 害虫 特定气味受体筛选高效驱避剂的方法，属于 生物 防治害虫技术领域。本发明在爪蟾卵母细胞异源表达系统中表达害的气味受体，通过双 电极 电压 钳技术筛选得到对报警 信息素 成分(反)-β-法尼烯有反应的特定气味受体，再利用双电极电压钳技术筛选可以激活此特定气味受体的气味来确定驱避剂，再通过Y型管行为学实验验证驱避剂的趋避强度，最终筛选到高效的驱避剂。本发明为大规模筛选害虫的高效驱避剂提供了简便可行的方法，具有很强的实用性。，下面是一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法专利的具体信息内容。
1.一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法，包括如下步骤，①利用在所述害虫的同物种基因组中预测得到的气味受体序列，利用氨基酸一致性比对结果进行排序，选取高同源性的气味受体为候选特定气味受体，克隆得到候选特定气味受体的全长序列，
②在爪蟾卵母细胞异源表达系统中表达，
③使用双电极电压钳技术筛选对所述害虫的报警信息素或趋避性气味气体成分有反应的特定气味受体，
④使用双电极电压钳技术筛选可激活害虫特定气味受体的气味物质。
2.根据权利要求1所述的方法，所述害虫为蚜虫。
3.根据权利要求2所述的方法，所述害虫的同物种为豌豆蚜和棉蚜，所述报警信息素成分为(反)-β-法尼烯。
4.根据权利要求3所述的方法，所述步骤③中筛选得到的豌豆蚜气味受体ApisOR5和棉蚜气味受体AgosOR5。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，还包括步骤⑤，所述步骤⑤为通过Y型管行为学实验并计算趋避强度来检测驱避剂的趋避强度，同时筛选到最佳的可激活害虫特定气味受体的气味物质。
6.根据权利要求5所述的方法，所述害虫为蚜虫，所述气味物质为乙酸香叶酯。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括步骤③后对筛选到的特定气味受体的验证步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，所述验证步骤包括通过RNA干扰技术对该受体基因进行害虫体内沉默和/或利用Y型管行为学实验验证该筛选到的特定气味受体为所述害虫的报警信息素成分的特定气味受体。
一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法
技术领域
背景技术
[0002] 蚜虫为刺吸式口器害虫，通过直接吸食植物汁液和传播植物病毒对农作物产生严重的危害。长期以来，蚜虫的防治一直以化学防治为主，蚜虫对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类等多种杀虫剂产生了抗性。另外，蚜虫具有保守的报警机制，当其遭受到天敌捕食或寄生等危险时，会从腹部后侧的腹管释放对周围其它个体有报警作用的小液滴，这种甘油三酯小液滴中含有蚜虫报警信息素的主要成分。蚜虫的报警信息素易挥发，附近的其它个体感知后会产生相应的趋避行为，如：逃离这株植物或直接从植物上掉落。
[0003] 使用气相色谱质谱仪分析23种蚜虫被碾碎后释放的报警信息素主要成分，结果显示，16种蚜虫被碾碎后释放的报警信息素的唯一或主要成分为(反)-β-法尼烯，5种蚜虫被碾碎后释放的报警信息素中含有少量(反)-β-法尼烯，2种蚜虫被碾碎后释放的报警信息素中无(反)-β-法尼烯。(反)-β-法尼烯作为豌豆蚜和棉蚜报警信息素的唯一成分，在其它各种蚜虫保守的报警机制中也起到了重要的作用。
[0004] 利用蚜虫保守的报警机制来防治蚜虫可减缓化学防治对环境的污染和蚜虫抗药性的产生，但由于蚜虫自身释放的(反)-β-法尼烯气味分子在空气容易被氧化，将其直接应用发展为控制蚜虫的驱避剂有一定的难度，因此筛选得到其它高效且稳定的驱避剂补充(反)-β-法尼烯因氧化而损失的趋避效果或者直接替代(反)-β-法尼烯应用于蚜虫防治使其产生趋避的行为反应，在利用驱避剂进行害虫防治的过程中是必要的。因此，寻找简便可行的筛选高效驱避剂的方法也具有重要意义。
[0005] 参与昆虫感知外界气味分子的蛋白种类有很多，其中气味受体是其中重要的一类。特定的气味分子会激活特定的气味受体，进而昆虫会产生相应的行为。昆虫能够通过特定的气味受体感知对其有趋避作用的气味分子，从而做出相应的趋避行为反应。因此，利用已知能对蚜虫产生趋避行为的(反)-β-法尼烯筛选得到能够感知此气味的特定气味受体，然后再利用该特定气味受体，筛选能够激活该特定气味受体的其它气味，作为对昆虫可能存在趋避效应的候选驱避剂，因此寻找这样一种可行的筛选昆虫驱避剂的方法，将可以实现环境友好，经济有效的绿色防止途径来控制害虫的危害。
发明内容
[0006] 本发明提供一种基于蚜虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法，利用生物信息学软件进一步分析已预测得到的豌豆蚜和棉蚜的气味受体，利用氨基酸一致性比对筛选可感知报警信息素(反)-β-法尼烯的候选特定气味受体，通过爪蟾卵母细胞异源表达系统，应用双电极电压钳技术筛选能够被(反)-β-法尼烯激活的特定气味受体；然后利用RNA干扰技术将筛选得到的气味受体在豌豆蚜体内进行基因沉默，结合豌豆蚜行为学实验验证所得到的该气味受体为感知(反)-β-法尼烯的特定气味受体。
[0007] 一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法，包括如下步骤，[0008] ①利用在所述害虫的同物种基因组中预测得到的气味受体序列，利用氨基酸一致性比对结果进行排序，选取高同源性的气味受体为候选特定气味受体，克隆得到候选特定气味受体的全长序列，
[0009] ②在爪蟾卵母细胞异源表达系统中表达，
[0010] ③使用双电极电压钳技术筛选对所述害虫的报警信息素或趋避性气味气体成分有反应的特定气味受体，
[0011] ④使用双电极电压钳技术筛选可激活害虫特定气味受体的气味物质。
[0012] 所述害虫为蚜虫。
[0013] 所述害虫的同物种为豌豆蚜和棉蚜，所述报警信息素成分为(反)-β-法尼烯。
[0014] 所述步骤③中筛选得到的豌豆蚜气味受体ApisOR5和棉蚜气味受体AgosOR5。
[0015] 所述方法还包括步骤⑤，所述步骤⑤为通过Y型管行为学实验并计算趋避强度来检测驱避剂的趋避强度，同时筛选到最佳的可激活害虫特定气味受体的气味物质。
[0016] 所述害虫为蚜虫，所述气味物质为乙酸香叶酯。
[0017] 所述方法还包括步骤③后对筛选到的特定气味受体的验证步骤。
[0018] 所述验证步骤包括通过RNA干扰技术对该受体基因进行害虫体内沉默和/或利用Y型管行为学实验验证该筛选到的特定气味受体为所述害虫的报警信息素成分的特定气味受体。
[0019] 本发明以选定的特定气味受体，ApisOR5和AgosOR5为例，利用爪蟾卵母细胞异源表达系统结合双电极电压钳技术筛选能够激活该受体的气味，然后通过豌豆蚜和棉蚜Y型管行为学实验验证上述筛选得到的气味对蚜虫的趋避效应。该方法为筛选新的昆虫驱避剂提供了新的技术手段和平台，为有效防治蚜虫，乃至其它害虫提供了新的技术资源和环境友好的新的方法。
[0020] 本发明优点是：
[0021] 1.本发明中筛选得到特定气味受体可作为标准，利用同源性，可找到其它种类蚜虫中的(反)-β-法尼烯的特定气味受体。
[0022] 2.本发明具有普适性，可应用于大规模筛选蚜虫的驱避剂。
[0023] 3.本发明可定量比较蚜虫驱避剂的趋避强度。
[0025] 图1为豌豆蚜和棉蚜候选特定气味受体同源树，
[0026] 图2为ApisOR5/Orco和ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞对(反)-β-法尼烯刺激的反应图；A为ApisOR5/Orco和ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞对(反)-β-法尼烯刺激的反应轨迹图；B为ApisOR5/Orco和ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞对(反)-β-法尼烯刺激的反应电流值图，
[0027] 图3为ApisOR5/Orco和ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞对梯度浓度(反)-β-法尼烯刺激的反应轨迹图，
[0028] 图4为ApisOR5/Orco和ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞对梯度浓度(反)-β-法尼烯刺激的剂量反应曲线图，
[0029] 图5为RNA干扰ApisOR5基因后Y型管行为学实验结果图，
[0030] 图6为ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞的气味反应谱图，
[0031] 图7为豌豆蚜对(反)-β-法尼烯和乙酸香叶酯行为学反应图，
[0032] 图8为棉蚜对(反)-β-法尼烯和乙酸香叶酯行为学反应图，
[0033] 图9为(反)-β-法尼烯和乙酸香叶酯对豌豆蚜和棉蚜趋避强度图。
具体实施方式
[0034] 下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的保护范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0035] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
[0036] 实例1蚜虫气味受体基因的分析与克隆
[0037] 1.蚜虫气味受体基因的分析
[0038] 使用DNAMAN8.0软件比对已预测得到的豌豆蚜和棉蚜气味受体(豌豆蚜气味受体预测：Smadja,C.,Shi,P.,Butlin,R.K.&Robertson,H.M.Large gene family expansions and adaptive evolution for odorant and gustatory receptors in the pea aphid,Acyrthosiphon pisum.Mol Biol Evol 26,2073-2086,doi:10.1093/molbev/msp116(2009)棉蚜气味受体预测：Cao,D.,Liu,Y.,Walker,W.B.,Li,J.&Wang,G.Molecular characterization of the Aphis gossypii olfactory receptor gene families.PLoS One 9,e101187,doi:10.1371/journal.pone.0101187(2014).)的氨基酸一致性，按照同源性从高到低排序后，选择氨基酸一致性高于65％的气味受体，作为候选的特定气味受体，并构建同源树，如图1所示。
[0039] 2.蚜虫的饲养与组织收集
[0041] 棉蚜是在中国农业科学院植物保护研究所使用土培棉花饲养的，饲养温度为25±1℃，光周期为14：10，相对湿度为60±5％。取3，4龄若虫及成虫蚜触角置于-70℃冰箱待用。
[0042] 3.RNA的提取
[0043] RNA提取的全部过程均在无RNA酶条件下进行。整个提取步骤如下所示：
[0045] 2)4℃，12000rpm离心10min。
[0046] 3)将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。为了充分裂解核蛋白复合体，室温放置5min。
[0047] 4)向离心管中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min。
[0048] 5)4℃，12000rpm离心15min。
[0049] 6)将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，向离心管中加入0.5mL异丙醇，缓慢混匀后，室温放置10min。
[0050] 7)4℃，12000rpm离心10min。
[0051] 8)吸弃上清，向离心管中加入1mL75％乙醇，缓慢混匀。
[0052] 9)4℃，7500rpm离心5min。
[0053] 10)吸弃上清，室温干燥10min至无明显水痕。
[0054] 11)加入10-20μL DEPC水(根据沉淀量决定)溶解沉淀，55-60℃孵育10min。
[0055] 4.cDNA第一条链合成
[0057] 1)在无RNA酶的1.5mL离心管中加入：总RNA 0.1ng-5μg，1μL oligo(dT)18primer，加RNase-free水补至12μL，缓慢混匀后离心。
[0058] 2)65℃温育5min后，立即置于冰上。
[0059] 3)依次加入：4μL 5×Reaction缓冲液，1μL RiboLock RNase Inhibitor(20u/μL)，2μL 10mM dNTP Mix，1μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/μL)使总体积达到20μL，缓慢混匀后离心。
[0060] 4)42℃温育1h后，70℃温育5min，保存于-20℃冰箱。
[0061] 5.候选特定气味受体的扩增及测序
[0062] 依据氨基酸序列一致性比对结果进行排序，一致性高于65％的组合作为候选特定气味受体，有15组候选特定气味受体。根据预测的序列全长，设计上下游引物，扩增候选特定气味受体的全长序列。
[0063] 上述实验中使用的部分引物列表如下：
[0064] ApisOrcoF:ATGGGTTATAAGAAAGATGGTCTTAT
[0065] ApisOrcoR:TTATTTAAGCTGCACCAAAACC
[0066] ApisOR5F:ATGCAACGCATAGACACCATCA
[0067] ApisOR5R:TTATGACAACTTGTGAGGTTTTATTGTT
[0068] AgosOR5F:ATGCCGCGCATAGACGCT
[0069] AgosOR5R:TTACGACATCTTATGAGGTTTTATAGCTTC
[0070] PCR反应体系为：2μL cDNA作为模版，0.25μL primeSTAR HS DNA polymerase，5μL 5×PrimeSTAR缓冲液(加Mg2+)，2μL dNTP mixture(0.25mM)，上下游引物(10μM)各0.5μL，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应条件为：94℃5min预热变性，98℃10s、55℃15s、72℃1.5min进行35个循环，72℃延伸10min。
[0071] PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，切下目的条带处的凝胶放入1.5mL离心管中，使用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(按照试剂盒说明书操作)，将回收到的PCR产物连接到pEASY-Blunt载体上(按照pEASY-Blunt载体试剂盒说明书操作)，连接后转入Trans1-T1化学感受态细胞中(按照试剂盒说明书操作)。挑取8个白色的单克隆菌落，用上述引物进行PCR验证，挑取PCR验证也为阳性结果的菌落保种，扩大培养后进行测序。正反向测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下一步的实验。
[0072] 克隆得到候选特定气味受体，分别为ApisOrco-AgosOrco、ApisOR2-AgosOR2、ApisOR4-AgosOR4、ApisOR5-AgosOR5、ApisOR10-AgosOR10、ApisOR17-AgosOR17、ApisOR20-AgosOR20、ApisOR23-AgosOR23、ApisOR25-AgosOR25、ApisOR31-AgosOR31、ApisOR37-AgosOR37、ApisOR38-AgosOR38、ApisOR39-AgosOR39、ApisOR42-AgosOR42、ApisOR43-AgosOR43。
[0073] 实例2爪蟾卵母细胞异源表达系统中表达气味受体
[0074] 选择2个表达载体上合适的酶切位点且测序正确的气味受体序列全长中无选择的酶切位点。上游引物为保护碱基(TCA)+选择的酶切位点+Kozak序列(GCCACC)+引物序列，下游引物为保护碱基(TCA)+选择的酶切位点+引物序列。
[0075] 上述实验中使用的部分引物列表如下：
[0076] ApisOrcoF:TCA GCCACCATGGGTTATAAGAAAGATGGTC(SpeⅠ)
[0077] ApisOrcoR:TCA TTATTTAAGCTGCACCAAAA(XhoⅠ)
[0078] ApisOR5F:TCA GCCACCATGCAACGCATAGACACCAT(BglⅡ)
[0079] ApisOR5R:TCA TTATGACAACTTGTGAGGTTTTATT(SphⅠ)
[0080] AgosOR5R:TCA GCCACCATGCCGCGCATAGACGC(HindⅢ)
[0081] AgosOR5F:TCA TTACGACATCTTATGAGGTTTTATAGCT(SpeⅠ)
[0082] PCR反应体系为：2μL cDNA作为模版，0.25μL primeSTAR HS DNA polymerase，5μL 5×PrimeSTAR缓冲液(加Mg2+)，2μL dNTP mixture(0.25mM)，上下游引物(10μM)各0.5μL，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应条件为：94℃5min预热变性，98℃10s、55℃15s、72℃1.5min进行35个循环，72℃延伸10min。
[0083] PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，切下目的条带处的凝胶放入1.5mL离心管中，用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(按照试剂盒说明书操作)，将回收到的PCR产物和pT7Ts载体，先进行双酶切操作后再进行连接反应。连接体系为6μL双酶切过的气味受体基因片段、1μL双酶切过的pT7Ts载体、2μL10×T4Ligase缓冲液和1μL的T4Ligase，Ligase，22℃连接2h后，转入Trans1-T1化学感受态细胞中(按照试剂盒说明书操作)。挑取8个白色的单克隆菌落进行PCR验证，挑取PCR验证也为阳性结果的菌落保种，扩大培养后进行测序。
正反向测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下一步的实验。
正反向测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下一步的实验。
[0084] 选取测序正确的保种菌液扩大培养后提取质粒，选取载体上有但序列全长上没有的酶切位点进行单酶切，酶切体系和反应条件按照相应酶的说明书操作，酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，确保完全切开。
[0085] 酚氯仿抽提线性化DNA模版步骤如下：
[0086] 1)在线性化质粒体系中加灭菌超纯水至100μL，然后加入100μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，震荡15s，充分混匀。
[0087] 2)常温，12000rpm离心10min。
[0088] 3)将上清小心吸取至干净的1.5mL离心管中后，加入0.5μLGenElute LPA，10μL3M NaAc(pH＝5.2)，200μL 100％乙醇，缓慢混匀，-20℃沉淀2h。
[0089] 4)取出冷冻样品，4℃，14000rpm离心30min。
[0090] 5)吸弃上清后，加入1mL 80％乙醇，缓慢混匀。
[0091] 6)4℃，14000rpm离心5min。
[0093] 在电泳检测正确的基础上，进行cRNA合成，详细实验步骤为：
[0094] 1)在无RNA酶的1.5mL离心管中依次加入10μL 2×NTP/CAP、2μL 10×Reaction缓冲液、6μL酚氯仿抽提好的线性化模版和2μL T7 Enzyme mix，震荡混匀离心，37℃温育2h。
[0095] 2)向体系中加入30μL RNase-free水和30μL的氯化锂溶液，4℃静置过夜。
[0096] 3)4℃，14000rpm离心30min。
[0097] 4)吸弃上清，加入1mL 70％乙醇，缓慢混匀。
[0098] 5)4℃，14000rpm离心5min。
[0099] 6)小心吸弃上清，风干沉淀，根据沉淀量加水稀释，充分混匀。
[0100] 7)取1μL样品与3μL无核酸酶水充分混匀，2μL用于电泳检测，2μL用于测定浓度。
[0101] 8)剩余的样品置于70℃温育5min，迅速置于冰上冷却。
[0102] 9)依据测定的浓度加RNase-free水稀释到cRNA浓度为2μg/μL，存放于-70℃冰箱。
[0103] 10)挑选健康成熟的爪蟾卵母细胞以27.6nL的体积进行cRNA注射，放于18℃恒温培养箱中培养3天。
[0104] 实例3双电极电压钳筛选可以感知(反)-β-法尼烯的特定气味受体
[0105] 将原浓的(反)-β-法尼烯溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成终浓度为1mol/L，使用1×Ringer(1×Ringer由10×Ringer稀释10倍。10×Ringer配制方法：NaCl：56.1g、KCl：1.5g、MgCl2·6H2O：10.2g、HEPES：11.9g、10mL、100×CaCl2,灭菌水定容至1L)将1mol/L(反)-β-法尼烯稀释成终浓度为10-4mol/L。利用双电极电压钳记录表达候选特定气味受体的爪蟾卵母细胞对10-4mol/L(反)-β-法尼烯刺激的反应，利用仪器OC-725C oocyte clamp进行记录数据，利用仪器Digidata 1440A和软件pCLAMP 10.2获取数据，数据用mean±SEM表示(n≥8)，数据的统计用单因素方差分析，利用GraphPadPrism 5.0作图。
[0106] 克隆得到的15组候选特定气味受体中，只有ApisOR5/Orco和AgosOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞可对10-4mol/L(反)-β-法尼烯刺激有反应，反应轨迹如图2A所示，反应值如图2B所示。
[0107] 将1mol/L(反)-β-法尼烯梯度稀释成终浓度为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L，使用双电极电压钳记录ApisOR5/Orco和AgosOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞对梯度浓度(反)-β-法尼烯的剂量反应轨迹图，如图3所示，反应值随浓度的增加而增大。根据反应值拟合出剂量反应曲线，ApisOR5/Orco的EC50值为2.13×10-7mol/L，AgosOR5/Orco的EC50值为2.98×10-7mol/L，如图4所示。
[0108] 实施例4RNAi技术干扰豌豆蚜体内特定气味受体
[0109] 为了进一步确定ApisOR5基因的体内功能与体外功能是否一致，采用RNA干扰ApisOR5后行为学实验验证。
[0110] RNA干扰ApisOR5基因的详细步骤如下：
[0111] 1)GFP为绿色荧光蛋白基因，作为对照处理组。使用加T7接头的引物从ApisOR5-pT7Ts、GFP-T3质粒上扩增合成dsRNA的线性化模版，扩增体系为1μL ApisOR5-pT7Ts或GFP-T3稀释50倍质粒作为模版，0.25μL primeSTAR HS DNA polymerase，5μL 5×PrimeSTAR缓冲液(加Mg2+)，2μL dNTP mixture(0.25mM)，上下游引物(10μM)各0.5μL，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应条件为：94℃5min预热变性，98℃10s、55℃15s、72℃1.5min进行35个循环，72℃延伸10min。
[0112] 详细引物序列为：
[0113] GFP F:TAATACGACTCACTATAGGGGTGGAGAGGGTGAAGGTGATG
[0114] GFP R:TAATACGACTCACTATAGGGGTGTCCAAGAATGTTTCCATCT
[0115] ApisOR5F:TAATACGACTCACTATAGGGGCAACGCATAGACACCATCA
[0116] ApisOR5R:TAATACGACTCACTATAGGGGCAACGCATAGACACCATCA
[0117] 2)酚氯仿抽提合成dsRNA线性化DNA模版，抽提的方法与酚氯仿抽提合成cRNA的线性化DNA模版步骤相同，最终加无核酸酶水稀释到终浓度为1250ng/μL。
[0118] 3)合成dsGFP、dsApisOR5的反应体系为：10μL 5×Transcription缓冲液、1μL ATP(100mM)、1μL UTP(100mM)、1μL GTP(100mM)、1μL CTP(100mM)、1μL上述抽提过的含T7启动子的线性化DNA模版、1.25μL RiboLock RNase Inhibitor(40u/μL)、1.5μL T7 RNA Polymerase，加无核酸酶水至50μL体系，轻弹混匀，37℃温育2h。
[0119] 4)75℃热激5min后，室温冷却，电泳检测。
[0120] 5)加无核酸酶水定容至200μL，加入100μL水饱和酚、100μL氯仿，轻柔混合。
[0121] 6)4℃，12000rpm离心15min。
[0122] 7)吸取上清，加入等体积的氯仿，轻柔混合。
[0123] 8)4℃，12000rpm离心15min。
[0124] 9)吸取上清，加入20μL 3M NaAc(pH＝5.2)，250μL 100％乙醇，-20℃沉淀至少3h。
[0125] 10)4℃，12000rpm离心30min。
[0126] 11)吸弃上清，加1mL 75％乙醇洗涤沉淀。
[0127] 12)4℃，12000rpm离心5min。
[0128] 13)吸弃上清，风干沉淀，电泳检测，根据沉淀量加无核酸酶水稀释，最终稀释到终浓度为12μg/μL,分装，存放于-70℃冰箱。
[0129] 14)挑选3龄的豌豆蚜若虫若干头，饥饿处理1h后(以防注射时体液外流)，每头注射27.6nL的dsRNA，注射完放回蚕豆苗上饲养72h。
[0130] 15)挑取注射后饲养72h的豌豆蚜进行Y型管(直径1.5cm，主臂长15cm，分支臂长24.5cm)行为学实验。Y型的铜丝被放置在玻璃管中心来促进蚜虫的爬行。滤纸(0.5cm×
0.5cm)被放置在分支臂的末端，实验时气流以0.5L/min速度通过滤纸，滤纸上点2μL正己烷作为溶剂对照或者2μL浓度为0.5％(V/V)的相应气味(溶于正己烷)。将15只蚜虫放到主臂与分支臂连接处，气流通分支臂、连接处，最后从主臂最下端流出，15min后统计进入分支臂的做出选择的蚜虫的数量。使用two-sided binominal检验验证显著性，使用GraphPadPrism 5.0作图，如图5所示，RNA干扰ApisOR5后(反)-β-法尼烯对豌豆蚜的趋避性被明显削弱。实例5利用蚜虫特定气味受体筛选高效驱避剂
0.5cm)被放置在分支臂的末端，实验时气流以0.5L/min速度通过滤纸，滤纸上点2μL正己烷作为溶剂对照或者2μL浓度为0.5％(V/V)的相应气味(溶于正己烷)。将15只蚜虫放到主臂与分支臂连接处，气流通分支臂、连接处，最后从主臂最下端流出，15min后统计进入分支臂的做出选择的蚜虫的数量。使用two-sided binominal检验验证显著性，使用GraphPadPrism 5.0作图，如图5所示，RNA干扰ApisOR5后(反)-β-法尼烯对豌豆蚜的趋避性被明显削弱。实例5利用蚜虫特定气味受体筛选高效驱避剂
[0131] 使用实例2、实例3所述方法，筛选可以激活ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞的气味。如图6所示，除(反)-β-法尼烯外，一共筛选了60种气味，只有乙酸香叶酯可以激活ApisOR5/Orco共表达的爪蟾卵母细胞。
[0132] 筛选使用的气味列表如下：
[0133]
[0134] 使用实例4中Y型管行为学实验的方法，测定正己烷(对照)、(反)-β-法尼烯和乙酸香叶酯对正常的豌豆蚜和棉蚜的趋避情况，使用two-sided binominal检验验证显著性，使用GraphPadPrism 5.0作图，如图7、8所示，(反)-β-法尼烯和乙酸香叶酯均可趋避豌豆蚜和棉蚜。
[0135] 趋避强度AI的计算方法是AI＝(对照-处理)/(对照+处理)，数值趋近于1，表明趋避强度越高。(反)-β-法尼烯和乙酸香叶酯对豌豆蚜和棉蚜的趋避强度，如图9所示。对于豌豆蚜和棉蚜来说，筛选到的乙酸香叶酯的趋避强度都比(反)-β-法尼烯的趋避强度高。
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