[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求2017年1月12日提交的临时申请62/445,429的权益，并通过引用以其全文结合在此。

[0003] 序列表

[0004] 提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37 C.F.R.§1.821提交的，名称为“81158_PCT_T25.txt”，大小为305千字节，于2017年11月28日生成并经由EFS-Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。

[0005] 本发明涉及蛋白工程、植物分子生物学以及有害生物控制的领域。更具体地，本发明涉及具有杀昆虫活性的新型蛋白质及其变体，核酸(其表达产生杀昆虫蛋白)，以及制造这些杀昆虫蛋白和相应的核酸的方法和使用这些杀昆虫蛋白和相应的核酸来控制昆虫的方法。

[0006] 昆虫有害生物是引起作物损失的一个主要原因。仅在美国，由于各个属的昆虫的侵染每年就损失数十亿美元。除了大田作物的损失之外，昆虫有害生物对于菜农和果农、对于观赏性花卉的生产商而言也是一种负担，并且对于园丁和房屋所有者而言是一种令人讨厌的东西。

[0007] 玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。在美国，三个重要的物种是玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫)、长角巴氏根萤叶甲(D.longicornis barberi，又称北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫)。在美国玉米带中，只有西方和北方玉米根虫被认为是主要的玉米有害生物。另外地，美国南部的一种重要的玉米根虫有害生物是墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae))。玉米根虫的幼虫通过几乎专一摄食玉米根而造成最为实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养物质的产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食在整个根部通过为导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了途径，对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，其中它们摄食穗、穗丝以及花粉，由此干扰了正常的授粉。

[0008] 玉米根虫主要是通过密集施用化学杀有害生物剂而得到控制的，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而具有活性。由此可以达到良好的玉米根虫控制，但这些化学品有时也能影响其他有益的生物。由化学杀有害生物剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了抗性昆虫品种。又另一个问题是由于下述事实：玉米根虫幼虫在地下摄食因此使得施用杀昆虫剂的救护处理变得困难。因此，大多数杀昆虫剂的施用是在种植时预防性地进行的。这种实践导致了巨大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性有害生物控制的机制存在着不断增加的需要。

[0009] 生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素像δ-内毒素(Δ-内毒素；也被称为结晶毒素或Cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株，也已经施用至作物植物中，产生了针对昆虫有害生物的令人满意的结果。这些δ-内毒素是在结晶基质内所容纳的蛋白质，已知它们当被某些昆虫摄取时拥有杀昆虫活性。来自苏云金芽孢杆菌的若干天然Cry蛋白或工程化的Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。例如，起始于2003年，通过表达Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1、或修饰的Cry3A(mCry3A)或Cry3Ab(eCry3.1Ab)蛋白而控制玉米根虫的转基因玉米杂交种在美国已经是可商购的。

[0010] 尽管已经显示使用表达Cry蛋白的转基因植物非常有效，但现在针对某些转基因植物中表达的Cry蛋白具有抗性的昆虫有害生物是已知的。因此，仍需要鉴定新型并有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要的是对根萤叶甲属(Diabrotica)物种(一种主要的玉米有害生物)有毒的蛋白质，与现存的昆虫控制产品相比这些蛋白质作为缓和抗性的演化的途径具有不同的作用方式。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制剂是令人希望的。

[0011] 鉴于这些需要，本发明提供了新型的杀昆虫蛋白(即，WoodsCRW)和与WoodsCRW及其变体基本上同一的蛋白质。本发明的蛋白质针对玉米根虫(根萤叶甲属物种)具有毒性。本发明的蛋白质也可能对其他鞘翅目和/或鳞翅目具有毒性。本发明进一步涉及编码WoodsCRW或其变体的核酸分子、其互补物或与WoodsCRW及其变体基本上同一的核酸分子。

[0012] 还包括在本发明中的是含有此类重组(或与其互补)的核酸的载体；包括此类核酸并能够使此类核酸表达的植物或微生物；用此类核酸转化的植物，例如转基因玉米植物；此类植物的子代(此类植物包含稳定整合的并且可以按照孟德尔方式进行遗传的核酸)，和/或此类植物和这种子代的种子。本发明还包括育种的方法，以将包含本发明的核酸分子的转基因引入子代植物和各种种质中。

[0013] 本发明还包括含有WoodsCRW或其变体的组合物和配制品，这些组合物和配制品能够抑制昆虫有害生物存活、生长和/或繁殖的能力，或能够限制与昆虫有关的损害或作物植物的损失，例如将WoodsCRW或其变体作为组合物或配制品的一部分施用至昆虫侵染的区域或植物，或施用至预防性处理易感染昆虫的区域或植物以赋予针对昆虫有害生物的保护。

[0014] 本发明进一步涉及制造WoodsCRW或其变体的方法，以及使用这些核酸的方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护。

[0015] 本文描述的新型蛋白质针对昆虫具有活性。例如，在实施例中，本发明的蛋白质可用于控制经济上重要的昆虫有害生物，包括鞘翅目昆虫，如西方玉米根虫(WCR)、北方玉米根虫(NCR)、南方玉米根虫(SCR)和/或墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)。本发明的杀昆虫蛋白可以单独使用或与其他昆虫控制策略组合使用，来以最小的环境影响赋予针对相同昆虫有害生物的增强的有害生物控制效率和/或增加靶昆虫的谱。

[0016] 通过学习本发明的以下说明书和非限制性实例，本发明的其他方面和优点对于本领域的技术人员而言将变得清楚。

[0017] 序列表中序列的简要说明

[0018] SEQ ID NO:1是WoodsCRW氨基酸序列。

[0019] SEQ ID NO:2是WoodsCRW大肠杆菌优化的核苷酸序列。

[0020] SEQ ID NO:3是WoodsCRW天然核苷酸序列。

[0021] SEQ ID NO:4是WoodsCRW变体C485S核苷酸序列。

[0022] SEQ ID NO:5是WoodsCRW变体C435S核苷酸序列。

[0023] SEQ ID NO:6是WoodsCRW变体C398S核苷酸序列。

[0024] SEQ ID NO:7是WoodsCRW变体C383S核苷酸序列。

[0025] SEQ ID NO:8是WoodsCRW变体C313S核苷酸序列。

[0026] SEQ ID NO:9是WoodsCRW变体Y194W核苷酸序列。

[0027] SEQ ID NO:10是WoodsCRW变体Y194F核苷酸序列。

[0028] SEQ ID NO:11是WoodsCRW变体C383S/C485S核苷酸序列。

[0029] SEQ ID NO:12是WoodsCRW变体C435S/C485S核苷酸序列。

[0030] SEQ ID NO:13是WoodsCRW变体C398S/C435S核苷酸序列。

[0031] SEQ ID NO:14是WoodsCRW变体C398S/C485S核苷酸序列。

[0032] SEQ ID NO:15是WoodsCRW变体C383S/C435S/C485S核苷酸序列。

[0033] SEQ ID NO:16是WoodsCRW变体C313S/C383S/C398S/C435S/C485S核苷酸序列。

[0034] SEQ ID NO:17是WoodsCRW变体K396L核苷酸序列。

[0035] SEQ ID NO:18是WoodsCRW变体K406L核苷酸序列。

[0036] SEQ ID NO:19是WoodsCRW变体C383A/C485A核苷酸序列。

[0037] SEQ ID NO:20是WoodsCRW变体C398A/C485A核苷酸序列。

[0038] SEQ ID NO:21是WoodsCRW变体C383L核苷酸序列。

[0039] SEQ ID NO:22是WoodsCRW变体C398L核苷酸序列。

[0040] SEQ ID NO:23是WoodsCRW变体I77L/I83L/Y98F核苷酸序列。

[0041] SEQ ID NO:24是WoodsCRW变体Y248F/I264L/Y277F核苷酸序列。

[0042] SEQ ID NO:25是WoodsCRW变体Y326F/I340L/I351L核苷酸序列。

[0043] SEQ ID NO:26是WoodsCRW变体I209L/Y223F/I228L核苷酸序列。

[0044] SEQ ID NO:27是WoodsCRW变体I447L/Y464F/I469L核苷酸序列。

[0045] SEQ ID NO:28是WoodsCRW变体C435L核苷酸序列。

[0046] SEQ ID NO:29是WoodsCRW变体C485L核苷酸序列。

[0047] SEQ ID NO:30是WoodsCRW变体I403L/I404L核苷酸序列。

[0048] SEQ ID NO:31是WoodsCRW变体V399L核苷酸序列。

[0049] SEQ ID NO:32是WoodsCRW变体V399F核苷酸序列。

[0050] SEQ ID NO:33是WoodsCRW变体C398F核苷酸序列。

[0051] SEQ ID NO:34是WoodsCRW变体C398Y核苷酸序列。

[0052] SEQ ID NO:35是WoodsCRW变体C398I核苷酸序列。

[0053] SEQ ID NO:36是WoodsCRW变体C398M核苷酸序列。

[0054] SEQ ID NO:37是WoodsCRW变体C485S氨基酸序列。

[0055] SEQ ID NO:38是WoodsCRW变体C435S氨基酸序列。

[0056] SEQ ID NO:39是WoodsCRW变体C398S氨基酸序列。

[0057] SEQ ID NO:40是WoodsCRW变体C383S氨基酸序列。

[0058] SEQ ID NO:41是WoodsCRW变体C313S氨基酸序列。

[0059] SEQ ID NO:42是WoodsCRW变体Y194W氨基酸序列。

[0060] SEQ ID NO:43是WoodsCRW变体Y194F氨基酸序列。

[0061] SEQ ID NO:44是WoodsCRW变体K396L氨基酸序列。

[0062] SEQ ID NO:45是WoodsCRW变体K406L氨基酸序列。

[0063] SEQ ID NO:46是WoodsCRW变体C383S/C485S氨基酸序列。

[0064] SEQ ID NO:47是WoodsCRW变体C435S/C485S氨基酸序列。

[0065] SEQ ID NO:48是WoodsCRW变体C398S/C435S氨基酸序列。

[0066] SEQ ID NO:49是WoodsCRW变体C398S/C485S氨基酸序列。

[0067] SEQ ID NO:50是WoodsCRW变体C383S/C435S/C485S氨基酸序列。

[0068] SEQ ID NO:51是WoodsCRW变体C313S/C383S/C398S/C435S/C485S氨基酸序列。

[0069] SEQ ID NO:52是WoodsCRW变体C383A/C485A氨基酸序列。

[0070] SEQ ID NO:53是WoodsCRW变体C398A/C485A氨基酸序列。

[0071] SEQ ID NO:54是WoodsCRW变体C383L氨基酸序列。

[0072] SEQ ID NO:55是WoodsCRW变体C398L氨基酸序列。

[0073] SEQ ID NO:56是WoodsCRW变体I77L/I83L/Y98F氨基酸序列。

[0074] SEQ ID NO:57是WoodsCRW变体Y248F/I264L/Y277F氨基酸序列。

[0075] SEQ ID NO:58是WoodsCRW变体Y326F/I340L/I351L氨基酸序列。

[0076] SEQ ID NO:59是WoodsCRW变体I209L/Y223F/I228L氨基酸序列。

[0077] SEQ ID NO:60是WoodsCRW变体I447L/Y464F/I469L氨基酸序列。

[0078] SEQ ID NO:61是WoodsCRW变体C435L氨基酸序列。

[0079] SEQ ID NO:62是WoodsCRW变体C485L氨基酸序列。

[0080] SEQ ID NO:63是WoodsCRW变体I403L/I404L氨基酸序列。

[0081] SEQ ID NO:64是WoodsCRW变体V399L氨基酸序列。

[0082] SEQ ID NO:65是WoodsCRW变体V399F氨基酸序列。

[0083] SEQ ID NO:66是WoodsCRW变体C398F氨基酸序列。

[0084] SEQ ID NO:67是WoodsCRW变体C398Y氨基酸序列。

[0085] SEQ ID NO:68是WoodsCRW变体C398I氨基酸序列。

[0086] SEQ ID NO:69是WoodsCRW变体C398M氨基酸序列。

[0087] SEQ ID NO:70和71是WoodsCRW片段的氨基酸序列。

[0088] SEQ ID NO:72是WoodsCRW氨基酸序列，其中“X”可以是任何氨基酸。

[0089] SEQ ID NO:73是包含两个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体D397-Leu-Leu-C398的核苷酸序列。

[0090] SEQ ID NO:74是包含两个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C398-Leu-Leu-V399的核苷酸序列。

[0091] SEQ ID NO:75是包含两个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体D397-Leu-C398-Leu的核苷酸序列。

[0092] SEQ ID NO:76是WoodsCRW变体Y436F的核苷酸序列。

[0093] SEQ ID NO:77是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体D397-Leu-C398的核苷酸序列。

[0094] SEQ ID NO:78是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C398-Leu-V399的核苷酸序列。

[0095] SEQ ID NO:79是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体L382-Leu-C383的核苷酸序列。

[0096] SEQ ID NO:80是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C383-Leu-Y384的核苷酸序列。

[0097] SEQ ID NO:81是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体L434-Leu-C435的核苷酸序列。

[0098] SEQ ID NO:82是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C435-Leu-Y436的核苷酸序列。

[0099] SEQ ID NO:83是Plu1415-Woods嵌合体的核苷酸序列。

[0100] SEQ ID NO:84是Woods-Plu1415嵌合体的核苷酸序列。

[0101] SEQ ID NO:85是Plu1415蛋白的氨基酸序列。

[0102] SEQ ID NO:86是包含两个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体D397-Leu-Leu-C398的氨基酸序列。

[0103] SEQ ID NO:87是包含两个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C398-Leu-Leu-V399的氨基酸序列。

[0104] SEQ ID NO:88是包含两个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体D397-Leu-C398-Leu的氨基酸序列。

[0105] SEQ ID NO:89是WoodsCRW变体Y436F的氨基酸序列。

[0106] SEQ ID NO:90是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体D397-Leu-C398的氨基酸序列。

[0107] SEQ ID NO:91是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C398-Leu-V399的氨基酸序列。

[0108] SEQ ID NO:92是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体L382-Leu-C383的氨基酸序列。

[0109] SEQ ID NO:93是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C383-Leu-Y384的氨基酸序列。

[0110] SEQ ID NO:94是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体L434-Leu-C435的氨基酸序列。

[0111] SEQ ID NO:95是包含一个插入的亮氨酸残基的WoodsCRW变体C435-Leu-Y436的氨基酸序列。

[0112] SEQ ID NO:96是Plu1415-Woods嵌合体的氨基酸序列。

[0113] SEQ ID NO:97是Woods-Plu1415嵌合体的氨基酸序列。

[0114] SEQ ID NO:98是Plu1415蛋白的氨基酸序列。

[0115] SEQ ID NO:99是WoodsCRW的C-末端β-棱柱结构域(氨基酸347-490)的核苷酸序列。

[0116] SEQ ID NO:100是WoodsCRW的C-末端β-棱柱结构域(氨基酸347-490)的氨基酸序列。

[0117] 定义

[0118] 为了清晰起见，定义了在本说明书中所使用的某些术语并且将其呈现如下：

[0119] 本发明的杀昆虫蛋白的“活性”意指杀昆虫蛋白作为口服活性的昆虫控制剂发挥作用，具有毒性作用、和/或能够干扰或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。当本发明的杀昆虫蛋白被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不摄食使该杀昆虫蛋白可供该昆虫利用的来源。“杀有害生物的”被定义为有毒的生物活性，其能够控制有害生物(如昆虫、线虫、真菌、细菌或病毒)，优选地通过杀死或破坏它们来控制。“杀昆虫的”被定义为有毒的生物活性，其能够控制昆虫，优选地通过杀死它们来控制。“杀有害生物剂”是具有杀有害生物活性的药剂。“杀有害生物剂”是具有杀昆虫活性的药剂。

[0120] “与……相关联/可操作地连接”指物理上或功能上相关的两种核酸。例如，启动子或调节性DNA序列被说成“与”对RNA或蛋白质进行编码的DNA序列“相关联”，条件是将这两条序列可操作地连接，或设定为使该调节性DNA序列将影响该编码或结构DNA序列的表达水平。

[0121] “编码序列”是转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的核酸序列。优选地，RNA进而在生物中被翻译以产生蛋白质。

[0122] “控制”昆虫意指通过毒性作用抑制了昆虫有害生物存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物植物中的损失。“控制”昆虫可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。

[0123] “递送”杀昆虫蛋白意指该杀昆虫蛋白与昆虫相接触，产生毒性作用以及对昆虫的控制。这种杀昆虫蛋白可以按照许多公认的方式进行递送，例如，通过表达该杀昆虫蛋白的转基因植物、一种或多种配制的蛋白组合物、一种或多种可喷洒的蛋白组合物、诱饵基质、或领域公认的任何其他的毒素递送系统。

[0124] “控昆虫有效量”意指杀昆虫蛋白的浓度，其通过毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“控昆虫有效量”可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管它优选意指杀死昆虫。

[0125] 如本文使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导特定的核苷酸序列的表达的核酸序列，包含可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子，该目的核苷酸序列可操作地连接至终止信号。它还典型地包含适当翻译该核苷酸序列所需要的序列。包含该目的核苷酸序列的表达盒可能具有其组分中的至少一种，该组分相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时才引发转录。在多细胞生物(如植物)的情况下，该启动子对于特定组织、或器官、或者发育阶段也可以是特异的。

[0126] 包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。表达盒还可以是包括驱动其天然基因的天然启动子，然而已经以对于异源表达有用的重组形式获得。表达盒的这种用途使它如此在其被引入的细胞中不是天然存在的。

[0127] 表达盒还可以任选地包括在植物中发挥作用的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出目的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的核苷酸序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以是源自另一种来源(即，对于启动子、目的核苷酸序列、植物宿主、或其任何组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。任何已知在植物中发挥作用的可供使用的终止子均可以在本发明的上下文中使用。

[0128] 当参考多核苷酸(如植物的基因、ORF或其部分、或转基因)使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白)通过mRNA的“翻译”转化为蛋白质的过程。基因表达可以在该过程的许多阶段进行调节。例如，在反义构建体或dsRNA构建体的情况下，各自地表达可仅指该反义RNA或仅指dsRNA的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白质的产生。

[0129] “基因”是位于基因组内并且包含编码核酸序列的限定区域，并且典型地还包含其他负责控制该编码部分表达(也就是转录和翻译)的主要调节性核酸。基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。另外的可能存在的元件是例如内含子。如在自然界中所发现，基因的调节性核酸序列在正常情况下可能不与该相关联的核酸序列进行可操作地连接，并因此不会是嵌合基因。

[0130] “目的基因”是指当转移至植物时，在该植物上赋予所希望的性状(如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他有害生物的抗性、除草剂耐受性、非生物胁迫耐受性、雄性不育、改性脂肪酸代谢、改性碳水化合物代谢、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力)的任何核酸分子。“目的基因”还可以是被转移至植物用于在该植物中产生商业上有价值的酶或代谢物的基因。

[0131] “异源”核酸序列或核酸分子是天然地不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞相关联的核酸序列或核酸分子，包括天然存在的核酸序列的非天然存在的多个拷贝。异源核酸序列或核酸分子可以包含嵌合序列，如嵌合表达盒，在该表达盒中，启动子和编码区源自多源生物。启动子序列可以是组成型启动子序列、组织特异性启动子序列、化学诱导型启动子序列、伤口诱导型启动子序列、胁迫诱导型启动子序列、或发育阶段特异性启动子序列。

[0132] “同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关联的核酸序列。

[0133] “同源重组”是在同源核酸分子之间的核酸片段的相互交换。

[0134] “同一性”或“百分比同一性”是指在两个核酸或蛋白序列之间的相似性的程度。对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参考序列的序列同一性百分比。在两个核酸或两个氨基酸序列的上下文中，短语“基本上同一的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少约50％核苷酸或氨基酸残基同一性(如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的)的两个或更多个序列或子序列。在某些实施例中，基本上同一的序列具有至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或甚至至少约90％或95％核苷酸或氨基酸残基同一性。在某些实施例中，基本上的同一性存在于这些序列的整个长度为至少约50个残基的区域中，或在整个至少约100个残基的区域中，或这些序列在至少约150个残基中是基本上同一的。在另外的实施例中，当这些序列在编码区的整个长度上是同一的时，这些序列是基本上同一的。

[0135] 用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85：2444(1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，科学街575号(575Science Dr.)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))，或通过目测检查(总体上参见Ausubel等人,下文)。

[0136] 适合于确定序列同一性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于以下文献中：Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410(1990)。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for 
Biotechnology Information)公开地获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈值(Altschul等人,1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止这些字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：10915(1989))。

[0137] 除了计算序列同一性百分数之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则所述测试核酸序列被认为是与所述参考序列相似的。

[0138] 用于进行序列比对的另一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]22：4673-4680,1994)。将匹配的碱基或氨基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100，以获得百分比同一性。例如，如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基，则它们会是25％同一的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度，则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如，如果在200个氨基酸的蛋白质与400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸，则相对于较短的序列而言这两个蛋白质是50％同一的。如果所述较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸，则将匹配的数目除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)并乘以100，以获得百分比同一性。

[0139] 两个核酸基本上同一的另一个指标是这两个分子在严格条件下彼此进行杂交。短语“特异性杂交”是指分子在严格条件下仅与特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在该序列存在于DNA或RNA复合混合物(例如，总细胞的)中时进行的。“基本上结合”是指在探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，这些错配可以通过降低杂交介质的严格来容纳，以实现靶核酸序列的所希望的检测。

[0140] 在核酸杂交实验(如DNA杂交和RNA杂交)的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第I部分“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针检验策略综述]”Elsevier[爱思唯尔集团],纽约。通常，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与其靶子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。

[0141] Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格条件被选定为等于特定探针的Tm。针对互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的一个实例是具有1mg肝素的50％甲酰胺、在42℃、将该杂交过夜进行。高严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃以0.2x SSC洗涤持续15分钟(参见Sambrook，下文，针对SSC缓冲液的描述)。通常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的中严格洗涤的实例是在45℃以1x SSC持续15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是在40℃以4-6x SSC持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐)，并且温度典型地是至少约30℃。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。一般而言，在特定的杂交测定中相比于不相关的探针观察到的高出2倍(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白是基本上同一的，则它们仍然是基本上同一的。例如，当使用遗传密码允许的最大程度的密码子简并而生成核酸的拷贝时，则发生这种情况。

[0142] 以下是可以用来克隆同源核苷酸序列(这些序列与本发明的参考核苷酸序列基本上同一)的杂交/洗涤条件的设置的实例：参考核苷酸序列在以下条件下优选地与该参考核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在2XSSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、
1mM EDTA中在50℃，并且在1X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；仍更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.5X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.1X SSC、
0.1％SDS中在50℃洗涤；更优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在
50℃，并且在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤。

[0143] 两个核酸或蛋白质是基本上同一的另一个指标是由第一核酸所编码的蛋白质与由第二核酸所编码的蛋白质具有免疫交叉反应性或与其特异性结合。因此，蛋白质典型地是与第二蛋白质基本上同一的，例如其中这两种蛋白质仅在保守性取代上不同。

[0144] 当核酸序列编码了多肽(该多肽与由参考核酸序列所编码的多肽具有相同的氨基酸序列)时，这种核苷酸序列与这种参考核酸序列“同类编码”。

[0145] “分离的”核酸分子或分离的毒素是通过人工从其天然环境中分开而存在的核酸分子或毒素并因此不是自然的产物。分离的核酸分子或毒素可能以纯化的形式存在或可能存在于非天然的环境中，如例如没有限制，存在于重组的微生物细胞、植物细胞、植物组织或植物中。

[0146] “核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源中分离的单链或双链DNA或RNA的区段。在本发明的上下文中，这种核酸分子典型地是DNA的区段。在一些实施例中，本发明的核酸分子是分离的核酸分子。

[0147] 术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文可以互换地使用。

[0148] 如本文使用的，“密码子优化的”序列意指重组的、转基因的、或合成的多核苷酸的核苷酸序列，其中密码子被选择以反映宿主细胞可能具有的特定的密码子偏好性。这是以这样一种方式来完成，该方式是为了保持由密码子优化的多核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，重组DNA构建体的核苷酸序列包括已经针对该构建体有待在其中表达的细胞(例如，动物、植物、或真菌细胞)进行密码子优化的序列。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表达元件)进行密码子优化用于在植物中表达。参见，例如，美国专利号6,121,014，通过引用结合在此。

[0149] “植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。

[0150] “植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。

[0151] “植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。

[0152] “植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。

[0153] “植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。

[0154] 如本文使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

[0155] “启动子”是编码区的不被翻译的DNA序列上游，其包含RNA聚合酶结合位点并且起始DNA的转录。启动子区还可以包括充当基因表达的调节物的其他元件。

[0156] “调节元件”是指参与控制核苷酸序列的表达的序列。调节元件包含可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子以及终止信号。它们还典型地涵盖适当翻译该核苷酸序列所需的序列。

[0157] “转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物的方法。在具体实施例中，“转化”意指DNA分子稳定地整合到目的生物的基因组(核或质体)中。

[0158] “转化的/转基因的/重组的”是指引入了异源核酸分子的宿主生物，例如细菌或植物。所述核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者所述核酸分子还可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含该异源的核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。

[0159] 核苷酸通过其碱基由以下标准缩写表示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。氨基酸也由以下标准缩写表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。

[0160] 本发明涉及新型杀昆虫蛋白，其针对鞘翅目(例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、巴氏根萤叶甲(Diabrotica barber)(北方玉米根虫；NCR)和/或黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫；SCR)和/或其他根萤叶甲属物种(包括墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)和/或科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado Potato Beetle))具有活性。在实施例中，本发明的新型杀昆虫蛋白可针对鳞翅目物种具有活性。本发明还涉及核酸(它们的表达产生了本发明的杀昆虫蛋白)，以及涉及制造和使用这些杀昆虫蛋白以控制昆虫有害生物的方法。在实施例中，这些核酸的表达产生杀昆虫蛋白，其可用于控制鞘翅目昆虫(如西方、北方和/或南方玉米根虫)，特别是当表达于转基因植物(如转基因玉米植物)中时。

[0161] 本发明进一步涵盖了核酸分子，该核酸分子包含编码本发明的杀昆虫蛋白的核苷酸序列。可优化核苷酸序列用于在细菌(如大肠杆菌)中表达或用于在植物(如玉蜀黍(Zea may))中表达。经优化用于在异源生物(如与其起源不同的细菌)或植物中表达的核苷酸序列不是天然存在的。在这个实施例的一个方面，核酸分子包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4至36、SEQ ID NO:73至83、和/或SEQ ID NO:99的核苷酸序列。制造编码本发明的杀昆虫蛋白的核酸分子的方法的具体示例性教导可以在本申请的实例中找到。本领域的技术人员应当认识到可以对由本发明所涵盖的制造杀昆虫蛋白的示范性方法进行修饰。

[0162] 技术人员将认识到，用于商业用途的转基因，如包含SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99中的任一个的核酸分子，可能具有对核酸序列的相对较小的修饰以符合政府法规标准。此类修饰将不会影响产生的分子的功能，该分子将与SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、和/或SEQ ID NO:99基本上同一。技术人员将认识到修饰的核酸分子将与起始分子是基本上相同的，并且涵盖于本发明中。

[0163] 本发明还涵盖包含以下的核酸分子：(a)SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99中任一个的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其是与SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99的核苷酸序列中的任一个具有至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列；(c)编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、或SEQ ID NO:86-96，并且具有昆虫控制活性；(d)编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100的氨基酸序列的任一个具有至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％、或100％同一性；或(e)与上述(a)至(d)中的任一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

[0164] 本发明进一步涵盖表达盒，该表达盒包含可操作地连接至异源核苷酸序列的启动子，该异源核苷酸序列包含：(a)SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99中任一个的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99中任一个的核苷酸序列具有至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的核苷酸序列；
(c)编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至
72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100，并且具有昆虫控制活性；(d)编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100中任一个的氨基酸序列具有至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性；或(e)与上述(a)至(d)中的任一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明涵盖包含异源核酸分子的表达盒，该异源核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:67、或SEQ ID NO:86至91的氨基酸序列具有至少93％同一性。表达盒包含可操作地连接至异源核苷酸序列的启动子，并且该表达盒不是天然存在的。

[0165] 在一些实施例中，表达盒的异源核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:72的氨基酸序列，其中“X”氨基酸残基可以是任何氨基酸残基。在一些实施例中，表达盒的异源核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，该多肽与SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少93％同一性。

[0166] 本发明还涵盖重组载体或构建体，这些重组载体或构建体也可被称为载体或构建体，其包含本发明的表达盒和/或核酸分子。在此类载体中，这些核酸优选地处于表达盒中，这些表达盒包含用于在能够表达核苷酸分子的宿主细胞中表达核苷酸分子的调节元件。此类调节元件通常包含启动子和终止信号并且优选地还包含元件，这些元件允许由本发明的核酸所编码的多肽的有效的翻译。包含核酸的载体能够在特定的宿主细胞中复制(优选是作为染色体外的分子)并因此可用来在这些宿主细胞中扩增本发明的核酸。本发明还涵盖宿主细胞，该宿主细胞含有本发明的表达盒或核酸分子。在一个实施例中，用于此类载体的宿主细胞是微生物(如细菌，特别是苏云金芽孢杆菌或大肠杆菌)，或真菌(如酵母)。在另一个实施例中，用于此类重组载体的宿主细胞是内生菌或附生菌。在又另一个实施例中，此类载体是病毒载体并被用于在特定的宿主细胞(例如昆虫细胞或植物细胞)中复制核苷酸序列。重组载体也用于将本发明的核苷酸分子转化到宿主细胞中，由此这些核苷酸分子被稳定整合到转基因宿主的DNA中。在一个实施例中，转基因宿主是植物，例如单子叶植物，如玉米植物或小麦植物。在实施例中，转基因宿主植物是双子叶植物，如大豆植物或棉花植物。

[0167] 在另一个实施例中，将本发明的核酸中的至少一个插入到适当的表达盒(包含启动子以及终止信号)中。核酸的表达可以是组成型的，或者可以使用响应于各种类型的刺激以起始转录的诱导型启动子。在另一个实施例中，其中表达了本发明的杀昆虫蛋白的细胞是微生物，如病毒、细菌或真菌。在又另一个实施例中，病毒(如杆状病毒)在其基因组中含有本发明的核酸并且在感染了适当的真核细胞(适合于病毒复制以及该核酸的表达)之后表达了大量相应的杀昆虫蛋白。将由此产生的杀昆虫蛋白用作杀昆虫剂。可替代地，被工程化以包括所述核酸的杆状病毒被用来体内感染昆虫并通过该杀昆虫毒素的表达或通过病毒感染与该杀昆虫毒素的表达的组合而将其杀死。在一个另外的实施例中，本发明还涵盖了用于产生具有杀昆虫活性的多肽的方法，该方法包括在编码该多肽的核酸分子被表达的条件下培养宿主细胞。

[0168] 细菌细胞也是用于表达本发明的核酸的宿主。在一个实施例中，使用了能够在植物组织内生活并复制的非致病的共生细菌(所谓的内生菌)，或能够定居在叶际或根际的非致病的共生细菌(所谓的附生菌)。此类细菌包括以下属的细菌：农杆菌属、产碱杆菌属、固氮螺菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、沙雷氏菌属、链霉菌属以及黄单胞菌属。共生的真菌(如木霉属以及胶枝霉属)也是为了相同目的表达本发明的核酸的可能的宿主。

[0169] 这些基因操作技术对于不同的可供使用的宿主而言是特异性的并且在本领域中是已知的。例如，表达载体pKK223-3以及pKK223-2可以用来在大肠杆菌中(在转录或翻译融合中)在tac或trc启动子之后表达异源基因。为了表达编码多个ORF的操纵子，最简单的方法是在转录融合中将该操纵子插入载体(如pKK223-3)中，允许对该异源基因的同源核糖体结合位点进行利用。在革兰氏阳性物种(如芽孢杆菌属)中的过表达技术在本领域中也是已知的，并且可在本发明的上下文中使用(Quax等人,在：Industrial Microorganisms：Basicand Applied Molecular Genetics[工业微生物：基础和应用分子遗传学]中，编辑Baltz等人,American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿(1993))。用于过表达的替代性系统依赖于例如酵母载体，并包括毕赤酵母属、酵母属、以及克鲁维酵母属的使用(Sreekrishna,在:Industrial microorganisms:basic and applied molecular genetics[工业微生物：基础和应用分子遗传学]中,Baltz,Hegeman,和Skatrud编辑,American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿(1993)；Dequin和Barre,Biotechnology[生物科技]L2:173-177(1994)；van den Berg等人,Biotechnology[生物科技]8:135-139(1990))。

[0170] 某些杀昆虫蛋白已经在植物中表达，并且来自这样的植物的种子每年出售给农民用于控制各种昆虫有害生物。使这样的自我保护的杀昆虫产品经历各种监管机构的审查和注册，包括例如美国环保署(EPA)。

[0171] 膳食暴露是人类可以暴露于转基因植物中表达的杀昆虫蛋白的主要途径。哺乳动物急性经口毒性和蛋白质消化率是EPA对人体健康风险评估的终点。杀昆虫蛋白安全性的进一步科学证据在于，它们已显示使用模拟胃液在体外迅速降解。例如，用代表性Cry1、Cry2和Cry3蛋白进行的七次体外测定的结果确立这些蛋白质通常在30秒内迅速降解。这些结果支持更广泛的结论，即Cry蛋白的这些组的成员(共享显著的氨基酸序列同一性)在人类摄入后可能迅速降解。对植物中表达的每种转基因蛋白进行类似的测试。另一方面考虑是杀昆虫蛋白是否可能引起过敏反应。所证实的转基因杀昆虫蛋白在体外迅速降解应使这种发生的可能性降至最低。相比之下，食物过敏原通常保留在体外胃肠道模型中，而无过敏史的常见食物蛋白在模拟胃液中迅速降解(Metcalfe等人1996)。

[0172] 模拟胃液(SGF)测定在代表哺乳动物上消化道的严格控制的条件下测量测试蛋白的体外消化率。例如，在37℃下经一小时的时间段，将细菌产生的测试Cry蛋白(在0.5-5mg/ml的浓度下)以10单位的胃蛋白酶活性/μg测试蛋白的比率暴露于胃蛋白酶(来自猪胃粘膜，溶解于2mg/ml NaCl中，pH 1.2)。将样品在1、2、5、10、30和60分钟的时间点处取出，并通过加入预热的(95℃-2分钟)终止缓冲液(65％0.5M碳酸氢钠(pH 11)、35％Tricine加样缓冲液)立即淬灭，以使胃蛋白酶立即失活，并返回加热再持续5分钟。一旦测定完成，便通过SDS-PAGE在10％-20％Tris-Tricine凝胶(肽可见低至1kDa)上检查时间点样品和对照(只有测试蛋白，只有胃蛋白酶))以跟踪由胃蛋白酶进行的消化的动力学和水平。如果测试蛋白质本文蛋白质的显著多肽片段在例如5和/或10分钟时间点处可见，那么它不能被SGF测定消化或不能完全消化，并且可以定性评分为“否”或“不可消化的”。如果测试蛋白质或任何显著多肽片段在例如5分钟时间点处可见，那么它可以被SGF测定消化，并且可以定性评分为“是”或“可消化的”。

[0173] 本发明还涵盖多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100中任一个具有至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％、至少
60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列，并进一步包含引入的蛋白酶切割位点。引入的蛋白酶切割位点不是天然存在的，并且作为取代突变或作为插入或缺失突变被引入多肽序列中。引入的蛋白酶切割位点可以通过在包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100中任一个的多肽序列中插入至少一个亮氨酸残基而被引入。引入的突变可能使多肽不稳定，因此蛋白酶可以进入切割位点，先前由于蛋白质的紧密和/或稳定折叠或由于空间位阻，蛋白酶无法进入。引入的蛋白酶切割位点可以是多肽序列中引入的突变，该突变被蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶)识别，作为蛋白水解切割的位点。在一些实施例中，引入的蛋白酶切割位点可以改变现有的蛋白酶切割位点，以使其被不同的蛋白酶识别。针对胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和胃蛋白酶的蛋白酶切割位点在本领域中是熟知的。胰凝乳蛋白酶优先切割肽酰胺键，其中酰胺键的羧基侧(P1位置)是大的疏水性氨基酸(酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)。胰蛋白酶主要在氨基酸赖氨酸或精氨酸的羧基侧切割肽链，除非其中任何一个随后是脯氨酸。胃蛋白酶在切割疏水性氨基酸和优选芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)之间的肽键方面最有效。
这些切割位点是优先的切割位点，并不包括由胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶识别的所有切割位点，并且还不包括所有蛋白酶的所有切割位点。

[0174] 经工程化以包含引入的蛋白酶切割位点的多肽的实例是WoodsCRW变体C398L(SEQ ID NO:55)。该取代突变改变从“NKDCVS”至“NKDLVS”的基序。该引入的蛋白酶切割位点可以被胃蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶识别，并且不存在于野生型WoodsCRW蛋白序列中。在一些实施例中，引入的蛋白酶切割位点可以在突变位点处或其附近处，例如多肽的残基388-408。本领域众所周知的是，蛋白质中的半胱氨酸经常与其他半胱氨酸残基共价键合以形成二硫键。二硫键在一些蛋白质的折叠和稳定性中起重要作用。因此，与野生型WoodsCRW相比，WoodsCRW变体C398L可具有改变的或不太稳定的三级结构。在一些实施例中，引入的蛋白酶切割位点可位于引入的突变的远端。例如，引入的C398L突变可以使WoodsCRW多肽的三维折叠“松散”，从而使先前不可接近(因此不被切割)的蛋白酶切割位点可接近蛋白酶。这导致引入的突变引入在未经改变的多肽中不存在的蛋白酶切割位点。在一些实施例中，引入的突变和/或引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基1至490之间。在另外的实施例中，引入的突变和/或引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基100至490之间。在另外的实施例中，引入的突变和/或引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:
86至96中任一个的氨基酸残基190至490之间。在另外的实施例中，引入的突变和/或引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至
96中任一个的氨基酸残基190至310之间。在另外的实施例中，引入的突变和/或引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至210之间。在其他实施例中，引入的突变位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基300至490之间。
在另外的实施例中，引入的突变和/或引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基300至400之间。

[0175] 引入的蛋白酶切割位点以改变该位点处的蛋白酶特异性，例如，它可以将胰蛋白酶蛋白水解切割位点改变为胰凝乳蛋白酶蛋白水解切割位点。例如，WoodsCRW变体K406L(SEQ ID NO:45)可以将胰蛋白酶切割位点改变为胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶切割位点。在一些实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基1至490之间。在另外的实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基100至490之间。在另外的实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至490之间。在另外的实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:
37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至400之间。在另外的实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至310之间。在另外的实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至210之间。在其他实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基
300至490之间。在另外的实施例中，引入的蛋白酶切割位点位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:
37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基300至400之间。在一个另外的实施例中，改变蛋白酶特异性的引入的蛋白酶切割位点可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、或SEQ ID NO:86至96中任一个的相应氨基酸残基313至490之间。

[0176] 本发明还涵盖多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、或SEQ ID NO:86至96中任一个具有至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列，并进一步包含引入的突变，与包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽相比，该引入的突变在SGF测定中改善消化率。突变可以是取代突变、插入、或缺失。突变可以是至少一个亮氨酸残基的插入。

[0177] 本发明还包括改善多肽消化率的方法，该多肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、或SEQ ID NO:86至96中任一个具有至少45％同一性、至少50％同一性、至少55％、至少
60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％同一性、或100％同一性，该方法包括将至少一个突变引入多肽的氨基酸序列。在实施例中，该引入的突变改善了SGF测定中多肽的消化率。突变可以通过引入蛋白酶切割位点来改善消化率。在其他实施例中，突变可以通过改变该位点处的蛋白酶特异性来改善消化率。例如，这样使已经是胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶位点突变为胃蛋白酶位点。
在其他实施例中，突变可使蛋白质不稳定，使得蛋白酶可接近位点用于切割。蛋白酶可接近的位点可能远离引入的突变。在优选的实施例中，突变不改变或不显著改变多肽的活性或杀昆虫活性。在一些实施例中，具有引入的突变的多肽具有WoodsCRW的至少50％、至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的杀昆虫活性。
该方法在本说明书的实例中例证，其中，例如，在SGF测定中发现WoodsCRW变体C398L、C398Y、和D397-Leu-Leu-C398具有改善的消化率。它们还保留了非常高的杀昆虫活性。

[0178] 在以上所述的方法的一些实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基1至490之间。在另外的实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至
69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基100至490之间。在另外的实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至490之间。在另外的实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至400之间。在另外的实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至310之间。在另外的实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基190至210之间。在其他实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基300至490之间。在另外的实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至69、SEQ ID NO:
72、或SEQ ID NO:86至96中任一个的氨基酸残基300至400之间。在一个另外的实施例中，一个或多个引入的突变可以位于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:37至69中任一个的相应氨基酸残基313至490之间。在其他实施例中，可以将一个或多个突变引入SEQ ID NO:1的氨基酸序列
313至490之间。

[0179] 在其他实施例中，可以将突变引入到SEQ ID NO:1的C398处或其近端。在另外的实施例中，突变可以是C398L、C398I、C398V、C398G、C398A、C398F、C398M、C398S、C398W、或C398Y。在其他实施例中，突变可以是氨基酸残基的插入或缺失，例如像至少一个亮氨酸残基的插入。该残基或这些残基可以邻近SEQ ID NO:1的C398或与其相邻，例如像WoodsCRW变体D397-Leu-C398、D397-Leu-Leu-C398、C398-Leu-V399、C398-Leu-Leu-V399、或D397-Leu-C398-L，在SGF测定中这些变体均被发现具有改善的消化率。它们还保留了非常高的杀昆虫活性(参见实例)。亮氨酸残基还可以插入C398的近端，其中“近端”可以是距离C398至少1、至少2、至少4、至少6、至少8、至少10、或至少20个氨基酸。

[0180] 本发明的杀昆虫蛋白当在生物测定中进行针对昆虫有害生物的测验时具有昆虫控制活性。在一个实施例中，本发明的杀昆虫蛋白针对鞘翅目昆虫和/或鳞翅目昆虫具有活性。本领域技术人员将理解，与本发明的其他蛋白质相比，本发明的蛋白质可具有不同范围的杀昆虫活性。在一些实施例中，与WoodsCRW的其他变体相比，WoodsCRW突变变体可以对更广泛的昆虫有害生物(例如更多的鞘翅目或鳞翅目物种)具有杀昆虫活性。在其他实施例中，WoodsCRW的变体可以对鳞翅目物种而不对鞘翅目物种具有杀昆虫活性。在一些实施例中，与未经修饰的WoodsCRW(SEQ ID NO:1)相比，WoodsCRW的变体可以对鞘翅目或鳞翅目物种的更广范围的杀昆虫活性具有活性。

[0181] 鳞翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何被分类为鳞翅目的昆虫，包括在轭翅亚目、有喙亚目和异石蛾亚目及其任何组合内的那些昆虫物种。示例性鳞翅目昆虫包括但不限于：玉米螟属物种，如欧洲玉米螟(O.nubilalis，European corn borer)；菜蛾属物种，如小菜蛾(P.xylostella，diamondback moth)；灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)(秋夜蛾(fall armyworm))、黄条粘虫(S.ornithogalli，yellowstriped armyworm)、西部黄条粘虫(S.praefica，western yellowstriped armyworm)、南部粘虫(S.eridania，southern armyworm)和甜菜夜蛾(S.exigua，beet armyworm)；地老虎属物种，如小地老虎(A.ipsilon)(黑色地老虎)、普通地老虎(A.segetum，common cutworm)、泥背地老虎(A.gladiaria，claybacked cutworm)和西部灰地老虎(A.orthogonia，pale western cutworm)；切根虫属物种(Striacosta spp.)，如豆白缘切根虫(S.albicosta)(西部豆切根虫(western bean cutworm))；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)，如玉米穗虫(H.zea)(玉米穗蛾(corn earworm))、茶色铃夜蛾(H.punctigera)(原生夜蛾(native budworm))、海灰翅夜蛾(S.littoralis)(埃及棉树叶虫(Egyptian cotton leafworm))和棉铃虫(H.armigera，cotton bollworm)；实夜蛾属物种(Heliothis spp.)，如烟芽夜蛾(H.virescens)(烟夜蛾(tobacco budworm))；蔗螟属物种(Diatraea spp.)，如西南玉米螟(D.grandiosella，southwestern corn borer)和小蔗螟(D.saccharalis)(甘蔗蛀虫))；粉纹夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)，如粉纹夜蛾(T.ni，cabbage  looper)；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia  spp.)，如地中海玉米螟(S.nonagroides，Mediterranean corn borer)；红铃虫属物种(Pectinophora spp.)，如棉红铃虫(P.gossypiella，pink bollworm)；纹卷蛾属物种(Cochylis spp.)，如向日葵细卷叶蛾(C.hospes，banded sunflower moth)；天蛾属物种(Manduca spp.)，如烟草天蛾(M.sexta，tobacco hornworm)和番茄天蛾(M.quinquemaculata，tomato hornworm)；玉米苗斑螟属物种(Elasmopalpus spp.)，如南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；尺夜蛾属物种(Pseudoplusia spp.)，如大豆尺蠖
(P.includens)(大豆夜蛾)；干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)，如黎豆夜蛾
(A.gemmatalis)(绒毛豆毛虫(velvetbean caterpillar))；绿夜蛾属物种(Plathypena spp)，如苜蓿绿夜蛾(P.scabra，green cloverworm)；马醉木属物种(Pieris spp.)，如大菜粉蝶(P.brassicae)(纹白蝶(cabbage butterfly))；夜蛾属物种(Papaipema spp.)，如蛀茎夜蛾(P.nebris，stalk borer)；黏虫属物种(Pseudaletia spp.)，如一星黏虫(P.unipuncta)(普通黏虫)；疆夜蛾属物种(Peridroma spp.)，如杂色地老虎(P.saucia，variegated  cutworm)；茄茎麦蛾属物种(Keiferia  spp.)，如番茄蠹蛾
(K.lycopersicella，tomato pinworm)；菜粉蝶属物种(Artogeia spp.)，如菜粉蝶(A.rapae，imported cabbageworm)；茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)，如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm)；透翅缓夜蛾属物种(Crymodes spp.)，如
C.devastator，glassy cutworm；脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)，如脏切夜蛾(F.ducens，dingy cutworm)；以及前述的任何组合。在这个实施例的一个方面中，本发明的杀昆虫蛋白针对黑色地老虎、甘蔗蛀虫和/或西南玉米螟具有活性。

[0182] 鞘翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何鞘翅目昆虫，包括原鞘亚目、粘食亚目、肉食亚目和多食亚目、及其任何组合中的那些。

[0183] 在这个实施例的一个方面中，本发明的杀昆虫蛋白针对根萤叶甲属物种具有活性。根萤叶甲属是鞘翅目的一种甲虫属，通常被称为“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”。示例性根萤叶甲属物种包括但不限于：巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle))、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫(western spotted  cucumber beetle))、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲(3-spotted leaf beetle))、南美叶甲(D.speciosa)(菊花甲虫(chrysanthemum beetle))、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curvipustulata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲
(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusa)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲
(D.trifasciata)以及微绿根萤叶甲(D.viridula)；及其任何组合。

[0184] 根据本发明的鞘翅目昆虫有害生物的其他非限制性实例包括叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)，如马铃薯叶甲(L.decemlineata)(科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle))；叶甲虫属物种(Chrysomela spp.)，如黑杨叶甲虫(C.scripta，cottonwood leaf beetle)；咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)，如咖啡果小蠹
(H.hampei，coffee berry borer)；米象属物种(Sitophilus spp.)，如玉米象(S.zeamais，maize weevil)；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)，如烟草跳甲(E.hirtipennis，tobacco flea beetle)和马铃薯跳甲(E.cucumeris，potato flea beetle)：条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如十字花科植物跳甲(P.cruciferae，crucifer flea beetle)和西方黑色跳甲(P.pusilla，western black flea beetle)；花象属物种(Anthonomus spp.)，如胡椒花象(A.eugenii，pepper weevil)；金针虫属物种(Hemicrepidus spp.)，如金针虫(H.memnonius，wireworms)；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，如金针虫(M.communis，wireworm)；Ceutorhychus属物种(Ceutorhychus spp.)，如甘蓝荚象甲(C.assimilis，cabbage seedpod weevil)；条跳甲属物种，如十字花科植物跳甲(P.cruciferae，crucifer flea beetle)；Aeolus属物种(Aeolus spp.)，如A.mellillus(金针虫(wireworm))；Aeolus属物种，如小麦铁线虫(A.mancus，wheat wireworm)；Horistonotus属物种(Horistonotus spp.)，如砂线虫(H.uhlerii，sand wireworm)；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)，如玉米谷象(S.maidis，maize billbug)、梯牧草谷象(S.zeae，timothy billbug)、牧草长喙象(S.parvulus，bluegrass billbug)和南方玉米谷(S.callosus，southern corn billbug)；鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)(蛴螬(white grub))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)，如玉米跳甲(C.pulicaria，corn flea beetle)；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)，如日本甲虫(P.japonica，Japanese beetle)；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)，如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis)(墨西哥豆甲虫(Mexican bean beetle))；萤叶甲属物种(Cerotoma spp.)，如豆叶甲(C.trifurcate，Bean leaf beetle)；
豆芫菁属物种(Epicauta spp.)，如边缘豆芫菁(E.pestifera)和芫菁(E.lemniscata，Blister beetles)；以及前述的任何组合。

[0185] 本发明的杀昆虫蛋白还可以针对半翅类、双翅类、草盲蝽属物种和/或其他刺吸式昆虫(例如直翅目或缨翅目的刺吸式昆虫)具有活性。双翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何双翅目昆虫，包括但不限于斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)，如三叶斑潜蝇(L.trifolii)(潜叶虫(leafminer))和美洲斑潜蝇(L.sativae，vegetable leafminer)；Scrobipalpula属物种，如番茄潜叶虫(S.absoluta，tomato leafminer)；地种蝇属物种(Delia spp.)，如玉米种蝇(D.platura)(种蝇(seedcorn maggot)、甘蓝种蝇蛆(D.brassicae，cabbage maggot)和甘蓝根花蝇(D.radicum，cabbage root fly)；锈蝇属物种(Psilia spp.)，如胡萝卜锈蝇(P.rosae，carrot rust fly)；根斑蝇属物种(Tetanops spp.)，如甜菜根蛆(T.myopaeformis，sugarbeet root maggot)；以及前述的任何组合。

[0186] 直翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何直翅目昆虫，包括但不限于黑蝗属物种(Melanoplus spp.)，如异黑蝗(M.differentialis，Differential grasshopper)、赤胫黑蝗(M.femurrubrum)(红胫蝗虫(Redlegged grasshopper))、双带黑蝗(M.bivittatus，Twostriped grasshopper))；及其任何组合。

[0187] 缨翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何缨翅目昆虫，包括但不限于花蓟马属物种(Frankliniella spp.)，如西花蓟马(F.occidentalis)(西方花蓟马(western flower thrips))和烟褐花蓟马(F.fusca)(烟草蓟马(tobacco thrips))；和蓟马属物种(Thrips spp.)，如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马(onion thrips))、瓜蓟马(T.palmi，melon thrips)；以及前述的任何组合。

[0188] 本发明的杀昆虫蛋白还可以针对线虫具有活性。如本文使用的术语“线虫”涵盖目前已知的或之后鉴定的任何被分类为动物界线虫门的生物，包括但不限于有腺纲(包括例如：嘴刺目、等咽目、单齿目、矛线目、毛首目、索虫目、姆斯帕目、薄咽目、色矛目、带线虫目、链环目和单宫目)和/或胞管肾纲(包括例如：小杆目、圆线虫目、蛔虫目、旋尾目、驼形目、双胃目、垫刃目和滑刃目)中的线虫。

[0189] 线虫包括但不限于寄生线虫，如根结线虫、胞囊线虫和/或腐线虫。根据本发明的线虫的示例性属包括但不限于：根结线虫属(根结线虫)、异皮线虫属(胞囊线虫)、球异皮线虫属(Globodera)(胞囊线虫)、穿孔线虫属(穿孔线虫)、肾状线虫属(肾形肾状线虫)、短体线虫属(腐线虫)、滑刃线虫属(叶面线虫)、螺旋线虫属(螺旋线虫)、纽带线虫属(矛线虫)、拟毛刺属(短粗根线虫)、长针线虫属、珍珠线虫属(假根结线虫)、亚粒线虫属(Subanguina)、刺线虫属(刺线虫)、小环线虫属(小环线虫)、环线虫属(环线虫)、茎线虫属(茎线虫)、锥线虫属(锥线虫)、半轮线虫属(半轮线虫)、鞘线虫属(鞘线虫)、潜根线虫属(潜根线虫)、根结线虫属(Hypsoperine)、大茎线虫属(大茎线虫)、Melinius属、刻点胞囊属(Punctodera)、五沟线虫属(Quinisulcius)、盾线虫属(盾线虫)、剑线虫属(匕首线虫)、矮化线虫属(矮化线虫)、穿刺线虫属(穿刺线虫)、伞滑刃属(蛔虫)、及其任何组合。

[0190] 根据本发明的示例性植物寄生线虫包括但不限 于：细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus，pine wood nematode)、龙胆轮线虫属(Criconemoides ornata)、马玲薯腐烂线虫(Ditylenchusdestructor，potato rot nematode)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchusdipsaci，stem and bulb nematode)、马铃薯胞囊线虫(Globodera pallida，potato cyst nematode)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(金黄线虫(golden nematode))、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii，sugar beet cyst nematode)；玉米胞囊线虫(Heterodera zeae，corn cyst nematode)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae，cereal cyst nematode)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、Heterodera trifolii(三叶异皮线虫)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、Hoplolaimus magnistylus、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、北方根节线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、异盘中环线虫(Mesocriconema xenoplax)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、Naccobus dorsalis、Paratrichodorus christiei、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、Pratylenchus hexincisus、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、Pratylenchus projectus、斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)、Pratylenchus tenuicaudatus、Pratylenchus thornei、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、Punctodera chaccoensis、Quinisulcius acutus、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis)、顺逆矮化线虫(Tylenchorhynchus dubius)、柑桔半穿刺线虫(Tylenchulus 
semipenetrans)、美洲剑线虫(Siphinema americanum)、X.Mediterraneum、以及前述的任何组合。

[0191] 在另一个实施例中，本发明涵盖了产生针对昆虫具有活性的杀昆虫蛋白的方法，该方法包括：(a)获得包含基因的宿主细胞，该基因自身包含本发明的表达盒和/或核酸分子；和(b)以表达针对昆虫具有活性的杀昆虫蛋白的方式使该转基因宿主细胞生长。

[0192] 在又另外的实施例中，本发明涵盖了控制昆虫的方法，该方法包括将本发明的控昆虫有效量的杀昆虫蛋白递送至昆虫。

[0193] 在一个实施例中，本发明的杀昆虫蛋白中的至少一种在较高级的生物(如植物)中表达。在这种情况下，表达控昆虫有效量的杀昆虫蛋白的转基因植物保护其本身免受昆虫有害生物。在昆虫开始以这种转基因植物为食时，它也摄取了这种已表达的杀昆虫蛋白。这将阻止昆虫进一步咬食植物组织和/或甚至可以伤害或杀死昆虫。将本发明的核酸插入到表达盒中，然后该核酸可被稳定地整合到该植物的基因组中。在另一个实施例中，该核酸包括在非致病的自我复制的病毒中。根据本发明所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于：玉米、小麦、燕麦、草坪草、牧场草、亚麻、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、小萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、小南瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、大麻、绿皮西葫芦、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥属物种，以及木本植物，如针叶树以及落叶树。

[0194] 在另一个实施例中，本发明涵盖了产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分的方法，该方法包括：(a)引入包含本发明的表达盒的核酸分子；和(b)使该植物部分生长成植物，该植物表达该表达盒的异源核酸分子，并且该植物与未用包含该表达盒的核酸分子转化的对照植物或植物部分相比，具有增强的昆虫抗性。在一个优选的实施例中，表达盒可以编码包含以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少
91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性或相似。在一个优选的实施例中，表达盒可以编码包含以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少60％同一性。“增强的”昆虫抗性可测量为增加的杀昆虫活性。增强的昆虫抗性与对照植物相比可高出0％、至少1％、至少2％、至少3％、至少
4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、或至少
1000％的杀昆虫活性。可通过植物转化、植物组织培养或育种的方法产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。可通过有性或无性繁殖的方法来产生植物或植物部分。可以使用任何合适的对照植物或植物部分，例如在相同环境下生长的、具有相同或相似遗传背景的植物。在实施例中，对照植物或植物部分与所描述的植物具有相同的遗传背景并在相同的环境中生长，但其不包含本发明的分子，而所描述的植物包含本发明的分子。

[0195] 在另一个实施例中，本发明涵盖了使植物或植物部分的昆虫抗性与对照植物或植物部分相比增强的方法，该方法包括在该植物或植物部分中表达本发明的核酸分子或表达盒，其中该表达盒的异源核酸的表达导致植物或植物部分与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性。在实施例中，表达盒或核酸分子包含可操作地连接至包含核苷酸序列的异源核酸分子的启动子，该核苷酸序列包含：(a)SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99中任一个的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99中任一个的核苷酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的核苷酸序列；
(c)编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至
72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100，并且具有昆虫控制活性；(d)编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性；或(e)与上述(a)至(d)中的任一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。可将核酸分子或表达盒引入植物。
在一些实施例中，可将核酸分子或表达盒引入植物部分中，并且可从该植物部分产生包含核酸分子或表达盒的植物。

[0196] 在另一个实施例中，本发明涵盖了产生与对照植物相比具有增强的昆虫抗性的植物的方法，该方法包括在植物部分中检测包含本发明的核酸分子或表达盒的异源核酸，以及从该植物部分产生植物，从而产生与对照植物相比具有增强的昆虫抗性的植物。在一个另外的实施例中，本发明涵盖了鉴定与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分的方法，该方法包括在该植物或植物部分中检测本发明的核酸分子或表达盒，从而鉴定具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。在一个另外的实施例中，将该表达盒或其诊断片段在来自该植物或植物部分的核酸样品中的扩增产物中进行检测。诊断片段可以是至少10个连续核苷酸长的核酸分子，其对于本发明的表达盒是独特的。

[0197] 在又另一个实施例中，本发明涵盖了产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物的方法，该方法包括将第一亲本植物与第二亲本植物进行杂交，其中至少该第一亲本植物在其基因组中包含含有本发明的核酸分子或表达盒的异源核酸；以及产生子代后代，其中该子代后代包含至少一种在其基因组中具有所述异源核酸并且与对照植物相比展现出增强的昆虫抗性的植物。

[0198] 在优选的实施例中，本发明的方法赋予植物或植物部分针对鞘翅目和/或鳞翅目昆虫有害生物的增强的昆虫抗性。在实例中证明了对鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物两者的昆虫控制。在另外的实施例中，本发明的方法赋予植物或植物部分针对根萤叶甲属物种(包括玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种、墨西哥玉米根萤叶甲和/或南美叶甲(Diabrotica speciosa))和/或相关物种的增强的昆虫抗性。

[0199] 在优选的实施例中，本发明的方法赋予单子叶植物增强的昆虫抗性。

[0200] 本发明进一步涵盖了转基因植物，该转基因植物包含本发明的异源核酸分子或表达盒，该异源核酸分子或表达盒在被转录或被翻译时赋予增强的昆虫抗性。在优选的实施例中，异源核酸分子包含与SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99中任一个具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列。在一个另外的实施例中，转基因植物包含异源核酸分子，该异源核酸分子包含与SEQ ID NO:2至36、SEQ ID NO:73至83、或SEQ ID NO:99具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列。在实施例中，转基因植物是双子叶植物。在优选的实施例中，转基因植物是单子叶植物。在另外的实施例中，转基因植物是苜蓿、小茴香、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西蓝花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、罗马甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽、柑橘、克莱门氏小柑橘、咖啡豆、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苦苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、葡萄柚、白兰瓜、豆薯、奇异果、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、秋葵、洋葱、橙子、观赏植物、木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、车前草、李、石榴、杨树、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、小萝卜、覆盆子、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、小南瓜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、枫香、柑桔、茶、烟草、番茄、草皮、藤、西瓜、洋芋或绿皮西葫芦。在优选的实施例中，转基因植物是粟、柳枝稷、玉蜀黍、高粱、小麦、燕麦、草坪草、牧场草、亚麻、稻、甘蔗、油菜或大麦。

[0201] 在又另一个实施例中，本发明的转基因植物包含异源核酸分子，该异源核酸分子包含启动子序列。在又另一个实施例中，本发明的转基因植物可包含异源核酸分子，该异源核酸分子编码至少一种另外的所希望的性状。另外的性状可以在与本发明的分子相同的异源核酸分子上编码，或者可以在第二异源核酸分子上编码。另外的所希望的性状可赋予对第二昆虫有害生物的昆虫抗性、对相同昆虫有害生物的昆虫抗性、非生物胁迫耐受性、雄性不育、除草剂抗性、细菌疾病抗性、真菌疾病抗性、病毒疾病抗性、线虫抗性、改性脂肪酸代谢、改性碳水化合物代谢、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力。另外的所希望的性状还可诱导商业上有价值的酶或代谢物在植物内产生。

[0202] 在实施例中，所希望的另外的性状是第二杀有害生物剂。第二杀有害生物剂可对任何植物有害生物(包括昆虫、线虫、真菌、病毒或细菌)具有活性。昆虫植物有害生物的实例包括但不限于：褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)(例如褐飞虱(N.lugens)(褐色飞虱(brown planthopper)))；灰飞虱属物种(Laodelphax spp.)(例如灰飞虱(L.striatellus)(褐色小飞虱(small brown planthopper)))；黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)(例如二点黑尾叶蝉(N.virescens)或黑尾叶蝉(N.cincticeps)(青叶蝉(green leafhopper))，或二条黑尾叶蝉(N.nigropictus)(稻叶蝉(rice leafhopper)))；白背飞虱属物种(Sogatella spp.)(例如白背飞虱(S.furcifera，white-backed planthopper))；土长蝽属物种(Blissus spp.)(例如麦长蝽(B.leucopterus leucopterus)(麦小蝽(chinch bug)))；黑蝽属物种(Scotinophora spp.)(例如稻黑蝽(S.vermidulate，rice blackbug))；拟缘蝽属物种(Acrosternum spp.)(例如拟绿蝽(A.hilare)(绿椿象(green stink bug)))；稻弄蝶属物种(Parnara spp.)(例如直纹稻弄蝶(P.guttata，rice skipper))；禾草螟属物种(Chilo spp.)(例如二化螟(C.suppressalis)(水稻二化螟(rice striped stem borer))、台湾稻螟(C.auricilius)(金线二化螟(gold-fringed stem borer))、或稻多丽螟(C.polychrysus)(黑头茎螟(dark-headed stem borer)))；稻螟属物种(Chilotraea spp.)(例如稻多丽螟(C.polychrysa)(稻茎螟(rice stalk borer)))；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)(例如大螟(S.inferens)(粉红色稻螟(pink rice 
borer)))；蛀禾螟属物种(Tryporyza spp.)(例如稻白螟(T.innotata)(白稻螟(white rice borer))、或三化螟(T.incertulas)(黄稻螟(yellow rice borer)))；稻纵卷叶螟属物种(Cnaphalocrocis spp.)(例如稻纵卷叶螟(C.medinalis，rice leafroller))；潜蝇属物种(Agromyza spp.)(例如日本稻潜蝇(A.oryzae)(潜叶虫(leafminer)、或美洲黍潜叶蝇(A.parvicornis)(玉米污点斑潜蝇(corn blot leafminer)))；蔗螟属物种(例如小蔗螟(甘蔗蛀虫)、或西南玉米螟(D.grandiosella，southwestern corn borer)；Narnaga属物种(例如稻螟蛉(N.aenescens，green rice caterpillar))；黄夜蛾属物种(Xanthodes spp.)(例如犁纹黄夜蛾(X.transversa，green caterpillar))；灰翅夜蛾属物种(例如草地贪夜蛾(S.frugiperda)(秋夜蛾(fall armyworm))、甜菜夜蛾(S.exigua，beet armyworm)、海灰翅夜蛾(S.littoralis，climbing cutworm)或西部黄条粘虫(S.praefica，western yellowstriped armyworm))；光腹夜蛾属物种(Mythimnaspp.)(例如粘虫(Mythmna seperata，Pseudaletia seperata))；铃夜蛾属物种(例如玉米穗虫(玉米穗蛾))；Colaspis属物种(例如葡萄肖叶甲(C.brunnea，grape colaspis))；稻水象属物种(Lissorhoptrus spp.)(例如稻水象虫(L.oryzophilus)(稻水象鼻虫(rice water weevil))；稻象甲属物种(Echinocnemus spp.)(例如稻鳞象虫(E.squamos)(稻象鼻虫(rice plant weevil)))；稻铁甲属物种(Diclodispa spp.)(例如水稻铁甲(D.armigera，rice hispa))；负泥虫属物种(Oulema spp.)(例如水稻负泥虫(O.oryzae(稻叶泥虫(leaf beetle)))；米象属物种(Sitophilus spp.)(例如米象(S.oryzae，rice weevil))；稻瘿蚊属物种(Pachydiplosis spp.)(例如稻瘿蚊(P.oryzae，rice gall midge))；毛眼水蝇属物种(Hydrellia spp.)(例如麦叶毛眼水蝇(H.griseola)(小米潜叶虫(small rice leafminer))、或稻茎毛眼水蝇(H.sasakii，rice stem maggot))；黄潜蝇属物种(Chlorops spp.)(例如秆蝇(C.oryzae，stem maggot))；根萤叶甲属物种(例如玉米根萤叶(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)；黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫)；玉米螟属物种(例如欧洲玉米螟(O.nubilalis，European corn borer)；地老虎属物种(例如小地老虎(黑色地老虎))；玉米苗斑螟属物种(Elasmopalpus spp.)(例如，南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；梳爪叩头虫属物种(Melanpotus spp.)(金针虫(wireworm))；方头甲属物种(Cyclocephalaspp.)(例如北方圆头犀金龟(C.borealis，northern masked chafer)或南方圆头犀金龟(C.immaculata，southern masked chafer))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)(例如日本甲虫(P.japonica，Japanese beetle))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)(例如玉米跳甲(C.pulicaria，corn flea beetle))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)(例如玉米谷象(S.maidis，maize billbug))；缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)(例如玉米蚜(R.maidis)(玉米叶蚜虫(corn leaf aphid))；圆尾蚜属物种(Anuraphis spp.)(例如玉米根蚜(A.maidiradicis，corn root aphid))；黑蝗属物种(Melanoplus spp.)(例如赤胫黑蝗(M.femurrubrum)(红胫蝗虫(redlegged 
grasshopper))、异黑蝗(M.differentialis，differential grasshopper)或血黑蝗(M.sanguinipes)(迁徙蝗虫(migratory grasshopper))；种蝇属物种(Hylemya spp.)(例如玉米种蝇(H.platura，seedcorn maggot))；呆蓟马属物种(Anaphothrips spp.)(例如草蓟马(A.obscrurus，grass thrips))；水蚁属物种(Solenopsis spp.)(例如窃叶蚁(S.milesta，thief ant))；四爪螨属物种(Tetranychus spp.)(例如二斑叶螨(T.urticae，twospotted spider mite)、朱砂叶螨(T.cinnabarinus，carmine spider mite)；铃夜蛾属物种(例如玉米穗虫(棉螟蛉(cotton bollworm))、或棉铃虫(H.armigera)(美国螟蛉虫(American  bollworm)))；红铃虫属物种(Pectinophora spp.)(例如棉红铃虫
(P.gossypiella，pink bollworm))；钻夜蛾属物种(Earias spp.)(例如翠纹钻夜蛾(E.vittella，spotted bollworm))；实夜蛾属物种(Heliothis spp.)(例如烟芽夜蛾(H.virescens)(烟夜蛾(tobacco budworm)))；花象属物种(例如棉铃象甲(A.grandis)(棉铃象虫(boll weevil)))；Pseudatomoscelis属物种(例如棉跳盲蝽(P.seriatus，cotton fleahopper))；粉虱属物种(Trialeurodes spp.)(例如纹翅粉虱(T.abutiloneus)(结翅粉虱(banded-winged whitefly))、温室白粉虱(T.vaporariorum)(温室粉虱(greenhouse whitefly)))；小粉虱属物种(Bemisia spp.)(例如银叶粉虱(B.argentifolii)(银叶白粉虱(silverleaf whitefly))；蚜虫属物种(Aphis spp.)(例如棉蚜(A.gossypii)(棉花蚜虫(cotton aphid))；草盲蝽属物种(Lygus spp.)(例如牧草盲蝽(L.lineolaris)(无泽盲蝽(tarnished plant bug))或豆荚草盲蝽(L.hesperus)(西方无泽盲蝽(western tarnished plant bug)))；美洲蝽属物种(Euschistus spp.)(例如斑点美洲蝽(E.conspersus)(具散点的椿象(consperse stink bug)))；Chlorochroa属物种(例如佐井氏蝽(C.sayi)(佐井氏椿象(Say stinkbug)))；绿蝽属物种(Nezara spp.)(例如稻绿蝽(N.viridula)(南方绿椿象(southern green stinkbug)))；蓟马属物种(例如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马(onion thrips)))；花蓟马属物种(Frankliniella spp.)(例如烟褐花蓟马(F.fusca)(烟草蓟马(tobacco thrips))或西花蓟马(F.occidentalis)(西方花蓟马(western flower 
thrips))；叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)(例如马铃薯叶甲(L.decemlineata)(科罗拉多马铃薯甲虫(Coloradopotato beetle))、伪马铃薯叶甲(L.juncta)(伪马铃薯甲虫(false potato beetle))或胡颓子叶茄叶甲(L.texana)(德克萨斯伪马铃薯甲虫(Texan false potato beetle)))；Lema属物种(例如三线马铃薯甲虫(L.trilineata，three-lined potato beetle))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)(例如马铃薯跳甲(E.cucumeris，potato flea beetle)，烟草跳甲(E.hirtipennis)(跳甲(flea beetle))，或块茎跳甲(E.tuberis，tuber flea beetle))：豆芫菁属物种(例如横带芫青(E.vittata，striped blister beetle))；猿叶甲属物种(Phaedon spp.)(例如辣根猿叶甲(P.cochleariae)(芥菜叶甲虫(mustard leaf beetle)))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)(例如墨西哥豆瓢虫(E.varivetis)(墨西哥豆甲虫(mexican bean beetle)))；蟋蟀属物种(Acheta spp.)(例如家蟋蟀(A.domesticus)(室内蟋蟀(house cricket)))；叶蝉属物种(Empoasca spp.)(例如马铃薯微叶蝉(E.fabae)(马铃薯微叶蝉(potato leafhopper)))；瘤蚜属物种(Myzus spp.)(例如桃蚜(M.persicae)(绿桃蚜(green peach aphid)))；木虱属物种(Paratrioza spp.)(例如考氏木虱(P.cockerelli)(木虱(psyllid)))；宽胸叩头虫属物种(Conoderus spp.)(例如南方马铃薯金针虫(C.falli，southern potato wireworm)或马铃薯金针虫(C.vespertinus，tobacco wireworm))；茄麦蛾属物种(例如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm))；长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)(例如马铃薯长管蚜
(M.euphorbiae)(马铃薯蚜(potato aphid)))；Thyanta 属物种(例如T.Pallidovirens(红肩椿象(redshouldered stinkbug)))；茄麦蛾属物种(例如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm))；棉铃虫属物种(例如玉米穗虫(柿铃虫(tomato fruitworm)))；茄茎麦蛾属物种(Keiferia spp.)(例如番茄蠹蛾(lycopersicella，tomato pinworm))；
Limonius属物种(Limonius spp.)(金针虫(wireworms))；天蛾属物种(Manduca spp.)，例如烟草天蛾(M.sexta，tobacco hornworm)和番茄天蛾(M.quinquemaculata，tomato hornworm)；斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)(例如美洲斑潜蝇(L.sativae)、三叶斑潜蝇(L.trifolli)或南美斑潜蝇(L.huidobrensis)(潜叶虫))；果蝇属物种(Drosophilla spp.)(例如黑腹果蝇(Drosophila  melanogaster)、D.yakuba、拟暗果蝇
(D.Pseudoobscura)或拟果蝇(D.simulans))；林大步甲属物种(Carabus spp.)(例如粒步甲(C.granulatus))；摇蚊属物种(Chironomus spp.)(例如破伤风摇蚊(C.tentanus))；栉头蚤属物种(猫蚤(C.felis，cat flea))；Diaprepes 属物种(例如根象甲(D.abbreviatus，root weevil))；Ips属物种(例如I.pini(pine engraver))；拟谷盗属物种(Tribolium spp.)(例如赤拟谷盗(T.innotata，red floor beetle))；舌蝇属物种(Glossina spp.)(例如采采蝇(G.Morsitans，tsetse fly))；疟蚊属物种(Anopheles spp.)(例如冈比亚疟蚊(A.gambiae)(疟蚊(malaria mosquito)))；棉铃虫属物种(例如棉铃虫(H.armigera)(非洲螟蛉虫(African Bollworm))；无网管蚜属物种(Acyrthosiphon spp.)(例如豌豆蚜(A.pisum，pea aphid))；蚜属物种(Apis spp.)(例如意大利蜂(A.melifera)(蜜蜂))；叶蝉属物种(Homalodisca spp.)(例如琉璃叶蝉(H.coagulate)(玻璃翅叶蝉(glassy-winged sharpshooter)))；伊蚊属物种(Aedes spp.)(例如埃及伊蚊(Ae.aegypti)(黄热病伊蚊(yellow fever mosquito)))；蚕蛾属物种(Bombyx spp.)(例如家蚕(B.mori)(桑蚕(silkworm)))；飞蝗属物种(Locusta spp.)(例如非洲飞蝗(L.migratoria)(飞蝗
(migratory locust)))；牛蜱属物种(Boophilus spp.)(例如微小牛蜱(B.microplus)(牛蜱(cattle tick)))；Acanthoscurria属物种(例如A.Gomesiana(红发巧克力色食鸟蛛(red-haired chololate bird eater)))；折翅属物种(Diploptera spp.)(例如太平洋折翅蠊(D.punctata，pacific beetle cockroach))；袖蝶属物种(Heliconius spp.)(例如H.erato(红西番莲蝴(red passion flower butterfly))或红带袖蝶(H.melpomene)(邮差蝴蝶(postman butterfly)))；象虫属物种(Curculio spp.)(例如栎实象(C.glandium，acorn weevil))；菜蛾属物种(例如小菜蛾(P.xylostella，diamondback moth))；花蜱属物种(Amblyomma spp.)(例如牛蜱(A.variegatum，cattle tick))；Anteraea属物种(例如天蚕(A.Yamamai)(柞蚕(silkmoth)))；和阿蚊属物种(Armigeres spp.)(例如骚扰阿蚊(A.subalbatus))。

[0203] 本发明的杀昆虫蛋白可以与其他杀有害生物剂(例如Bt Cry蛋白)组合使用以增加有害生物的靶范围。此外，本发明的杀昆虫蛋白与杀昆虫剂(其具有不同的作用方式或靶向昆虫肠中不同的受体)相组合进行使用对于预防和/或管理昆虫抗性而言具有特定的功用。

[0204] 第二杀有害生物剂可以是源自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫蛋白。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白可以是许多杀昆虫蛋白中的任一种，包括但不限于：Cry1蛋白、Cry3蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry11蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry34蛋白连同Cry35蛋白、二元杀昆虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、二元杀昆虫蛋白PS149B1、VIP(营养期杀昆虫蛋白，披露于美国专利5849870和5877012中，通过引用并入本文)、TIC900或相关蛋白、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、修饰的Cry3A蛋白、或由前述杀昆虫蛋白中的任一个制成的杂合蛋白或嵌合体。在其他实施例中，苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白选自下组，该组由以下组成：Cry3Bb1、Cry34Ab1连同Cry35Ab1一起、mCry3A(美国专利号7276583，通过引用并入本文)、eCry3.1Ab(美国专利号8309516，通过引用并入本文)、和Vip3A蛋白(包括Vip3Aa(美国专利号6137033，通过引用并入本文))。

[0205] 在其他实施例中，本发明的转基因植物可包含第二杀有害生物剂(其可源自除苏云金芽孢杆菌以外的来源)。第二杀昆虫剂可以是选自下组的药剂，该组由以下组成：α淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、几丁质酶、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属物种(如嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)或伯氏致病杆菌(X.bovienii))杀昆虫蛋白、发光杆菌属物种(如发光杆菌(P.luminescens)或P.asymobiotica)杀昆虫蛋白、短芽胞杆菌属物种(如侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporous))杀昆虫蛋白、赖氨酸芽胞杆菌属物种(Lysinibacillus spp.)(如球形赖氨酸芽孢杆菌(L.Sphearicus))杀昆虫蛋白、色杆菌属物种(如C.subtsugae或C.piscinae)杀昆虫蛋白、耶尔森菌属物种(如耶尔森噬虫霉(Y.entomophaga))杀昆虫蛋白、类芽孢杆菌属物种(如丙型类芽孢杆菌属(P.propylaea))杀昆虫蛋白、梭菌属物种(如双酶梭菌(C.bifermentans))杀昆虫蛋白、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)(如荧光假单胞菌(P.fluorescens)杀昆虫蛋白和木质素。在其他实施例中，所述第二试剂可以是至少一种衍生自杀昆虫毒素复合物(Tc)(所述复合物来自发光杆菌属、异短杆菌属(Xenorhabus)、沙雷氏菌属或耶尔森菌属)的杀昆虫蛋白。在其他实施例中，杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细菌(如发光杆菌属物种)的ADP-核糖基转移酶。在仍其他实施例中，杀昆虫蛋白可以是Axmi205或源自Axmi205(美国专利号8575425和9394345，其各通过引用并入本文)。在其他实施例中，所述杀昆虫蛋白可以是VIP蛋白(如来自蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的VIP1和/或VIP2)。在仍其他实施例中，杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细菌(如来自侧孢短芽孢杆菌的ISP1A和ISP2A或来自球形芽孢杆菌的BinA和BinB)的二元毒素。在仍其他实施例中，所述杀昆虫蛋白可以被工程化或可以是前述杀昆虫蛋白中的任一个的杂交体或嵌合体。

[0206] 在一些实施例中，本发明的转基因植物可包含和/或表达至少一种非蛋白质的第二杀有害生物剂。在一些实施例中，第二杀有害生物剂可以存在于植物表面上，例如作为局部施用。在优选的实施例中，该第二杀有害生物剂是干扰RNA分子。干扰RNA分子典型地包含针对靶基因的至少一种RNA片段、间隔序列、和与第一RNA片段互补的第二RNA片段，从而可以形成双链RNA结构。当生物识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时，RNA干扰(RNAi)发生。所得的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段被称为小干扰RNA(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别，RNA的效应链(或“引导链”)被加载到所述复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶标杂交，此过程都被重复，有效防止那些mRNA被翻译，并且因此使mRNA自其中转录的特异性基因的表达“沉默”。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制(参见例如，公开物WO 2013/192256，其通过引用并入本文)。设计用于昆虫控制的干扰RNA产生非天然存在的双链RNA，其利用昆虫中的天然RNAi途径来触发靶基因的下调，这可能导致停止摄食和/或生长并可能导致昆虫有害生物死亡。干扰RNA分子可赋予针对与本发明的蛋白质相同的靶标有害生物的昆虫抗性，或可靶向不同的有害生物。靶标昆虫植物有害生物可以通过咀嚼、吸吮或刺穿来摄食。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于PCT专利申请号PCT/US17/044825；PCT/US17/044831；PCT/US17/
044832(通过引用并入本文)中。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于美国专利号9,
238,8223、9,340,797或8,946,510(通过引用并入本文)中。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于美国专利申请号12/868,994、13/831,230、14/207,313、或14/207318(通过引用并入本文)中。在其他实施例中，干扰RNA可赋予针对非昆虫植物有害生物(如线虫有害生物或病毒有害生物)的抗性。

[0207] 多于一种的杀有害生物剂在相同转基因植物中的共表达可以通过制造单一的重组载体(在一种所谓的分子堆积(molecular stack)中包含多于一种的杀有害生物剂的编码序列)并对植物进行遗传工程化以便在该转基因植物中含有并表达所有的杀有害生物剂而实现。此类分子叠加还可以通过使用微型染色体进行制备，如在例如美国专利7,235,716中所述的。可替代地，包含对第一杀有害生物剂进行编码的核酸的转基因植物可以用对第二有害生物剂等进行编码的不同的核酸进行再转化。可替代地，可以将植物(亲本1)遗传工程化，用于本发明的基因的表达。可以将第二植物(亲本2)遗传工程化，用于第二杀有害生物剂的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达被引入至亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物。

[0208] 包括和/或表达本发明的杀昆虫蛋白的转基因植物或种子还可以用杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理，如美国专利号5,849,320和5,876,739(通过引用并入本文)中所述的。在实施例中，在本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣以及转基因植物或种子针对相同靶昆虫(例如鞘翅目有害生物或根萤叶甲属靶有害生物)具有活性的情况下，该组合(i)在用于进一步增强本发明的组合物针对该靶昆虫的活性的方法中和/或(ii)在用于通过提供针对该靶昆虫的又另一种作用机制而防止对本发明的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此，在实施例中，本发明提供了增强根萤叶甲属昆虫群体的控制的方法，该方法包括提供本发明的转基因植物或种子并且向该植物或该种子施用本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣。

[0209] 即使在杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣针对不同昆虫具有活性的情况下，该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将针对鳞翅目昆虫具有活性的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣添加到本发明的转基因种子(在一些实施例中针对鞘翅目和一些鳞翅目具有活性)中，所产生的包被的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目有害生物两者。

[0210] 此类杀昆虫剂和/或杀昆虫种子包衣的实例包括但不限于，氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合。在另一个实施例中，该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣选自下组，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos)、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺、及其组合。包含此类杀昆虫剂和杀昆虫种子包衣的商业产品包括但不限于以下： (克百威)、 (灭多虫、灭多威、纳乃得)、 (胺甲萘)、 (联苯菊酯)、 (七氟菊酯)、
(氯氰菊酯)、 (氯氰菊酯)、Delta (溴氰菊酯)、
(λ-氯氟氰菊酯)、 (氯菊酯)、 (氯菊酯)、
(联苯菊酯)、 (联苯菊酯)、 (七氟菊酯))、 (λ氯氟
氰菊酯)、 (毒死蜱)、 (氯氧磷)、 (灭克磷)、
(甲拌磷)、 (甲拌磷、氟氰戊菊酯(flucythinate))、
(甲拌磷)、 (特丁磷)、 (乐果)、异氯磷、 (氟虫腈))、
(噻虫嗪)、 (吡虫啉)、 (吡虫啉)、 (噻
虫胺)和 (氟氯氰菊酯、嘧丙磷)。

[0211] 本发明还涵盖了组合物，该组合物包含控昆虫有效量的根据本发明的杀昆虫蛋白。在另外的实施例中，该组合物包含合适的农业运载体和具有杀昆虫活性的本发明的多肽。该农业运载体可包括有益于活性成分(如本发明的多肽，包括包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100中的任一个具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％同一性的氨基酸序列的多肽)施用的佐剂、混合剂、增强剂等。合适的运载体不应对有价值的作物具有植物毒性(特别是在作物的存在下施用组合物时所用的浓度)，并且不应与本文的活性成分的化合物(即本发明的多肽或其他组合物成分)进行化学反应。此类混合物可以设计用于直接施用于作物，或者可以是浓缩物或配制品，其通常在施用前用另外的运载体和佐剂进行稀释。它们可以包括惰性或活性组分，并且可以是固体(如例如尘剂、粉剂、颗粒剂、水分散性颗粒剂或可湿性粉剂)或液体(如例如可乳化浓缩物、溶液、乳剂或悬浮液)。合适的农业运载体可包括液体运载体，例如水、甲苯、二甲苯、石脑油、作物油、丙酮、甲基乙基酮、环己酮、三氯乙烯、全氯乙烯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、乙酸丁酯、丙二醇单甲醚和二乙二醇甲醚、甲醇、乙醇、异丙醇、戊醇、乙二醇、丙二醇、甘油等。水通常是用以稀释浓缩物的选用运载体。合适的固体运载体可包括滑石、叶腊石粘土、硅石、凹凸棒石粘土、砂藻土(kieselguhr)、白垩、硅藻土(diatomaxeous earth)、石灰、碳酸钙、膨润土、漂白土、棉子壳、小麦粉、大豆粉、浮石、木粉、核桃壳粉、木质素等。在另一个实施例中，本发明的多肽可以包封在合成基质(如聚合物)中，并施用于宿主(如植物)的表面。昆虫摄取宿主细胞允许将昆虫控制剂递送至昆虫并导致对昆虫有害生物的毒性作用。

[0212] 在另外的实施例中，本发明的组合物可以是粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体或溶液。本发明的组合物可以通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩细菌细胞的培养物来制备。本发明的组合物可包含按重量计至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的本发明的多肽。

[0213] 在实施例中，本发明的组合物可包含至少第二杀有害生物剂(例如，其可以从植物中转基因表达和/或掺入组合物中)，其可以是杀昆虫的、杀线虫的、杀真菌的、或杀细菌的。至少第二杀有害生物剂可以针对与本发明的多肽相同的昆虫或不同的昆虫具有杀昆虫作用。第二杀有害生物剂可以是多肽。杀有害生物剂可以是干扰RNA(例如，dsRNA)。第二杀有害生物剂可以是微生物(如细菌)，其包含编码杀有害生物剂的核酸分子和/或包含杀有害生物剂(如多肽或干扰RNA)。可对该微生物进行减毒、热灭活或冷冻干燥。微生物可能死亡或无法繁殖。第二杀有害生物剂可以是杀昆虫剂，例如卡巴呋喃、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、噻虫胺、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷
(tebupirimiphos)、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺、及其组合，或含有如上所述的杀虫剂和杀虫种子包衣的商业产品。

[0214] 本发明的组合物(例如包含本发明的多肽和农业上可接受的运载体的组合物)可用于传统农业方法中。农业上可接受的运载体是可用于将包含本发明的多肽的组合物施用至植物或种子的配制品。例如，可以将本发明的组合物与水和/或肥料混合，并且能以任何装置将其在出苗前和/或出苗后施用至所希望的场所，该装置是如飞机喷雾桶、灌溉设备、直接注入喷雾设备、背囊喷雾桶、家畜浸渍槽、在地面喷雾中使用的农场设备(例如，喷管式喷雾器、手动喷雾器)等。所希望的场所可以是土壤、植物等。

[0215] 本发明的组合物可以在以下时间施用至处于任何生理状态下的种子或植物繁殖体：在种子收获和播种之间的任何时间；或在播种期间或播种后；和/或发芽后。优选种子或植物繁殖体处于足够耐用的状态，使得在处理过程期间不会造成损害或造成最小的损害，包括物理损害或生物损害。配制品可以使用常规的包衣技术以及机器(如流化床技术、滚筒研磨方法、静态转动(rotostatic)种子处理器和转鼓包衣器)施用至种子或植物繁殖体上。

[0216] 本发明还包括用于控制鳞翅目和/或鞘翅目有害生物群体的方法，该方法包括使所述群体与控昆虫有效量的具有杀昆虫活性的本发明的多肽接触，其中该多肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:86至96、或SEQ ID NO:100具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性。接触包括有害生物群体的成员摄食或摄取多肽。多肽可以并入昆虫膳食食物中，或者可以在昆虫然后摄取的植物组织中表达或存在。在另外的实施例中，控制鳞翅目和/或鞘翅目有害生物群体包括通过使昆虫与控昆虫有效量的本发明的多肽接触来杀死昆虫。

[0217] 本发明还包含用于保护植物免于昆虫有害生物的方法，该方法包括在植物或植物细胞中表达编码本发明的杀昆虫多肽的核苷酸序列或表达盒。在实施例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2至36的核苷酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性，或编码包含以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37至72、SEQ ID NO:
86至96、或SEQ ID NO:100具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性。在另外的实施例中，植物或植物细胞产生杀昆虫多肽，该杀昆虫多肽针对鳞翅目和/或鞘翅目有害生物具有杀昆虫活性。

[0218] 本发明进一步包含用于增加植物产量的方法，该方法包括在田地中生长已经在其基因组中稳定地并入本发明的表达盒的核酸分子的植物或其种子，并且其中所述田地被有害生物侵染，所述多肽针对该有害生物具有杀昆虫活性。

[0219] 一旦将所希望的核酸转化至特定的植物物种中，它可以在那个物种中进行增殖或者使用传统的育种技术将其移至相同物种的其他品种中(特别是包括商品化的品种)。

[0220] 在实施例中，在转基因植物中表达本发明的核酸，因此引起相应的杀昆虫蛋白在该转基因植物中的生物合成。以这种方式，产生了针对昆虫(特别是玉米根虫)具有增强的抗性的转基因植物。为了其在转基因植物中的表达，可对本发明的这些核酸任选地进行修饰和优化。尽管在许多情况中来自微生物有机体的基因可以在没有修饰的情况下在植物中以高水平表达，但在转基因植物中的低表达可能是由于具有在植物中不优选的密码子的微生物核酸所造成的。在本领域中已知的是，所有生物针对密码子使用具有特定偏好，并且可以对本发明中所描述的核酸的密码子进行改变以符合植物的偏好，同时保持由此所编码的氨基酸。此外，在植物中高表达最好是由以下编码序列实现的，这些编码序列具有至少大约35％、优选大于约45％、更优选大于约50％、并且最优选大于约60％的GC含量。具有低GC含量的微生物核酸可能在植物中表达欠佳，这是由于存在可使信息不稳定的ATTTA基序，以及可能引起不适当的聚腺苷酸化作用的AATAAA基序。在实施例中，可以对序列进行修饰以便迎合单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(Murray等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]17:477-498(1989))。此外，针对可能引起信息缩短的不合理剪接位点的存在对这些核酸筛选。可以使用熟知的位点定向诱变、PCR、以及合成基因的构建，例如，使用公开的专利申请EP 0 385 962、EP 0 359 472、以及WO 93/07278中所述的方法，对在这些核酸之内所有需要做出的变化(如以上所描述的那些变化)进行改变。

[0221] 在本发明的一个实施例中，根据在美国专利5,625,136(通过引用并入本文)中所披露的方法来制造本发明的杀昆虫蛋白的编码序列。在这个方法中，使用了玉蜀黍优选的密码子，即最频繁地编码玉蜀黍中的氨基酸的单个密码子。针对特定的氨基酸的玉蜀黍优选的密码子可源自(例如)来自玉蜀黍的已知基因序列。针对来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用发现于Murray等人,Nucleic Acids Research[核酸序列]17:477-498(1989)中，其通过引用并入本文。

[0222] 以这种方式，这些核苷酸序列可以进行优化用于在任何植物中表达。认识到的是该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。

[0223] 为了更加有效的翻译起始，可修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi已经提出了针对植物的适当的共有序列(NAR 15:6643-6653(1987))，并且Clontech提出了另一种共有翻译起始子(1993/1994目录，第210页)。这些共有序列适合与本发明的核酸一起使用。在实施例中，将这些序列并入包含核酸的构建体中，达到并且包括ATG(而未对第二个氨基酸进行修饰)，或者可替代地达到并且包括在ATG后的GTC(具有修饰该转基因的第二氨基酸的可能性)。

[0224] 在转基因植物中这些核酸的表达是由在植物中发挥作用的启动子所驱动的。启动子的选择将根据表达的时间和空间需要而变化，并且还根据靶物种而变化。因此，本发明的核酸在叶、柄(stalk)或茎(stem)、穗、花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴等等)、根、和/或籽苗中的表达是优选的。然而在许多情况下，寻求针对多于一种类型昆虫有害生物的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中表达。然而，对所选择的启动子的起源并没有限制，只要它们在驱动核酸在所希望的细胞中的表达中是操作性的就足够了。

[0225] 在一个实施例中，使用了以组成型表达的启动子，包括肌动蛋白或泛素或CMP启动子，或CaMV 35S和19S启动子。本发明的核酸也可以在用化学方法进行调节的启动子的调节下表达。用于基因表达的化学诱导的优选的技术详述于公开申请EP 0 332 104(汽巴-嘉基公司(Ciba-Geigy))以及美国专利5,614,395中。用于化学诱导的优选的启动子是烟草PR-1a启动子。

[0226] 在另一个实施例中，可使用一类伤口诱导型启动子。已经描述了数量众多的在创伤部位并且还在植物病原菌感染的部位表达的启动子。理想的是，这种启动子应该仅在感染的部位有局部活性，并且以这种方式，本发明的杀昆虫蛋白仅在需要合成这些蛋白的细胞中累积以杀死入侵的昆虫有害生物。这类优选的启动子包括由以下文献所描述的那些：Stanford等人Mol.Gen.Genet.[分子遗传学]215:200-208(1989)，Xu等人Plant 
Molec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)，Logemann等人Plant Cell[植物细胞]
1:151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)，Firek等人Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)，以及Warner等人Plant J.[植物杂志]3:191-201(1993)。

[0227] 用于在植物(特别是玉米)中表达对本发明的杀昆虫蛋白进行编码的基因的组织特异性的或组织优选的启动子是那些直接在根、髓、叶或花粉(特别是根)中表达的启动子。此类启动子，例如从PEPC或trpA中分离的那些披露于美国专利号5,625,136中，或从MTL中分离的那些披露于美国专利号5,466,785中。这两篇美国专利以其全文通过引用并入本文。

[0228] 此外，可以使用在质体中发挥作用的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9 5'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。适用于本发明的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。

[0229] 在另外的方面中，本发明的核苷酸序列可以与启动子可操作地相关联，该启动子是创伤诱导型或由有害生物或病原体侵染(例如，昆虫或线虫植物有害生物)进行的诱导型。已经描述了在创伤部位和/或在有害生物攻击(例如，昆虫/线虫摄食)或植物病原菌侵染的部位处表达的数量众多的启动子。理想的是，这种启动子应仅在攻击部位处或邻近该部位具有局部活性，并且以这种方式，本发明的核苷酸序列的表达将集中在所侵入或摄食的细胞中。此类启动子包括但不限于由以下描述的那些启动子：Stanford等人,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]215:200-208(1989)；Xu等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)；Logemann等人,Plant Cell[植物细胞]1:151-158(1989)；Rohrmeier和Lehle，Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)；
Firek等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)；Warner等人,Plant J.[植物杂志]3:191-201(1993)；美国专利号5,750,386；美国专利号5,955,646；美国专利号6,262,344；美国专利号6,395,963；美国专利号6,703,541；美国专利号7,078,589；美国专利号7,196,247；美国专利号7,223,901；以及美国专利申请公开2010043102。

[0230] 在本发明的一些实施例中，使用“最小启动子”或“基本启动子”。最小启动子能够募集并结合RNA聚合酶II复合体及其辅助蛋白，以允许转录起始和延伸。在一些实施例中，最小启动子被构建成仅包括来自转录因子的结合和目的核苷酸序列的转录所必需的一个选定启动子的核苷酸/核苷酸序列，所述目的核苷酸序列可操作地与包括但不局限于TATA盒序列的最小启动子相关联。在其他实施例中，最小启动子缺少募集并结合转录因子的cis序列，这些转录因子调节(例如，增强、阻抑、赋予组织特异性，赋予诱导性或阻抑性)转录。最小启动子通常被放置在待表达的核苷酸序列的上游(即，5’)。因此，可以选择来自与本发明一起可用的任何启动子的核苷酸/核苷酸序列用作最小启动子。

[0231] 可以将数量众多的其他序列掺入本发明所描述的表达盒中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列(例如，来自Adhl和bronzel)以及病毒的前导序列(例如，来自TMV、MCMV、和AMV)。

[0232] 本发明的核酸在植物中针对不同的细胞定位的靶向表达可能是更优选的。在一些情况下，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他情况下，在某个亚细胞器中的定位可能是优选的。使用本领域内熟知的技术进行编码酶类的转基因的亚细胞定位。典型地，对编码来自已知细胞器靶向的基因产物的靶肽的DNA进行操作并将其融合在该核酸的上游。针对叶绿体的许多此类靶序列是已知的并且已经证明了它们在异源构建体中的功能。还将本发明的核酸的表达靶向至宿主细胞的内质网或液泡。实现其的技术在本领域中是熟知的。

[0233] 适用于植物转化的载体在本领域中是熟知的。对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一种T-DNA边界序列的载体是合适的，而对于直接基因转移，任何载体都是合适的，并且仅含有目的构建体的线性DNA也许是优选的。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(Schocher等人,Biotechnology[生物技术]4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转化这两者，转化通常(但不是必需的)用选择性标记进行，这种选择性标记可以提供针对抗生素(卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤)或除草剂(basta)的抗性。包含本发明的核酸分子的植物转化载体还可包含以下基因(例如磷酸甘露糖异构酶；PMI)，这些基因提供转基因植物的阳性选择，如美国专利5,767,378和5,994,629(通过引用并入本文)中所披露的。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。

[0234] 在实施例中，核酸可以转化到核基因组中。在另一个实施例中，本发明的核酸被直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需实质性的密码子优化，而且质体能够在单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在McBride等人(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91,7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及例如使用生物射弹(biolistic)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)，将位于选择性标记侧翼的经克隆的质体DNA区连同目的基因一起引入合适的靶组织中。所述1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰原质体系的特定区域。最初，将叶绿体16SrRNA和rps12基因的点突变(赋予对壮观霉素和/或链霉素抗性)用作用于转化的选择性标记(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,和Maliga,P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87,8526-8530；Staub,J.M.,和Maliga,P.(1992)Plant Cell[植物细胞]4,39-45)。这以大约每100次靶叶轰击大约1个的频率产生稳定的同质转化株。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的引入(Staub,J.M.和Maliga,P.(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]12,601-606)。转化频率的实质性增加是通过用显性选择性标记(细菌aadA基因，其编码了壮观霉素-解毒酶氨基糖苷-3'-腺苷酰转移酶)置换隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因来获得的(Svab,Z.,和Maliga,P.(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90,913-917)。先前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻这种绿藻的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)Nucl.Acids Res.[核酸研究]19:4083-4089)。有用于质体转化的其他选择性标记在本领域是已知的，并且被包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大约15-20个细胞分裂循环以便达到同质状态。质体表达(其中基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个优选的实施例中，将本发明的核酸插入到质体靶向的载体中并且转化到所希望的植物宿主的质体基因组中。获得了对于包含本发明的核酸的质体基因组同型的植物，并且这些植物能够优先地高表达该核酸。

[0235] 实例

[0236] 通过参考以下具体的实例可以进一步描述本发明。这些实例仅仅是出于说明性目的而提供的，并且并不旨在进行限制，除非另外指明。本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是熟知的，并且由以下文献进行描述：J.Sambrook等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor[冷泉港],NY[纽约]：Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2001)；T.J.Silhavy,M.L.Berman,和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions[基因融合实验],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港],NY[纽约](1984)和Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验手册],New York[纽约],John Wiley and Sons Inc.[约翰威利父子出版公司],(1988),Reiter等人,Methods in Arabidopsis Research[拟南芥属研究方法],World Scientific Press[世界科学出版社](1992)，以及Schultz等人,Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学手册],Kluwer Academic Publishers[克鲁沃学术出版社](1998)。

[0237] 实例1：针对西方玉米根虫具有杀昆虫活性的蛋白质的鉴定

[0238] 从海栖木洞菌(Woodsholea maritima)鉴定出杀昆虫蛋白(SEQ ID NO:1)。合成该基因的大肠杆菌优化的形式(SEQ ID NO:2)，并将该基因克隆到pET29a载体中，产生构建体pET29a(Woods)。将pET29a(Woods)构建体转化到大肠杆菌BL21*(DE3)中，并在18℃下在卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani)培养基中用IPTG孵育过夜进行蛋白质表达。通过使用弗氏压碎器(French pressure cell)，随后以20,000x g将整个裂解物离心三十分钟，从这些培养物制备裂解物的可溶性部分。然后测试上清液(可溶性部分)对西方玉米根虫(WCR)的生物活性。

[0239] 使用膳食掺入方法进行生物活性测定。简言之，将大肠杆菌BL21*(DE3)裂解物与等体积的加热的人造昆虫膳食(Bioserv公司，弗伦奇敦(Frenchtown)，新泽西州(NJ))在1.5mL离心管中混合，然后施用于小的培养皿中。在膳食-样品混合物冷却并固化后，向每个板中添加12只WCR幼虫。将板密封并且保持在就温度、光照以及相对湿度而言的环境实验室条件下。将来自携带空pET29a载体的大肠杆菌BL21*(DE3)培养物的裂解物用作阴性对照。
在第4天和第7天评估死亡率。对于该表格以及所有后续显示出对CRW的杀昆虫活性的表格，“备注”栏的缩写如下：s＝小幼虫，sm＝小/中等幼虫，m＝中等幼虫，mb＝中等/大幼虫，b＝大幼虫，vb＝非常大的幼虫。如表1所示，来自表达pET29a(Woods)的培养物的裂解物显示出针对WCR的较强生物活性。将海栖木洞菌(W.maritima)蛋白更名为WoodsCRW。

[0240] 表1：针对西方玉米根虫的杀昆虫活性

[0241]

[0242] 通过Bio-Rad Experion和BCA蛋白测定对裂解物制剂中的WoodsCRW蛋白进行定量，并且将其在膳食掺入生物测定中在一系列浓度下针对12只WCR幼虫进行重新测试(表2)。一系列测试浓度的WoodsCRW显示出对WCR的较强生物活性。

[0243] 表2：WoodsCRW裂解物对WCR的杀昆虫活性

[0244]

[0245]

[0246] 实例2：经纯化的WoodsCRW对西方玉米根虫具有杀昆虫活性

[0247] 针对WoodsCRW产生包含SEQ ID NO:2的pET-6His-SUMO构建体。将pET-6His-SUMO-WoodsCRW构建体转化到大肠杆菌BL21*(DE3)中以用于蛋白质生产。使用针对His标记的蛋白质的标准技术纯化SUMO标记的蛋白质，随后用SUMO蛋白酶切割以释放无标记的WoodsCRW蛋白。然后将切割的蛋白质应用于HisTrapFFFPLC柱上并收集柱流过物。通过SDS-PAGE分析流过级分的纯度(WoodsCRW的预期MW为54.1kDa)。然后在4℃下将经纯化的WoodsCRW透析到1X PBS中过夜，并然后浓缩至13mg/mL。然后以实例1中描述的膳食掺入方法，将一系列浓度的纯的蛋白质针对12只WCR幼虫进行测试。如表3所示，WoodsCRW对WCR非常有效；6μg/mL的WoodsCRW在第6天产生83％的死亡率。

[0248] 表3：经纯化的WoodsCRW对WCR的杀昆虫活性

[0249]

[0250] 实例3：WoodsCRW对北方玉米根虫具有杀昆虫活性

[0251] 如实例2中那样纯化WoodsCRW，并在膳食掺入测定中测试其针对12只北方玉米根虫(NCR)幼虫的功效，基本上如实例1所述进行，不同之处在于在第3天和第7天评估死亡率。测试浓度为0.2mg/mL和0.1mg/mL的WoodsCRW。阴性对照只有1xPBS。如表4所示，WoodsCRW展示出针对NCR的杀昆虫活性。

[0252] 表4：WoodsCRW针对NCR的杀昆虫活性

[0253]

[0254] 实例4：WoodsCRW对Cry抗性西方玉米根虫具有杀昆虫活性

[0255] 为确定WoodsCRW毒性是否通过从Cry3相关蛋白分离的作用方式，如实例2中那样纯化WoodsCRW，并测试其针对对mCry3A毒素有抗性的WCR菌株(mCry3A-R)和针对对eCry3.1Ab毒素有抗性的WCR菌株(eCry3.1Ab-R)的功效。基本上如实例1所述进行膳食掺入测定，不同之处在于在第4天和第6天评估死亡率。测试两个不同浓度(0.2mg/mL和0.075mg/mL)的经纯化的WoodsCRW。阴性对照只有1xPBS。还测定了对mCry3A或eCry3.1Ab无抗性的WCR(sus＝易感的)。用12只WCR幼虫进行每个测定。如表5所示，WoodsCRW展示出针对Cry抗性WCR菌株的杀昆虫活性。

[0256] 表5：WoodsCRW针对Cry-R WCR的杀昆虫活性

[0257]

[0258]

[0259] 实例5：WoodsCRW对鳞翅目不具有杀昆虫活性

[0260] 使用膳食覆盖生物测定，测试来自表达WoodsCRW(SEQ ID NO:2)的细菌培养物的裂解物对一组鳞翅目昆虫有害生物的生物活性。通过类似于实例1那样的膳食掺入测定，分别测试欧洲玉米螟(ECB)、黑色地老虎(BCW)和玉米螟(CEW)以及秋夜蛾(FAW)的WoodsCRW杀昆虫活性。使用来自Bl21*(DE3)细菌培养物(所述培养物携带编码WoodsCRW(SEQ ID NO:2)的基因)的裂解物，测试每个实验中的12只L1幼虫。BCW、CEW、和FAW的阳性对照样品由暴露于表达Vip3A的大肠杆菌Bl21*(DE3)裂解物的幼虫组成(美国专利号5,877,012，通过引用并入本文)。将单独的1X PBS和来自携带空pET29载体的Bl21*(DE3)细菌培养物的裂解物用作阴性对照。在第7天评估死亡率。达到L3阶段的幼虫未受到处理的显著影响。如果幼虫仅达到L2阶段，则处理可能导致生长抑制。如果幼虫在整个处理过程中保持在L1阶段，则发生生长抑制。这也可以被认为是“有效死亡率”，因为即使它们仍然存活，幼虫也不会发展到超过L1阶段。在这些实验条件下，WoodsCRW针对测试的鳞翅目昆虫有害生物没有活性(表6)。

[0261] 表6：WoodsCRW针对鳞翅目的杀昆虫活性

[0262]

[0263]

[0264] L1＝一龄，L2＝二龄，L3＝三龄

[0265] 实例6：Woods CRW变体对WCR具有杀昆虫活性

[0266] 将突变引入到WoodsCRW中，并测定包含WoodsCRW突变变体和/或经纯化的WoodsCRW突变变体蛋白质的细菌裂解物的蛋白质稳定性和杀昆虫活性。突变包括在半胱氨酸残基处的氨基酸变化以及邻近半胱氨酸残基处的亮氨酸残基的插入。引入这些突变以确定WoodsCRW突变变体是否可以被设计保持杀昆虫活性但在模拟胃液(SGF)测定中可消化。
这种WoodsCRW变体可具有商业价值，例如通过在植物中的转基因表达来赋予植物杀昆虫特性。

[0267] 使用基本上如实例1所述进行的膳食掺入测定，每个实验测定使用12只WCR幼虫测定杀昆虫活性。结果示出在表7-19中。SEQ IDNO对应于变体的氨基酸序列。表14-16和19中示出的突变体在所述位置处包含亮氨酸插入，如“-Leu-”或“-L-”所示。对于表14，测试每种细菌裂解物的1:20稀释液。对于表15和16，将裂解物稀释液作为处理的一部分示出。对于表17-19，将所使用的经纯化的蛋白质的量作为处理的一部分示出。大多数突变体WoodsCRW变体显示出杀昆虫活性。然而，极少显示出SGF消化率。

[0268] 实例7：对大肠杆菌裂解物制剂进行的模拟胃液测试

[0269] 该实例描述了为测定SGF消化率而进行的测定。将在50mM磷酸钾(pH 7.0)、50mM氯化钠中的细菌裂解物稀释至3mg/mL(总蛋白浓度)用于消化率分析。在37℃下，通过将15μL裂解物添加至285μL模拟胃液[10个单位的胃蛋白酶/μg蛋白，或大约1579个单位的胃蛋白酶/mL，在G-Con溶液(2mg/mL氯化钠，pH 1.2)]中来启动消化反应。在5或10分钟时，取出100μL的裂解物-SGF反应液，并通过将其添加到100μL的预热(95℃)的终止溶液中来终止该反应，该终止溶液由65％Tricine加样缓冲液(Bio-rad 2x Tricine加样缓冲液w/10％β-巯基乙醇)和35％500mM碳酸氢钠(pH 11.0)组成。通过将5μL测试裂解物添加到预热(95℃)的100μL终止溶液和95μL模拟胃液中来产生零时间点(T0)。将所有样品在95℃下加热5分钟，并然后储存在冰上直至SDS-PAGE分析。在标准蛋白质凝胶电泳之前，将30微升的每种反应液加样到10％-20％Tris-tricine肽凝胶上。在电泳后立即用40％甲醇：10％乙酸混合物将Tris-tricine凝胶固定20分钟。然后将凝胶用GelCode蓝蛋白染色剂在室温下染色1小时。1小时后，将聚丙烯酰胺凝胶用蒸馏水脱色至少12小时。结果定性地显示在表7-19中的“SGF”栏中。还测试了表20中的WoodsCRW突变变体的消化率。“否”(N)表示在凝胶电泳后可通过GelCode蓝蛋白染色检测到完整的WoodsCRW蛋白变体，这表明该蛋白质在SGF测定中不能被完全消化。“是”(Y)表示不可检测到完整的WoodsCRW蛋白变体，这表明WoodsCRW蛋白变体在SGF测定中是可消化的。对于表7-19，如果SGF栏不含“N”或“Y”，则表明未测试蛋白质的消化率。

[0270] 表7：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0271]

[0272] 表8：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0273]

[0274]

[0275] 表9：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0276]

[0277] 表10：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0278]

[0279] 表11：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0280]

[0281] 表12：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0282]

[0283]

[0284] 表13：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0285]

[0286] 表14：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0287]

[0288]

[0289] 表15：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0290]

[0291]

[0292] 表16：WoodsCRW突变变体针对WCR的杀昆虫活性

[0293]

[0294]

[0295] 表17：WoodsCRW的经纯化的C398L变体针对WCR的杀昆虫活性

[0296]

[0297] 表18：WoodsCRW的经纯化的C398Y变体针对WCR的杀昆虫活性

[0298]

[0299]

[0300] 表19：WoodsCRW的经纯化的D397-Leu-Leu-C398变体针对WCR的杀昆虫活性[0301]

[0302]

[0303] 表20：在SGF测定中WoodsCRW的突变变体的消化

[0304]WoodsCRW突变变体 SEQ ID NO. SGF
C435L 61 N
C485L 62 N
I403L/I404L 63 N
V399L 64 N
V399F 65 N
C398F 66 Y
C398I 68 N
C398M 69 N

[0305] 如表9所示，WoodsCRW C313S/C383S/C398S/C435S/C485S突变变体(SEQ ID NO:42)具有非常低的杀昆虫活性，当使用580μg/mL蛋白质时在第6天具有33％的死亡率。表10显示WoodsCRW变体C383S/C435S/C485S(SEQ ID NO:41)也具有较低的杀昆虫活性，当使用
50μg/mL蛋白质时在第6天具有42％的死亡率。另外地，表8显示WoodsCRW变体C398S/C435S(SEQ ID NO:39)和C398S/C485S(SEQ ID NO:40)具有降低的杀昆虫活性。另外，表7显示WoodsCRW变体C435S(SEQ ID NO:29)和C383S(SEQ ID NO:31)具有一定程度的降低的杀昆虫活性。这些结果表明，至少一种经修饰的半胱氨酸和/或至少两种经修饰的半胱氨酸的组合在WoodsCRW的杀昆虫活性中起重要作用。这些结果还表明，从约氨基酸313至约氨基酸
485的蛋白质结构域对于WoodsCRW的杀昆虫活性是必需的。

[0306] 如表14-16和19所示，在位置C398周围的亮氨酸插入保留了相对高的杀昆虫活性并且可被SGF消化。另外，将C398突变为L或Y也导致WoodsCRW突变变体具有相对高的针对WCR的杀昆虫活性和相对高的SGF消化率(表17和18)。

[0307] 实例8：针对Cry3抗性WCR具有杀昆虫性的WoodsCRW变体C398L和C398Y

[0308] 为确定WoodsCRW突变变体C398L和C398Y是否对对Cry3相关蛋白质具有抗性的WCR保留杀昆虫活性，测定这两个变体对eCry3.1Ab抗性WCR的活性。使用经纯化的WoodsCRW C398L或C398Y蛋白质，与实例4所述的方法相类似地进行膳食掺入测定。结果示出在表21中。处理包括对经纯化的蛋白质的浓缩。结果表明WoodsCRW突变变体C398L和C398Y对Cry3抗性WCR菌株具有杀昆虫活性。

[0309] 表21：WoodsCRW的经纯化的突变变体针对eCry3.1Ab抗性WCR的杀昆虫活性[0310]

[0311] 实例9：WoodsCRW具有杀昆虫活性所必需的结构域

[0312] 将WoodsCRW的晶体结构溶解，并发现其与Plu1415具有显著的结构相似性，该Plu1415是来自细菌发光杆菌(Photorhabdus luminescens)的蛋白质，其晶体结构由Rosado等人.,2007(Science[科学]317：1548-1551)描述。如Plu1415一样，WoodsCRW由N-末端MACPF结构域和C-末端β-棱柱结构域组成。使用12只WCR幼虫，根据实例1中描述的膳食掺入生物测定法，测定Plu1415的细菌裂解物的杀昆虫活性。结果示出在表22中。有趣的是，Plu1415对WCR不具有杀昆虫活性。

[0313] 表22：Plu1415的细菌裂解物针对WCR的杀昆虫活性

[0314]

[0315] 将这两种晶体结构用于产生嵌合蛋白，以确定哪个(哪些)结构域负责WoodsCRW对WCR的杀昆虫活性。基于这两种蛋白质的结构比较，产生了两种互补的融合蛋白。Plu1415-WoodsCRW嵌合体包含Plu1415的N-末端MACPF结构域(氨基酸1-362)和WoodsCRW的C-末端β-棱柱结构域(氨基酸363-506)。类似地，WoodsCRW-Plu1415嵌合体包含WoodsCRW的N-末端MACPF结构域(氨基酸1-346)和Plu1415的C-末端β-棱柱结构域(氨基酸347-494)。使用12只幼虫并根据实例1中所述的膳食摄入生物测定法测定嵌合体对WCR的杀昆虫活性。结果示出于表23和24中。有趣的是，Plu1415-Woods嵌合体对WCR具有杀昆虫活性，然而Woods-Plu1415嵌合体对其不具有杀昆虫活性。这些数据表明WoodsCRW的C末端β-棱柱结构域对于杀昆虫活性是必需且必要的，并且当与嵌合构建体中的MACPF结构域融合时可赋予针对WCR的杀昆虫活性。

[0316] 表23：Plu1415-Woods嵌合体针对WCR的杀昆虫活性

[0317]

[0318] 表24：Woods-Plu1415嵌合体针对WCR的杀昆虫活性

[0319]

[0320] 实例10：具有WoodsCRW变体C398L和C398Y的玉蜀黍的转化

[0321] 产生适合于对WoodsCRW变体C398L和C398Y进行农杆菌介导的转化的二元载体构建体。所述二元载体各自包含玉蜀黍优化的WoodsCRW变体C398L或玉蜀黍优化的WoodsCRW变体C398Y编码序列，该编码序列在5'端可操作地连接至适于在植物中驱动表达的启动子并在3'端可操作地连接至终止子序列。例如，使用美国专利号6,320,100(通过引用并入本文)中所述的方法进行玉蜀黍密码子优化。使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术将所述构建体转化到根癌农杆菌中。为了制备用于转化的农杆菌，将细胞在28℃和220rpm下在液体YPC培养基中培养过夜。基本如描述于Negrotto等人,2000(Plant Cell Reports[植物细胞报告]19：798-803)中的进行未成熟的玉蜀黍胚的农杆菌转化。对于这个实例，所有的培养基组分基本上如Negrotto等人(如上)所述。然而，本领域内已知的各种培养基组分可以被代替。

[0322] 在转化、选择和再生后，使用 分析来测定植物中是否存在PMI基因和WoodsCRW玉蜀黍密码子优化的、变体C398L或C398Y的编码序列。还测试了植物中是否存在载体骨架。将对载体骨架为阴性且包含所述转基因的一个拷贝的植物转移至温室并测定其对WCR损害的抗性。

[0323] 实例11：表达WoodsCRW变体的玉蜀黍植物对WCR具有杀昆虫活性

[0324] 通过ELISA以来自每次事件的叶或根组织中的ng/mg总可溶性蛋白(TSP)检测WoodsCRW变体的存在。使用根段生物测定法(Root Segment Bioassay)测定杀昆虫活性。简言之，当表达WoodsCRW变体的玉蜀黍事件达到V3-V4阶段时，采集来自每次事件的玉蜀黍根组织的样品。将玉蜀黍根组织置于培养皿中，并且然后在根段生物测定中用12只WCR幼虫将其感染。在第3天评估两个根组织样品(Rep1和Rep2)的摄食孔(FH)和瘢痕损害。将来自未转化(无效)玉蜀黍的根组织用作阴性对照。来自表25和26的数据显示，与无效样品根组织相比，已知对CRW具有杀昆虫活性的WoodsCRW变体的转基因表达在WoodsCRW转基因根组织中提供了保护而免于CRW(表25和26)。

[0325] 表25：转基因WoodsCRW变体C398L玉蜀黍针对WCR的杀昆虫活性

[0326]

[0327]

[0328] ND＝未检测到；FH＝摄食孔；L＝轻度瘢痕；M＝中度瘢痕；H＝重度瘢痕；+＝优异的表现者；+/-＝良好的表现者；-＝差的表现者

[0329] 表26：转基因WoodsCRW变体C398Y玉蜀黍针对WCR的杀昆虫活性

[0330]

[0331]

[0332] ND＝未检测到；FH＝摄食孔；L＝轻度瘢痕；M＝中度瘢痕；H＝重度瘢痕；+＝优异的表现者；+/-＝良好的表现者；-＝差的表现者

[0333] 实例12：WoodsCRW与干扰RNA组合针对WCR具有杀昆虫活性

[0334] 如实例2中那样纯化WoodsCRW和/或WoodsCRW变体。制备针对必需靶标并已知具有杀昆虫活性的dsRNA。在非限制性实例中，dsRNA可靶向编码液泡ATP合酶、β-微管蛋白、26S蛋白体亚基p28蛋白、EF1α48D、肌钙蛋白I、跨膜四蛋白、γ-外被体、β-外被体和/或保幼激素环氧化物水解酶的基因(美国临时申请号62/371,259、62/371,261、和62/371,262；美国专利号7,812,219；各自通过引用并入本文)。在基本上如实例1所述进行的膳食掺入测定中测试dsRNA和纯化的蛋白质针对WCR的功效。

[0335] 应当理解的是，本文描述的实例和实施例仅是出于说明性的目的，并且根据其说明书的不同修改或变化将提示本领域的技术人员并且将会包含在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。

[0336] 在本说明书中提到的所有公开物和专利申请显示了本发明所属领域中的技术人员的技术水平。所有这些公开物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被具体地并单独地指明通过引用而被并入。