基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品
阅读：114发布：2020-05-12
专利汇可以提供基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞 治疗 产品，涉及 生物 技术、 基因治疗 和药物开发技术领域，本发明提供的基因修饰间充质干细胞的制备方法，包括使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到基因修饰间充质干细胞。该方法工艺简单，操作方便，可批量生产，且无需昂贵的仪器即可实现，能够有效节约成本。同时，应用本方法制备得到的基因修饰间充质干细胞修饰基因的表达与新鲜制备的细胞无明显差异，在节约时间成本的 基础 上，可保障修饰基因稳定地表达，从而进一步保证基因修饰间充质干细胞的活 力 和疗效。，下面是基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品专利的具体信息内容。
1.一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到所述基因修饰间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述修饰的时间为3h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒包括缺陷型重组腺病毒，优选包括Ad.HGF、Ad.DCN或Ad.luc。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒的感染复数为80-
150MOI，优选为100MOI。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
6.应用权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞。
7.如权利要求1-5任一项所述的制备方法或权利要求6所述的基因修饰间充质干细胞在制备细胞治疗产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞治疗产品包括细胞治疗药物；
优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。
9.一种细胞治疗产品，其特征在于，所述细胞治疗产品包括权利要求6所述的基因修饰间充质干细胞；
优选地，所述细胞治疗产品包括细胞治疗药物；
优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。
10.如权利要求9所述的细胞治疗产品在制备治疗百草枯中毒的产品中的应用。
基因修饰间充质干细胞、制备方法、应用及细胞治疗产品
技术领域
背景技术
[0002] 干细胞具有自我更新和定向分化潜能，已证实可促进多种组织损伤的修复，如放射性肺损伤、慢性肝损伤、溃疡性结肠炎等。而间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是重要的成体干细胞，具有高度自我更新能力、多向分化潜能和取材方便等优点而使其倍受关注，加上其具有免疫豁免的优势，MSCs是干细胞治疗的理想细胞类型。MSC在多种疾病的基础和临床研究中疗效显著，包括心肌梗塞、神经系统、糖尿病、软骨和骨损伤、克罗恩病、移植物抗宿主病(GVHD)等。然而，在疾病的损伤局部，往往存在显著的缺血缺氧、炎症、氧化应激等病理生理环境，可显著降低移植MSCs的存活和效能，进而影响MSCs的治疗效果难以达到预期。因此，通过基因修饰获得增强型MSCs，提升MSCs在损伤部位存活与植入，对于扩展和增强MSCs的应用与疗效具有重要意义。
[0003] MSCs在组织和器官损伤修复中的作用和机制，主要包括以下几个方面：(1)定向分化作用：MSCs可归巢至受损伤局部，在刺激因子的作用下，分化为特定类型细胞(如肠上皮细胞细胞等)，修复损伤组织并恢复组织功能；(2)免疫与炎症调节作用：MSCs能够抑制多种免疫细胞活性(如DC，T、B淋巴细胞和NK细胞等)，并抑制多种炎症因子的分泌(如IFN-γ、IL-12、TNF-α等)；同时，还能通过分泌IL-4、IL-10等多种抗炎因子，抑制巨噬细胞和T淋巴细胞功能，进而对抗IL-1、IL-6、IL-8等引起的炎症反应；(3)促进组织细胞的再生：通过释放多种生长因子，如血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)，胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF-1)，HGF等，发挥抗凋亡、促增殖、促血管生成等作用，进而达到促进组织修复的目的；(4)其他：MSCs还可通过多种机制抑制疾病的进展，如MSCs可以通过抑制I型和III型胶原的沉积以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1)等基因和蛋白的表达，抑制组织和器官纤维化进程。
[0004] MSCs虽然有广泛的炎症调节、组织修复与再生等功能，但其无法有效针对疾病发生、发展的关键分子或环节。因此，其临床疗效往往很难达到预期。通过基因修饰手段增强MSCs在损伤局部的定植与分化，抑制疾病发生发展的关键环节，对于提升MSCs的治疗效果具有重要意义。目前，基因修饰MSCs治疗研究处于起步阶段，大多数方案采用新鲜制备的细胞。新鲜制备细胞虽然具有细胞活力高等优势，但也存在制备成本高(不能批量生产)、质量控制困难(细胞制备后质检时间有限)、成药性差等缺陷。建立一种可冻存的、高效的基因修饰MSCs产品的制备方法，对于提高MSCs的成药性具有重要意义。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供由上述制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供上述制备方法或基因修饰间充质干细胞在制备细胞治疗产品中的应用。
[0009] 本发明的第四个目的在于提供一种细胞治疗产品。
[0010] 本发明的第五个目的在于提供上述细胞治疗产品在制备治疗百草枯中毒的产品中的应用。
[0011] 本发明提供了一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括：使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到所述基因修饰间充质干细胞。
[0012] 进一步的，所述修饰的时间为3h。
[0013] 进一步的，所述重组腺病毒包括缺陷型重组腺病毒，优选包括Ad.HGF、Ad.DCN或Ad.luc。
[0014] 进一步的，所述重组腺病毒的感染复数为80-150MOI，优选为100MOI。
[0015] 进一步的，所述间充质干细胞包括牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
[0016] 本发明还提供了应用上述的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞。
[0017] 本发明还提供了上述的制备方法或基因修饰间充质干细胞在制备细胞治疗产品中的应用。
[0018] 进一步的，所述细胞治疗产品包括细胞治疗药物；
[0019] 优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。
[0020] 本发明还提供了一种细胞治疗产品，所述细胞治疗产品包括上述的基因修饰间充质干细胞；
[0021] 优选地，所述细胞治疗产品包括细胞治疗药物；
[0022] 优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。
[0023] 本发明还提供了上述的细胞治疗产品在制备治疗百草枯中毒的产品中的应用。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0025] 本发明提供的基因修饰间充质干细胞的制备方法，包括使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到基因修饰间充质干细胞。该方法工艺简单，操作方便，可批量生产，且无需昂贵的仪器即可实现，能够有效节约成本。重组腺病毒具有宿主范围广的优点，可广泛适用于不同间充质干细胞的修饰，且应用重组腺病毒修饰后的间充质干细胞能够对疾病发生、发展的关键分子或环节，有效提升治疗效果。同时，该制备方法在重组腺病毒对间充质干细胞修饰2-4h后冻存即可，质检时间充裕，能够有效控制基因修饰间充质干细胞的质量。且相比于更长的修饰时间如修饰24h或48h后再冻存，应用本方法制备得到的基因修饰间充质干细胞修饰基因的表达与新鲜制备的细胞无明显差异，在节约时间成本的基础上，可保障修饰基因稳定地表达，从而进一步保证基因修饰间充质干细胞的活力和疗效。
[0026] 本发明提供的基因修饰间充质干细胞，应用本发明提供的制备方法制备得到，该基因修饰间充质干细胞可作为原液在液氮长期保存，复苏后不影响其目的基因的表达效率及在体内的存活，可有效提升基因修饰间充质干细胞的成药性。
[0027] 此外，本发明的发明人通过实验发现，应用本发明提供的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞，在百草枯中毒小鼠的治疗中，与单纯的间充质干细胞相比，可显著提升小鼠的存活率，有望扩展基因修饰间充质干细胞的临床应用，提升百草枯中毒的救治水平。附图说明
[0028] 图1A为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞PE标记异型对照的流式细胞术检测结果；
[0029] 图1B为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞HLA-DR的流式细胞术检测结果；
[0030] 图1C为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD105的流式细胞术检测结果；
[0031] 图1D为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞FITC标记异型对照的流式细胞术检测结果；
[0032] 图1E为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD45的流式细胞术检测结果；
[0033] 图1F为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD19的流式细胞术检测结果；
[0034] 图1G为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD34的流式细胞术检测结果；
[0035] 图1H为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD11b的流式细胞术检测结果；
[0036] 图1I为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD73的流式细胞术检测结果；
[0037] 图1J为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞CD90的流式细胞术检测结果；
[0038] 图2为本发明实施例2提供的牙髓间充质干细胞成骨(左)分化和成脂分化(右)能力检测结果；
[0039] 图3为本发明实施例4提供的不同工艺制备Ad.HGF基因修饰牙髓间充质干细胞后，HGF表达检测结果；
[0040] 图4A为本发明实施例5提供的感染后3h冻存制备Ad-luc基因修饰牙髓间充质干细胞裸鼠皮下移植后，活体成像检测结果；
[0041] 图4B为本发明实施例5提供的感染后24h冻存制备Ad-luc基因修饰牙髓间充质干细胞裸鼠皮下移植后，活体成像检测结果；
[0042] 图5为本发明实施例5提供的不同工艺制备Ad-luc基因修饰牙髓间充质干细胞裸鼠皮下移植后，活体成像检测统计分析结果；
[0043] 图6为本发明实施例6提供的基因修饰脐带间充质干细胞的细胞表型检测结果；
[0044] 图7为本发明实施例6提供的基因修饰脐带间充质干细胞的成骨(左)分化和成脂(右)分化能力检测结果；
[0045] 图8为本发明实施例7提供的基因修饰牙髓间充质干细胞治疗百草枯小鼠的生存率比较。
具体实施方式
[0046] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0047] 除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
[0048] 一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
[0049] 通过基因修饰的手段增强间充质干细胞，对于提升充质干细胞的治疗效果具有重要意义，然而目前所采用的间充质干细胞基因修饰手段通常需要新鲜制备的细胞，普遍存在成本较高、质量难控的问题。基于此，根据本发明的第一个方面，提供了一种基因修饰间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括：使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰，修饰2-4h后冻存，得到所述基因修饰间充质干细胞。
[0050] 本发明提供的基因修饰间充质干细胞的制备方法，工艺简单，操作方便，可批量生产，且无需昂贵的仪器即可实现，能够有效节约成本。重组腺病毒具有宿主范围广的优点，可广泛适用于不同间充质干细胞的修饰，且重组腺病毒能够有效增殖，滴度较高，更适于提升基因修饰间充质干细胞的应用效果，应用重组腺病毒修饰后的间充质干细胞能够对疾病发生、发展的关键分子或环节，有效提升治疗效果。同时，该制备方法在重组腺病毒对间充质干细胞修饰2-4h后冻存即可，质检时间充裕，能够有效控制基因修饰间充质干细胞的质量。且相比于更长的修饰时间如修饰24h或48h后再冻存，应用本方法制备得到的基因修饰间充质干细胞修饰基因的表达与新鲜制备的细胞无明显差异，在节约时间成本的基础上，可保障修饰基因稳定地表达，从而进一步保证基因修饰间充质干细胞的活力和疗效。
[0051] 需要进行说明的是，在本发明中，重组腺病毒来源于重组腺病毒质粒载体，对进行修饰的重组腺病毒不做限定，凡是通过修饰能够提升间充质干细胞的应用效果的重组腺病毒均在本发明的保护范围之内。本发明使用重组腺病毒对间充质干细胞进行修饰具有如下优势：(1)基因容量大：可将整个表达框插入，实现生理水平表达，或同时表达多个目的基因；(2)基因表达效率高；(3)重组腺病毒易制备高滴度产品，成本低；(4)安全性高：不整合入基因组。
[0052] 为了提升该基因修饰间充质干细胞的安全性，在一些优选的实施方式中，所述重组腺病毒包括缺陷型重组腺病毒，缺陷型重组腺病毒能够在有效修饰的基础上，避免病毒的长期大量克隆，从而能够进一步增强制备得到的基因修饰间充质干细胞的使用安全性。
[0053] 优选地，重组腺病毒包括Ad.HGF、Ad.DCN或Ad.luc。
[0054] 在一些优选的实施方式中，所述重组腺病毒的感染复数为80-150MOI，例如可以为，但不限于80MO、90MOI、100MOI、110MOI、120MOI、130MOI、140MOI或150MOI，当重组腺病毒的感染复数在上述范围内时，更能够保证制备得到的基因修饰间充质干细胞中修饰基因稳定地表达。
[0055] 优选地，重组腺病毒的感染复数为100MOI。
[0056] 本发明的发明人通过对重组腺病毒的感染复数进行进一步的调整和优化，发现采用100MOI重组腺病毒对间充质干细胞进行基因修饰后，直接移植或者冻存后移植对细胞的存活、目的基因的表达更无显著影响。
[0057] 需要进行说明的是，在本发明中，修饰的时间例如可以为，但不限于2h、2.2h、2.5h、2.8h、3h、3.2h、3.5h、3.8h或4h。间充质干细胞在使用重组腺病毒修饰2-4h后再进行冻存，复苏后具有较高的修饰基因的表示水平和移植后的体内存活。
[0058] 优选地，修饰的时间为3h。
[0059] 本发明的发明人进一步发现，与修饰后更长时间如24h或48h冻存相比，重组腺病毒基因修饰后3h冻存，可以进一步提高其修饰基因的表示水平和移植后的体内存活。
[0060] 需要进行说明的是，在本发明中，对修饰的间充质干细胞不做限定，优选地，可以对牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞进行修饰。
[0061] 根据本发明的第二个方面，还提供了应用上述的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞。
[0062] 本发明提供的基因修饰间充质干细胞，应用本发明提供的制备方法制备得到，该基因修饰间充质干细胞可作为原液在液氮长期保存，复苏后不影响其目的基因的表达效率及在体内的存活，可有效提升基因修饰间充质干细胞的成药性。
[0063] 根据本发明的第三个方面，还提供了上述的制备方法或基因修饰间充质干细胞在制备细胞治疗产品中的应用。
[0064] 间充质干细胞具有广泛的炎症调节、组织修复与再生等功能，在多种疾病的基础和临床研究中均有显著的疗效，通过本发明提供的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞，其修饰基因的表达率及其在体内的存活率均较高，因此可应用其制备如HGF修饰牙髓间充质干细胞注射液、DCN修饰牙髓间充质干细胞注射液等细胞治疗产品。
[0065] 在一些优选的实施方式中，所述细胞治疗产品包括细胞治疗药物。
[0066] 优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。
[0067] 根据本发明的第四个方面，还提供了一种细胞治疗产品，所述细胞治疗产品包括上述的基因修饰间充质干细胞。
[0068] 基于本发明提供的基因修饰间充质干细胞的修饰基因表达率及其在体内的存活率均较高，可有效提升基因修饰间充质干细胞的成药性，因此，包含本发明提供的基因修饰间充质干细胞的细胞治疗产品，能够有效对疾病发生、发展的关键分子或环节，具有较高的活力和较好的疗效。
[0069] 此外，根据本发明的第五个方面，还提供了上述的细胞治疗产品在制备治疗百草枯中毒的产品中的应用。
[0070] 本发明的发明人通过实验发现，应用本发明提供的制备方法制备得到的基因修饰间充质干细胞，在百草枯中毒小鼠的治疗中，与单纯的间充质干细胞相比，可显著提升小鼠的存活率，有望扩展基因修饰间充质干细胞的临床应用，提升百草枯中毒的救治水平。
[0071] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0072] 本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：
[0073] 超净工作台[Thermo，1300]；二氧化碳培养箱[Thermo，311]；倒置显微镜[BM-37XB]；细胞计数仪[Countstar-IC1000]；低温水平离心机[Thermo，Sorvall ST 8R]；生物安全柜[Thermo，1300SERIES A2]；流式细胞术[BD Bioscience,FACS calibur]；
[0074] 主要试剂：
[0075]试剂 品牌 批号
氯化钠注射液 四药 1710223102
0.25％胰蛋白酶 GIBCO 1836501
0.4％台盼蓝 GIBCO 1854966
无血清冻存液MSC Freezing BI 1823345
重组腺病毒 公司自制
氯化钠注射液 四药 1710223102
0.25％胰蛋白酶 GIBCO 1836501
0.4％台盼蓝 GIBCO 1854966
无血清冻存液MSC Freezing BI 1823345
重组腺病毒 公司自制
[0076] 实施例1牙髓间充质干细胞的分离和培养
[0077] 经供者签署知情同意书，在取得《医疗机构执业许可证》的具有供者筛查能力的医疗机构，由持有医师或护士执业证书的经验丰富的医护人员，按照诊疗常规，在麻醉下无菌拔除无龋齿、无牙髓炎和牙髓坏死的第三磨牙。新鲜拔除的牙齿立即放入符合要求的牙齿采集瓶(装有20ml无菌生理盐水)中，24h内分离培养牙髓间充质干细胞。具体方法为：剪碎牙冠后取牙髓组织，经生理盐水反复冲洗后剪碎成1mm3左右的小块；置于含3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml Dispase的生理盐水中，37℃水浴摇床消化40min；经70μm细胞筛过筛后，1000rpm离心10min，收集细胞；用适量含20％胎牛血清的α-MEM培养基重悬成单细胞悬液，将细胞接种于10cm培养皿中，于37℃、5％CO2培养，3-5天换液一次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况，12-16天后，将克隆性生长的细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，得到P0代牙髓间充质干细胞。
[0078] 实施例2牙髓间充质干细胞的鉴定与扩增
[0079] 收集实施例1获得的P0代间充质干细胞(牙髓、脐带、骨髓、脂肪)以8000细胞/cm2的密度进行传代，培养4d后，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，继续传代。传代至P5代，进行细胞表型、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)，以及多项分化(成骨分化和成脂分化)潜能检测。
[0080] (1)免疫表型检测
[0081] 间充质干细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，采用FITC或PE标记的CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等抗体及相应的同型对照抗体标记细胞，流式细胞仪检测。检测结果参见图1A-图1J，牙髓间充质干细胞高表达间充质干细胞特异性抗原CD73、CD90及CD105，不表达造血及免疫细胞表面标志CD11b、CD19、CD34、CD45，几乎不表达移植免疫排斥相关的表面标志HLA-DR。这些结果提示，通过实施例1的分离方法成功获得高纯度的牙髓MSCs。
[0082] (2)PGE2表达
[0083] PGE2是一种重要的细胞生长和调节因子，在间充质干细胞介导的免疫和炎症调节过程中发挥重要作用。P4代牙髓间充质干细胞按照8000细胞/cm2的密度接种75cm2培养瓶后，37℃、5％CO2培养4d，收集上清，采用ELISA检测试剂盒检测PGE2的表达，结果表明，PGE2的表达量大于200pg/ml。
[0084] (3)多向分化潜能检测
[0085] 成骨分化：将P5代牙髓间充质干细胞，以1×104细胞/孔接种24孔培养板，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞达到80％左右融合度后，加入成骨诱导液，每4天换液。诱导21天后用茜素红染色进行鉴定。
[0086] 成脂分化：将P5代牙髓间充质干细胞，以1.5×104细胞/孔接种24孔培养板，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24小时后，加入成脂诱导液，每4天换液。诱导14天后用油红O(Oil Red O)染色进行鉴定。
[0087] 检测结果参见图2，表明分离获得的牙髓间充质干细胞具有成骨及成脂分化潜能。综上，本发明实施例1成功分离并扩增获得了高质量的牙髓间充质干细胞。
[0088] 实施例3牙髓间充质干细胞基因修饰及冻存工艺
[0089] P5代牙髓间充质干细胞按照16000细胞/cm2的密度接种175cm2的培养瓶，于置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养48h，待细胞达到70％-80％融合度，加入100MOI(IU/细胞)的重组腺病毒载体(Ad.HGF，Ad.DCN和Ad.luc)，共同孵育3h后：(1)用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，采用无血清冻存液冻存细胞；(2)弃含有病毒液的培养基，用生理盐水洗涤两次后，加入间充质干细胞无血清培养基继续培养至24h，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，采用无血清冻存液冻存细胞。感染后3h及感染后24h，牙髓间充质干细胞状态良好。
[0090] 实施例4冻存工艺对牙髓间充质干细胞活率及外源基因表达的影响
[0091] Ad.HGF基因修饰的牙髓间充质干细胞冻存2周后，复苏细胞，计数并计算细胞活率。结果如表1所示，表明重组腺病毒介导的基因修饰(HGF和luciferase)对牙髓间充质干细胞冻存后的细胞活率无明显影响。
[0092] 表1 Ad.HGF基因修饰细胞冻存前后细胞活率
[0093]
[0094] 复苏的细胞，按照8000细胞/cm2的密度接种6孔板；以新鲜的、感染Ad.HGF 3h和48h后的细胞为对照。将其置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养24h或48h，收集上清；4℃，3000rpm离心10min，吸取上清，-80℃冻存待用。
[0095] 采用ELISA检测试剂盒检测上清中HGF的浓度，结果如图3所示，可见感染后24h冻存组，其培养后24h和48h的HGF表达量显著低于新鲜制备的基因修饰细胞；然而，感染后3h冻存组，其培养后24h和48h的HGF表达量与新鲜制备的基因修饰细胞相当，甚至高于新鲜制备的细胞。
[0096] 实施例5冻存工艺对基因修饰牙髓间充质干细胞体内存活的影响
[0097] 基于体外研究的结果，采用Ad.luc基因修饰的牙髓间充质干细胞进行体内移植研究。分别按照实施例3的方法，制备感染后3h冻存的基因修饰牙髓间充质干细胞(DPSC.luc.F3h)和感染后24h收集的新鲜的基因修饰牙髓间充质干细胞(DPSC.luc.N3h)，然后采用皮下移植方式，移植裸鼠皮下，采用活体成像技术观察牙髓间充质干细胞的存活时间。检测结果参见图4A、图4B和图5，可见移植后不同时间点，DPSC.luc.F3h移植组的荧光强度与DPSC.luc.N3h相当，甚至高于DPSC.luc.N3h，表明基因修饰以后3h冻存，对于牙髓间充质干细胞的存活及修饰基因的表达无显著影响。
[0098] 实施例6冻存工艺对基因修饰脐带间充质干细胞的影响
[0099] (1)脐带间充质干细胞的分离培养
[0100] 产妇同意并签署知情同意书后，将脐带存于装有含有300mlα-MEM培养基无菌玻璃瓶中，于4℃储存，并于收集后24小时内分离培养脐带干细胞。用无菌生理盐水反复清洗，并剪切成2cm左右的片段，并剔脐静脉和脐动脉，取胶冻状的Wharton’s jelly部分；将其剪碎成5mm3大小组织块，用滴管依次摆放组织块于预先润湿的10cm培养皿中，加入少量无血清培养基后，于37℃、5％CO2培养48h；补液后继续培养，每3-4天换液一次；7-10天可见长梭形细胞爬出；10～14天，去除组织块，将克隆性生长的细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，得到P0代脐带间充质干细胞。
[0101] (2)脐带间充质干细胞的基因修饰
[0102] 按照牙髓间充质干细胞基因修饰方法，采用100MOI重组腺病毒载体Ad.HGF感染脐带间充质干细胞，共同孵育3h后，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，采用无血清冻存液冻存细胞。
[0103] (3)免疫表型检测
[0104] 冻存14天后，复苏基因修饰脐带间充质干细胞，按照16000细胞/cm2的密度接种6孔板，培养48h后，经0.25％胰蛋白酶消化后，采用FITC或PE标记的CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等抗体及相应的同型对照抗体标记细胞，流式细胞仪检测。检测结果参见图6，这些结果提示，通过基因修饰及冻存工艺对脐带间充质干细胞表型无明显影响。
[0105] (4)多向分化潜能检测
[0106] 按照实施例2的方法，对基因修饰脐带间充质干细胞的成骨和成脂能力进行检测。检测结果参见图7，表明基因修饰和冻存工艺对脐带间充质干细胞的成骨及成脂分化潜能无显著影响。
[0107] 实施例7基因修饰牙髓间充质干细胞对百草枯中毒的治疗效果评价
[0108] 雌性C57BL/6J小鼠经检疫合格后，按体重进行分层随机分组，包括：溶媒对照组、6
模型对照组、脐带间充质干细胞组，牙髓间充质干细胞组(1×10)、HGF基因修饰牙髓间充质干细胞组(DPSC.HGF)(1×106)、decorin修饰牙髓间充质干细胞组(DPSC.DCN)(1×106)。
造模前所有动物禁食过夜(12小时以上，不禁水)，溶媒对照组灌胃给予灭菌注射用水，其他各组灌胃给予150mg/kg的PQ进行造模，造模后约2小时开始给予饲料正常喂养。分别于D1(PQ造模后)、D3天给予细胞，第28天安乐死所有存活动物。动物的生存曲线参见图8，提示牙髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞均可一定程度提升小鼠的存活率，而通过实施例3制备的基因修饰牙髓间充质干细胞具有更加显著的优势。
模型对照组、脐带间充质干细胞组，牙髓间充质干细胞组(1×10)、HGF基因修饰牙髓间充质干细胞组(DPSC.HGF)(1×106)、decorin修饰牙髓间充质干细胞组(DPSC.DCN)(1×106)。
造模前所有动物禁食过夜(12小时以上，不禁水)，溶媒对照组灌胃给予灭菌注射用水，其他各组灌胃给予150mg/kg的PQ进行造模，造模后约2小时开始给予饲料正常喂养。分别于D1(PQ造模后)、D3天给予细胞，第28天安乐死所有存活动物。动物的生存曲线参见图8，提示牙髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞均可一定程度提升小鼠的存活率，而通过实施例3制备的基因修饰牙髓间充质干细胞具有更加显著的优势。
[0109] 总之，通过100MOI重组腺病毒载体进行基因修饰后3h冻存，对于包括牙髓间充质干细胞在内的间充质干细胞的活力和修饰基因的表达均无明显影响，可保障基因修饰细胞的治疗效果。
[0110] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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