含有4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和有机酸化合物的抗微
生物混合物、以及含有该抗微生物混合物的化妆品组合物
[0001] 本
发明的主题是一种含有4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和特定的
有机酸化合物的抗微生物混合物，以及还有含有此混合物的化妆品组合物。
[0002] 如在
申请WO 2011/039445中所述的，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(酮化合物)是作为化妆品组合物的
防腐剂的令人感兴趣的物质，用于保护组合物免遭微
生物污染。
[0003] 然而，希望能够以降低的浓度将所述酮化合物结合到组合物中，尤其是化妆品组合物或
皮肤病学组合物，而同时保持良好的抗微生物保存性能。因此，为此目的，寻求酮化合物与其他具有抗微生物功效的化合物的组合。
[0004] 诸位
发明人已经出乎意料地发现4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与有机酸化合物的组合使得能够获得具有协同抗微生物活性的抗微生物混合物，所述有机酸化合物选自如下所定义的苯
甲酸盐(如
苯甲酸钠)、山梨酸或其盐、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸丙酯、5-正辛酰基
水杨酸、氧肟酸、脱氢乙酸或其盐。
[0005] 如下所述的实例的结果显示了用几种混合物进行的最小抑制浓度(MIC)测量获得的协同抗微生物活性。当抗微生物混合物使得能够获得小于或等于20％、或者甚至小于或等于25％的菌株生长百分比时，抗微生物活性被认为是协同的。
[0006] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与苯甲酸盐(如苯甲酸钠)的组合使得能够获得，特别是对
酵母，特别是对白色念珠菌，对革兰氏阴性菌，特别是对
铜绿假单胞菌，以及对
革兰氏阳性菌，特别是对金黄色葡萄球菌具有协同抗微生物活性的抗微生物混合物。
[0007] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与山梨酸或其盐的组合使得能够获得，特别是对霉菌，特别是对黑曲霉，以及对革兰氏阳性菌，特别是对粪肠球菌具有协同抗微生物活性的抗微生物混合物。此外，与山梨酸的混合物还对酵母，特别是对白色念珠菌，以及对革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌具有协同的抗微生物活性。
[0008] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与4-羟基苯甲酸甲酯或4-羟基苯甲酸丙酯的组合使得能够获得，特别是对酵母，特别是对白色念珠菌，以及对革兰氏阴性菌，特别是对铜绿假单胞菌具有协同抗微生物活性的抗微生物混合物。此外，与4-羟基苯甲酸甲酯的混合物也对革兰氏阳性菌，特别是对金黄色葡萄球菌以及对粪肠球菌具有协同抗微生物活性。此结果是出人意料的，因为一方面，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与4-羟基苯甲酸乙酯的混合物，以及另一方面，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与4-羟基苯甲酸丁酯的混合物不具有协同抗微生物活性。
[0009] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与5-正辛酰基水杨酸的组合使得能够获得，特别是对霉菌，特别是对黑曲霉，以及对革兰氏阳性菌，特别是对粪肠球菌具有协同抗微生物活性的抗微生物混合物。此外，与5-正辛酰基水杨酸的混合物还对酵母，特别是对白色念珠菌，以及对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有协同的抗微生物活性。
[0010] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与如下所定义的氧肟酸、特别是辛基氧肟酸的组合使得能够获得，特别是对霉菌，尤其是对黑曲霉具有协同抗微生物活性的抗微生物混合物。
[0011] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与脱氢乙酸或其盐、特别是脱氢乙酸钠的组合使得能够获得，特别是对霉菌、特别是对黑曲霉，以及对酵母、特别是对白色念珠菌具有协同抗微生物活性的抗微生物混合物。
[0012] 更确切地说，本发明的主题是一种抗微生物混合物，所述抗微生物混合物包含4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和有机酸化合物或由其构成，所述有机酸化合物选自：
[0013] i)苯甲酸盐；
[0014] ii)山梨酸或其盐；
[0015] iii)4-羟基苯甲酸甲酯或4-羟基苯甲酸丙酯；
[0016] iv)5-正辛酰基水杨酸；
[0017] v)式(I)的氧肟酸或其盐：
[0018] R-C(＝O)-NH-OH(I)
[0019] 其中R表示直链或支链、饱和或不饱和C5至C11
烃基；
[0020] vi)脱氢乙酸或其盐。
[0021] 术语“有机酸化合物”旨在意指先前提及的化合物可以是
羧酸、羧酸盐或羧酸酯。
[0022] 本发明的主题还是一种组合物、特别是化妆品组合物或皮肤病学组合物，其在生理学上可接受的介质中包含先前所述的所述混合物。
[0023] 本发明的另一个主题是一种用于
角蛋白材料的非
治疗性美容处理的方法，所述方法包括向角蛋白材料施用如先前所述的组合物。所述方法可以是用于护理或化妆或清洁角蛋白材料的美容方法。
[0024] 本发明的主题还是一种用于保存包含生理学上可接受的介质的组合物的方法，特别是化妆品组合物或皮肤病学组合物，其特征在于，所述方法包括将如先前所述的抗微生物混合物结合到所述组合物中。
[0025] 本发明的主题还是先前所述的抗微生物混合物用于保存包含生理学上可接受的介质的组合物的用途。
[0026] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮是具有下式的化合物
[0027]
[0028] 根据第一
实施例，本发明的主题是一种抗微生物混合物，所述抗微生物混合物包含4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和苯甲酸盐，或由其构成。
[0029] 所述苯甲酸盐可以选自
碱金属(钠、
钾)盐，碱土金属(
钙、镁)盐或单
乙醇胺或铵盐。优选地，其是钠盐：苯甲酸钠。
[0030] 有利地，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和苯甲酸盐以一定含量存在于所述混合物中，所述含量使得4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/苯甲酸盐重量比是0.1至3、优选0.1至1.5、优选0.2至1.5并且更优选0.2至1.2。
[0031] 抗微生物混合物可以具有0.2至3、优选0.2至2.2并且优选0.2至1.5的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/苯甲酸盐重量比。此混合物对革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抗微生物活性。
[0032] 抗微生物混合物可以具有0.2至1.5、优选0.2至0.7的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/苯甲酸盐重量比。此混合物对酵母、特别是对白色念珠菌具有良好的抗微生物活性。
[0033] 抗微生物混合物可以具有0.1至1.5、优选0.1至1.1的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/苯甲酸盐重量比。此混合物对革兰氏阴性菌、特别是对铜绿假单胞菌具有良好的抗微生物活性。
[0034] 根据第二实施例，本发明的主题是一种抗微生物混合物，所述抗微生物混合物包含4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和山梨酸或其盐，或由其构成。
[0035] 山梨酸对应于式CH3-CH＝CH-CH＝CH-COOH的化合物己-2,4-二烯酸(CAS编号：110-44-1)。
[0036] 所述山梨酸盐可以选自碱金属(钠、钾)盐，碱土金属(钙、镁)盐或三乙醇胺盐。优选地，其是
钾盐：山梨酸钾。
[0037] 有利地，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和山梨酸或其盐以一定含量存在于所述混合物中，所述含量使得4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/山梨酸或其盐的重量比是0.1至2.5、优选0.1至1.5、优选0.2至1.5并且更优选0.2至1.2。
[0038] 根据本发明的抗微生物混合物特别是对霉菌、尤其是对黑曲霉，以及对革兰氏阳性菌、特别是对粪肠球菌具有协同抗微生物活性。此外，与山梨酸的混合物还对酵母，特别是对白色念珠菌，以及对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有协同的抗微生物活性。
[0039] 根据本发明的实施的第一变体，抗微生物混合物包括山梨酸。
[0040] 抗微生物混合物可以具有0.1至1.5、并且优选0.2至1.2的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/山梨酸重量比。此混合物对革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抗微生物活性。
[0041] 抗微生物混合物可以具有0.1至1.5、优选0.4至1.2的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/山梨酸重量比。此混合物对酵母、特别是对白色念珠菌具有良好的抗微生物活性。
[0042] 抗微生物混合物可以具有0.1至0.8、优选0.2至0.6的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/山梨酸重量比。此混合物物对霉菌、尤其是对黑曲霉具有良好的抗微生物活性。
[0043] 抗微生物混合物可以具有0.15至0.4、优选0.2至0.3的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/山梨酸重量比。此混合物对革兰氏阳性菌粪肠球菌具有良好的抗微生物活性。
[0044] 根据本发明的实施的第二变体，抗微生物混合物包括山梨酸钾。
[0045] 抗微生物混合物可以具有0.1至1.5、优选0.1至1.2的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/山梨酸钾重量比。此混合物对革兰氏阳性菌粪肠球菌具有良好的抗微生物活性。
[0046] 抗微生物混合物可以具有0.3至2.5、优选0.3至1.5的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/山梨酸钾重量比。此混合物物对霉菌、尤其是对黑曲霉具有良好的抗微生物活性。
[0047] 根据第三实施例，本发明的主题是一种抗微生物混合物，所述抗微生物混合物包含4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和4-羟基苯甲酸酯(选自4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸丙酯)，或由其构成。
[0048] 4-羟基苯甲酸酯，随后称为“酯化合物”，选自4-羟基苯甲酸甲酯和4-羟基苯甲酸丙酯。
[0049] 有利地，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和酯化合物以一定含量存在于所述混合物中，所述含量使得4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/酯化合物重量比是0.3至5、优选0.4至4.5。
[0050] 根据本发明的抗微生物混合物，特别是对酵母、特别是对白色念珠菌、以及对革兰氏阴性菌、特别是对铜绿假单胞菌具有协同抗微生物活性。此外，与4-羟基苯甲酸甲酯的混合物也对革兰氏阳性菌、特别是对金黄色葡萄球菌以及对粪肠球菌具有协同抗微生物活性。
[0051] 根据本发明的实施的第一变体，抗微生物混合物包括4-羟基苯甲酸甲酯。
[0052] 抗微生物混合物可以具有0.1至1.5、优选0.2至1.5并且优选0.4至1.2的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/4-羟基苯甲酸甲酯重量比。此混合物对酵母、特别是对白色念珠菌具有良好的抗微生物活性。
[0053] 抗微生物混合物可以具有0.4至3、优选0.4至2.2的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/4-羟基苯甲酸甲酯重量比。此混合物对革兰氏阴性菌、尤其是对铜绿假单胞菌具有良好的抗微生物活性。
[0054] 抗微生物混合物可以具有0.1至0.8、优选0.1至0.6的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/4-羟基苯甲酸甲酯重量比。此混合物对革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抗微生物活性。
[0055] 抗微生物混合物可以具有0.1至1.5的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/4-羟基苯甲酸甲酯重量比。此混合物对革兰氏阳性菌粪肠球菌具有良好的抗微生物活性。
[0056] 根据本发明的实施的第二变体，抗微生物混合物包括4-羟基苯甲酸丙酯。
[0057] 抗微生物混合物可以具有0.3至1.5、优选0.4至1.2的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/4-羟基苯甲酸丙酯重量比。此混合物对酵母、特别是对白色念珠菌具有良好的抗微生物活性。
[0058] 抗微生物混合物可以具有0.7至5、优选0.8至4.5的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/4-羟基苯甲酸丙酯重量比。此混合物对革兰氏阴性菌、尤其是对铜绿假单胞菌具有良好的抗微生物活性。
[0059] 根据第四实施例，本发明的主题是一种抗微生物混合物，所述抗微生物混合物包含4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和5-正辛酰基水杨酸，或由其构成。
[0060] 5-正辛酰基水杨酸也称为辛酰基水杨酸。其对应于化合物CAS编号78418-01-6。
[0061] 有利地，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和5-正辛酰基水杨酸或其盐以一定含量存在于所述混合物中，所述含量使得4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/5-正辛酰基水杨酸重量比是0.5至60、优选0.5至50、优选0.5至45。
[0062] 根据本发明的抗微生物混合物，特别是对霉菌、尤其是对黑曲霉，对酵母、特别是对白色念珠菌，以及对革兰氏阳性菌、特别是对粪肠球菌具有协同抗微生物活性。
[0063] 抗微生物混合物可以具有3至12、优选3至10的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/5-正辛酰基水杨酸重量比。此混合物对霉菌、尤其是对黑曲霉具有协同抗微生物活性。
[0064] 抗微生物混合物可以具有0.5至12、优选0.5至10的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/5-正辛酰基水杨酸重量比。此混合物对酵母、尤其是对白色念珠菌具有协同抗微生物活性。
[0065] 抗微生物混合物可以具有7至60、优选8至50并且优选9至45的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/5-正辛酰基水杨酸重量比。此混合物对革兰氏阳性菌粪肠球菌具有协同抗微生物活性。
[0066] 根据第五实施例，本发明的主题是一种抗微生物混合物，所述抗微生物混合物包含4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和式(I)的氧肟酸或其盐，或由其构成：
[0067] R-C(＝O)-NH-OH(I)
[0068] 其中R表示直链或支链、饱和或不饱和C5至C11烃基。
[0069] 根据本发明考虑的氧肟酸是具有通式(I)的化合物：
[0070] R-C(＝O)-NH-OH(I)
[0071] 其中：
[0072] R表示直链或支链、饱和或不饱和C5-C11烃基。
[0073] 这些化合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如根据文献WO2009/070736中描述的制备方法获得。
[0074] 根据一个实施例，根据本发明的氧肟酸更特别地选自己基氧肟酸(caprohydroxamic acid)、辛基氧肟酸、癸基氧肟酸和月桂基氧肟酸、或它们的混合物。
[0075] 所述式(I)的氧肟酸的盐可以选自碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，或铵盐。
[0076] 根据一个优选的实施例，在根据本发明的组合物中使用的氧肟酸是辛基氧肟酸。
[0077] 有利地，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和氧肟酸(I)可以一定含量存在于所述混合物中，所述含量使得4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/氧肟酸(I)(优选辛基氧肟酸)重量比是4至150、优选30至130、优选45至130、更优选60至130、特别是90至130、并且特别是95至120。
[0078] 有利地，抗微生物混合物包括1,3-丙二醇，特别是根据5至20、优选8至17、并且仍更好地10至15的1,3-丙二醇/氧肟酸(I)重量比。
[0079] 根据本发明的抗微生物混合物，特别是对霉菌、尤其是对黑曲霉具有协同抗微生物活性。
[0080] 优选地，根据本发明的抗微生物混合物含有辛基氧肟酸。
[0081] 根据一个优选的实施例，抗微生物混合物含有氧肟酸和1,3-丙二醇。优选地，此混合物具有5至20、优选8至17、并且仍更好地10至15的1,3-丙二醇/辛基氧肟酸重量比。
[0082] 根据第六实施例，本发明的主题是一种抗微生物混合物，所述抗微生物混合物包含4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和脱氢乙酸或其盐，或由其构成。
[0083] 脱氢乙酸对应于化合物：
[0084]
[0085] 所述脱氢乙酸盐可以选自碱金属(钠、钾)盐。优选地，其是钠盐：脱氢乙酸钠。
[0086] 有利地，4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮和脱氢乙酸或其盐以一定含量存在于所述混合物中，所述含量使得4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/脱氢乙酸或其盐(优选脱氢乙酸钠)的重量比是4至60、优选5至50。
[0087] 根据本发明的抗微生物混合物，特别是对霉菌、尤其是对黑曲霉，以及对酵母、特别是对白色念珠菌具有协同抗微生物活性。
[0088] 优选地，根据本发明的抗微生物混合物含有脱氢乙酸钠。
[0089] 抗微生物混合物可以具有10至60、优选15至50的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/脱氢乙酸钠重量比。此混合物对酵母、特别是对白色念珠菌具有良好的抗微生物活性。
[0090] 抗微生物混合物可以具有4至40、优选5至30的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮/脱氢乙酸钠重量比。此混合物物对霉菌、尤其是对黑曲霉具有良好的抗微生物活性。
[0091] 本发明的主题还是一种组合物，其在生理学上可接受的介质中包含先前所述的抗微生物混合物。
[0092] 术语“生理学上可接受的介质”意指与人角蛋白材料如皮肤、头皮、毛发以及指甲可相容的介质。除了先前所述的有机酸化合物之外，所述介质可以包含一种或多种附加成分。
[0093] 化合物4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮可以相对于所述组合物的总重量按重量计0.01％至5％、优选按重量计0.01％至3％、优选按重量计0.01％至2.5％并且更优选按重量计0.01％至2％的量存在于根据本发明的组合物中。
[0094] 本发明的主题还是一种组合物，其在生理学上可接受的介质中包含先前所述的抗微生物混合物。
[0095] 术语“生理学上可接受的介质”意指与人角蛋白材料如皮肤、头皮、毛发以及指甲可相容的介质。除了先前所述的酮化合物或有机酸化合物之外，所述介质可以包含一种或多种附加成分。
[0096] 组合物可以包含至少一种选自以下项的附加成分：水、油、含有2至10个
碳原子的多元醇、
胶凝剂、
表面活性剂、成膜
聚合物、
着色剂、芳香剂、填料、UV遮蔽剂、
植物提取物、化妆品和皮肤病学活性剂、以及盐。
[0097] 根据本发明的组合物可以包含水相。
[0098] 组合物可以包含水，所述水可以相对于所述组合物的总重量按重量计5％至90％、并且优选按重量计35％至75％的含量存在。
[0099] 组合物还可以包含在室温(25℃)下可与水混溶的多元醇，尤其选自尤其含有2至10个碳原子、优选含有2至6个碳原子的多元醇，如甘油、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、二丙二醇、二乙二醇、或二甘油。有利地，根据本发明的组合物包含1,3-丙二醇，其含量尤其是相对于所述组合物的总重量按重量计0.1％至20％、优选按重量计优选0.1％至10％并且优选按重量计0.5％至5％。
[0100] 根据本发明的组合物可以呈以下形式：水包油(O/W)乳液、油包水(W/O)乳液或多重乳液(三重：W/O/W或O/W/O)、油状溶液、油状凝胶、水性溶液、水性凝胶、固体组合物。这些组合物可以根据通用方法制备。
[0101] 根据本发明的组合物可以总体上是
流体并且可以具有呈白色或着色的乳膏、
软膏、乳剂、乳液、精华液、糊剂或
泡沫的外观。它们可以任选地以
气溶胶形式被施用到皮肤上。它们还可以呈固体形式，例如，呈棒或密实的粉末的形式。
[0102] 根据本发明的组合物尤其可以呈以下形式：
[0103] -化妆产品，尤其用于对面部、身体的皮肤、或唇部或睫毛进行化妆；
[0104] -剃须后用的凝胶或乳液；剃须产品；
[0105] -除臭剂(棒条滚抹物(roll-on)或气溶胶)；
[0106] -除毛乳膏；
[0107] -身体保健组合物，如淋浴凝胶或洗发剂；
[0108] -药用组合物；
[0109] -固体组合物如皂或清洁棒；
[0110] -气溶胶组合物，还包含加压推进剂；
[0111] -头发定型乳液、头发造型乳膏或凝胶、
染色组合物、成永久波浪形的组合物、对抗头发损失的乳液或凝胶、或护发剂；
[0112] -用于护理或清洁皮肤的组合物。
[0113] 本发明的主题还是一种用于制备组合物、特别是化妆品组合物或皮肤病学组合物的方法，所述方法包括混合以下项的步骤：4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮、先前所述的有机酸化合物、以及一种或多种附加成分，尤其是化妆品成分或皮肤病学成分，如先前所述的那些。
[0114] 以下实例更详细地展示了本发明。成分的量以重量百分比形式表示。
[0115] 实例1：确定作为MIC的协同抗微生物活性
[0116] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和有机酸化合物(称为物质B)的混合物的协同抗微生物活性效果的证明是通过根据以下公式计算协同指数(或FIC指数)来进行的：
[0117]FIC指数＝(MICa与B/MICa)+(MICb与A/MICb)
[0118] 其中：
[0119] -MICa与B：使得能够获得抑制效果的组合A+B中产品A的最小浓度
[0120] -MICb与A：使得能够获得抑制效果的组合A+B中产品B的最小浓度。
[0121] -MICa：单独的产品A的最小抑制浓度。
[0122] -MICb：单独的产品B的最小抑制浓度。
[0123] 该公式第一次在以下文章中描述：F.C.Kull,P.C.Eisman,H.D.Sylwestrowka,和R.L.Mayer,Applied Microbiology[应用微生物学]9:538-541,1961。
[0124] 对于所测试的单独的每种化合物，认为MIC是使得能够获得小于或等于25％的微生物生长百分比的第一浓度。
[0125] 对于所测试的组合，MICa与b以及MICb与a是使得能够获得小于或等于25％的微生物生长百分比的组合中A和B各自的浓度。
[0126] FIC指数的解释：
[0127] 当FIC指数值小于或等于1时，认为测试化合物的组合具有协同效应。
[0128] 所获得的结果总结在下表中。
[0129] 在以下菌株或其部分上测试化合物A和B的组合：黑曲霉、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌。
[0130] 使用微生物菌株黑曲霉ATCC 6275，以及用聚氧乙烯化的(20OE)山梨糖醇单棕榈酸酯(来自禾大公司(Croda)的Tween 40)和 BioReagent增补的双倍浓度沙氏(Sabouraud)肉汤液体培养基(即5g的Phytagel+0.6gTween 40+60g的沙氏肉汤的混合物)。
[0131] 使用微生物菌株粪肠球菌ATCC 33186和双倍浓度BHI(脑心浸液)肉汤液体培养基。
[0132] 使用微生物菌株金黄色葡萄球菌ATCC 6538和双倍浓度营养肉汤液体培养基。
[0133] 使用微生物菌株铜绿假单胞菌ATCC 9027和双倍浓度营养肉汤液体培养基。
[0134] 使用微生物菌株白色念珠菌ATCC 10231和双倍浓度沙氏肉汤液体培养基。
[0135] 使用96孔微孔板和32.5℃的孵育
温度。
[0136] 微孔板的孵育时间为：
[0137] -对于白色念珠菌ATCC 10231、铜绿假单胞菌ATCC 9027和金黄色葡萄球菌ATCC 6538，在好氧条件下18至24h；
[0138] -对于黑曲霉ATCC 6275，在好氧条件下24至30h；
[0139] -对于粪肠球菌ATCC 33186，在好氧条件下24至48h。
[0140] 测试
[0141] 对于每种化合物：
[0142] A＝4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮化合物
[0143] B＝有机酸化合物
[0144] 通过将1g的化合物混合在9ml的1‰琼脂水溶液中来制备10％(重量/体积)母液。用1‰琼脂溶液进行连续稀释。
[0145] ●单独的化合物A和B的测试
[0146] 将所获得的50μl的每种含有化合物A或B的子溶液加入微孔板孔中。还向其中加入以双倍浓度接种白色念珠菌菌株的100μl沙氏液体营养肉汤和50μl的1‰琼脂水溶液。
[0147] ●化合物A和B作为混合物的测试
[0148] 将所获得的50μl每种含有化合物A的子溶液和所获得的50μl每种含有化合物B的子溶液加入微孔板孔中。还向其中加入以双倍浓度接种白色念珠菌菌株的100μl沙氏液体营养肉汤。
[0149] 微生物生长对照
[0150] 还制备了阳性微生物生长对照。阳性微生物生长对照对应于在没有化合物A和B的情况下，100μl的1‰琼脂水溶液与以双倍浓度接种白色念珠菌菌株的100μl的沙氏液体营养肉汤的混合物。
[0151] 单独的化合物A和B的吸光度对照
[0152] 吸光度对照在单独的化合物A和B上平行进行。该对照对应于100μl双倍浓度无菌沙氏液体营养肉汤+100μl双倍浓度化合物A或B。
[0153] 在三种情况下(吸光度对照、生长对照和测试)，存在于每个微孔板孔中的最终体积为200μl。
[0154] 在两种情况下(测试和对照)，接种物表示存在于孔的最终体积(200μl)中的白色念珠菌菌株的浓度，并且为2至6×105cfu/ml的白色念珠菌。
[0155] 化合物A和B各自单独或组合的最小抑制浓度(MIC)以已知方式，通过在620nm
波长下的光
密度测量来确定。
[0156] 再次进行上述测试(测试、吸光度对照和生长对照)以在以下菌株上测试组合A+B：粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌。
[0157] 获得了以下结果，其中化合物B1＝苯甲酸钠：
[0158] 金黄色葡萄球菌
[0159]
[0160]
[0161]
[0162] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0163] i)0.0625％的A和0.25％的B1，即比率A/B1＝0.25
[0164] ii)0.125％的A和0.25％的B1，即比率A/B1＝0.5
[0165] iii)0.25％的A和0.25％的B1，即比率A/B1＝1
[0166] iv)0.25％的A和0.125％的B1，即比率A/B1＝2
[0167] 白色念珠菌
[0168]
[0169]
[0170] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0171] i)0.025％的A和0.1％的B1，即比率A/B1＝0.25
[0172] ii)0.05％的A和0.1％的B1，即比率A/B1＝0.5
[0173] iii)0.05％的A和0.05％的B1，即比率A/B1＝1
[0174] 铜绿假单胞菌
[0175]
[0176]
[0177] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0178] i)0.0625％的A和0.5％的B1，即比率A/B1＝0.125
[0179] ii)0.125％的A和0.5％的B1，即比率A/B1＝0.25
[0180] iii)0.25％的A和0.5％的B1，即比率A/B1＝0.5
[0181] iv)0.5％的A和0.5％的B1，即比率A/B1＝1
[0182] 实例2：确定作为MIC的协同抗微生物活性
[0183] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和山梨酸(称为物质B2)的混合物以及4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和山梨酸钾(称为物质B3)的混合物的协同抗微生物活性效果的证明是根据实例1中描述的方案进行的。
[0184] 在以下菌株上测试化合物A和B2的组合：金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、粪肠球菌。
[0185] 在以下菌株上测试化合物A和B3的组合：黑曲霉、粪肠球菌。
[0186] 获得以下结果：
[0187] A)与化合物B2：山梨酸的混合物
[0188] 金黄色葡萄球菌
[0189]
[0190]
[0191]
[0192] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0193] i)0.0625％的A和0.25％的B2，即比率A/B2＝0.25
[0194] ii)0.125％的A和0.25％的B2，即比率A/B2＝0.5
[0195] iii)0.25％的A和0.25％的B2，即比率A/B2＝1
[0196] 白色念珠菌
[0197]
[0198]
[0199] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0200] i)0.025％的A和0.05％的B2，即比率A/B2＝0.5
[0201] ii)0.05％的A和0.05％的B2，即比率A/B2＝1
[0202] 黑曲霉
[0203]
[0204]
[0205] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0206] i)0.0625％的A和0.25％的B2，即比率A/B2＝0.25
[0207] ii)0.125％的A和0.25％的B2，即比率A/B2＝0.5
[0208] 粪肠球菌
[0209]
[0210]
[0211]
[0212] 所获得的结果显示了混合物的协同抑制活性：
[0213] i)0.125％的A和0.5％的B2，即比率A/B2＝0.25
[0214] B)与化合物B3：山梨酸钾的混合物
[0215] 粪肠球菌
[0216]
[0217]
[0218] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0219] i)0.125％的A和1％的B3，即比率A/B3＝0.125
[0220] ii)0.25％的A和1％的B3，即比率A/B3＝0.25
[0221] iii)0.5％的A和1％的B3，即比率A/B3＝0.5
[0222] iv)1％的A和1％的B3，即比率A/B3＝1
[0223] 黑曲霉
[0224]
[0225]
[0226]
[0227] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0228] i)0.025％的A和0.05％的B3，即比率A/B3＝0.5
[0229] ii)0.05％的A和0.05％的B3，即比率A/B3＝1
[0230] iii)0.05％的A和0.025％的B3，即比率A/B3＝2
[0231] 实例3：
[0232] 制备具有以下组成的面部护理水包油乳液(重量百分比含量)：
[0233]
[0234]
[0235] 实例4：确定作为MIC的协同抗微生物活性
[0236] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和4-羟基苯甲酸甲酯(称为物质B4)的混合物以及4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和4-羟基苯甲酸丙酯(称为物质B5)的混合物的协同抗微生物活性效果的证明是根据实例1中描述的方案进行的。
[0237] 在以下菌株上测试化合物A和B4的组合：金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、和铜绿假单胞菌。
[0238] 在以下菌株上测试化合物A和B5的组合：白色念珠菌和铜绿假单胞菌。
[0239] 获得以下结果：
[0240] A)与化合物B4：4-羟基苯甲酸甲酯的混合物
[0241] 金黄色葡萄球菌
[0242]
[0243]
[0244]
[0245] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0246] i)0.0625％的A和0.5％的B4，即比率A/B4＝0.125
[0247] ii)0.125％的A和0.5％的B4，即比率A/B4＝0.25
[0248] iii)0.25％的A和0.5％的B4，即比率A/B4＝0.5
[0249] 白色念珠菌
[0250]
[0251]
[0252] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0253] i)0.025％的A和0.1％的B4，即比率A/B4＝0.25
[0254] ii)0.05％的A和0.1％的B4，即比率A/B4＝0.5
[0255] iii)0.05％的A和0.05％的B4，即比率A/B4＝1
[0256] 铜绿假单胞菌
[0257]
[0258]
[0259]
[0260] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0261] i)0.125％的A和0.25％的B4，即比率A/B4＝0.5
[0262] ii)0.25％的A和0.25％的B4，即比率A/B4＝1
[0263] iii)0.5％的A和0.25％的B4，即比率A/B4＝2
[0264] B)与化合物B5：4-羟基苯甲酸丙酯的混合物
[0265] 白色念珠菌
[0266]
[0267]
[0268] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0269] i)0.025％的A和0.05％的B5，即比率A/B5＝0.5
[0270] ii)0.05％的A和0.05％的B5，即比率A/B5＝1
[0271] 铜绿假单胞菌
[0272]
[0273]
[0274] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0275] i)0.5％的A和0.5％的B5，即比率A/B5＝1
[0276] ii)1％的A和0.5％的B5，即比率A/B5＝2
[0277] iii)0.5％的A和0.25％的B5，即比率A/B5＝2
[0278] iv)1％的A和0.25％的B5，即比率A/B5＝4
[0279] C)
[0280] 此外，还注意到以下混合物：
[0281] -4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与4-羟基苯甲酸乙酯的混合物，
[0282] -4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮与4-羟基苯甲酸丁酯的混合物，
[0283] 在前述相同测试中测试的所述混合物没有协同抗微生物活性。
[0284] 实例5：确定作为MIC的协同抗微生物活性
[0285] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和5-正辛酰基水杨酸(称为物质B6)的混合物的协同抗微生物活性效果的证明是根据实例1中描述的方法进行的。
[0286] 获得以下结果：
[0287] 白色念珠菌
[0288]
[0289]
[0290] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0291] i)0.0625％的A和0.05％的B6，即比率A/B6＝0.5
[0292] ii)0.05％的A和0.05％的B6，即比率A/B6＝1
[0293] iii)0.1％的A和0.05％的B6，即比率A/B6＝2
[0294] iv)0.05％的A和0.025％的B6，即比率A/B6＝2
[0295] v)0.1％的A和0.025％的B6，即比率A/B6＝4
[0296] vi)0.1％的A和0.0125％的B6，即比率A/B6＝8
[0297] 黑曲霉
[0298]
[0299]
[0300] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0301] i)0.2％的A和0.05％的B6，即比率A/B6＝4
[0302] ii)0.2％的A和0.025％的B6，即比率A/B6＝8
[0303] 粪肠球菌
[0304]
[0305]
[0306]
[0307] 所获得的结果显示了混合物的协同抑制活性：
[0308] i)0.125％的A和0.0125％的B6，即比率A/B6＝10
[0309] ii)0.25％的A和0.0125％的B6，即比率A/B6＝20
[0310] iii)0.5％的A和0.0125％的B6，即比率A/B6＝40
[0311] 实例6：确定作为MIC的协同抗微生物活性
[0312] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和辛基氧肟酸(称为物质B7)的混合物的协同抗微生物活性效果的证明是根据实例1中描述的方法进行的。
[0313] 在黑曲霉菌株上测试化合物A和B7的组合。
[0314] 对于B7，使用在1,3-丙二醇中的按重量计7.5％的B'＝辛基氧肟酸(化合物B7)(由英狄士化学公司(Inolex Chemical)以名称Zeastat出售)。
[0315] 获得以下结果：
[0316] 黑曲霉
[0317]
[0318]
[0319] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0320] i)0.025％的A和0.05％的B’(3.7510-3％的B7)，即比率A/B7＝6.7
[0321] ii)0.05％的A和0.05％的B’(3.7510-3％的B7)，即比率A/B7＝13.3
[0322] iii)0.1％的A和0.05％的B’(3.7510-3％的B7)，即比率A/B7＝26.7
[0323] iv)0.05％的A和0.025％的B’(1.87510-3％的B7)，即比率A/B7＝26.7[0324] v)0.1％的A和0.025％的B’(1.87510-3％的B7)，即比率A/B7＝53.3
[0325] vi)0.1％的A和0.0125％的B’(0.9410-3％的B7)，即比率A/B7＝106
[0326] 实例7：确定抗微生物混合物的抗微生物活性
[0327] 通过激发(Challenge)测试方法评价4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮+辛基氧肟酸抗微生物混合物(各自重量比为0.16)的抗微生物功效。
[0328] 化妆品配方
[0329] 制备具有以下组成的面部护理水包油乳液(重量百分比含量)：
[0330]
[0331]
[0332] 对照配方A：与前述含有0.15％的4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮并且不含有辛基氧肟酸(用水补偿为1.5％)类似的配方
[0333] 对照配方B：含有1.5％的辛基氧肟酸(在1,3-丙二醇中的溶液)并且不含有4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(用水补偿为0.15％)的类似配方
[0334] 微生物培养物
[0335] 使用5种纯的微生物培养物。
[0336]微生物 传代培养基 T° ATCC
大肠杆菌(Ec) Trypto-大豆
酪蛋白 35℃ 8739
粪肠球菌(Ef) Trypto-大豆酪蛋白 35℃ 33186
铜绿假单胞菌(Pa) Trypto-大豆酪蛋白 35℃ 19429
白色念珠菌(Ca) 沙氏 35℃ 10231
黑曲霉(An) 麦芽 35℃ 6275
[0337] ATCC＝美国典型培养物保藏中心
[0338] 将革兰氏阴性菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌)、革兰氏阳性菌(粪肠球菌)、酵母(白色念珠菌)、和霉菌(黑曲霉)的菌株分别在接种细菌和酵母的前一天，以及接种霉菌的前5天接种到传代培养基中。
[0339] 在接种当天：
[0340] -对于细菌和酵母，分别制备在胰蛋白胨盐稀释剂中的悬浮液，以通过分光光度计获得具有在544nm处的35％至45％
透射光的光密度的悬浮液；
[0341] -对于霉菌，通过用6至7ml的
收获溶液洗涤琼脂来收集孢子，并且在无菌试管或烧瓶中回收悬浮液。
[0342] 在均化微生物悬浮液后，将0.2ml接种物引入每个药瓶中(使用纯的悬浮液：1×108至3×108cfu/ml)并将20g产品(＝化妆品配方)中的微生物悬浮液用刮刀彻底均化。
[0343] 均化后，存在于产品中的微生物含量对应于106个微生物/克产品的浓度，即接种到含有108个微生物/ml的1％接种物。
[0344] 微生物与产品在22℃±2℃下并且在黑暗中
接触7天的时间后，进行10倍稀释并计数产品中剩余的可再生微生物的数量。
[0345] 结果
[0346]
[0347] <200CFU：所述方法的灵敏度极限
[0348] 实例8：确定作为MIC的协同抗微生物活性
[0349] 4-(3-乙氧基-4-羟苯基)丁-2-酮(称为物质A)和脱氢乙酸钠(称为物质B8)的混合物的协同抗微生物活性效果的证明是根据实例1中描述的方案进行的。
[0350] 获得以下结果：
[0351] 白色念珠菌
[0352]
[0353]
[0354] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0355] i)0.025％的A和0.00125％的B8，即比率A/B8＝20
[0356] ii)0.05％的A和0.00125％的B8，即比率A/B8＝40
[0357] 黑曲霉
[0358]
[0359]
[0360] 所获得的结果显示了以下混合物的协同抑制活性：
[0361] i)0.0625％的A和0.01％的B8，即比率A/B8＝6.25
[0362] ii)0.125％的A和0.01％的B8，即比率A/B8＝12.5
[0363] iii)0.0625％的A和0.005％的B8，即比率A/B8＝12.5
[0364] iv)0.125％的A和0.005％的B8，即比率A/B8＝25。
