低聚琼胶寡酸盐及其在制备治疗神经退行性疾病和心脑血管
疾病的药物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 神经退化是神经元结构和功能逐渐丧失，包括神经元死亡和胶质细胞平衡，会导致痴呆等
认知障碍。在其他原因中，年龄(阿尔茨海默病(AD)、
帕金森病 (PD))或影响CNS细胞功能的基因突变(亨廷顿氏舞蹈病、早发性AD或PD、
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS))会引起神经退行性疾病。
[0003] AD的病理标志是脑中的斑
块和缠结。斑块由
淀粉样β蛋白以及其他组成，而缠结则主要由过度磷
酸化的tau蛋白组成。检测导致这种疾病的蛋白有助于开发特异性
抗体。在研究环境中，这些产品在评估与神经退行性疾病进展有关的淀粉样β和tau以及其他蛋白的表达和沉降中起到重要作用。帕金森病(PD) 是一种运动功能失调且最终进展成认知能
力失调的疾病，这种疾病也有年龄和遗传
基础，并且与AD相比，蛋白聚集更复杂。尽管大多数PD都是特发性PD，但某些有已知的基因突变，这使得新型疗法研究非常复杂。目前对于神经退行性疾病上缺乏有效的治疗药物，目前上市的甘露特钠也只能是缓解AD早中期的症状而不能阻断及逆转疾病的进展。
[0004] 琼胶寡糖和硫琼胶寡糖已被报道具有多种药理活性，但目前尚无低聚琼胶寡酸及寡二酸的药理活性报道；本发明在前人研究的基础上，通过弱酸
氧化制备得琼胶寡糖衍
生物，即低聚琼胶寡酸及寡二酸盐，采用一系列不同的神经退行性疾病和心脑血管疾病的细胞及动物模型，发现低聚琼胶寡酸及硫琼胶寡二酸的药效作用明显优于
原料药，表明低聚琼胶寡酸盐及硫琼胶寡二酸盐在制备抵抗神经退行性疾病和心脑血管疾病中的应用价值。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供了低聚琼胶寡酸盐及其在制备治疗神经退行性疾病和心脑血管疾病的药物和保健食品中的应用。
[0006] 本发明采用Aβ蛋白诱导神经PC12细胞的损伤模型、CoCl2诱导心肌细胞和神经细胞缺氧损伤的模型、以及MPP+导致的SK-N-MC细胞的损伤模型，探索低聚琼胶寡酸盐及硫琼胶寡二酸盐对神经细胞和心肌细胞保护作用。研究证明低聚琼胶寡酸盐及硫琼胶寡二酸盐能够有效抑制Aβ在细胞内的聚集；明显抑制 CoCl2诱导细胞存活率的下降；并有效减少缺氧损伤导致的PCl2神经细胞和 H2C9心肌细胞的凋亡；同时可显著提高MPP+导致的SK-N-MC细胞的损伤，有效抑制Synuclein蛋白的聚集；可通过多种途径抵抗神经退行性疾病和心脑血管疾病。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0008] 本发明提供了一种低聚琼胶寡酸盐，其结构式通式如下：
[0009] 。
[0010] 进一步的：所述低聚琼胶寡酸盐具体为以下4种：低聚琼胶寡酸盐、新琼寡酸盐、硫琼胶寡二酸盐、紫菜胶寡二酸盐，其结构式通式分别如下：
[0011]
[0012] 本发明还提供了所述的低聚琼胶寡酸盐在制备治疗神经退行性疾病和心脑血管疾病的药物中的应用。
[0013] 进一步的：所述低聚琼胶寡酸盐及硫琼胶寡二酸盐是以红藻为原料，经酶降解法、经化学降解法或者物理降解法或者自由基降解法或者臭氧降解法或上述降解法组合降解，制得不同分子量低聚琼胶寡糖、新琼寡糖、硫琼胶寡糖、紫菜胶寡糖；后将所制备的寡糖，配置成1-55％的
水溶液，加入
氧化剂至终浓度1-35％，在25-120℃下反应，制得还原端C1位为
羧酸的不同分子量低聚寡酸；低聚寡糖可经中和制备得到不同分子量的低聚琼胶寡酸、新琼寡酸、硫琼胶寡二酸、紫菜胶寡二酸的锂盐、钠盐、
钾盐、
钙盐或镁盐，重均分子量为0.3kDa～20kDa，聚合度为1-50。
[0014] 进一步的：所述氧化剂为双氧水、溴水、
次氯酸和次氯酸盐中的其中一种。
[0015] 进一步的：所述红藻包括紫菜、坛紫菜、江篱、海萝藻。
[0016] 进一步的：所述琼胶寡酸盐能显著提高聚集Aβ蛋白对神经PCl2细胞的损伤，有效抑制Aβ在细胞内的聚集。
[0017] 进一步的：所述琼胶寡酸盐能明显抑制CoCl2诱导细胞存活率的下降，并有效减少缺氧损伤导致的PCl2神经细胞和H2C9心肌细胞的凋亡。
[0018] 进一步的：所述琼胶寡酸盐能显著提高MPP+导致的SK-N-MC细胞的损伤，有效抑制Aβ蛋白的聚集。
[0019] 进一步的：所述化学降解法为酸降解法或Fenton降解法，所述物理降解法为
微波或超声降解法；所述酶降解法使用琼胶酶或者硫琼胶降解酶；自由基降解法为双氧水辅助Cu离子的降解法；所述臭氧降解法为溶质中充有臭氧并辅助一定
温度的降解法；所述降解法组合降解为上述任意2种或者任意2种以上降解方法的组合。
[0020] 本发明的优点及有益效果是：
[0021] 1、本发明采用Aβ蛋白诱导神经PCl2细胞的损伤模型、CoCl2诱导心肌细胞和神经细胞缺氧损伤的模型、以及MPP+导致的SK-N-MC细胞的损伤模型，发现低聚琼胶寡酸盐及硫琼胶寡二酸盐对神经细胞和心肌细胞的有效保护作用。并且低聚琼胶寡酸盐及硫琼胶寡二酸盐的效果显著优于原料药琼胶寡糖和硫琼胶寡糖。
[0022] 2、本发明产品来源于海洋天然多糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，可开发成抗神经退行性疾病和心脑血管疾病的药物及功能食品，因此具有较好的市场应用前途。
具体实施方式
[0023] 以下结合
实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。
[0024] 实施例1：海萝藻、江篱、紫菜提取物及其寡酸的制备
[0025] 将海萝藻、江篱、紫菜三种海藻35℃烘干，
粉碎40目备用。取海藻碎沫100g，加入500ml 85％
乙醇，85℃
脱脂脱色2小时，重复操作1次，筛绢100目过滤， 35℃烘干，脱脂后用蒸馏水搅拌提取三次，每次离心后合并上清液，经浓缩、
透析、醇沉和干燥，得所述提取多糖。采用
硫酸苯酚发测得总糖含量在30-80％，采用标定方法测的D-半乳糖和内醚半乳糖的含量在10-40％、10％-40％，硫酸钡比浊法测得硫酸根含量在10-40％，多糖可进一步经QFF阴离子交换色谱柱分离可得纯化组分，之后纯化组分可通过0.1MH2SO460℃进行降解2小时，或者通过酶法、微波辅助、自由基、臭氧降解中的一种或者多种方法组合制备得降解寡糖，所得多糖及寡糖的分子量测定采用HPGPC Agilent1260 Series高效液相系统监测，用不同凝胶色谱柱(Shodex系列)分离，用在线示差检测器(RI)和十八
角激光散射仪(MALLS)联用分析多糖及寡糖分子量，Agilent Chemstation控制系统及GPC
数据处理软件，流动相为0.1mol/L的NaNO3溶液，柱温25℃，流速为0.5mL/min。多糖样品配制成5mg/mL浓度，12000转离心10min，取上清，自动进样20uL。分离得到的含半乳糖和/或者硫酸半乳糖和/或者内醚半乳糖及硫酸半乳糖与内醚半乳糖交替连接的多糖及寡糖。
[0026] 所述低聚琼胶寡酸盐的结构式如下，其分子量在0.1～200kDa之间：
[0027] 。
[0028] 具体将其分为如下4种结构为：
[0029]
[0030] n＝0-50，相对应的为琼胶寡糖、新琼寡糖、硫琼胶寡糖、紫菜胶寡糖。
[0031] 将所制备的低聚琼胶寡糖、新琼寡糖、硫琼胶寡糖、紫菜胶寡糖，配置成 1-55％的水溶液，加入氧化剂(包括但不局限于双氧水、溴水、次氯酸、次氯酸盐等)至终浓度1-35％，在25-120℃下反应，依据本尼迪特
试剂(
柠檬酸、硫酸
铜、
碳酸钠配制成)来检验反应是否完全，至不再出现砖红色沉淀时即为氧化完全；制备得琼胶寡酸和硫琼胶寡二酸，Bio-GelP4柱分离纯化后，再经中和制备得到不同分子量的低聚琼胶寡酸、新琼寡酸、硫琼胶寡二酸、紫菜胶寡二酸的锂盐、钠盐、
钾盐、钙盐或镁盐，聚合度在1-60；所制得的寡酸的结构为：
[0032]
[0033] n＝0-50，相对应的，分别为琼胶寡酸、新琼寡酸、硫琼胶寡二酸、紫菜胶寡二酸。
[0034] 实施例2、琼胶寡酸和硫琼胶寡酸对Aβ聚集体诱导神经细胞损伤的保护作用[0035] 以未加Aβ1-42的细胞活力为阴性对照，观察受试化合物对Aβ诱导产生的神经细胞毒的抑制作用，具体实施步骤如下：将PCl2细胞接种于MEM完全培养液中，置入96孔板中培养，放入恒温细胞
培养箱孵育24小时后，加入提前聚集的Aβ蛋白寡聚体，2h后，每孔加入受试化合物溶液，培养箱继续孵育24h。结束后，采用MTT法测定细胞存活率。每次三个平行，实验重复三次。
[0036] 表1结果表明，琼胶寡酸和硫琼胶寡酸能够有效保护神经细胞免受Aβ聚集蛋白的损伤，其中从20uM便具有很好的保护作用，并且随着剂量的增加药效也增加。其中，硫琼胶寡二酸的效果最好，100-500uM时保护效果达到88-90％。
[0037] 表1琼胶寡酸和硫琼胶寡酸对Aβ聚集体诱导神经细胞损伤的影响
[0038]
[0039]
[0040] 实施例3、琼胶寡酸和硫琼胶寡酸对CoCl2诱导神经细胞和心肌细胞缺氧损伤的保护作用
[0041] 以未加CoCl2诱导的神经细胞PCl2和心肌细胞H9C2的细胞活力为阴性对照，观察系列化合物对诱导CoCl2产生的神经细胞和心肌细胞缺氧损伤的抑制作用，具体实施步骤如下：将PCl2和H9C2细胞接种于MEM或者DMEM完全培养液中，置入96孔板中培养，放入恒温细胞培养箱孵育24小时后，加入提前溶解好的含 CoCl2的损伤液，2h后，每孔加入系列化合物溶液，培养箱继续孵育48小时。结束后，采用MTT法测定细胞存活率。每次三个平行，实验重复三次。
[0042] 表2和3结果显示，琼胶寡酸和硫琼胶寡酸能够有效保护神经细胞免受CoCl2的缺氧损伤，其中从20uM便具有很好的保护作用，并且随着剂量的增加药效也增加。其中，硫琼胶寡二酸的效果最好，100uM时保护效果达88％，100uM时保护效果达94％；同时，琼胶寡酸和硫琼胶寡酸也能够有效保护心肌细胞免受 CoCl2的缺氧损伤，其中以硫琼胶寡二酸的效果最好，100uM-500uM时保护效果达到88-92％。
[0043] 表2琼胶寡酸和硫琼胶寡酸对CoCl2缺氧诱导神经细胞损伤的影响
[0044]
[0045]
[0046] 表3琼胶寡酸和硫琼胶寡酸对CoCl2缺氧诱导心肌细胞损伤的影响
[0047] 样品(uM) 细胞存活率对照组 52±2.1％
琼胶寡酸低剂量20 67±2.4％
琼胶寡酸中剂量100 78±2.6％
琼胶寡酸高剂量500 86±3.0％
硫琼胶寡二酸低剂量20 72±2.5％
硫琼胶寡二酸中剂量100 86±3.9％
硫琼胶寡二酸高剂量500 92±3.7％
紫菜胶寡二酸低剂量20 65±1.6％
紫菜胶寡二酸中剂量100 77±2.5％
紫菜胶寡二酸高剂量500 86±1.8％
[0048] 实施例6、琼胶寡酸和硫琼胶寡酸对MPP+诱导神经细胞损伤的保护作用[0049] 以未加双氧水诱导的神经细胞SK-N-MC为阴性对照，观察系列化合物对双氧水诱导产生的神经细胞损伤的抑制作用，具体实施步骤如下：将SK-N-MC细胞接种于MEM完全培养液中，置入96孔板中培养，放入恒温细胞培养箱孵育24 小时后，加入提前溶解好的含MPP+的损伤液，2h后，每孔加入系列化合物溶液，培养箱继续孵育48小时。结束后，采用MTT法测定细胞存活率。每次三个平行，实验重复三次。
[0050] 表4结果显示，琼胶寡酸和硫琼胶寡酸能够有效保护神经细胞免受MPP+损伤，其中从20uM便具有很好的保护作用，并且随着剂量的增加药效也增加。其中，硫琼胶寡二酸的效果最好，100uM-500uM时保护效果达到85-88％。
[0051] 表4琼胶寡酸和硫琼胶寡酸对MPP+诱导SK-N-MC神经细胞损伤的影响[0052] 样品 细胞存活率对照组 53±2.1％
琼胶寡酸低剂量 67±1.9％
琼胶寡酸中剂量 83±2.4％
琼胶寡酸高剂量 86±2.7％
硫琼胶寡二酸低剂量 71±3.1％
硫琼胶寡二酸中剂量 85±3.3％
硫琼胶寡二酸高剂量 88±2.2％
紫菜胶寡二酸低剂量20 69±2.7％
紫菜胶寡二酸中剂量100 78±2.5％
紫菜胶寡二酸高剂量500 86±1.8％
[0053] 以上实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
