一种蜘蛛毒素杀虫肽
阅读：509发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种蜘蛛毒素杀虫肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种白额高脚蛛(Heteropoda venatoria)中的杀虫肽选择性抑制昆虫 电压 门 控钠离子通道，对属于昆虫纲蜚蠊目的美洲蜚蠊具备较强致死活性，可作为多肽类 杀虫剂 用于农业 害虫 防治；所述的杀虫肽是从白额高脚蛛(Heteropoda venatoria)蜘蛛毒液中分离出来的活性多肽毒素，包含37个 氨 基酸残基，含6个半胱氨酸形成的3对二硫键，分子量为4169.63Da，等电点为4.27，氨基酸序列为Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe。，下面是一种蜘蛛毒素杀虫肽专利的具体信息内容。
1.一种白额高脚蛛(Heteropoda venatoria) 中的杀虫肽具备选择性抑制昆虫电压门控钠离子通道的活性；所述的杀虫肽是从白额高脚蛛(Heteropoda venatoria)蜘蛛毒液中分离出来的活性多肽毒素，由37个氨基酸残基组成，含6个半胱氨酸形成的3对二硫键，分子量为4169.63Da，等电点4.27，氨基酸序列为Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe。
2.根据权利要求1所述杀虫肽，可作为生物杀虫剂用于农业害虫、室内害虫等防治。
一种蜘蛛毒素杀虫肽
技术领域
背景技术
[0002] 农业害虫严重破坏了粮食供应，并传播了各种各样的人类和动物病原体。虽然化学杀虫剂是防治害虫的主要手段，但目前很多害虫产生严重的抗药性，导致有些害虫再猖獗。同时农药残留对环境和人类健康产生了很大影响。因此，我们迫切需要开发新的、安全的、更为高效并对环境无害的新型杀虫剂。
发明内容
[0003] 本发明的目的旨在于提供一种以昆虫离子通道为靶点并具备选择性的杀虫肽。
[0004] 上述发明目的是通过以下技术方案实现的：本发明提供的杀虫肽来自于白额高脚蛛(Heteropoda venatoria)的蜘蛛粗毒，通过分离纯化而得到的一种具有37个氨基酸残基的多肽；由37个氨基酸残基组成，含6个半胱氨酸形成的3对二硫键，分子量为4169.63Da，等电点4.27，氨基酸序列为：氨基酸序列为Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe。
[0005]杀虫肽对属于昆虫纲蜚蠊目的美洲蜚蠊具备较强致死活性。另外，具备较低的哺乳动物毒性，是进行农业害虫防治的潜在分子。在高效防治农业害虫的同时，使用多肽类杀虫剂可以避免传统化学杀虫剂对人类和环境的危害。
[0006] 白额高脚蛛杀虫肽的分离纯化和制备方法（1）杀虫肽分离纯化
白额高脚蛛用电刺激（5-10V 的脉冲电流）3-5s的方法采集毒液，于-70℃下冷冻干燥成白色粉末，再于-20℃低温存放。10 mg的粗毒干粉用10 ml双蒸水溶解后，12000转/分钟离心五分钟，取上清液进行用C18 RP-HPLC进行初步分离纯化（图1A）（大连依利特P230p制备型HPLC；反相制备柱：月旭，Ultimate XB-C18，5μm，4.6mm´250mm；洗脱液分别为：A液(0.1%TFA/H2O)、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 5-60 min, 5-60% B液； 流速，3 ml/min；
温度，25°C），在215 nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干。对星号洗脱峰进一步细分（图1B）（美国Waters HPLC 2795；反相分析柱：月旭，Ultimate XB-C18, 5 μm，4.6 mm´
250 mm；洗脱液分别为：A液（0.1%TFA/H2O）、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 12-38 min,
20-50% B液；流速：1 ml/min；温度：25°C），在215nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干，并用质谱测定其分子量。使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MADI-TOF MS（AB SCIEX，美国）鉴定其分子量为45168.12 Da(图1E)。使用自动Edman降解和cDNA文库数据库得到它的氨基酸序列为Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe，包含六个半胱氨酸，是典型的ICK（抑制性半胱酸结）模体结构。
白额高脚蛛用电刺激（5-10V 的脉冲电流）3-5s的方法采集毒液，于-70℃下冷冻干燥成白色粉末，再于-20℃低温存放。10 mg的粗毒干粉用10 ml双蒸水溶解后，12000转/分钟离心五分钟，取上清液进行用C18 RP-HPLC进行初步分离纯化（图1A）（大连依利特P230p制备型HPLC；反相制备柱：月旭，Ultimate XB-C18，5μm，4.6mm´250mm；洗脱液分别为：A液(0.1%TFA/H2O)、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 5-60 min, 5-60% B液； 流速，3 ml/min；
温度，25°C），在215 nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干。对星号洗脱峰进一步细分（图1B）（美国Waters HPLC 2795；反相分析柱：月旭，Ultimate XB-C18, 5 μm，4.6 mm´
250 mm；洗脱液分别为：A液（0.1%TFA/H2O）、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 12-38 min,
20-50% B液；流速：1 ml/min；温度：25°C），在215nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干，并用质谱测定其分子量。使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MADI-TOF MS（AB SCIEX，美国）鉴定其分子量为45168.12 Da(图1E)。使用自动Edman降解和cDNA文库数据库得到它的氨基酸序列为Asp Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ala Asp Cys Thr Ser Asp Ser Asp Cys Cys Glu Asn Trp Val Cys Ser Lys Thr Gly Phe Val Lys Asn Ile Cys Lys Tyr Asn Phe，包含六个半胱氨酸，是典型的ICK（抑制性半胱酸结）模体结构。
[0007] （2）杀虫肽的化学合成 杀虫肽的化学合成用的是Fmoc固相方法化学合成。具体操作步骤：1、试剂的准备：取
2 mL EP管，按多肽合成顺序编号，每管中加入过量的催化剂（HBTU，TBTU，各0.5 mM）和与编号相对应的Fmoc氨基酸（0.5 mM）；2、树脂的活化：取0.1 mM树脂置于合成柱中→加入2-3 mLDMF(使树脂膨胀，-NH2暴露出来)，摇动膨胀35 min →抽干DMF→重复洗涤一次→加3 mL20%哌啶摇动反应15 min（去除树脂上保护-NH2的Fmoc基团）→DMF洗一次→ 哌啶洗一次→DMF 洗6次；3、氨基酸的活化：向第一步中编号为1的EP管中加入1.5 mL 5%NMM/DMF溶液避光反应30 min（反应后溶液会变色）；4、第一个氨基酸的偶联：将第三步骤中活化好的氨基酸加入合成柱内→避光摇晃1h→抽干→DMF洗3遍；5、第2到第37个氨基酸残基的延伸：重复步骤234→当最后一个氨基酸连接上后重复步骤2（使 Fmoc基团去除）→甲醇洗2次，抽干→合成柱置于冷冻干燥机中过夜；6、沉淀与裂解：裂解液加入合成柱中避光摇晃反应3 h→TFA洗净→50 mLEP管收集→以N2吹干TFA至EP管中仅剩 1-2 mL液体→过量乙醚沉淀多肽→ 冻干（裂解液：苯甲硫醚 5 %， 二巯基甲烷 3 %， TFA 90 %，苯甲醚 2%）。
2 mL EP管，按多肽合成顺序编号，每管中加入过量的催化剂（HBTU，TBTU，各0.5 mM）和与编号相对应的Fmoc氨基酸（0.5 mM）；2、树脂的活化：取0.1 mM树脂置于合成柱中→加入2-3 mLDMF(使树脂膨胀，-NH2暴露出来)，摇动膨胀35 min →抽干DMF→重复洗涤一次→加3 mL20%哌啶摇动反应15 min（去除树脂上保护-NH2的Fmoc基团）→DMF洗一次→ 哌啶洗一次→DMF 洗6次；3、氨基酸的活化：向第一步中编号为1的EP管中加入1.5 mL 5%NMM/DMF溶液避光反应30 min（反应后溶液会变色）；4、第一个氨基酸的偶联：将第三步骤中活化好的氨基酸加入合成柱内→避光摇晃1h→抽干→DMF洗3遍；5、第2到第37个氨基酸残基的延伸：重复步骤234→当最后一个氨基酸连接上后重复步骤2（使 Fmoc基团去除）→甲醇洗2次，抽干→合成柱置于冷冻干燥机中过夜；6、沉淀与裂解：裂解液加入合成柱中避光摇晃反应3 h→TFA洗净→50 mLEP管收集→以N2吹干TFA至EP管中仅剩 1-2 mL液体→过量乙醚沉淀多肽→ 冻干（裂解液：苯甲硫醚 5 %， 二巯基甲烷 3 %， TFA 90 %，苯甲醚 2%）。
[0008] 合成的产物是混合物，需要分离纯化得到目的多肽。采用制备型反向高效液相色谱为化学合成的杀虫肽进行分离纯化（图1C）（大连依利特P230p制备型HPLC；反相制备柱：月旭,Ultimate XB-C18，5μm，4.6 mm´250 mm；洗脱液分别为：A液(0.1%TFA/H2O)、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度，10-40 min, 20-60%B液；流速，3 ml/min；温度，25°C）, 在280 nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干(图1C)。分离得到目的线性多肽后，采取如下复性条件：0.1 mol/L Tris HCL、0.1 M Nacl、5 mM GSH、0.5 mM GSSH、5 mM EDTA、样品浓度为0.1 g/L、pH=7.4。复性产物经制备型色谱分离纯化，分离冻干（大连依利特P230p制备型HPLC；反相制备柱：月旭,Ultimate XB-C18，5μm，4.6 mm´250 mm；洗脱液分别为：A液(0.1%TFA/H2O)、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 10-40 min, 10-42% B液； 流速，3 ml/min；温度，25°C）（图1D）。质谱测定为质谱结果显示其与天然粗毒分离的杀虫肽分子量一致。
[0010] 图1 杀虫肽的分离纯化和质谱鉴定图1A. 白额高脚蛛粗毒的RP-HPLC初步纯化图谱（星号标记峰为包含目的峰的组分）；
图1B.初步纯化峰的进一步分离纯化（星号标记峰为单一的杀虫肽）；图1C. 化学合成杀虫肽的RP-HPLC纯化图谱；图1D. 杀虫肽复性后的RP-HPLC的分离纯化图谱；图1E. 天然分离纯化的杀虫肽的质谱鉴定图；图1F. 化学合成复性后得到的杀虫肽的质谱鉴定图。
图1B.初步纯化峰的进一步分离纯化（星号标记峰为单一的杀虫肽）；图1C. 化学合成杀虫肽的RP-HPLC纯化图谱；图1D. 杀虫肽复性后的RP-HPLC的分离纯化图谱；图1E. 天然分离纯化的杀虫肽的质谱鉴定图；图1F. 化学合成复性后得到的杀虫肽的质谱鉴定图。
[0011] 图2 杀虫肽的选择性抑制昆虫电压门控钠通道图2A. 1 μM杀虫肽抑制昆虫电压门控钠通道的电流示意图;图2B. 杀虫肽对昆虫电压门控钠通道的半数抑制浓度IC50图；图2C. 10 μM 杀虫肽抑制昆虫电压高电压激活钙通道的电流示意图；图2D. 15 μM杀虫肽抑制昆虫电压门控钾通道的电流示意图。
[0012] 图3 杀虫肽对哺乳动物电压门控离子通道的影响图3A.10 μM杀虫肽对大鼠背根神经节电压门控钙通道无明显影响；图3B.15 μM杀虫肽对哺乳动物心肌钠通道Nav1.5无明显影响；图3C.15 μM杀虫肽对哺乳动物Nav1.7无明显影响；图3D.15 μM杀虫肽对哺乳动物Nav1.8无明显影响。
[0013]
具体实施方式
[0014] 为了揭示杀虫肽对昆虫的致死效果，我们检测了杀虫肽对昆虫纲蜚蠊目美洲蜚蠊的半致死剂量，初步评判了对哺乳动物的安全性。并对其作用机制进行了研究，实验的开展都是严格的根据标准化研究所标准进行。
[0015] 1、主要材料和仪器化学合成的相关试剂在吉尔生化(上海)有限公司购买，其余生化试剂购自sigma公司。
实验所用美洲蜚蠊为本实验动物房繁殖，C57小鼠购置于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
实验所用到细胞ND7/23和 HEK293T 细胞（ ATCC）购自中科院上海生命科学研究所细胞库。实验仪器主要有大连依利特P230p、美国Waters HPLC 2795 Alliance、全细胞膜片钳系统：记录采集数据放大器为EPC10 USB Amplifier(HEKA,德国)，数据记录和控制软件为PatchMaster(HEKA，德国)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MADI-TOF MS（AB SCIEX，美国）
2. 实验方法和结果
2.1 杀虫肽杀虫活性
选取体重为0.8-1 g范围的美洲蜚蠊56只，毒性实验用昆虫生理盐水溶解。杀虫肽对美洲蜚蠊急性毒性实验各组剂量为（nmol/g）：0（对照组）、0.29、0.53、0.96、1.74、3.09、5.56和10。从第四、五腹板交接处注射杀虫肽10 μL。实验过程中，对照组注射等体积的昆虫生理盐水时，美洲蜚蠊没有出现明显的异常情况，说明注射昆虫生理盐水对蜚蠊没有明显的影响。10min后，10 nmol/g美洲蜚蠊出现后肢麻痹、行动迟缓等较明显的中毒症状。24小时后，各实验组死亡率如下：0%、0%、14.29%、42.85%、57.00%、57.00%和100%。使用log(inhibitor)VS.response(GraphPad Prism 5.01)公式拟合，测定杀虫肽对美洲蜚蠊LD50（半数致死剂量）为3.44 nmol/g。然而，7 mg/kg 杀虫肽对小鼠进行腹腔注射，24 h后小鼠无异常反应（N=3）。
实验所用美洲蜚蠊为本实验动物房繁殖，C57小鼠购置于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
实验所用到细胞ND7/23和 HEK293T 细胞（ ATCC）购自中科院上海生命科学研究所细胞库。实验仪器主要有大连依利特P230p、美国Waters HPLC 2795 Alliance、全细胞膜片钳系统：记录采集数据放大器为EPC10 USB Amplifier(HEKA,德国)，数据记录和控制软件为PatchMaster(HEKA，德国)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MADI-TOF MS（AB SCIEX，美国）
2. 实验方法和结果
2.1 杀虫肽杀虫活性
选取体重为0.8-1 g范围的美洲蜚蠊56只，毒性实验用昆虫生理盐水溶解。杀虫肽对美洲蜚蠊急性毒性实验各组剂量为（nmol/g）：0（对照组）、0.29、0.53、0.96、1.74、3.09、5.56和10。从第四、五腹板交接处注射杀虫肽10 μL。实验过程中，对照组注射等体积的昆虫生理盐水时，美洲蜚蠊没有出现明显的异常情况，说明注射昆虫生理盐水对蜚蠊没有明显的影响。10min后，10 nmol/g美洲蜚蠊出现后肢麻痹、行动迟缓等较明显的中毒症状。24小时后，各实验组死亡率如下：0%、0%、14.29%、42.85%、57.00%、57.00%和100%。使用log(inhibitor)VS.response(GraphPad Prism 5.01)公式拟合，测定杀虫肽对美洲蜚蠊LD50（半数致死剂量）为3.44 nmol/g。然而，7 mg/kg 杀虫肽对小鼠进行腹腔注射，24 h后小鼠无异常反应（N=3）。
[0016] 2.2 杀虫肽的杀虫机制研究电压门控钠通道是杀虫剂作用的靶点之一，筛选昆虫电压门控钠通道的调制剂是进行杀虫剂筛选的常规平台。从美洲蜚蠊中提取神经元（DUM）进行昆虫离子通道电生理实验。1 μM杀虫肽抑制昆虫电压门控钠通道的活性（图2A），IC50为690 nmol（图2B），10 μM杀虫肽不影响神经元本身的高电压激活钙通道（N=3）（图2C）,15 μM杀虫肽对昆虫电压门控钾通道具备一定抑制作用（抑制率等于15.43±0.05%，N=3），可证实杀虫肽是专一性电压门控钠通道的抑制剂。同时15 μM杀虫肽不影响Hek293T异源表达的Nav1.5（N=3）、Nav1.7（N=4）和Nav1.8（N=3），也不影响急性分离大鼠背根神经节 (DRG)的电压门控钙离子通道，从分子机制上证实了杀虫肽对昆虫电压门控钠通道的抑制效果具备专一性和高活性，为杀虫肽的杀虫作用机制和对哺乳动物的安全性提供了充足的理论基础。
[0017] 上述实验结果表明杀虫肽具有很强的杀虫活性，它通过抑制昆虫电压门控钠通道阻止神经传导来发挥杀虫作用，同时对哺乳动物安全性较高。因此，杀虫肽有巨大潜力研发新型生物杀虫剂。
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