抗植物致病组合物
阅读：1015发布：2020-05-14
专利汇可以提供抗植物致病组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有抗致病活性的分离的细菌和包括其的组合物。本发明进一步涉及源自所述细菌的化合物或其类似物，和使用其 治疗 或减少病原体的症状的方法，所述病原体包括但不限于 植物 病原菌。，下面是抗植物致病组合物专利的具体信息内容。
1.分离的细菌，其包括与SEQ ID NO:1具有至少98％序列同一性的核酸序列和与SEQ ID NO:2-14中的任一种具有至少85％序列同一性的至少一种另外的核酸序列。
2.权利要求1所述的分离的细菌，其包括在SEQ ID NO:2-14中陈述的核酸序列。
3.权利要求1所述的分离的细菌，其包括与人参土戴氏菌具有至少10％序列变化性的核酸序列。
4.组合物，其包括权利要求1-3中任一项所述的细菌，和乳化剂、生长基质或其组合中的任一种。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述乳化剂包括选自如下的材料：非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或两亲型表面活性剂。
6.权利要求4或5中任一项所述的组合物，其中所述乳化剂是非离子型表面活性剂。
7.权利要求4所述的组合物，其中所述生长基质包括选择性细菌生长培养基。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述选择性细菌生长培养基包括选自糖和氨基酸的一种或多种材料。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述糖选自：阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、蜜二糖、半乳糖、肌醇、葡糖苷、和其任意组合或衍生物。
10.权利要求8所述的组合物，其中所述氨基酸选自：脯氨酸硝基苯胺、γ-L-谷氨酰对硝基苯胺、苯丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、和其任意组合。
11.权利要求4至10中任一项所述的组合物，进一步包括选自如下的一种或多种化合物：喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。
12.组合物，其包括喹啉甲醛和羟甲基-2-糠醛，或其任意衍生物。
13.权利要求4至12中任一项所述的组合物，进一步包括选自如下的材料：肥料、除草剂、杀虫剂、或其任意组合。
14.治疗或减少病原体的症状的方法，所述方法包括使所述病原体与权利要求1至3中任一项所述的分离的细菌或权利要求4至13中任一项所述的组合物接触的步骤，从而治疗或减少所述病原体的症状。
15.权利要求14所述的方法，其中所述病原体是植物病原菌。
16.权利要求15所述的方法，其中所述植物病原菌选自野油菜黄单胞菌、韧皮部杆菌暂定属和植原体。
17.权利要求14所述的方法，其中所述病原体是蜜蜂螺原体。
18.组合物，其包括植物种子和封装所述植物种子的胶囊，其中所述胶囊包括：
i.权利要求1-2中任一项所述的细菌或权利要求3-10中任一项所述的组合物，和ii.生物相容性材料。
19.权利要求18所述的组合物，其中所述生物相容性材料包括粘合材料。
20.权利要求19所述的组合物，其中所述粘合材料选自：瓜尔胶、衍生的瓜尔胶、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酸)、聚丙烯酸酯、聚(乙二醇)、膦酸酯-封端聚合物、聚环氧乙烷、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚四氢呋喃、聚酰胺、淀粉、衍生的淀粉、糯玉米、高粱、糯高粱、西米、糊精、几丁质、壳聚糖、藻酸盐组合物、树胶、果胶、纤维素、或其任意组合或衍生物。
21.权利要求18至19中任一项所述的组合物，其中所述生物相容性材料是或包括矿物质。
22.权利要求18至19中任一项所述的组合物，进一步包括粘合剂。
23.权利要求22所述的组合物，其中所述粘合剂选自：明胶、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、麦芽糊精、多糖、脂肪、油、蛋白质、虫胶、偏二氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木质素磺酸钙、丙烯酸共聚物、聚丙烯酸乙烯酯、玉米蛋白、壳聚糖、聚环氧乙烷、丙烯酰亚胺聚合物、聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰亚胺单体、藻酸盐、聚氯丁二烯、糖浆、或其任意组合。
抗植物致病组合物
技术领域
[0001] 本发明在其一些实施方式中涉及抗植物致病组合物。
背景技术
[0002] 细菌植原体暂定属(genus Ca.Phytoplasma)由相对小的细菌组成，其全部是韧皮部局限的、非螺旋的和无细胞壁的植物病原体。与病毒不同，植原体具有其自身的、高度降低的代谢，但是对其存活必需的分子中的一些获取自宿主。它们代表柔膜菌纲内的单源进化枝，其当前基于多种保守基因的序列分析被分为至少15个亚群。
[0003] 葡萄黄化病(grapevine yellows)(GY)——最初认为是由病毒引起的病害复合体——现在已知具有植原体病原学。GY综合征的几乎相同症状由不同的植原体引起并且在葡萄藤(酿酒葡萄(Vitis vinifera))的叶、枝条和花穗(cluster)上出现。典型症状包括叶脉与叶片变色与坏死、叶向下卷曲、枝条缺乏木质化或不完全木质化、枝条萎缩(shunting)与坏死、花序败育和浆果皱缩。那些症状与筛板处的胼胝质沉积和随后的韧皮部退化相关。虽然迄今为止不知道酿酒葡萄或砧木(rootstock)的抗性栽培种，但是就症状严重性而言，多个葡萄品种相当地不同。其范围从高度易感的栽培种中的快速衰退和死亡到作为病原体的无症状携带者(carrier)的耐受性砧木。
[0004] 大约70％的世界葡萄生产被用于葡萄酒，其是世界上最高附加值的农业食用产品。影响葡萄酒质量的主要因素是葡萄生长的条件。病害、虫害和葡萄栽培实践极大地影响葡萄生产和质量的一致性。大部分时间，使用杀虫剂预防性地或应答性地防控病害和虫害。
[0005] 考虑到常规应用被证明无效，病原体——包括但不限于韧皮部局限的病原体(例如，植原体)——的防控需要新策略。
发明内容
[0006] 本发明涉及具有抗致病活性的分离的细菌和包括其的组合物。本发明进一步涉及源自所述细菌的化合物或其类似物，和使用其治疗或减少病原体——包括但不限于植物病原菌——的症状的方法。
[0007] 根据一方面，提供了分离的细菌，其包括与SEQ ID NO：1具有至少98％序列同一性的核酸序列，和与SEQ ID NO：2-14中的任一种具有至少85％序列同一性的至少一种另外的核酸序列。
[0008] 根据一些实施方式，分离的细菌包括在SEQ ID NO：2-14中陈述的核酸序列。根据一些实施方式，分离的细菌包括与人参土戴氏菌(Dyella ginsengisoli)具有至少10％序列变化性(sequence variety)的核酸序列。
[0009] 根据另一方面，提供了组合物，其包括本发明的分离的细菌，和乳化剂、生长基质中的任一种或其组合。
[0010] 根据一些实施方式，组合物包括乳化剂，其包括选自如下的材料：非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或两亲型表面活性剂。根据一些实施方式，乳化剂是非离子型表面活性剂。在一个实施方式中，所述非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯。
[0011] 根据一些实施方式，组合物包括生长基质，所述生长基质包括选择性细菌生长培养基。根据一些实施方式，所述选择性细菌生长培养基包括选自糖和氨基酸的一种或多种材料。根据一些实施方式，所述糖选自：阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、蜜二糖、半乳糖、肌醇、葡糖苷、和其任意组合或衍生物。根据一些实施方式，所述氨基酸选自：脯氨酸硝基苯胺、γ-L-谷氨酰对硝基苯胺、苯丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、和其任意组合。
[0012] 根据一些实施方式，组合物进一步包括选自如下的一种或多种化合物：喹啉甲醛(quinolinecarboxaldehyde)、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。
[0013] 根据另一方面，包括组合物，其包括喹啉甲醛和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。
[0015] 根据另一方面，提供了治疗或减少病原体的症状的方法，方法包括使所述病原体与本文公开的分离的细菌或组合物接触的步骤，从而治疗或减少病原体的症状。
[0016] 根据一些实施方式，所述病原体是植物病原菌。根据一些实施方式，植物病原菌选自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、韧皮部杆菌暂定属(Candidatus Liberibacter)和植原体。根据一些实施方式，植物病原菌是植原体。在另一个示例性实施方式中，病原体是韧皮部杆菌暂定属。在另一个示例性实施方式中，病原体是野油菜黄单胞菌。
[0017] 根据一些实施方式，病原体是蜜蜂螺原体(Spiroplasma melliferum)。
[0019] i.本文公开的细菌或组合物，和
[0020] ii.生物相容性材料。
[0021] 根据一些实施方式，生物相容性材料包括粘合材料。根据一些实施方式，所述粘合材料选自：瓜尔胶、衍生的瓜尔胶、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酸)、聚丙烯酸酯、聚(乙二醇)、膦酸酯-封端聚合物、聚环氧乙烷、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚四氢呋喃、聚酰胺、淀粉、衍生的淀粉、糯玉米、高粱、糯高粱、西米、糊精、几丁质、壳聚糖、藻酸盐组合物、树胶、果胶、纤维素、或其任意组合或衍生物。
[0022] 根据一些实施方式。所述生物相容性材料是矿物质或包括矿物质。根据一些实施方式，组合物进一步包括粘合剂。根据一些实施方式，粘合剂选自：明胶、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、麦芽糊精、多糖、脂肪、油、蛋白质、虫胶、偏二氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木质素磺酸钙、丙烯酸共聚物、聚丙烯酸乙烯酯、玉米蛋白、壳聚糖、聚环氧乙烷、丙烯酰亚胺聚合物、聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰亚胺单体、藻酸盐、聚氯丁二烯、糖浆、或其任意组合。
[0023] 本发明的适用性的进一步实施方式和完整范围将根据下文给出的详细描述变得显而易见。然而，应当理解仅仅通过说明给出详细描述和具体实例，同时指示本发明的优选实施方式，这是由于根据此详细描述，本发明的精神和范围内的多种改变和修改将对本领域技术人员显而易见。附图说明
[0024] 图1图解了与0.5μg/ml土霉素(描绘为“Oxy”)的抑制相比，戴氏菌属样细菌滤过物(描绘为“D”)对蜜蜂螺原体的体外发育的抑制。
[0025] 图2图解了(从左到右)己烷、MBTE、氯仿、丙酮和MEOH的分级提取物(fraction extract)对螺原体生长的作用。亮培养基指示螺原体生长而较暗培养基(由“*”标记)指示螺原体抑制。
[0026] 图3展现了对由具有或不具有DLB的培养基获得的甲醇和丙酮分级提取物的气相色谱法-质谱法(GC-MS)分析。
[0027] 图4A-D使用不同的探针呈现了葡萄藤植物叶柄部分中DLB定位的FISH分析：图4A：一般细菌——显示为灰色部分；图4B：DLB——特异性的；图4C：可见光；图4D：组合的所有图像。
[0028] 图5A-E展现了在接种之后八周，DLB对葡萄藤小植物的影响。图5A：健康的；图5B：健康的，接种有DLB；图5C：植原体-感染的；图5D：植原体-感染的，接种有戴氏菌属。图5E描绘了在健康的(“H”)和植原体-感染的(“Phyto”)植物接种有(“+D”)和未接种有DLB之后八周，DLB对葡萄藤小植物的影响。
[0029] 图6A-E描绘了在接种之后八周，DLB对小长春花小植物的影响。图6A：健康的；图6B：健康的，接种有DLB；图6C：植原体-感染的；图6D：植原体-感染的，接种有DLB。图6E展现了在健康的(“H”)和植原体-感染的(“Phyto”)植物接种有(“+D”)和未接种有DLB之后八周，DLB对小长春花小植物的影响(左组：枝条长度，右组：干重)。
[0030] 图7A-D呈现了显示DLB应用对葡萄藤的影响的柱状图。
[0031] 图8A-D呈现了显示DLB应用对葡萄藤的影响的柱状图。
[0032] 图9呈现了显示参考抗生素——土霉素——的标准曲线的图表。
[0033] 图10呈现了显示不同浓度的不同物质对螺原体生长的作用的图表，如通过微板测试测量的。
[0034] 图11是显示不同浓度的喹啉甲醛与羟甲基和它们对数个细菌物种的作用——如通过微板测试测量的——的柱状图。在每个三个一组的条柱中，左柱代表金黄色葡萄球菌，中柱代表大肠杆菌，并且右柱代表蜡样芽孢杆菌。
[0035] 图12描绘了本发明的细菌在黄单胞杆菌属发病机理试验下的作用。
具体实施方式
[0036] 本发明在其一些实施方式中涉及新型细菌、包括其的组合物。本发明进一步涉及包括源自所述细菌的化合物或其合成类似物的组合物。本发明进一步涉及其用于比如治疗或预防作物病害——包括但不限于由植原体引起的作物病害——的方法。
[0037] 本发明首次呈现了新型细菌，其在本文被称为“戴氏菌属样细菌”或“DLB”，对韧皮部局限的病原体比如植原体的症状具有特异性抑制作用。另外，有利地，本发明的细菌能够经由植物的根、种子和叶穿透处理的植物。本发明进一步展现了本文公开的细菌在黄单胞杆菌属发病机理试验中的效用，其指示该细菌还降低致病细菌——其不仅仅局限于韧皮部——的损害。
[0038] 根据一些实施方式，本发明提供了分离的细菌，其包括与在SEQ ID NO：1中陈述的核酸序列具有至少98％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，“与在SEQ ID NO：1中陈述的核酸序列具有至少98％同一性”进一步意为指的是与在SEQ ID NO：1中陈述的核酸序列的至少98.5％、至少99％、至少99.1％、至少99.5％、或至少99.9％、或100％序列同一性，包括其间的任意值或范围。
[0039] 在一些实施方式中，分离的细菌进一步包括与SEQ ID NO：2-14中的任一种具有至少85％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌进一步包括与SEQ ID NO：2-14中的任一种具有至少85％序列同一性的多种核酸序列。如本文使用的“多种”指的是在SEQ ID NO：2-14中陈述的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13种多核苷酸序列。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
[0040] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：2中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：2的核酸序列。
[0041] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：3中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：3的核酸序列。
[0042] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：4中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：4的核酸序列。
[0043] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：5中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：5的核酸序列。
[0044] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：6中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：6的核酸序列。
[0045] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：7中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：7的核酸序列。
[0046] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：8中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：8的核酸序列。
[0047] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：9中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：9的核酸序列。
[0048] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：10中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：10的核酸序列。
[0049] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：11中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：11的核酸序列。
[0050] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：12中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：12的核酸序列。
[0051] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：13中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：13的核酸序列。
[0052] 在一些实施方式中，分离的细菌包括与SEQ ID NO：14中的任一种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌包括含有SEQ ID NO：14的核酸序列。
[0053] 在一些实施方式中，分离的细菌进一步包括与人参土戴氏菌具有至少10％、至少15％、至少20％序列变化性的核酸序列。在一些实施方式中，分离的细菌进一步包括与橙黄弗拉托菌(Frateuria aurantia)具有至少10％、至少15％、至少20％序列变化性的核酸序列。
[0054] 应当领会本领域技术人员知晓测定人参土戴氏菌或橙黄弗拉托菌多核苷酸序列(参见，Jung et al.Int J Syst Evol Microbiol.2009；460-5；和Li et al.J Environ Sci，2009；21(2)：211-7)并且因而测定本发明的细菌与人参土戴氏菌或橙黄弗拉托菌细菌相比的序列变化性。在具体的实施方式中，本发明的细菌的16S rRNA基因与人参土戴氏菌的16S rRNA基因(登录号EF191353；SEQ ID NO：15)具有97％序列同一性。
[0055] 在具体的实施方式中，本发明的细菌的ITS序列与橙黄弗拉托菌的ITS序列(登录号CP003350)具有大约84％序列同一性。
[0056] 在一些实施方式中，与参考核酸序列“具有至少85％同一性”进一步意为指的是与参考核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、或至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列同一性，包括其间的任意值或范围。
[0057] 如下文描述的，可以使用具有在SEQ ID NO：16-17中陈述的核酸序列的引物对或具有在SEQ ID NO：18-19中陈述的核酸序列的探针序列检测SEQ ID NO：1。如下文进一步描述的，可以使用具有在SEQ ID NO：16-17中陈述的核酸序列的引物对检测SEQ ID NO：2。技术人员将领会引物和探针在本文被提供为分别用于检测本发明的细菌的16S rRNA(SEQ ID NO：1)和内转录间隔区(ITS)序列(SEQ ID NO：2)的非限制性实例。
[0058] 在具体的实施方式中，本发明的细菌是生物纯的培养物的形式。如本文使用的，短语“生物纯的培养物”指的是细菌的培养物，其中培养物和/或组合物中的至少80％(例如，至少85％、90％、95％或甚至所有100％)的微生物是这些细菌。
[0059] 在一些实施方式中，生物纯的培养物还被称为“分离物”。术语“分离物”意欲具体地指的是如此生物体，该生物体由其原始来源移出和由另外的组分——它们与该生物体原始地结合——纯化，并且因而通过人工(hand of man)由其自然环境改变。应当注意组合物可以包括完整的细菌细胞、其部分和来自其的提取物。分离的细菌指的是例如由环境——分离的细菌天然地位于其中——培育、纯化和/或与该环境分开地培养的细菌。分离的材料进一步涵盖从环境——细菌位于其中——分离和与该环境分开地培养的细菌，其中这些分离物以纯化的组成——其不包含任意显著量的其它微生物比如其它细菌菌株——存在。如本文使用的“分离的细菌”不包括在分离和/或基本上纯化之前在其天然环境中存在的细菌。
[0060] 在一些实施方式中，通过本领域已知的步骤由天然环境——比如飞虱(plant hopper)Hyalesthes obsoletus(半翅目：菱飞虱科(Cixiidae))——分离所述分离的细菌。如本文在下面展现的，本文公开的细菌是属于黄单胞杆菌科(其中还没有报道形成孢子的物种)的革兰氏阴性的、需氧的、杆形的细菌。
[0061] 如本文使用的，术语“基因组”指的是由生物体具备的总遗传信息或遗传物质，例如，细菌的整个遗传补体。基因组可以包括RNA或DNA。通常地，细菌基因组是环形的。
[0062] 如本文使用的，术语“核酸”是本领域熟知的。如本文使用的“核酸”将一般指的是包括核碱基的DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(例如，链)。核碱基包括例如在DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。
[0063] 如本文使用的，表述“核苷酸序列”、“核酸序列”、“多核苷酸序列”、和其等价物或类似短语指的是核苷酸聚合物中核苷酸单体的顺序。按照惯例，核苷酸序列通常以5′至3′方向书写。多核苷酸可以是单链或双链RNA或DNA的聚合物，其任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。除非另外指示，除明确指示的序列之外，本发明的具体的多核苷酸序列还任选地涵盖互补序列。如本文使用的，不意欲将术语“多核苷酸”限制于天然存在的多核苷酸结构、天然存在的核苷酸序列、天然存在的主链或天然存在的核苷酸间键合。本领域技术人员熟知发现与本发明一起使用的各种多核苷酸类似物、非天然核苷酸、非天然磷酸二酯键键合和核苷酸间类似物。
[0064] 本发明进一步提供了公开的细菌的变体和类似物。术语参考细菌的“变体”指示如下细菌：其与参考细菌相比在基因组序列和/或由此编码的多肽(一种或多种)中具有变化(一种或多种)，同时保留与参考细菌相同的表型特性。变体还涵盖如下细菌：其与参考细菌相比在基因组序列和/或由此编码的多肽(一种或多种)中具有变化(一种或多种)，同时改进参考细菌的表型特性。在一些实施方式中，本发明的变体是遗传改造的变体(例如，对参考细菌的核酸序列进行遗传改造的突变(一种或多种)的结果)。
[0065] 变体可以包括例如遗传物质的沉默突变、保守突变、次要缺失、和/或次要复制，并且保留参考细菌的表型特性。在一些实施方式中，本发明的变体保留取决于本发明的细菌的基因组的任何可观察到的特性或性质，比如细菌的表型特性和/或针对植原体的抑制活性。
[0066] 术语“表型特性”指示细菌的形态和/或宿主范围。用于表型分析细菌的方法是本领域熟知的。
[0067] 根据一些实施方式，本发明进一步涵盖具有如下基因组的变体：其与在SEQ ID NO：2-14中陈述的核酸序列包括至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。根据一些实施方式，本发明进一步涵盖具有如下基因组的变体：其相对于在SEQ ID NO：
2-14中陈述的核酸序列包括至少1、至少2、至少4、至少5或至少10个突变。
2-14中陈述的核酸序列包括至少1、至少2、至少4、至少5或至少10个突变。
[0068] 在一些实施方式中，突变包括缺失、插入、置换或其任意组合。在一些实施方式中，可以在非编码区比如操纵子和启动子区中发现缺失、插入、置换。在一些实施方式中，可以在细菌的编码区中发现缺失、插入、置换。在一些实施方式中，缺失、插入、置换是沉默突变，其不导致编码的氨基酸序列的改变。
[0069] 关于核酸序列的术语“％同一性”指示序列之间同一性或同源性的水平，并且可以通过本领域已知的技术测定。关于核酸序列的术语“％变化性”指示序列之间变化性的水平，并且可以通过本领域已知的技术测定。
[0070] 在比对序列以提供最大同源性后，例如，可以通过由Needleman等(Needleman et al，J.Mol.Biol.48：443-453(1970))描述的Fitch等的算法版本(Fitch et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：1382-1386(1983))测定序列同一性百分比。可选地，可以使用Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877的数学算法完成两条序列之间同一性百分数的测定。这样的算法被并入Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215，403-410的BLASTP程序。为了出于比较目的获得缺口(gapped)比对，如Altschul et al(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各自程序(例如，XBLAST)的缺省参数。
[0071] 可以针对具体的噬菌体通过本领域技术人员熟知的化学、放射或其它方法制造变体。还可以通过本领域技术人员熟知的同源重组方法制造变体。具有突变序列的变体可以包括缺失、插入、添加或置换，其全部都可以通过常规技术构建。
[0072] 细菌组合物
[0073] 在一些实施方式中，本发明提供了组合物(其贯穿本文被称为：“细菌组合物”)，其包括本发明的细菌，即，戴氏菌属样细菌。
[0074] (i)乳化剂
[0075] 在一些实施方式中，细菌组合物进一步包括乳化剂。如本文使用的，术语“乳化剂”指的是促进乳剂形成和稳定的物质。根据一些实施方式，乳化剂选自十二烷基硫酸钠、磷脂、糖脂、甘油三酯、卵磷脂、肥皂、硬脂酸钠、硬脂酸钾、硬脂酸铵、油酸钠、油酸钾、油酸铵、棕榈酸钠、棕榈酸钾和棕榈酸铵。
[0076] 在一个实施方式中，乳化剂是表面活性剂。术语“表面活性剂”(其也称为表面活化剂)包括降低两种液体之间或液体与固体之间或气体与液体之间的表面张力(或界面张力)的任何试剂。表面活性剂可以充当洗涤剂、湿润剂、乳化剂、泡沫剂、和/或分散剂。
[0077] 通常地，表面活性剂包括任何非离子的、阴离子的、阳离子的、两性离子的、和两性的可接受的表面活性剂。在一些实施方式中，乳化剂是非离子型表面活性剂。在一些实施方式中，乳化剂是阴离子型表面活性剂。在一些实施方式中，乳化剂是阳离子型表面活性剂。在一些实施方式中，乳化剂是两亲型表面活性剂。根据本发明的一些实施方式，乳化剂选自阳离子乳化剂、阴离子乳化剂、非离子乳化剂和其组合。
[0078] 非离子型表面活性剂包括但不限于失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧失水山梨醇脂肪酸酯、聚亚氧烷基高级醇醚和聚亚氧烷基高级醇酯。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括聚氧乙烯山梨醇酯比如聚山梨醇酯80( 80)、聚山梨醇酯60( 60)和聚山梨醇酯20( 20)，泰洛沙泊；聚氧乙烯异辛基苯基醚比如Triton X-100，聚氧乙烯壬基苯基醚比如NP-40，聚氧乙烯十二烷基醚比如Brij 58，辛基葡糖苷，和烷基麦芽糖苷比如正十二烷基-β-D-麦芽糖苷；泊洛沙姆4070；泊洛沙姆188；和硬脂酸-40-聚烃氧基酯。
每种可能性是本发明的单独的实施方式。
每种可能性是本发明的单独的实施方式。
[0079] 非离子型表面活性剂还可以包括但不限于乙氧基化脂肪醇(烷基聚乙二醇)；烷基酚聚乙二醇；烷基硫醇聚乙二醇；乙氧基化脂肪胺(烷基氨基聚乙二醇)；乙氧基化脂肪酸(酰基聚乙二醇)；乙氧基化聚丙二醇(PluronicsTM；例如，Pluronic F-68)；脂肪酸烷基醇酰胺，(脂肪酸酰胺聚乙二醇)；N-烷基-、N-烷氧基聚-羟基-脂肪酸酰胺，蔗糖酯；山梨醇酯和聚乙二醇醚，聚氧乙烯-氢化蓖麻油，脂肪酸烷醇酰胺，蔗糖脂肪酸酯，一、二和三辛酸甘油酯。每种可能性是本发明的单独的实施方式。
[0080] 阴离子型表面活性剂包括但不限于烷基硫酸盐、烯烃硫酸盐、醚硫酸盐、甘油单酯硫酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、芳基磺基琥珀酸盐，其包括十二烷基硫酸钠(SDS)、二辛基磺基琥珀酸钠、二辛基磺酸钠。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
[0081] 阳离子型表面活性剂包括但不限于苯甲羟胺盐、聚亚氧烷基烷基胺、烷基胺、烷醇胺脂肪酸酯、季铵脂肪酸酯、二烷基铵盐、烷基吡啶鎓盐，其包括硬脂胺、油酸三乙醇胺、氯化苄甲乙氧铵。每种可能性是本发明的单独的实施方式.
[0082] 两性表面活性剂包括，例如，基于咪唑啉的两性表面活性剂(比如2-椰油酰基(cocoyl)-2-氢氧化咪唑啉鎓-1-羧基乙氧基-2-钠盐)、基于甜菜碱的表面活性剂(比如烷基甜菜碱、酰胺甜菜碱和磺基甜菜碱)、和酰基甲基牛磺酸。每种可能性是本发明的单独的实施方式。
[0083] 表面活性剂以如下量存在于本发明的组合物中：按重量计组合物的总重量的大约0.001％至大约10％的量，可选地按重量计大约0.001％至大约0.5％的量，或按重量计大约
0.001％至大约0.2％的量，或按重量计组合物的总重量的大约0.001％至大约0.05％的量。
0.001％至大约0.2％的量，或按重量计组合物的总重量的大约0.001％至大约0.05％的量。
[0084] 在一些实施方式中，通过制备和混合两种溶液提供乳剂，一种是水相(水基相)并且另一种是有机相(油基相)，以便于在一个相中使另一个分散。
[0085] (ii)生长基质
[0086] 在一些实施方式中，本发明的组合物包括本文描述的细菌和生长基质。在一些实施方式中，术语“生长基质”或“生长培养基”——其贯穿本文被可交换地使用——意欲意思是用于细菌在培养物中生长的培养基，其包括对细菌的生长必需的组分，比如，非限制性地，碳源/能源。
[0087] 通常地，可以通过在液体培养基或琼脂板中生长公开的菌株来产生本发明的组合物。液体培养基可以是包括碳源与氮源和无机盐的任何合适的营养培养基。合适的培养基是可获得的或可以由商业来源获得。所述培养基可以是液体形式和固体形式。
[0088] 在一些实施方式中，生长基质是选择性生长培养基。在一些实施方式中，选择性生长培养基被设计为阻抑一些微生物的生长，同时允许其它(一种或多种)(例如，公开的微生物)的生长。
[0089] 在一些实施方式中，选择性生长培养基包括糖和/或氨基酸，或其衍生物。
[0090] 如本领域已知的，术语“氨基酸”(或“多种氨基酸”其也称为“氨基酸类型(一种或多种)”)被理解包括二十种天然存在的氨基酸，而不限制于此。另外，除非另外说明，术语“氨基酸”可以指的是D-和L-氨基酸二者。在本发明的一些实施方式中，非常规的或修饰的氨基酸(例如，合成的)也是可能的。
[0091] 在一些实施方式中，选择性生长培养基包括一种或多种氨基酸，其选自，但不限于脯氨酸硝基苯胺、γ-L-谷氨酰对硝基苯胺、苯丙氨酸、甘氨酸、精氨酸和其任意组合。
[0093] 糖的示例性衍生物是糖苷。糖的另一种示例性衍生物是糖醇。术语“糖苷”是类属的并且具体的糖残基的存在由适当的术语指示，如葡糖苷、半乳糖苷、果糖苷等。糖苷可以被认为衍生自单糖、二糖、三糖或甚至包含多至例如9个糖单元的寡糖。
[0094] 在一些实施方式中，选择性生长培养基包括一种或多种糖或糖衍生物，其选自，但是不限于阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、蜜二糖、半乳糖、肌醇、葡糖苷和其任意组合。
[0095] 在一些实施方式中，葡糖苷选自对硝基苯基-β-葡糖苷(p-n-p-β-Glc)、p-n-p-α-葡糖苷、和p-n-p-α-β-葡糖苷，而不限于此。在示例性实施方式，生长培养基包括p-n-p-α-β-葡糖苷。
[0096] 在一些实施方式中，选择性生长培养基包括一种或多种材料，其选自p-n-p-木糖苷、七叶苷(esculine)和尿素，而不限于此。
[0097] 在一些实施方式中，选择性生长培养基包括呋喃妥因(nitrofuration)、环丙沙星、头孢噻酚、美罗培南、诺氟沙星、萘啶酸、硫酸抗敌素、亚胺培南、头孢吡肟(cefeprime)、氨曲南和头孢呋辛。
[0098] (iii)运载体
[0099] 本发明的组合物还可以包括一种或多种运载体，优选地一种或多种农业上可接受的运载体。在一个实施方式中，运载体，比如农业上可接受的运载体，可以是固体或液体。本文有用的运载体包括通常用于配制农业组合物的任何物质。
[0100] 在一个实施方式中，农业上可接受的运载体可以选自填料、溶剂、赋形剂、表面活性剂、悬浮剂、展着剂(speader)/粘着剂(粘合剂)、消泡剂、分散剂、湿润剂、漂移抑制剂(driff reducing agent)、助剂、佐剂或其混合物。
[0101] 本发明的组合物可以通过已经建立的程序被配制为，例如，浓缩剂、溶液、喷雾、气溶胶、浸浴、浸渍剂(dip)、乳剂、可湿性粉末、可溶性粉末、悬浮剂(suspension concentrate)、粉剂、颗粒、水分散性颗粒、微胶囊、糊剂、凝胶和其它制剂类型。这些程序包括混合和/或研磨活性成分与农业上可接受的运载体物质，比如填料、溶剂、赋形剂、表面活性剂、悬浮剂、展着剂/粘着剂(粘合剂)、消泡剂、分散剂、湿润剂、漂移抑制剂、助剂和佐剂。
[0102] 在一个实施方式中，固体运载体包括但不限于矿物土(mineral earth(比如硅酸、硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、凹凸棒石黏土、石灰石、石灰、白垩、胶块土、黄土、黏土、白云石、硅藻土、氧化铝、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、磨碎的塑料(ground plastic)、肥料——比如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵和尿素——和蔬菜产品——比如谷粒碎粉、树皮碎粉、木材碎粉和坚果壳碎粉——纤维素粉末等。作为颗粒的固体运载体，下列是合适的：压碎的或分级的(fractionated)天然石材比如方解石、大理石、浮石、海泡石和白云石；无机或有机碎粉的合成颗粒；有机材料的颗粒比如木屑、椰子壳、玉米芯、玉米壳或烟草杆；硅藻石(kieselguhr)、磷酸三钙、软木粉或吸收剂炭黑；水溶性聚合物、树脂、蜡；或固体肥料。这样的固体组合物可以——如果需要的话——包含一种或多种相容的湿润剂、分散剂、乳化剂或着色剂，其——当固体时——也可以充当稀释剂。
[0103] 在一个实施方式中，运载体还可以是液体，例如，水；醇类，特别是丁醇或乙二醇，以及它们的醚或酯，特别是乙酸甲基乙二酯；酮类，特别是丙酮、环己酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或异佛尔酮；石油馏分比如石蜡烃或芳香族烃，特别是二甲苯或烷基萘；矿物油或植物油；脂肪族氯代烃，特别是三氯乙烷或二氯甲烷；芳香族氯代烃，特别是氯苯；水溶性或强极性溶剂比如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或N-甲基吡咯烷酮；液化气；等或其混合物。
[0104] 展着剂/粘着剂促进本发明的组合物粘附植物表面的能力。表面活性剂、展着剂/粘着剂的实例包括但不限于吐温和Triton (Rhom and Hass Company)， Pulse，C. Codacide D-C. Supamet Oil， Penetrant， and
TM
Freeway， Fortune Plus ，Fortune Plus Lite，Fruimec，Fruimec lite，芳香族磺酸——例如，木素磺酸，苯酚磺酸，萘磺酸和二丁基萘磺酸——和脂肪酸的碱金属盐、碱土金属盐和铵盐，烷基和烷基芳基磺酸盐，和烷基、月桂基醚和脂肪醇硫酸盐，和硫酸化十六醇、十七醇和十八醇的盐，脂肪醇乙二醇醚的盐，磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合产物，萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合产物，聚氧乙烯辛基酚醚，乙氧基化异辛基酚、乙氧基化辛基酚和乙氧基化壬基酚，烷基酚聚乙二醇醚，三丁基苯基聚乙二醇醚，烷基芳基聚醚醇，异十三醇，脂肪醇环氧乙烷缩合物，乙氧基化蓖麻油，聚氧乙烯烷基醚，乙氧基化聚氧丙烯，月桂醇聚乙二醇醚缩醛，山梨醇酯，木素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。在选择包含物时，一种或多种农业表面活性剂比如吐温根据已知的方案期望地包括在组合物中。
TM
Freeway， Fortune Plus ，Fortune Plus Lite，Fruimec，Fruimec lite，芳香族磺酸——例如，木素磺酸，苯酚磺酸，萘磺酸和二丁基萘磺酸——和脂肪酸的碱金属盐、碱土金属盐和铵盐，烷基和烷基芳基磺酸盐，和烷基、月桂基醚和脂肪醇硫酸盐，和硫酸化十六醇、十七醇和十八醇的盐，脂肪醇乙二醇醚的盐，磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合产物，萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合产物，聚氧乙烯辛基酚醚，乙氧基化异辛基酚、乙氧基化辛基酚和乙氧基化壬基酚，烷基酚聚乙二醇醚，三丁基苯基聚乙二醇醚，烷基芳基聚醚醇，异十三醇，脂肪醇环氧乙烷缩合物，乙氧基化蓖麻油，聚氧乙烯烷基醚，乙氧基化聚氧丙烯，月桂醇聚乙二醇醚缩醛，山梨醇酯，木素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。在选择包含物时，一种或多种农业表面活性剂比如吐温根据已知的方案期望地包括在组合物中。
[0105] 湿润剂降低组合物中水的表面张力并且因而增加在其上可以施加给定量的组合物的表面积。湿润剂的实例包括但不限于聚丙烯酸的盐，木质素磺酸的盐，苯酚磺酸或萘磺酸的盐，环氧乙烷与脂肪醇或脂肪酸或脂肪酯或脂肪胺的缩聚物，取代的苯酚(特别是烷基苯酚或芳基苯酚)，磺基琥珀酸酯的盐，牛磺酸衍生物(特别是烷基牛磺酸盐)，醇的磷酸酯或环氧乙烷与苯酚的缩聚物的磷酸酯，脂肪酸与多元醇的酯，或上面的化合物的硫酸、磺酸或磷酸官能团衍生物。
[0106] 如上面描述的，本发明的组合物可以单独使用或与一种或多种其它农药(agricultural agent)组合使用，所述农药包括杀虫剂、除虫剂、杀螨剂(acaracide)、另外的杀真菌剂、杀菌剂、除草剂、抗生素、抗菌剂、杀线虫剂、杀鼠剂、昆虫病原体、信息素、引诱剂、植物生长调节剂、植物激素、昆虫生长调节剂、化学不育剂、微生物虫害防控剂、驱避剂、病毒、诱食剂(phagostimulent)、植物营养物、植物肥料和生物防控物。当与其它农药组合使用时，两种药剂的施用可以是分开的、同时的或连续的。这些农药的具体实例是本领域技术人员已知的，并且许多是商业上容易获得的。
[0107] 杀真菌剂的实例包括但不限于下列种类的杀真菌剂：甲酰胺、苯并咪唑、三唑、羟基吡啶、二甲酰胺、苯基酰胺、噻二唑、氨基甲酸酯、氰基-肟、肉桂酸衍生物、吗啉、咪唑、β-甲氧基丙烯酸酯和吡啶/嘧啶。杀真菌剂的进一步的实例包括但不限于天然杀真菌剂、有机杀真菌剂、硫基杀真菌剂、铜/钙杀真菌剂和植物宿主防御的诱导子。天然杀真菌剂的实例包括但不限于全乳、乳清、脂肪酸或酯化脂肪酸。有机杀真菌剂的实例包括但不限于通过有机认证标准的任何杀真菌剂，比如生物防控剂、天然产品、诱导子(其中一些也可以被分类为天然产品)、和硫与铜杀真菌剂(限于受限的用途)。在一些实施方式中，可以采用非有机杀真菌剂。
[0108] 杀虫剂的实例包括但不限于嘧菌酯(azoxystrobin)、双苯三唑醇、萎锈灵、Cu2O、霜脲氰、环唑醇、环丙嘧啶、苯氟磺胺(dichlofluamid)、 醚唑、烯唑醇、氧唑菌、拌种咯、咯菌腈、氟壹哇(fluquiconazole)、氟硅唑、粉唑醇、呋霜灵、双胍盐、己唑醇、恶霉灵、抑霉唑、酰胺唑、种菌唑(ipconazole)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、代森锰锌、甲霜灵、R-甲霜灵、叶菌唑(metconazole)、 霜灵、稻瘟酯、戊菌唑、戊菌隆、丙氯灵、丙环唑、咯喹酮、SSF-109、螺环菌胺(spiroxamin)、戊唑醇、噻菌灵、对甲抑菌灵(tolifluamid)、唑菌嗪、粉锈宁、唑菌醇、氟菌唑、灭菌唑(triticonazole)和特效唑。
[0109] 重要的是，使用的任何添加剂以不干扰生物防控剂的效力的量存在。
[0110] 组合物可以进一步包括稳定剂。如本文使用的，术语“稳定剂”指的是维持本发明的细菌的化学结构和/或生物学活性的赋形剂。在一些实施方式中，稳定剂选自吐温、triton、泰洛沙泊、普流罗尼类、Brijcs、Spans、泊洛沙姆和cmulphor。在一些实施方式中，稳定剂是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方式中，稳定剂是聚山梨醇酯。在一些实施方式中，稳定剂选自聚山梨醇酯、十二烷基苯硫酸钠(SDBS)、聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)、和聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯(吐温20)。
[0111] 组合物可以进一步包括缓冲剂。“缓冲剂”意思是被添加至组合物以便调节溶液制剂或冻干制剂——当重构时——中的pH值的试剂(一种或多种)。可以使用本领域通常可获得的方法实现此pH最佳值的测定。例如，本发明的组合物中可以包括的代表性缓冲剂是磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。每种可能性是本发明的单独的实施方式。缓冲剂调节溶液的pH值，使得维持其中的细菌或化合物的稳定性。在一些实施方式中，本组合物的pH值在大约5至大约8的范围中。
[0112] 可以以大量形式制备组合物。一种制剂包括粉末形式的本发明的组合物。在进一步的形式中，组合物与稀释剂比如水混合以形成喷雾、泡沫、凝胶、或浸渍剂，并且使用已知的方案适当地施加。
[0113] 还可以使用配制用于其它施加方法甚至可以是任意已知的本领域方法比如注射、擦拭(rubbing)或涂刷的组合物。间接施加组合物至植物周围或环境比如土壤、水或作为种子包衣施加也被考虑。
[0114] 施加本发明的组合物以便于为有效的生物防控剂的浓度可以取决于如下变化：最终用途、植物的生理学条件；类型(包括细菌物种)、病原体感染浓度和程度；温度、季节、湿度、植物的生长期阶段和年龄；施加的常规杀虫剂或其它处理物(包括杀真菌剂)的数目和类型；和植物处理(比如叶采摘和修剪)。
[0115] 考虑在种植周期中的相同或不同时间重复施加。本发明的组合物可以在季节中较早或较晚施加。这可以是开花期内(over flowering)或在结果、块茎出现期间等。本发明的组合物还可以刚好在收获之前或收获之后施加。
[0116] 可以以任何方式配制上面陈述的组合物。非限制性制剂实例包括但不限于干燥颗粒物(grain)比如可乳化浓缩物(EC)、可湿性粉末(WP)、可溶性液体(SL)、气溶胶、超低体积浓缩溶液(ULV)、可溶性粉末(SP)、微胶囊、水分散颗粒(WDG)、流动剂(Flowable)(FL)、微乳剂(ME)、纳米乳剂(NE)等。在本文描述的任何制剂中，活性成分的百分数充分在技术人员的能力内，例如，在0.01％至99.99％的范围内。
[0117] 组合物可以是液体、凝胶、固体、或生物熏蒸剂的形式。可以通过如下制备固体组合物：在活性成分(一或多种)的溶液中浸泡固体运载体并且在温和条件下干燥悬浮液，比如在室温下蒸发或在65℃或更低下真空蒸发。固体组合物也可以是与菌株一起生长的干燥颗粒物。组合物可以额外地包括表面活性剂，其出于乳化、分散、湿润、散布、整合、崩解控制、稳定活性成分和改进流动性或防锈的目的被使用。
[0118] 源自戴氏菌属样细菌的化合物和其类似物
[0119] 根据一些实施方式，组合物包括由公开的细菌的生物纯的培养物产生的多种化合物(例如，挥发性有机化合物(VOC))。根据一些实施方式，组合物包括同一于、类似于、或衍生自所述化合物的多种合成化合物。
[0120] 在一些实施方式中，所述多种化合物选自喹啉甲醛、羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。
[0121] 在一些实施方式中，组合物包括喹啉甲醛、或羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、其任意衍生物。
[0122] 在一些实施方式中，提供了组合物，其包括喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括以1∶10至10∶1的比率的喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括以1∶5至5∶1的比率的喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括以1∶4至4∶1的比率的喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括以1∶3至3∶1的比率的喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括以1∶2至2∶1的比率的喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括以1∶1.5至1.5∶1的比率的喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。在一些实施方式中，组合物包括以1∶1.1至1.1∶1的比率的喹啉甲醛、和羟甲基-2-糠醛、或其任意衍生物。
[0123] 在一些实施方式中，喹啉甲醛或其衍生物具有由式I代表的结构：
[0124]
[0125] 其中R1至R5中的每个代表取代基，并且其中在每种情况下，来自R1至R7的一至四个取代基包括或选自氢、烷基、环烷基、芳基、杂脂环的、杂芳基、烷氧基、羟基、巯基、硫代烷氧基、芳氧基、硫代芳氧基、氨基、硝基、卤代(halo)、三卤代甲基、氰基、酰胺、羧基、砜基、次硫酸基(sulfoxy)、亚砜基、磺酰胺，或是稠环，并且R1至R5中的至少一个独立地是由式I2代表的形式：
[0126]
[0127] 在一些实施方式中，喹啉甲醛具有式II的结构(其也称为4-喹啉甲醛)：
[0128]
[0129] 在一些实施方式中，5-(羟甲基)-2-糠醛的衍生物选自，但不限于：5-甲基糠醛、2-呋喃基烷基酮、2，5-呋喃二甲醛、糠醛、糠醇、5-烷基-糠醛、2，5-呋喃二羧酸。在此，“烷基”可以指的是C1-C5烷基，例如，甲基。
[0131] 在一些实施方式中，术语协同或其任意语法派生词被定义为两种或更多种化合物的同时作用，其中生物体对组合的总应答大于单个组分的总和。虽然已经研究了抗菌化合物的许多组合，但是极少揭示协同作用，并且具有协同增强活性的抗菌组合的全球使用是相当有限的。
[0132] 提取方法
[0133] 在一些实施方式中，本文描述的化合物由包括公开的细菌的培养基或上清液提取。
[0134] 如本文使用的，术语“提取”或其任意语法派生词包括但不限于通过提取工艺比如蒸馏、有机提取、醇提取、水相提取和溶剂提取由来源比如植物或动物获得的产物(例如，凝结物、油树脂、馏出物、干粉提取物、流体提取物和残留物)。
[0135] 用于提取的非限制性实例溶剂包括甲醇、丙酮、叔丁基醚(MTBE)、氯仿和己烷。在示例性实施方式，溶剂选自甲醇和丙酮。
[0136] 分馏和/或吸附色谱法也是提取由本发明的细菌分离株产生的期望产物的方法的非限制性实例。分馏在本领域已知为将混合物分离为其组分部分，或级分，比如通过将它们加热至化合物的几种级分将蒸发的温度通过它们的沸点分离化合物。吸附色谱法是物理分离方法，其中混合物的组分通过它们在两个相中的分布差异而被分离，其中一个相是固定的(固定相)而另一个(流动相)以确定方向移动通过。物质必须与将保留的固定相相互作用并且通过其被分离。
[0137] 气相色谱法是熟知的用于分馏和测定样品——其包含不同挥发性的化合物的混合物—-中各种组分的相对量的技术。例如，样品被气化并且全部得到数量的气体穿过分析色谱柱。色谱方法比如气相色谱法可以快速地测定多组分样品——比如将由本发明的真菌分离株产生的样品——的挥发物含量。
[0138] 抗菌活性
[0139] 在一些实施方式中，本发明提供了抗菌组合物。在一些实施方式中，本发明提供了抗植物致病组合物。
[0140] 在一些实施方式中，本发明的化合物和包括其的组合物的特征在于具有抗菌活性，例如，针对靶标细菌的裂解活性。
[0141] 在一些实施方式中，提供了治疗或预防植物感染例如植原体植物感染的方法。在一些实施方式中，方法包括使用公开的组合物中的一种治疗植物从而减少症状或预防植原体植物感染的步骤。
[0142] 因而，根据本发明的一方面，提供了杀伤植物病原菌或减少其症状的方法，方法包括使植物病原菌暴露于有效量的组合物，所述组合物包括公开的细菌的生物纯的培养物或由生物培养物产生并且能够杀伤植物病原菌或减少其损害或症状的至少一种化合物。
[0143] 根据本发明的额外或可选方面，提供了用于减少由植物病原菌引起的对植物或植物部分的总体损害的方法，方法包括将植物或植物部分暴露于有效量的任何公开的组合物(例如，其任何实施方式中的细菌组合物)或由生物培养物产生并且能够杀伤植物病原菌或减少其症状的至少一种化合物，从而减少对植物或植物部分的总体损害。
[0144] 短语“抗植物致病活性”和“抗植物致病功效”在本文可交换地使用并且指的是某些药剂比如某些微生物拮抗一种或多种植物病原菌的能力。术语“抗菌的”意思是拮抗一种或多种细菌——特别是一种或多种植物致病细菌——的能力。因此，抗菌剂，比如抗真菌细菌菌株，是如下药剂：其是一种或多种真菌，优选地一种或多种植物致病真菌的拮抗物。这样的药剂在本文被认为具有抗真菌功效。
[0145] 如本文使用的，术语“生物防控剂”(BCA)指的是生物药剂，其充当一种或多种病原体，比如植物致病昆虫、植物致病细菌、或植物致病原生动物的拮抗物，或能够防控一种或多种植物病原菌。拮抗可以采取大量形式。在一种形式中，生物防控剂可以简单地充当驱避剂。在另一种形式中，生物防控剂可以致使环境对植物病原菌不利。在进一步优选的形式中，生物防控剂可以寄生于植物病原菌、使其无能力、致使其无法生殖、阻碍其生长、和/或杀伤其。拮抗机制包括但不限于抗生、寄生、不育和毒性。因此，充当一种或多种植物病原菌的拮抗物的药剂可以说具有抗植物致病功效。例如，为植物致病昆虫的拮抗物的药剂可以说具有真菌致病功效(mycopathogenic efficacy)。
[0146] 如本文使用的，“生物防控组合物”是包含或包括至少一种生物防控剂——其是一种或多种病原体(例如，植物病原菌)的拮抗物——的组合物。这样的防控剂包括但不限于充当驱避剂的药剂，致使环境对病原体不利的药剂，和使病原体无能力、致使其无法生殖、和/或杀伤其的药剂。因此，这样的组合物在本文被认为具有抗植物致病功效。
[0147] 因此，如本文使用的，“抗植物致病组合物”是包含或包括至少一种药剂——其是一种或多种植物病原菌的拮抗物——的组合物。这样的组合物在本文被认为具有抗植物致病功效。
[0148] 如本文使用的，术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的，或他们由已知的方式、手段、技术和程序容易研发出的那些方式、手段、技术和程序。
[0149] 如本文使用的，术语“治疗”包括废除、大幅度抑制、减慢或逆转病症的进展，大幅度减轻病症的临床或审美(aesthetical)症状或大幅度预防病症的临床或审美症状的出现。
[0150] 如本文使用的，术语“防控(control或controlling)”一般理解是预防、减少或根除病原体感染或抑制这样的感染的速率和程度，或减少植物或其周围环境中或植物或其周围环境上的病原体群体，其中感染(一种或多种)或群体(一种或多种)中这样的预防和减少关于未治疗的感染(一种或多种)或群体(一种或多种)是统计上显著的。还考虑治愈性治疗。优选地，这样的防控通过病原体群体之中增加的死亡率来实现。
[0151] 如本文使用的，术语“减少”指的是与未暴露于如本文描述的治疗的病原体在给定时间中的生长相比，在该给定时间中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的生长减少或甚至100％生长停滞。
[0152] 如本文使用的，术语“预防”在抗菌剂的上下文中指示微生物细胞的生长速率大体上消失(nullified)或减小微生物在缺少公开的细菌存在下的可比较状况中的表观的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％——包括其间的任意值。可选地，预防意思是减小至微生物细胞在缺少公开的细菌或包含其的组合物存在下的可比较状况中的表观的至少15％、10％或5％。用于测定微生物细胞的表观水平的方法是本领域已知的。
[0153] 本发明的组合物的作用也可以被描述为杀虫的或pestistatic。
[0154] 如本文使用的，术语“植物内寄生物”指的是能够在植物内生存或以其他方式与植物相关联并且不引起病害或以其他方式危害植物的生物体(即能够与植物共生生存)。植物内寄生物可以占据植物组织——包括叶、茎、花、果实、种子或根——的细胞内或细胞外空间。植物内寄生物可以例如是细菌或真菌微生物。
[0155] 如本文使用的，术语“植物”不仅涵盖整株植物，而且扩展至植物部分、插条以及植物产品——包括根、叶、花、种子、茎、愈伤组织、坚果和果实、鳞茎、块茎、球茎、谷粒、插条、根状茎或接穗，并且包括任何植物材料，而不论种植前、生长期间、和在收获时或收获后。可能得益于本发明的应用的植物覆盖大范围的农业和园艺作物。
[0156] 如本文使用的，术语“植物病原菌”指的是对植物致病的生物体。植物致病生物体通常指的是单细胞生物体，例如，包括细菌，以及真菌、卵菌、壶菌、藻类和线虫。病原体可以处于任何发育阶段。
[0157] 根据具体的实施方式，植物病原菌是微生物(例如，细菌)。植物致病细菌通常包括但不限于农杆菌属(例如，根瘤农杆菌)；欧文氏菌属、泛菌属(Pantoea)、果胶杆菌属、沙雷氏菌、食酸菌属(Acidovorax)、假单胞菌属、雷尔氏菌属(Ralstonia)、根瘤杆菌属(Rhizobacter)、根单胞菌属(Rhizomonas)、黄单胞杆菌属、松材线虫属(Xylophilus)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属、梭状芽胞杆菌属、节杆菌属、棒形杆菌属(Clavibacter)、短小杆菌属(Curtobacterium)、赖氏菌属(Leifsonia)、红球菌属、链霉菌属和黄单胞杆菌属(地毯草黄单胞菌(X.axonopodis)、白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)、疱病黄单胞菌(X.vesicatoria))。
[0158] 在具体的实施方式中，植物致病细菌选自棒形杆菌属、黄单胞杆菌属、假单胞菌属(例如，丁香假单胞菌(P.syringae))、和果胶杆菌属(例如，胡萝卜软腐果胶杆菌(P.carotovorum))。
[0159] 在一些实施方式中，病原体是通常在植物维管系统(例如，木质部或韧皮部)中定居的病原体。在一些实施方式中，病原体选自韧皮部局限的病原体。在一些实施方式中，韧皮部局限的病原体选自螺原体、和植原体、支原体和韧皮部杆菌(libaribacter)。在示例性实施方式，韧皮部局限的病原体选自蜜蜂螺原体和腐皮植原体(Phytoplasma solani)。
[0161] 在一个实施方式中，储存细菌细胞(一种或多种)，以便它对杀伤植物病原菌或减少其生长是有效的。例如，细胞可以被干燥(例如冷冻干燥)或冷冻。在另一个实施方式中，细胞在培养物中。用于繁殖细胞的培养基选自：土壤、水培设备、和/或人工生长培养基。
[0162] 组合物可以包括公开的细菌细胞——其具有公开的菌株的识别特性中的至少一种——的全肉汤培养物、液体或固体培养物、或悬浮液，以及上清液、滤过物和/或提取物，或更具体地，多种(i)代谢物、(ii)分离的化合物、(iii)源自本文公开的细菌的挥发物、或(iv)合成化合物(例如，包括喹啉甲醛、或羟甲基-2-糠醛)或具有杀伤植物病原菌或减少其生长的活性的其衍生物的一种或多种。
[0163] 组合物可以与另一种微生物和/或杀虫剂(例如，杀线虫剂、杀菌剂、杀真菌剂、除虫剂)组合或一起使用。在一些实施方式中，细菌组合物进一步包括选自肥料、杀虫剂、或其任意组合的材料。
[0164] 如本文使用的，术语“肥料”指的是当施加于基质——例如，土壤、叶、水培溶液等——时，通过为生物体——例如，植物必需生物学功能，例如，生长、开花等——提供营养物使该基质丰富或肥沃的任何物质。
[0165] 根据在下面描述的本发明的一些实施方式中的进一步特性，杀虫剂选自杀螨剂、杀疥虫剂、灭藻剂、拒食剂、杀鸟剂、杀菌剂、鸟驱避剂、化学不育剂、杀真菌剂、除草剂安全剂、除草剂、昆虫引诱剂、昆虫驱避剂、除虫剂、哺乳动物驱避剂、交配干扰剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、植物激活剂、植物生长调节剂、杀鼠剂、增效剂、和杀病毒剂、和其任意组合。
[0166] 根据在下面描述的本发明的一些实施方式中的进一步特性，除草剂选自氯三嗪除草剂、氯乙酰苯胺除草剂、和卤化脂肪族除草剂。
[0167] 另外，杀虫剂可以是单位点(single site)抗真菌剂，其可以包括但不限于苯并咪唑，脱甲基抑制剂(DMI)(例如，咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)，吗啉，羟基嘧啶，苯胺基嘧啶，硫醇代磷酸酯(phosphorothiolate)，醌外部抑制剂(quinone outside inhibitor)，喹啉，二甲酰亚胺，甲酰亚胺，苯基酰胺，苯胺基嘧啶，苯基吡咯，芳香族烃，肉桂酸，羟基苯胺，抗生素，多氧菌素，酰基胺(acylamine)，邻苯二甲酰亚胺，苯环型的(二甲苯基丙氨酸)，选自咪唑、哌嗪、嘧啶和三唑的脱甲基抑制剂(例如，双苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、粉锈宁、糠菌唑、环唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑)，腈菌唑，和醌外部抑制剂(例如，甲氧基丙烯酸酯(strobilurin))。甲氧基丙烯酸酯可以包括但不限于嘧菌酯、醚菌酯(kresoxim-methoyl)或肟菌酯(trifloxystrobin)。在又另一个具体的实施方式中，抗真菌剂是醌，例如，喹氧灵(quinoxyfen)(5，7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。抗真菌剂也可以源自虎杖属(Reynoutria)提取物。
[0168] 杀真菌剂也可以是多位点(multi-site)非无机、化学杀真菌剂，其选自氯腈、喹喔啉、硫酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、chloralkylhios、苯基吡啶-胺、和氰基-乙酰胺肟。
[0169] 如上面记载的，组合物可以进一步包括杀线虫剂。此杀线虫剂可以包括但不限于化学品比如有机磷酸酯、氨基甲酸酯，和熏蒸剂，和微生物产品比如阿佛菌素、漆斑菌属某些种(spp.)、生物群系(坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus))、巴斯德菌属某些种、拟青霉属某些种，和有机产品比如皂苷和植物油。
[0170] 在组合物被施用施加于种子的情况下，在种植种子之前，它可以使用本领域已知的方法被对其完成为一种或多种包衣，其使用一种或多种种子包衣剂——包括但不限于乙二醇、聚乙二醇、壳聚糖、羧基甲基壳聚糖、苔泥炭、树脂和蜡——或具有的单位点、多位点或未知作用模式的化学杀真菌剂或杀菌剂。
[0171] 如上面记载的，可以使用本领域已知的方法施加上面陈述的组合物。具体地，这些组合物可以被施加于植物或植物部分和围绕其施加。在当前上下文中，植物被理解为意思是所有植物和植物群体，比如期望的和不期望的野生植物或作物(包括天然存在的作物)。作物可以是可以通过如下获得的植物：常规的植物育种和优化方法，或生物技术和遗传工程方法，或这些方法的组合，所述植物包括转基因植物并且包括由植物育种家的权利保护或不由其保护的植物栽培品种。植物部分被理解为意思是植物在地面上和地面下的所有部分和器官，比如枝条、叶、花和根，可能提及的实例是叶、针叶、茎秆、茎、花、子实体、果实、种子、根、块茎和根茎。植物部分还包括但不限于收获的材料，以及无性和有性繁殖材料，例如插条、块茎、根茎、分株和种子。
[0172] 在一些实施方式中，植物是维管植物。维管植物包括维管组织，例如，韧皮部。韧皮部是将光合作用的产物从成熟的叶移位至生长和储存区域的植物组织。
[0173] 在一些实施方式中，葡萄藤适合于使用本发明的组合物的治疗。示例性葡萄藤(vine)选自——而不限于此——霞多丽(Chardonnay)、赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、黑皮诺(Pinot noir)、雷司令(Riesling)、长相思(Sauvignon blanc)、和赛美蓉(Sémillon)、桑娇维塞(Sangiovese)和卡尔卡耐卡(Garganega)。
[0174] 在示例性实施方式，植物是葡萄藤。在另一个示例性实施方式中，植物是小长春花。在另一个示例性实施方式中，植物是胡萝卜。
[0175] 如提及的，植物、其部分或植物病原菌被暴露于有效量的组合物。如本文使用的，暴露意思是足够量的本发明的化合物实现杀伤植物病原菌或减少其生长。
[0176] 可以通过例如浸泡、涂覆、浸渍、喷施、蒸发、雾化、分散、喷涂、或注射，直接实施将植物、其部分或植物病原菌暴露于上面陈述的组合物，或通过使得公开的组合物作用于它们的周围、栖息地或储存空间来实施将植物、其部分或植物病原菌暴露于上面陈述的组合物。
[0178] 单独地或与在上面陈述并且可以施加于植物、植物部分、用于生长植物或种子的基质的一种或多种杀虫物质组合，组合物被用作杀虫剂，并且具体而言可以被用作除虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂和杀菌剂。
[0179] 组合物可以与组合物的其它增强化合物——比如，但不限于氨基酸、壳聚糖、几丁质、淀粉、激素、矿物质、协同的微生物——组合以增加功效和促进对植物的益处。
[0180] 种子包衣
[0181] 根据本发明的一些实施方式，提供了组合物，其包括植物种子和封装植物种子的胶囊，其中胶囊包括(a)本发明的细菌、和(b)生物相容性材料。
[0182] 在一些实施方式中，术语“生物相容性”被定义为材料在特定应用中在适当宿主应答的情况下发挥功能的能力。
[0183] 在生物材料应用的背景下，生物相容性指的是如下能力：在宿主中作为对于适当活性的支持性基体发挥功能，而不引发任何不期望的效果，或诱导任何不期望的局部或全身应答。
[0184] 在本发明的实施方式的上下文中，“生物相容性材料”描述了如此材料(例如，天然或合成聚合物)或基体(例如，水凝胶或支架)，其不干扰生物学活性，并且优选地为其提供合适的环境。
[0185] 在一些实施方式中，胶囊是芯-壳形式。在一些实施方式中，芯是或包括一种或多种种子。在一些实施方式中，壳是或包括生物相容性材料和本发明的细菌。
[0186] 术语“芯-壳结构”一般指的是固体材料，其中固体材料是微粒材料，并且其中单个微粒(一种或多种)的特征在于包含至少两种不同类型的材料，其可以通过它们的组成和/或通过它们的结构和/或通过它们在微粒中的布局彼此区分，其中一个或多个某种类型的材料被包含在复合材料的内部中。
[0188] 在一些实施方式中，芯-壳结构是闭合结构。如本文使用的，术语“闭合的”是关于两个实体——即限定外壳的实体(封闭实体)和在其中被至少部分封闭的实体——的大小、形状、和微粒或组成的相对术语。一般而言，术语“闭合的”指的是物体的形态学状态，其具有基本上不连贯的离散的内(例如，种子)和外表面，其中内表面构成封闭区域的边界。
[0189] 在一些实施方式中，可以使用本领域已知的任何方法包被种子。例如，种子可以被包被在粘合剂中并且然后在聚合物粉末中翻滚(tumble)。在一些实施方式中，种子在没有粘合剂的情况下在聚合物粉末中翻滚，以引起粉末的薄层(dusting)附着至种子。
[0190] 在包衣中可以包括另外的组分。这样的组分可以是任意组合的下列中的任一种或多种：
[0191] 具有化学地和/或机械地稳定和/或保存种子的作用的组分：例如增加它们的贮存期、降低它们对环境污染物的易感性或降低它们在条播/撒播期间被破碎的可能性；
[0193] 具有通过施肥之外的手段保护或增强作物生长的作用的组分：例如除草剂、杀真菌剂、除虫剂、杀鼠剂、激素、植物刺激物或菌根真菌或孢子；
[0195] 颜料；
[0196] 粘合剂；
[0197] 具有改变土壤pH的作用的组分：例如石灰、硫或硫酸盐；和
[0198] 惰性多孔基体，其可被添加以允许到种子的改进的水、空气或营养物通道。
[0199] 这样的组分可以在过程的多个阶段被添加，例如它可以在形成如上面描述的浆料之前或之后与包衣粉末组合，或在如上面描述的混合阶段之前与粘合剂组合，或它可以在干燥之前或之后被喷施或以其它方式包被在种子上。组分可以在种子被浆料包被前被喷施或以其它方式包被在种子上，例如一种或多种组分可以在种子被浆料包被前被施加于种子。
[0200] 在一些实施方式中，种子的外部包衣由一层或多层形成，并且上面描述的另外的组分中的一种或多种可以存在于那些层中的至少一个中。在实践中，包衣的平均厚度可以在0.1至1.0mm的范围中，包衣的平均厚度也可以在0.1至2.0mm的范围中，但是范围可以被选择以适应讨论中的种子和每个种子的包衣的期望质量。
[0201] 在一些实施方式中，例如，包衣是例如按重量计0.5％、1％、5％、10％、20％、50％、60％、70％、80％、90％以上，或95％以上。
[0202] 可以通过粘合剂的选择，或粘合剂与包衣材料的相对比例控制每个种子包被的包衣质量。
[0203] 在一些实施方式中，生物相容性材料包括粘合材料。
[0204] 在一些实施方式中，粘合材料选自，但不限于瓜尔胶、衍生的瓜尔胶、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯酸)、聚丙烯酸酯、聚(乙二醇)、膦酸酯-封端聚合物、聚环氧乙烷、聚(乙烯醇)、聚甘油、聚四氢呋喃、聚酰胺、淀粉、衍生的淀粉、糯玉米、高粱、糯高粱、西米、糊精、几丁质、壳聚糖、藻酸盐组合物、树胶、果胶、纤维素、或其任意组合或衍生物。
[0205] 在一些实施方式中，生物相容性材料包括矿物质。
[0206] 在一些实施方式中，术语“矿物质”指的是一种或多种蒸发矿物质被附着至种子的外部。包衣可以包括粘合剂的基体，一种或多种蒸发矿物质的微粒被嵌入所述基体。包衣可以完全地或部分地包围种子。
[0207] 在一些实施方式中，粘合剂在暴露于水分时可能易于降解。粘合剂可以比如释放至少50％的矿物质微粒。
[0208] 在一些实施方式中，粘合剂选自，但不限于明胶、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、麦芽糊精、多糖、脂肪、油、蛋白质、虫胶、偏二氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木质素磺酸钙、丙烯酸共聚物、聚丙烯酸乙烯酯、玉米蛋白、壳聚糖，聚环氧乙烷、丙烯酰亚胺聚合物、聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰亚胺单体、藻酸盐、聚氯丁二烯、糖浆、或其任意组合。
[0209] 化学定义
[0210] 如本文使用的，术语“烷基”描述包括直链和直链基团的脂肪族烃。优选地，烷基具有21至100个碳原子，和更优选地21-50个碳原子。每当在本文叙述数值范围，例如，“21-100”时，其暗示该基团——在此情况下烷基——可以包含21个碳原子、22个碳原子、23个碳原子等，上至并且包括100个碳原子。在本发明的上下文中，“长烷基”是在其主链(连续的共价接合原子的最长路径)中具有至少20个碳原子的烷基。短烷基因此具有20个或更少个主链碳。如本文限定的，烷基可以是取代的或未取代的。
[0211] 如本文使用的，术语“烷基”还涵盖饱和或不饱和烃，因此此术语进一步涵盖烯基和炔基。如本文限定的术语“烯基”描述具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和烷基。如上文描述的，烯基可以被一种或多种取代基取代或未取代。如本文限定的，术语“炔基”是具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和烷基。如上文描述的，炔基可以被一种或多种取代基取代或未取代。术语“环烷基”描述全碳单环或稠环(即共享相邻的碳原子对的环)基团，其中环中的一个或多个不具有完全共轭的π-电子体系。如本文指示的，环烷基可以是取代的或未取代的。
[0212] 术语“芳基”描述全碳单环或稠环多环(即，共享相邻的碳原子对的环)基团，其具有完全共轭的π-电子体系。如本文指示的，芳基可以是取代的或未取代的。如本文限定的，术语“烷氧基”描述-O-烷基和-O-环烷基二者。如本文限定的，术语“芳氧基”描述-O-芳基。本文的通式中的烷基、环烷基和芳基中的每种可以被一种或多种取代基取代，其中每种取代基可以独立地是，例如，卤根、烷基、烷氧基、环烷基、烷氧基、硝基、胺、羟基、硫醇、硫代烷氧基、巯基、羧基、酰胺、芳基和芳氧基，这取决于取代的基团和其在分子中的位置。也考虑另外的取代基。
[0213] 术语“卤根”、“卤素”或“卤代”描述氟、氯、溴或碘。术语“卤代烷基”描述被一个或多个卤根(一种或多种)进一步取代的如本文限定的烷基。术语“卤代烷氧基”描述被一个或多个卤根(一种或多种)进一步取代的如本文限定的烷氧基。
[0214] 术语“羟基”或“氢氧根”描述-OH基团。术语“巯基”或“硫醇”描述-SH基团。如本文限定的，术语“硫代烷氧基”描述-S-烷基和-S-环烷基二者。如本文限定的，术语“硫代芳氧基”描述-S-芳基和-S-杂芳基二者。
[0215] 术语“胺”描述具有如本文限定的R’和R”的-NR’R”基团。
[0216] 术语“杂脂环族”或“杂环基”描述在环(一个或多个)中具有一种或多种原子比如氮、氧和硫的单环或稠环基团。环还可以具有一个或多个双键。然而，环不具有完全共轭的π-电子体系。代表性实例是哌啶、哌嗪、四氢呋喃、吗啉基等。
[0217] 术语“羧基”或“羧化物”描述-C(＝O)-OR′基团，其中R′是如本文限定的氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、杂芳基(通过环碳结合)或杂脂环族(通过环碳结合)。
[0218] 术语“羰基”描述-C(＝O)-R′基团，其中R′如上文限定。
[0219] 上面的术语还涵盖其硫代衍生物(硫代羧基和硫代羰基)。术语“硫代羰基”描述-C(＝S)-R′基团，其中R′如上文限定。“硫代羧基”基团描述-C(＝S)-OR′基团，其中R′如本文限定。
[0220] “亚砜基”基团描述-S(＝O)-R′基团，其中R′如本文限定。“砜基”或“磺酸盐/酯”基团描述-S(＝O)2-R′基团，其中Rx如本文限定。
[0221] “氨基甲酰基”或“氨基甲酸盐/酯”基团描述-OC(＝O)-NR′R″基团，其中R′如本文限定和R″如对于R′限定的。“硝基”基团指的是-NO2基团。“氰基”或“腈”基团指的是-C≡N基团。如本文使用的，术语“叠氮化物”指的是-N3基团。术语“磺酰胺”指的是-S(＝O)2-NR′R″基团，其中R′和R″如本文限定。
[0222] 术语“膦酰基”或“膦酸盐/酯”描述-O-P(＝O)(OR′)2基团，其中R′如上文限定。术语“氧膦基”描述-PR′R″基团，其中R′和R″如上文限定。
[0223] 术语“烷芳基”描述被如本文描述的芳基取代的如本文限定的烷基。示例性烷芳基是苄基。
[0224] 术语“杂芳基”描述单环或稠环(即，共享相邻的原子对的环)基团，其在环(一个或多个)中具有一种或多种原子，比如，例如，氮、氧和硫，并且此外具有完全共轭的π-电子体系。杂芳基的非限制性实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、 唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。如上文描述的，杂芳基可以被一种或多种取代基取代或未取代。代表性实例是噻二唑、吡啶、吡咯、 唑、吲哚、嘌呤等。
[0225] 如本文使用的，在本文可交换地提及的术语“卤代”和“卤根”描述卤素原子，即氟、氯、溴或碘，在本文也称为氟根、氯根、溴根和碘根。
[0226] 术语“卤代烷基”描述被一种或多种卤根(一个或多个)进一步取代的如上面限定的烷基。
[0227] 如本文使用的，术语“大约”指的是±10％。
[0228] 术语“包括”、“包含”、“含有”、“涵盖”、“具有”和它们的同源词意思是“包括但不限于”。术语“由…构成”意思是“包括且限于”。术语“大体上由…构成”意思是组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部分，但前提是额外的成分、步骤和/或部分不实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新型的特性。
[0229] 如本文使用的，除非上下文另外明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
[0230] 贯穿本申请，可以以范围格式呈现本发明的多种实施方式。应当理解范围格式的描述仅仅出于便利和简洁，并且不应当被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，范围描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围，以及该范围内的单个数值。例如，范围描述比如1至6应当被认为已经具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何这均适用。
[0231] 当提及具体的序列表时，这样的提及被理解还涵盖基本上对应于其互补序列的序列，如包括较少的序列变化——例如由测序误差、克隆误差造成——或导致碱基置换、碱基缺失或碱基添加的其它变化，条件是这样的变化的频率小于1/50个核苷酸，可选地，小于1/100个核苷酸，可选地，小于1/200个核苷酸，可选地，小于1/500个核苷酸，可选地，小于1/
1000核苷酸，可选地，小于1/5,000个核苷酸，可选地，小于1/10,000个核苷酸。
1000核苷酸，可选地，小于1/5,000个核苷酸，可选地，小于1/10,000个核苷酸。
[0232] 应当领会本发明的某些特征——其为了清楚在单独的实施方式的背景下描述——也可以被组合提供在单个实施方式中。相反地，本发明的多个特征——其为了简洁在单个实施方式的背景下描述——也可以被分开地或以任何合适的子组合或按照合适的被提供在本发明的任何其它描述的实施方式中。在多种实施方式的背景下描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必需特征，除非实施方式在没有那些要素的情况下不起作用。
[0234] 实施例
[0235] 现在参考下列实施例，其连同上面的描述以非限制性方式阐明本发明。
[0236] 通常，本文使用的术语和在本发明中利用的是实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中详尽地解释这样的技术。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook et al.，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson et al.，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren et al.(eds)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中陈述的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；″Current Protocols in Immunology″Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et a1.(eds)，″Basic and Clinical Immunology″(8th Edition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；在专利和科学文献中广泛地描述了可用的免疫试验，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,
876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，Eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney,R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)and″Methods in Enzymology″Vol.1-317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入，如同在本文充分陈述一样。贯穿本文提供其它一般参考。其中的程序被认为是本领域熟知的并且为了方便读者而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。
876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，Eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney,R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)and″Methods in Enzymology″Vol.1-317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入，如同在本文充分陈述一样。贯穿本文提供其它一般参考。其中的程序被认为是本领域熟知的并且为了方便读者而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。
[0237] 材料和方法
[0238] 昆虫和植物：2011年10月在Golan Heights，Israel收集十只飞虱Hyalesthes obsoletus(菱飞虱科)——葡萄藤植原体的传病媒介——并且直接放置在97％乙醇中或活着用于微生物分离。
[0239] 通过扦插具有芽的2-3em的茎和将其种植在包含生长培养基(蔗糖30g/L、硫胺素0.4mg/l、VPM 2.35g/L(Duchefa)、活性炭2.5g/L和肌醇100mg/L)的30ml玻璃管中，建立来自品种‘霞多丽’的葡萄藤酿酒葡萄和小长春花(长春花属某些种)小植物。小植物在24℃、
16：8L：D方案下的受控条件中生长。来自两种属的小植物在实验开始时是6-8周龄。
16：8L：D方案下的受控条件中生长。来自两种属的小植物在实验开始时是6-8周龄。
[0240] 细菌分离和鉴定：为了鉴定来自H.obsoletus的潜在的可培养的细菌，通过将昆虫浸没在氨苄青霉素和四环素混合物中5min接着进行三组使用无菌盐溶液的洗涤(每组2min)，对10只单个昆虫进行表面消毒。然后将样品放置在包含300μL无菌盐溶液(9％NaCl)的Eppendorf管中，使用研杵研磨并且以至10倍系列稀释。稀释102-107的150μL的等分试样然后被散布在结晶紫(CV)琼脂(66g/L蔗糖、10g/L山梨醇、2g/L LB、0.1％结晶紫和15g/L琼脂)上。平板在黑暗中在28℃下保持，并且通过PCR扩增的16S rRNA基因和内转录间隔区(ITS)结构域(表1)的DNA序列鉴定生长的集落。
[0241] 细菌生长：在上面描述的程序之后仅分离出一种细菌。虽然它与戴氏菌属密切相关，但是其最可能是未描述的属。为了产生大数量的细菌接种物，通过将来自CV平板培养物的两个接种环转移至500mL Erlenmeyer烧瓶中的250mL液体培养基(6g/L LB、2g/L K2HPO4和0.5g/L KH2PO4 pH 7)并且在28℃、150rpm下培育它们48h使细菌生长。通过离心(3500g；15min)收集细菌并且使用磷酸盐缓冲液(PBS)(8g/L NaCl、0.2KCl、1.44Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4 pH 7.5)洗涤两次。使用分光光度计(600nm)，利用PBS将细菌浓度调节至OD＝0.6(～
106CFU/mL)。通过CV平板上的CFU计数确认浓度。
106CFU/mL)。通过CV平板上的CFU计数确认浓度。
[0242] 细菌系统发生分析：为了进一步解析分离的细菌的系统发生布局，通过已知扩增大多数已知细菌的27F+1513R引物组扩增此细菌的几乎完整的16S核糖体RNA基因。获得的产物进行测序并且使用MAFFT与其它γ和β变形菌门(proteobacteria)——其由SILVA核糖体RNA基因数据库检索——比对。在Bayesian信息标准下使用jModelTest 2确定最适合的核苷酸置换模型，并且发现是TIM3+I+G。使用通过SeaView v4.5.4实施的PhyML v3.1构建最大似然率系统发生图。由1000份样品计算Bootstrapping支持值。
[0243] 细菌基因组分析：根据制造商的方案使用QIAamp DNA迷你试剂盒分离细菌的基因组DNA。使用NanoDrop分光光度计检查DNA的质量。在DNA Services Facility(Chicago，Illinois)中进行基因组测序；使用Nextera末端配对(mate pair)样品制备试剂盒生成末端配对文库，接着使用2×100解读(read)在Illumina MiSeq中基因组测序。在原始序列数据(Q20)——其由333个具有大约86.7％倍的覆盖度的重叠群生成6,709,847个解读——的质量修整后，通过软件程序包CLC Genomes Workbench(v7.0)完成从头装配。重叠群的N50质量测量是42.2kb，平均重叠群大小为12.5kb，并且装配的最大重叠群是大约191.2kb。使用DOE-JGI Microbial Genome Annotation Pipeline在由JGI研发的Integrated Microbial Genomes Expert Review(IMG ER)平台(http://img.jgi.doe.gov)内进行基因预测分析和功能注释。使用Prodigal V2.50预测出3832个基因——包括3757 CDS预测，使用tRNAscan-SE 1.3.1预测出49个tRNA基因和使用HMMER 3.0预测出5个rRNA基因。预测的编码序列被翻译并且用于搜索TIGRFam、Pfam、KEGG、COG和InterPro数据库。1945个蛋白编码基因被分配给1381个KO条目。
[0244] 使用NetCmpt工具计算植原体之间有效的代谢重叠。该软件以细菌物种的EC含量作为输入，将酶含量转化为物种特异性拓扑网络，应用基于拓扑学的算法预测物种特异性代谢资源(NetSeed)，和在排除共同资源之后模拟生长。使用DOE-JGI Microbial Genome Annotation Pipeline从由JGI研发的Integrated Microbial Genomes Expert Review(IMG ER)平台(http://img.jgi.doe.gov)检索细菌基因组的EC注释。由KEGG数据库检索植原体基因组的EC注释。使用antiSMASH工具预测抗生素和次级代谢物。
[0245] 细菌上清液的拮抗测试：为了检查由细菌分泌的化合物抑制蜜蜂螺原体(模拟植原体感染的模型细菌)的能力，细菌在改良的螺原体肉汤中生长10天。螺原体细胞被添加至上清液并且在29℃下培育五天，并且然后1μl的培育的滤过物被接种至包含酚红作为细胞生长的颜色标志物的新鲜的螺原体培养基，其包含酚红作为细胞生长的颜色标志物。颜色改变需要的时间与最初的螺原体浓度相关联，并且因此被用作滤过物的抑制效应抑制效果的量化参数。新鲜肉汤中的螺原体生长充当阳性对照并且0.5μg/ml土霉素的抑制效应抑制效果被用作参考。抑制指数被定义为滤过物中颜色改变的天数和阳性对照中需要的时间之间的比率。0.5μg/ml土霉素的抑制指数是2.3。因而，如果分离株的滤过物的抑制指数＜2，则其被认为是抑制性的。
[0246] 活性级分提取物的鉴定：为了鉴定具有潜在活性的挥发物，细菌在包含6g/L LB、2g/L K2HPO4和0.5g/L KH2PO4的大约500ml培养基中生长三天。培养物在8000rpm下离心
5min，并且使用500ml甲基叔丁基醚(MTBE)提取上清液两次。使用温和的氮气流将有机相蒸发至干燥，并且使用MTBE重悬干燥的提取物。使用不同的溶剂：甲醇、丙酮、MTBE、氯仿和己烷，通过包含玻璃棉、砂和二氧化硅的柱将此粗提取物分离为级分。在无菌培养基上进行相同的提取程序作为对照。使用温和的氮气流将通过柱分离获得的每种级分蒸发至干燥，并且使用1ml的乙醇重悬干燥的物质。为了检查每种级分提取物对螺原体生长的作用，进行下列测试：1ml的螺原体培养基、10μl螺原体细胞和20μl的每种级分提取物在29℃下培育三天。新鲜肉汤中生长的螺原体充当阳性对照，并且包含20μl的相提取物的无菌培养基被用作阴性对照。颜色从红色到黄色的改变指示螺原体生长。
5min，并且使用500ml甲基叔丁基醚(MTBE)提取上清液两次。使用温和的氮气流将有机相蒸发至干燥，并且使用MTBE重悬干燥的提取物。使用不同的溶剂：甲醇、丙酮、MTBE、氯仿和己烷，通过包含玻璃棉、砂和二氧化硅的柱将此粗提取物分离为级分。在无菌培养基上进行相同的提取程序作为对照。使用温和的氮气流将通过柱分离获得的每种级分蒸发至干燥，并且使用1ml的乙醇重悬干燥的物质。为了检查每种级分提取物对螺原体生长的作用，进行下列测试：1ml的螺原体培养基、10μl螺原体细胞和20μl的每种级分提取物在29℃下培育三天。新鲜肉汤中生长的螺原体充当阳性对照，并且包含20μl的相提取物的无菌培养基被用作阴性对照。颜色从红色到黄色的改变指示螺原体生长。
[0247] 细菌的活性级分提取物中的挥发物鉴定：为了鉴定选择的活性级分提取物(参见结果)中的化合物，1μl等分试样的样品被注入装备有Rxi-5SIL MS(30m*0.25mm*0.25μm)熔凝石英毛细管柱(Restek)的GC-MSD设备(6890N/5973N Agilent Technologies CA，USA)。氦(恒压15.2psi)被用作运载气体。注射器温度是250℃，其被设定用于不分流进样。烘箱设定为50℃持续1min，并且然后温度以5℃/min的速率增加至260℃。检测器温度是280℃。质量范围被记录为41至350m/z，其中电子能量是70eV。在上面提及的用于测定保留指数的条件下，直链烷烃(C7-C23)的混合物被注入柱。使用chamstation软件分析GC-MS光谱概况，通过比较它们的保留指数与文献的保留指数和通过比较光谱数据与标准品或与W9N08和HPCH2205 GC-MS库来分配(assign)挥发物的鉴定。
[0248] 细菌的特定化合物的拮抗测试：在细菌上清液的活性级分提取物中鉴定出潜在的抑制性化合物(4-喹啉甲醛和5-羟甲基-2-糠醛)后，购买类似的合成化合物(Sigma)并且对螺原体进行体外检查：1ml的螺原体培养基、10μl螺原体细胞和10μl的每种化合物(1毫摩尔的最终浓度)在29℃下培育三天。新鲜肉汤中生长的螺原体充当阳性对照，并且包含20址l的相提取物的无菌培养基被用作阴性对照。颜色从红色到黄色的改变指示螺原体生长。
[0249] 将细菌引入植物：在6-8周龄瓶外(ex-vitro)小长春花和葡萄藤小植物霞多丽品种(cv.)上测试分离株穿透葡萄藤的能力。在分离株培养物中或在PBS(作为对照)中处理小植物。所有处理以3-5次重复完成。测试几种方法：A)彻底洗涤离瓶的(ex-flasked)小植物，在种植之前在根边缘处切割并且浸没(submerge)24h。B)茎注射：使用30规格的针将20μl的溶液注入至茎的底部。C)刺破叶并且使用棉耳朵拭子涂抹溶液。处理的小植物然后在0/5L盆中被种植在商业盆栽土(EN12580，Tuf Merom Golan)中。
[0250] 在接种之后7-10d，从叶上接种点通过特异性PCR(参见，表1)检查在植物中分离株的存在。300mg叶取自每个植物以测试细菌的存在。对在接种后发育的新叶进行小心地取样，以确保没有外部污染。以三个重复实施该实验并且PBS被用作对照。
[0251] 细菌检测：
[0252] PCR。为了测定细菌和植原体二者在它们的真核宿主中的存在，由植物和昆虫提取DNA；通过CTAB方法自新出现的叶提取DNA，同时通过在裂解缓冲液中研磨昆虫接着在65℃下培育15min和然后在95℃下培育10min自每个单个飞虱提取DNA。所有DNA样品被保持-20℃在下直到进一步使用。
[0253] PCR反应(25μl)包含10μl的ApexTM Taq DNA Polymerase Master Mix(Genorama，Tartu，Estonia)，5皮摩尔的每种引物，12.5μl DDW和1μl DNA模板。PCR由如下构成：94℃-0.5min，退火Tm-0.5min(表1)和72℃-0.5min的35个循环，接着72℃10min。通过针对16S rRNA基因和ITS结构域的两组引物(表1)鉴定细菌，同时如先前描述的使用巢式PCR测试植原体存在。
[0254] 显微镜。在光学显微镜(BX61，Olympus)下使细菌培养物可视化。应用荧光原位杂交(FISH)程序，以便验证细菌的存在和测定其在葡萄藤内的位置。使用刀片将感染或未感染细菌的葡萄藤手动切片，并且切片浸没在FAA(20％乙醇、2.5％(v/v)乙酸、2.5％(v/v)甲醛)中。具有FAA的样品进行真空处理3小时并且在RT下保留另外的20h，并且随后被转移至50％乙醇和在-20℃中保持直到进一步分析。切片通过顺序转移至80％和100％乙醇进行脱水，并且然后在RT中浸没在具有10皮摩尔的荧光探针——Eub338，用于一般细菌并且特异于DLB(参见，表1)——的杂交缓冲液(20mM Tris-HCl[pH 8.0]、0.9M NaCl、0.01％十二烷基硫酸钠、30％甲酰胺)中4hr。切片然后在PBS中洗涤并且在IX81Olympus FluoView500共聚焦显微镜下可视化。使用无探针对照确认检测的特异性。
[0255] 作为抵抗植原体的生物药剂的细菌：为了检查细菌作为抵抗植原体的生物药剂的潜力，如上面描述的，五个重复的健康的和感染植原体的小长春花和葡萄藤小植物接种有细菌并且重新种植。植物然后生长八周，在其后检查包括枝条长度、叶长度、节间的数目和干重的特性。以五次重复实施实验，使用PBS作为对照。
[0256] 田间试验：实施田间实验以研究喷施分离株对减少田间生长的葡萄藤中的黄化症状的作用。
[0257] 细菌施加。具有35％感染的468株葡葡藤的Golan Heights中的霞多丽样地被划分为七个未处理的和处理的样地——其沿着生长季节(四月-九月)每两周喷施一次。使用具有1.8mm喷嘴涡轮枪的轮式喷雾器(Achim Raz Ltd)，植物被喷施有每株植物大约500ml的10％细胞悬浮液加0.1％吐温20。未喷施的样地充当对照。
[0258] 检测。通过PCR分析在喷施后7和14d检查细菌的存在，并且从叶样品分离DLB。取样的叶来自葡萄藤的中部(两片叶来自每个样地的两株葡萄藤)。三百毫克的叶柄和叶根(blade base)组织被研磨用于DNA提取，并且来自叶柄和叶根的1000mg被研磨用于在营养琼脂培养基(NA)上细胞分离。在流动水下使用商业肥皂彻底地洗涤叶，并且额外的消毒是通过浸泡在70％乙醇中接着次氯酸盐1％，并且在在细胞分离前完成无菌水中的三次洗涤。
[0259] 评估在葡萄园中的作用。在收获时，使用定性量度对每株葡萄藤的病害严重度进行评分：0-无症状的至4-严重症状的。由手动收获的喷施的和未喷施的葡萄藤测量148株葡萄藤的产量和花穗的数目。在休眠期期间测量修剪重量。由来自55株喷施的和未喷施的葡萄藤的随机采摘的浆果测量糖度(Must Brix)、pH和浆果重量。每株葡萄藤的产量载荷(yield load)被计算为产量与修剪重量之间的比率。
[0260] 经由种子包衣将细菌引入胡萝卜：三十个未处理的胡萝卜种子(多尔多涅品种(Cv.Dordogne))在室温下在10mL的108CFU/mL细菌制剂中接种2h。制剂然后被过滤并且种子被收集，放置在吸水纸上，干燥并且然后在包含珍珠岩或盆栽土的400mL盆中播撒。作为对照，使用无菌制剂以类似的方式培育相同量的种子。种子允许在自然日光条件和25-27℃的温度范围下在温室中发芽。对于每批处理的种子，播散四盆，两个使用珍珠岩并且两个使用盆栽土，并且每盆包含六个种子。
[0261] 播撒之后十八天，从每盆中的一个幼苗取两片嫩叶。提取DNA，接着使用细菌特异性引物进行经典PCR。
[0262] 表1：使用的引物和探针
[0263]
[0264] 实施例1
[0265] 本发明的细菌的分离和鉴定
[0266] 细菌分离和鉴定：在表面消毒后，在CV琼脂上平板接种飞虱的匀浆，其导致具有相5
同形态的7*10 个集落形成单位的生长。1421bp长的16S rRNA基因的DNA序列显示了与人参土戴氏菌(登录号EF191353)和橙黄弗拉托菌(登录号CP003350)(黄单胞杆菌科)——其分别由土壤和植物分离——的97％同一性。通过其内转录间隔区(ITS)序列——877bp长的DNA序列——确认了此分离株的同一性，其显示了与橙黄弗拉托菌(登录号CP003350)的
84％同一性。这些结果指示分离株是新的属。
同形态的7*10 个集落形成单位的生长。1421bp长的16S rRNA基因的DNA序列显示了与人参土戴氏菌(登录号EF191353)和橙黄弗拉托菌(登录号CP003350)(黄单胞杆菌科)——其分别由土壤和植物分离——的97％同一性。通过其内转录间隔区(ITS)序列——877bp长的DNA序列——确认了此分离株的同一性，其显示了与橙黄弗拉托菌(登录号CP003350)的
84％同一性。这些结果指示分离株是新的属。
[0267] 细菌基因组分析：该细菌的基因组包含4，191471bp，G+C含量为68.6％。细菌和植原体之间的共同有效重叠分数(Effective Overlap Score)是0，这指示两个物种的生长能力不依赖于共同的代谢物。在细菌基因组中鉴定次级代谢物的总计五个潜在的聚簇(cluster)，包括三个细菌素聚簇，一个萜聚簇和一个NRP聚簇。
[0268] 实施例2
[0269] 细菌上清液的拮抗作用
[0270] 细菌上清液的拮抗测试：细菌上清液的滤过物体外抑制螺原体发育(图1)。
[0271] 活性级分提取物的鉴定：当评估每种级分提取物对螺原体生长的作用时，仅甲醇和丙酮提取物体外抑制螺原体，而由无菌对照培养基获得的级分均不抑制此模型细菌(图2)。
[0272] 戴氏菌属活性级分提取物中的挥发物鉴定：通过比较活性级分提取物(甲醇和丙酮)与无菌对照培养基的相同级分提取物中挥发物的模式，两种化合物被鉴定为是针对螺原体潜在抑制性的(图3)。这些化合物是4-喹啉甲醛和5-羟甲基-2-糠醛。此外，通过LC-MS分析鉴定化合物吡咯并[1，2-a]吡嗪(数据未显示)。
[0273] 拮抗测试：仅4-喹啉甲醛能够在1毫摩尔的浓度下抑制螺原体生长，而在存在相同浓度下的5-羟甲基-2-糠醛的情况下，没有显示抑制。
[0274] 实施例3
[0275] 在接种后植物中的细菌检测
[0276] PCR。细菌能够通过检查的所有方法穿透小植物，包括喷施、涂抹(petting)叶、注射至茎和在细菌培养物中根浸没。然而，最好的接种由叶喷施取得，在喷施后一周高达73％的植物被细菌居住。该细菌能够在植物中移动上至28cm(3个节间)，但是大多数样品显示其停留在其被注入至的第一节间。通过特异性PCR检查细菌在接种的小植物中的存在显示在接种之后三周细菌占据葡萄藤植物的新出现的叶，而在未接种的植物中没有检测到PCR产物。此外，在接种之后六周，在任何植物中检测不到细菌。
[0277] 显微镜。对细菌培养物的观察显示此细菌是1μm长的棒形。FISH分析显示在细菌接种之后两周细菌局限于葡萄藤的韧皮部(如图4中显示的)。
[0278] 作为抵抗植原体的生物药剂的细菌：在健康的对照植物和由细胞居住的那些植物之间没有观察到显著差异。当细菌被引入感染植原体的小植物时，植原体对植物的影响被显著降低，如通过在接种之后八周观察到的所有记录的参数(枝条长度、叶长度和节间)可见的(图5A-E)。
[0279] 当细菌被引入小长春花时，观察到相似的结果：在健康的植物特性中没有显著的差异，但是细菌在感染植原体的小长春花中的存在降低植原体对这些植物在枝条长度和干重方面的作用，如在接种之后八周测量的(图6A-E)。
[0280] 实施例4
[0281] 田间实验
[0282] 喷施10％悬浮液导致通过添加表面活性剂改进的最高速率地穿透入叶。分别通过PCR和细胞分离方法，在9/17和7/17取样日期，在引入之后7天(dpi)在喷施的样品中检测细菌。阳性结果在2-85％的范围。细菌以大多数5-8dpi但高至15dpi存在于叶中。与对照相比，在喷施的葡萄藤中，症状严重度降低25％(图7A)，产量增加12％(图7B)，并且症状缓解的速率增加大约20％。糖水平高0.5Brix但是没有检测到pH差异(图7C、D)。喷施的葡萄藤的产量载荷在喷施的葡萄藤和健康的葡萄藤中而不在严重感染的葡萄藤中显著地增加(图8A、B、D)。
[0283] 总而言之，细菌由葡萄藤植原体的飞虱传病媒介分离。此细菌与人参土戴氏菌最密切相关，但是可以证明是单独的属。该细菌能够通过根和叶二者穿透植物，在韧皮部中居留至少三周，并且其存在似乎影响感染植原体的植物而非健康植物的形态。在一些参数中，植原体对植物形态的作用被显著地降低。田间实验支持实验室观察。结果指示该细菌具备从处理的种子迁移至幼苗的能力。
[0284] 实施例5
[0285] 细菌基质表征
[0286] 本发明的发明人分析和表征了细菌的生长基质。表2显示了DLB抗生素易感性测试(29种测试的抗生素)。
[0287] 细菌对下列抗生素有抗性：呋喃妥因、环丙沙星、头孢噻酚、美罗培南、诺氟沙星、萘啶酸、硫酸抗敌素、亚胺培南、头孢吡肟、氨曲南和头孢呋辛(29种测试的抗生素中的11种，表2)。
[0288] 表2.DLB抗生素易感性测试。
[0289]
[0290]
[0291] DLB代谢：使用BD BBLTM CrystalTm En/非发酵菌(non-fermenters)试剂盒测定可以由DLB利用的环境代谢物。结果显示了细菌使用或不使用代谢物(分别地表3和4)：
[0292] 表3.
[0293]糖/糖衍生物 氨基酸 其它
阿拉伯糖 脯氨酸硝基苯胺 p-n-p-木糖苷
甘露糖 γ-L-谷氨酰对硝基苯胺 七叶苷
蔗糖 苯丙氨酸 尿素
蜜二糖 甘氨酸
半乳糖 精氨酸
肌醇
p-n-p-α-β-葡糖苷
阿拉伯糖 脯氨酸硝基苯胺 p-n-p-木糖苷
甘露糖 γ-L-谷氨酰对硝基苯胺 七叶苷
蔗糖 苯丙氨酸 尿素
蜜二糖 甘氨酸
半乳糖 精氨酸
肌醇
p-n-p-α-β-葡糖苷
[0294] 表4
[0295]糖/糖衍生物 氨基酸 其它
鼠李糖 赖氨酸 对硝基苯基磷酰胆碱
山梨醇 对硝基苯基β-葡糖苷酸
甘露醇 对硝基苯基-N-乙酰氨基葡糖苷
福寿草醇 柠檬酸酯
对硝基苯基磷酸酯 丙二酸酯
对硝基苯基β-半乳糖苷 四唑
对硝基苯基二磷酸酯
对硝基苯基α-阿拉伯糖苷
鼠李糖 赖氨酸 对硝基苯基磷酰胆碱
山梨醇 对硝基苯基β-葡糖苷酸
甘露醇 对硝基苯基-N-乙酰氨基葡糖苷
福寿草醇 柠檬酸酯
对硝基苯基磷酸酯 丙二酸酯
对硝基苯基β-半乳糖苷 四唑
对硝基苯基二磷酸酯
对硝基苯基α-阿拉伯糖苷
[0296] 实施例6
[0297] 通过由本发明的细菌分泌的物质抑制螺原体
[0298] 不能直接测试由DLB分泌的物质对植原体的拮抗活性，这是由于不能在人工培养基中培养植原体。出于此原因，对蜜蜂螺原体——一种可培养的柔膜菌纲——测试这些物质的潜在抑制。实验在96孔微型板中实施。包含酚红和4μl螺原体细胞(大约105个细胞)的150μl新鲜肉汤被添加至每个孔。基于显示它们由DLB分泌的分析选择三种化合物，并且在实验中使用它们的合成等价物：喹啉甲醛、羟甲基-2-糠醛和吡咯并[1，2-a]吡嗪(Sigma-Aldrich，USA)以不同的浓度(2-0.02mM)被添加至接种的培养基，重复五次。微型板在28℃下培育两天，并且通过酶标仪(Multiskan EX，Thermo scientific，Waltham，MA USA)在OD＝595nm下对培养基的颜色评分。新鲜肉汤中生长的螺原体充当阳性对照，没有螺原体的培养基充当阴性对照，并且不同浓度的土霉素的抑制作用被用作参考。
[0299] 除对每种物质单独评分之外，还通过添加不同浓度(每种2-0.02mM)的两种化合物至相同的孔来测试这三种物质的组合。土霉素的最小抑制浓度(MIC)是0.35mM(图9)。
[0300] 喹啉甲醛在浓度2和1mM下抑制螺原体生长，而吡咯并[1，2-a]吡嗪仅在2mM下抑制螺原体。在检查的浓度下没有显示通过羟甲基-2-糠醛的抑制。喹啉甲醛与吡咯并或羟甲基的组合在2mM下没有显示显著的影响，但是在1mM下影响螺原体抑制(图10)。吡咯并[1，2-a]吡嗪与羟甲基的组合改变培养基吸收(medium absorption)(参见对照吡咯并与羟基)，并且因此抑制测量无效。
[0301] 总之，等价于由DLB分泌的物质的合成化合物在它们对螺原体——植原体的模型细菌——生长的作用方面变化。最高效的化合物是喹啉甲醛，但是其最小抑制浓度(MIC)仍高于参考抗生素——土霉素。
[0302] 此化合物与吡咯并[1，2-a]吡嗪的组合在1mM下显示了拮抗作用，这表明与仅存在喹啉甲醛相比，在同时存在这两种化合物的情况下，螺原体抑制显著地更低。
[0303] 喹啉甲醛与羟甲基的组合在1mM下显示了协同作用，这表明在同时存在这两种化合物的情况下，螺原体抑制显著高于仅存在喹啉甲醛情况下的螺原体抑制。
[0304] 对不同的细菌物种检查喹啉甲醛与羟甲基组合抑制螺原体的作用：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌。在96孔微型板中检查这些菌株。150μl LB培养基和4μl细菌5
细胞(大约10 个细胞)被添加至每个孔。微型板在37℃下培育一天，并且通过酶标仪(Multiskan EX，Thermo scientific，Waltham，MAUSA)在OD＝620nm下对浊度评分。新鲜肉汤中生长的细菌充当阳性对照，没有细菌的培养基充当阴性对照。
细胞(大约10 个细胞)被添加至每个孔。微型板在37℃下培育一天，并且通过酶标仪(Multiskan EX，Thermo scientific，Waltham，MAUSA)在OD＝620nm下对浊度评分。新鲜肉汤中生长的细菌充当阳性对照，没有细菌的培养基充当阴性对照。
[0305] 检查的细菌物种在2mM下被抑制，而仅大肠杆菌在1mM下起作用。
[0306] 实施例7
[0307] 韧皮部杆菌暂定属的抑制
[0308] 韧皮部杆菌暂定属是革兰氏阴性菌的属，其由数种经济上重要的植物病原体组成。其中，亚洲韧皮部杆菌(Ca.L.asiaticus)和茄科韧皮部杆菌(Ca.L.solanacearum)分别是毁灭性的柑橘绿化(黄龙病(Haunglongbing)-HLB)和斑马片病(zebra chip disease)/胡萝卜黄化病的疑似致病因子。与植原体暂定属(Ca.phytoplasma)植物病原菌类似，韧皮部杆菌属也是(通过木虱(psyllid))传播的传病媒介并且排他地在植物韧皮部组织中居住。由于这些类似的特性等，本发明的发明人探索DLB作为抵抗由韧皮部杆菌暂定属引起的病害的生物药剂的潜在用途，其聚焦于由茄科韧皮部杆菌引起的胡萝卜黄化病。
[0309] 基于DLB的基因组序列设计不同的实时PCR引物组。这些引物首先对连续稀释的纯化DNA测试以测定引物灵敏度。使用来自感染的小长春花植物的DNA提取物测试最灵敏的引物以测定其功效和特异性。
[0310] 通过灌溉或通过喷施进行DLB的施加，并且其后使用实时PCR确定最高效的施加方法。然后使用实时PCR关于施加方法测定不同植物组织中的DLB传播和丰度。使用实时PCR关于施加方法在胡萝卜植物中测定DLB寿命。
[0311] DLB被施加至使用热(hot)木虱传病媒介攻击的胡萝卜(根据上面的优化程序)。与未使用DLB处理的胡萝卜植物相比，随着时间对症状出现和茄科韧皮部杆菌(Lso)效价评分。
[0312] 为了测定DLB对木虱植物定殖的作用，根据上面的优化方案接种植物，并且然后将木虱(清洁的或热的)引入小网箱，测量木虱存活、产蛋数目和若虫存活。为了测定木虱由胡萝卜得到DLB和传播其的能力，胡萝卜植物接种有DLB并且使用实时PCR验证其在植物中的建立。然后，在感染的植物上使得清洁的木虱饲喂2天，并且然后通过实时PCR测试它们体内Lso的存在。
[0313] 在另外的示例性程序中，这些木虱然后被放置在清洁的胡萝卜植物上，使其饲喂4天。使用实时PCR随着时间对接种的植物测试将DLB传播入胡萝卜。
[0314] 在另外的示例性程序中，使在清洁的胡萝卜植物或感染Lso的植物上饲喂感染Lso的木虱。使用实时PCR随着时间测定木虱内部Lso的效价。
[0315] 具体地，处于3-4片真叶期的胡萝卜植物被喷施直到径流或灌溉50mL DLB的制剂，其浓度为108CFU/mL。胡萝卜植物然后在接种之后3、7、10和16天取样以测定叶中的DLB存在。半克新出现的叶被用于DNA提取，接着使用DLB特异性引物进行PCR。结果呈现在下面的表5中。
[0316] 表5.
[0317]接种之后天数 接种方法 通过PCR的DLB阳性(％) 样品数目
3 喷施 100 7
3 灌溉 60 5
7 喷施 87.5 8
7 灌溉 40 6
10 喷施 85 8
10 灌溉 0 7
16 喷施 37.5 8
16 灌溉 0 6
3 喷施 100 7
3 灌溉 60 5
7 喷施 87.5 8
7 灌溉 40 6
10 喷施 85 8
10 灌溉 0 7
16 喷施 37.5 8
16 灌溉 0 6
[0318] 实施例8
[0319] 黄单胞杆菌属发病机理试验
[0320] 通过使叶与浸泡细菌培养物的棉拭子擦拭，芝麻植物(4周龄)被暴露于DLB或DH5α(大肠杆菌)细菌。植物然后在室温下培育5天以使得DLB穿透。
[0321] 制备植物致病细菌野油菜黄单胞菌的两个菌株的培养物(分别描绘为“Xcc”和“Xcv”)(O.D.595nm＝0.3)。使用针在上芝麻叶中的一个上做出小刺孔，并且一滴细菌培养物被放置在叶的刺孔区域上。在3天后，试验结束并且记录症状(比如病变)。
[0322] 结果显示DLB的存在减少致病细菌的损害，其不局限于韧皮部(参见，图12)。
[0323] 虽然已经连同其具体实施方式描述了本发明，但是许多替代方案、修改和变化明显对本领域技术人员将是显而易见的。因此，意欲包括落入所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的替代方案、修改和变化。
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