植物生长的增强
阅读：978发布：2024-02-16
专利汇可以提供植物生长的增强专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及增强 植物 生长的方法。这涉及在一定条件下施用非感染型的过敏反应诱发剂多肽或蛋白于植物或植物 种子 ，其中所述条件能有效增强所述植物或由所述植物种子长成的植物的生长。或者，可以提供用编码过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物或转基因植物种子，并在有效增强植物生长的条件下，培育所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的植物。，下面是植物生长的增强专利的具体信息内容。
1.一种增强植物生长的方法，包括：
向植物或植物种子施用下述的过敏反应诱发剂多肽或蛋白，其中所述的过敏反应诱发剂多肽或蛋白是解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)的harpin或丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonassyringae pv.syringae)的harpinpss，其中所述施用能增强所述植物或由所述植物种子长成的植物的生长，所述植物选自：稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣萝菜、甘蓝、花椰菜、硬花球花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、绿皮南瓜、黄瓜、苹果、梨、瓜、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、蜀黍以及甘蔗。
2.依照权利要求1的方法，其中在通过喷洒、注入或磨擦叶面进行所述施用期间，在接近所述施用开始的时刻处理植物。
3.依照权利要求1的方法，其中在通过喷洒、注入、包被、撒粉或浸渍进行所述施用期间处理植物种子。
4.依照权利要求1的方法，其中以还包含一种载体的组合物将所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白施用于植物或植物种子。
5.依照权利要求4的方法，其中所述载体由以下选出：水、水溶液、浆液和粉末。
6.依照权利要求4的方法，其中所述组合物包含浓度大于0.5nM的过敏反应诱发剂多肽或蛋白。
7.依照权利要求4的方法，其中所述组合物还包含选自以下的添加剂：肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂以及它们的混合物。
8.依照权利要求1的方法，其中所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白是以已分离的形式施用的。
9.依照权利要求1的方法，其中所述施用导致所述多肽或蛋白渗透进植物。
10.依照权利要求1的方法，其中所述施用导致株高增加。
11.依照权利要求10的方法，其中在所述施用期间植株受到处理。
12.依照权利要求10的方法，其中在所述施用期间植物种子受到处理，所述方法另外还包括：
将用所述过敏反应诱发剂处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并从种植在土壤中的种子繁殖出植株。
13.依照权利要求1的方法，其中在所述施用期间植物种子受到处理，来增加发芽的植物种子的数量，所述方法还包括：
将用所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并
从种植在土壤中的种子繁殖出植株。
14.依照权利要求1的方法，其中所述施用导致产量提高。
15.依照权利要求14的方法，其中在所述施用期间植株受到处理。
16.依照权利要求14的方法，其中在所述施用期间植物种子受到处理，所述方法另外还包括：
将用所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并
从种植在土壤中的种子繁殖出植株。
17.依照权利要求1的方法，其中所述施用导致发芽更早。
18.依照权利要求17的方法，其中在所述施用期间植物种子受到处理，所述方法另外还包括：
将用所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并
从种植在土壤中的种子繁殖出植株。
19.依照权利要求17的方法，其中所述施用导致成熟更早。
20.依照权利要求19的方法，其中在所述施用期间植株受到处理。
21.依照权利要求19的方法，其中在所述施用期间植物种子受到处理，所述方法另外还包括：
将用所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并
从种植在土壤中的种子繁殖出植株。
22.依照权利要求1的方法，其中在所述施用期间植物种子受到处理，所述方法另外还包括：
将用所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并
从种植在土壤中的种子繁殖出植株。
23.依照权利要求22的方法，所述方法还包括：
将所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白以非感染的形式施用于所繁殖出的植株以进一步增强生长。
24.依照权利要求1的方法，其中所述施用导致果实和植株着色更早。
25.依照权利要求24的方法，其中在所述施用期间植物种子受到处理，所述方法另外还包括：
将用所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白处理过的种子种植在天然或人工土壤中，并
从种植在土壤中的种子繁殖出植株。
26.一种增强植物生长的方法，包括：
用编码下述过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子转化植物或植物种子，所述的过敏反应诱发剂多肽或蛋白为解淀粉欧文氏菌的harpin或丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinpss，其中过敏反应诱发剂蛋白被表达，并增强被转化的植物或由被转化的种子长成的植物的生长，其中所述植物选自：稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣萝菜、甘蓝、花椰菜、硬花球花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、绿皮南瓜、黄瓜、苹果、梨、瓜、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、蜀黍以及甘蔗。
27.依照权利要求26的方法，其中转化在植物中进行。
28.依照权利要求26的方法，其中转化在植物种子中进行。
29.依照权利要求26的方法，所述方法还包括：
向被转化的植物或植物种子施用下述的过敏反应诱发剂多肽或蛋白，所述的过敏
反应诱发剂多肽或蛋白为解淀粉欧文氏菌的harpin或丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinpss，所述施用进一步增强被转化的植物或由被转化的植物种子长成的植物的生长。
植物生长的增强
[0002] 本发明是在美国政府的资助下完成的(USDA NRI竞争性研究拨款第91-37303-6430号)。
[0003] 发明领域
[0004] 本发明涉及增强植物的生长。
[0005] 发明背景
[0006] 几个世纪以来，人们已经知道并实行施用有机肥料来改善植物生长(H.Marschner，“Mineral Nutrition of Higher Plants，”AcademicPress：New York第674页(1986))。现代人类已经发展了复杂的无机肥料生产系统，生产出栽培者和农民可以施用于土壤或生长中的作物、通过增强生长来改善生产性能的易用产品。通过施用肥料产品，植株大小、着色、成熟和产量都可以得到改善。无机肥料包括普遍使用的化学品如硝酸铵。有机肥料可以包括厩肥和堆肥草渣(composted lawn debris)以及许多其它资源。
[0007] 在最近几年，研究者已经寻求通过使用生物制品来改善植物生长。如白僵菌(Beauveria bassiana)和Trichoderma harizamum的病虫害防治剂已经注册用于防治病虫害问题，并因此间接改善植物的生长及生产性能(Fravel等人，“防治植物病害的微生物制剂，” Formulation of Microbial Biopesticides，Beneficial Microorganisms，andNematodes，H.D.Burges编辑，Chapman and Hall：London(1996))。
[0008] 现在有一些通过应用微生物或微生物副产品来直接增强植物生长的迹象。人们已经在将豆科作物的种子引入一个新生境(site)时， 向其加入结瘤细菌(Weaver等人，“根瘤菌(Rhizobium)，”Methods ofSoil Analysis，第2部分，Chemical and Microbiological Properties，第二版，American Society of Agronomy：Madison(1982))。这些细菌可以改善植物的结瘤效率，并因此改善植物将游离氮转化为一种可利用形式的能力(这个过程叫固氮作用)。通常非豆科作物并不从这样的处理中受益。加入的细菌如根瘤菌(Rhizobium)直接寄生于根毛，然后开始一种互利共生关系：提供给植物好处，同时获得保护与支持。 [0009] 菌根真菌被认为是许多作物(特别是在营养缺乏的土壤中的针叶树)随意生长(optional growth)所必需的微生物。人们已经提出了包括植物激素的生物合成(Frankenberger等人，“松Ectomycorrhizal真菌彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)生物合成吲哚-3-乙酸，”Appl.Environ.Microbiol.53：2908-13(1987))、矿物质的摄入增加(Harley等人，“切下的山毛榉的菌根根摄入磷酸盐，”New Phytologist 49：388-97(1950)和Harley等人，“切下的山毛榉的菌根根摄入磷酸盐，IV.氧浓度对宿主和真菌的影响，”New Phytologist 52：124-32(1953))和水的摄入增加(A.B.Hatch，“松属(Pinus)菌根营养的物理基础，”BlackRock Forest Bull.No.6，第168页(1937))等机制。由于对于任何给定的菌根菌株都有可变和不一致的结果，以及对这类生物研究的困难，菌根真菌并未获得象结瘤细菌一样的使用频率。
[0010] 近年来已经认定植物生长促进根瘤细菌(“PGPR”)能改善植物的生长和发育。假说的机制从直接影响(如营养摄入增加)到间接机制(如病原体排代(pathogen displacement)置换)都有。应用PGPR得到的生长增强通常是指将一种活细菌接种到根系统，通过细菌产生的激素作用、铁载体获得改善的生长，或通过产生抗生素或竞争而预防病害，从而获得改善的生长。在所有上面的情况中，结果都是通过根定居，有时是通过应用种子包被产生的。有有限信息表明，一些PGPR菌株可能是直接的生长促进剂，在悉生条件下增强根的延长(Anderson等人，“在水培系统中菜豆对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)根部定居的应答，”Phytopathology 75：992-95(1985)，Lifshitz等人，“在悉生条件下恶臭假单胞菌菌株对Canola(油菜籽)幼苗的生长促进作用，”Can.J.Microbiol.33：390-95(1987)，Young等人，“PGPR：在植物生长调节剂和植物生长刺激或生物活性之间有关系吗？，” Promoting Rhizobacteria：Progress and Prospects，Second InternationalWorkshop on Plant Growth-promoting Rhizobacteria， 第 182-86 页(1991)，Loper等人，“吲哚-3-乙酸的细菌来源对糖甜菜根延伸的影响，” Phytopathology76：386-89(1986)，和Müller等人，“玉米(Zea mays L.)根际中的激素相互作用以及它们对植物发育的作用，”Z.Pflanzenernahrung Bodenkunde 152：247-54(1989))；然而，也有人已经提出植物生长调节剂的产生是介导这些作用的机制。许多细菌在体外产生各种植物生长调节剂(Atzorn等人，“菜豆根瘤菌(Rhizobiumphaseol)产生赤霉素和吲哚-3-乙酸与Phaseolus vulgaris根部结瘤有关，”Planta 175：532-38(1988)和M.E.Brown，“固体和根际微生物(Microorganism of Solid and Rhizosphere)产生的植物生长刺激素，”J.Appl.Bact.35：443-51(1972))或抗生素(Gardner等人，“产生抗生素的荧光假单胞菌对柑桔类根部的生长促进和抑制，”Plant Soil 77：103-11(1984))。
铁载体的产生是针对一些PGPR菌株提出的另一种机制(Ahl等人，“参与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株对根串珠霉(Thievaliopsis basicola)抑制的铁结合铁载体、氰酸和抗生素，”J.Phytopathol.116：121-34(1986)，Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌产生的铁载体增强植物生长，”Nature 286：885-86(1980)，和Kloepper等人，“假单胞菌铁载体(Pseudomonas siderophores)：解释病害抑制性土壤的机制，”Curr.Microbiol.4：317-20(1980))。在根表面定居并因此在表面与病原细菌直接竞争是另一种作用机制(Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌在体外对植物生长的抗生作用和根部微生物区系的排代作用的关系，”Phytopathology 71：1020-24(1981)，Weller等人，“通过用荧光假单胞菌处理种子提高小麦的 生长以及腐霉属(Pythium)防治的含意，”Can.J.Microbiol.8：328-34(1986)，和Suslow等人，“糖甜菜的根瘤细菌：种子施肥和根部定居对产量的影响，”Phytopathology 72：199-206(1982))。Canola(油菜籽)研究已经表明PGPR增强植物的生长参数，包括产量、出苗率和活力、早季植物生长(叶的数目和主长匐枝的长度)以及叶面积(Kloepper等人，“Canola(油菜籽)上促进植物生长的根瘤细菌，”Plant Disease72：42-46(1988))。对土豆的研究表明，当将假单胞菌属(Pseudomonas)菌株应用于种用马铃薯时，产量提高(Burr等人，“用特殊的荧光假单胞菌(Pseudomonas Fluorescens)和恶臭假单胞菌(P.Putida)菌株处理块茎提高马铃薯的产量，”Phytopathology 68：1377-83(1978)，Kloepper等人，“块茎接种促进植物生长的根瘤细菌对马铃薯根部上和子块茎中胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)群体的作用，” Phytopathology 73：217-19(1983)，Geels等人，“在用拮抗的种名待定的荧光假单胞菌(Fluorescent Pseudomonas spp.)处理种用块茎后使高频马铃薯种植土壤中的产量降低还原，”Phytopathol.Z.108：207-38(1983)，Howie等人，“根瘤细菌：栽培品种和土壤类型对马铃薯的植物生长和产量的影响，”Soil Biol.Biochem.15：127-32(1983)，和Vrany等人，“接种根际细菌的马铃薯植株的生长和产量，”FoliaMicrobiol.29：248-53(1984))。
增产明显地是由于PGPR的竞争作用(有可能是抗生作用)除去了种用块茎上的病原细菌(Kloepper等人，“块茎接种促进植物生长的根瘤细菌对马铃薯根部上和子块茎中胡萝卜软腐欧文氏菌群体的作用，”Phytopathology 73：217-19(1983)，Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌在根际定居对马铃薯植物发育和产量的作用，”Phytopathology
70：1078-82(1980)，Kloepper等人，“促进出土的根瘤细菌：对于农业的描述和含意，”第
155-164页，Iron，Siderophores，and Plant Disease，T.R.Swinburne编辑，Plenum，New York(1986)，和Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌对植物生长的抗生作用和根微生物区系的排代作用的关系，” Phytopathology 71：1020-24(1981))。在一些研究中，使用PGPR后植株的出土得到改善(Tipping等人，“促进出土的根瘤细菌对于超甜玉米的发育，”Phytopathology 76：938-41(1990)(摘要)和Kloepper等人，“促进出土的根瘤细菌：对于农业的描述和含意，”第155-164页， Iron，Siderophores，and Plant Disease，T.R.Swinburne编辑，Plenum，New York(1986))。许多其它研究表明，用根瘤细菌处理后，由于对植物病原体进行生物防治，植物健康得到改善(B.Schippers，“用根瘤细菌生物防治病原体，”Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.318：283-93(1988)，Schroth等人，“病害抑制性土壤和根部定居的细菌，”Science216：1376-81(1982)，Stutz等人，“参与抑制烟草青霉病的天然存在的荧光假单胞菌，”Phytopathology 76：181-85(1986)，和D.M.Weller，“用细菌生物防治根际中的土传植物病原体，”Annu.Rev.Phytopathol.26：379-407(1988))。 [0011] 已经发现对植物的病原体诱导的免疫促进生长。外部注射Peronospora tabacina到烟草木质部不仅减轻矮化，而且促进生长和发育。免疫后的烟草植物在温室试验和大田试验中，比对照植物约高40％，干重增加40％，鲜重增加30％，并多4-6片叶子(Tuzun，S.等人，“茎注射Peronospora tabacina并且进行Metalaxyl处理对大田中烟草生长和抵抗青霉病的保护作用的影响，”Phytopathology，74：804(1984))。这些植株大约比对照植株早开花2-3周(Tuzun，S.等人，“系统保护抵抗青霉病的因子在接种Peronospora tabacina Adam的烟草中的运动，”Physiological Plant Pathology，26：321-30(1985))。 [0012] 本发明涉及在先前的植物生长增强方法范围内的改进。
铁载体的产生是针对一些PGPR菌株提出的另一种机制(Ahl等人，“参与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株对根串珠霉(Thievaliopsis basicola)抑制的铁结合铁载体、氰酸和抗生素，”J.Phytopathol.116：121-34(1986)，Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌产生的铁载体增强植物生长，”Nature 286：885-86(1980)，和Kloepper等人，“假单胞菌铁载体(Pseudomonas siderophores)：解释病害抑制性土壤的机制，”Curr.Microbiol.4：317-20(1980))。在根表面定居并因此在表面与病原细菌直接竞争是另一种作用机制(Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌在体外对植物生长的抗生作用和根部微生物区系的排代作用的关系，”Phytopathology 71：1020-24(1981)，Weller等人，“通过用荧光假单胞菌处理种子提高小麦的 生长以及腐霉属(Pythium)防治的含意，”Can.J.Microbiol.8：328-34(1986)，和Suslow等人，“糖甜菜的根瘤细菌：种子施肥和根部定居对产量的影响，”Phytopathology 72：199-206(1982))。Canola(油菜籽)研究已经表明PGPR增强植物的生长参数，包括产量、出苗率和活力、早季植物生长(叶的数目和主长匐枝的长度)以及叶面积(Kloepper等人，“Canola(油菜籽)上促进植物生长的根瘤细菌，”Plant Disease72：42-46(1988))。对土豆的研究表明，当将假单胞菌属(Pseudomonas)菌株应用于种用马铃薯时，产量提高(Burr等人，“用特殊的荧光假单胞菌(Pseudomonas Fluorescens)和恶臭假单胞菌(P.Putida)菌株处理块茎提高马铃薯的产量，”Phytopathology 68：1377-83(1978)，Kloepper等人，“块茎接种促进植物生长的根瘤细菌对马铃薯根部上和子块茎中胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)群体的作用，” Phytopathology 73：217-19(1983)，Geels等人，“在用拮抗的种名待定的荧光假单胞菌(Fluorescent Pseudomonas spp.)处理种用块茎后使高频马铃薯种植土壤中的产量降低还原，”Phytopathol.Z.108：207-38(1983)，Howie等人，“根瘤细菌：栽培品种和土壤类型对马铃薯的植物生长和产量的影响，”Soil Biol.Biochem.15：127-32(1983)，和Vrany等人，“接种根际细菌的马铃薯植株的生长和产量，”FoliaMicrobiol.29：248-53(1984))。
增产明显地是由于PGPR的竞争作用(有可能是抗生作用)除去了种用块茎上的病原细菌(Kloepper等人，“块茎接种促进植物生长的根瘤细菌对马铃薯根部上和子块茎中胡萝卜软腐欧文氏菌群体的作用，”Phytopathology 73：217-19(1983)，Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌在根际定居对马铃薯植物发育和产量的作用，”Phytopathology
70：1078-82(1980)，Kloepper等人，“促进出土的根瘤细菌：对于农业的描述和含意，”第
155-164页，Iron，Siderophores，and Plant Disease，T.R.Swinburne编辑，Plenum，New York(1986)，和Kloepper等人，“促进植物生长的根瘤细菌对植物生长的抗生作用和根微生物区系的排代作用的关系，” Phytopathology 71：1020-24(1981))。在一些研究中，使用PGPR后植株的出土得到改善(Tipping等人，“促进出土的根瘤细菌对于超甜玉米的发育，”Phytopathology 76：938-41(1990)(摘要)和Kloepper等人，“促进出土的根瘤细菌：对于农业的描述和含意，”第155-164页， Iron，Siderophores，and Plant Disease，T.R.Swinburne编辑，Plenum，New York(1986))。许多其它研究表明，用根瘤细菌处理后，由于对植物病原体进行生物防治，植物健康得到改善(B.Schippers，“用根瘤细菌生物防治病原体，”Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.318：283-93(1988)，Schroth等人，“病害抑制性土壤和根部定居的细菌，”Science216：1376-81(1982)，Stutz等人，“参与抑制烟草青霉病的天然存在的荧光假单胞菌，”Phytopathology 76：181-85(1986)，和D.M.Weller，“用细菌生物防治根际中的土传植物病原体，”Annu.Rev.Phytopathol.26：379-407(1988))。 [0011] 已经发现对植物的病原体诱导的免疫促进生长。外部注射Peronospora tabacina到烟草木质部不仅减轻矮化，而且促进生长和发育。免疫后的烟草植物在温室试验和大田试验中，比对照植物约高40％，干重增加40％，鲜重增加30％，并多4-6片叶子(Tuzun，S.等人，“茎注射Peronospora tabacina并且进行Metalaxyl处理对大田中烟草生长和抵抗青霉病的保护作用的影响，”Phytopathology，74：804(1984))。这些植株大约比对照植株早开花2-3周(Tuzun，S.等人，“系统保护抵抗青霉病的因子在接种Peronospora tabacina Adam的烟草中的运动，”Physiological Plant Pathology，26：321-30(1985))。 [0012] 本发明涉及在先前的植物生长增强方法范围内的改进。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明涉及一种增强植物生长的方法。这种方法涉及在一定条件下施用非感染型的过敏反应诱发剂(elicitor)多肽或蛋白于植物或植物种子，以赋予所述植物或由所述植物种子长成的植物以增强的生 长。
[0015] 为赋予植物或由植物种子长成的植物以增强的生长，除施用过敏反应诱发剂多肽或蛋白于所述植物或所述植物种子外，一种可以选择的方法是可以利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，这涉及到：提供用编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物，并在有效允许所述DNA分子增强生长的条件下培育所述植物。用另一种方法，可以提供用编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物种子并种植在土壤中。然后在有效允许所述DNA分子增强生长的条件下，由种植的种子繁殖出植物。
[0016] 本发明的目标在于产生任何形式的植物生长增强或促进。这可以发生在早至从种子开始的植物生长，迟至植物的生活中。例如，依照本发明的植物生长包括产量更高、所产生种子的质量提高、种子发芽率提高、植物大小增加、生物量更高、果实更多和更大、果实着色更早、以及果实和植株成熟更早。结果是本发明为栽培者提供显著的经济效益。例如，早发芽和早成熟使得作物能够生长在生长季节短暂的地区，而在其它情况下短暂的生长季节会阻碍它们在当地的生长。种子发芽率的提高导致改善的作物林分(stand)以及更有效的种子使用。产量更高、大小增加和生物量生产增强使得给定的小块土地上年产出(revenue generation)更高。因此显然，本发明构成农业效率上的一个显著进步。
[0018] 图1是质粒载体pCPP2139的图，所述质粒载体包含解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)过敏反应诱发剂基因。
[0019] 图2是质粒pCPP50的图，所述质粒载体不包含解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂基因，但其它方面则与图1所示的质粒载体pCPP2139相同。参见Masui等人，Bio/Technology2：81-85(1984)，特此通过引 用结合到本文中。
[0020] 发明详述
[0021] 本发明涉及一种增强植物生长的方法。这种方法涉及在一定条件下将非感染型的过敏反应诱发剂多肽或蛋白施用于整株植物或植物部分、或施用于植物种子，以赋予所述植物或由所述植物种子长成的植物以增强的生长。或者，可以用这种方法处理植物来产生种子，然后种下种子，赋予子代植物增强的生长。
[0022] 为赋予植物或由植物种子长成的植物以增强的生长，除施用过敏反应诱发剂多肽或蛋白于所述植物或所述植物种子外，一种可选择的方法是利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，这就涉及到提供用编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物，并在有效允许所述DNA分子增强生长的条件下培育所述植物。或者，可以提供用编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物种子并将其种植在土壤中。然后在有效允许所述DNA分子增强生长的条件下，从所述种植的种子繁殖出植物。
[0023] 本发明中利用的过敏反应诱发剂多肽或蛋白可以对应于由广泛种类的真菌病原体或细菌病原体得到的过敏反应诱发剂多肽或蛋白。这样的多肽或蛋白能在所述诱发剂接触的植物组织中诱发(elicit)局部坏死。
[0024] 合适的多肽或蛋白诱发剂的细菌来源的例子包括欧文氏菌属、假单胞菌属以及单胞菌属(如下列细菌：解淀粉欧文氏菌、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)、胡萝卜软腐欧文氏菌、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、茄假单胞菌(Pseudomonas solancearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)及它们的组合)。
[0025] 过敏反应诱发剂多肽或蛋白的真菌来源的一个例子是疫霉属 (Phytophthora)，合适的疫霉属种包括Phytophthora pythium、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)以及柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)。 [0026] 可以用多种方法实施本发明的将过敏反应诱发剂多肽或蛋白施用于植物或植物种子的实施方案，包括：1)施用一种分离的诱发剂多肽或蛋白；2)施用不致病并且用编码过敏反应诱发剂多肽或蛋白的基因转化的细菌；以及3)施用在一些植物种中致病(但并不在其所施用的物种中致病)、并且天然包含编码所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白的基因的细菌。另外，从用依照本发明的过敏反应诱发剂蛋白或多肽处理过的植株上，可以回收依照本发明的种子。
[0027] 在本发明的一个实施方案中，所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白可以从它们相应的生物中分离得到，并施用于植物或植物种子。这样的分离程序是广为人知的，如Arlat，M.，F.Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“PopA1，为在特殊牵牛花基因型中诱导过敏样反应的一种蛋白，它通过茄假单胞菌的Hrp途径分泌，” EMBO J.13：543-553(1994)；He，S.Y.，H.C.Huang，和A.Collmer，“丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.Syringae)的harpinpss：通过Hrp途径分泌、并在植物中诱发过敏反应的一种蛋白，” Cell73：1255-1266(1993)；和Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应的harpin诱发剂，”Science 257：85-88(1992)所述，特此通过引用结合到本文中。还可参见未决的美国专利申请序号08/200,024和08/062,064，特此通过引用结合到本文中。然而，本发明分离得到的过敏反应诱发剂多肽或蛋白最好如下所述重组产生并纯化。 [0028] 在本发明的其它实施方案中，可以通过施用包含编码过敏反应诱发剂多肽或蛋白的基因的细菌，将本发明的过敏反应诱发剂多肽或蛋白施用于植物或植物种子。这样的细菌必须能够分泌或输出所述多肽或蛋白，以便所述诱发剂能接触植物细胞或植物种子细胞。在这些实施方案中，所述过敏反应诱发剂多肽或蛋白由所述细菌在植株中或种子上产生，或恰好在将所述细菌引入所述植物或植物种子之前产生。
[0029] 在本发明的细菌应用模式的一个实施方案中，所述细菌并不致病，并且已经用编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的基因转化(如通过重组)。例如，大肠杆菌并不在植物中诱发过敏反应，可以用编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的基因转化大肠杆菌，然后将其施用于植物。大肠杆菌外的其它细菌物种也可用于本发明的这个实施方案中。 [0030] 在本发明的细菌应用模式的另一个实施方案中，所述细菌致病，并且天然包含编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的基因。这样的细菌的例子已经在上面提过。然而，在该实施方案中，这些细菌施用于对所述细菌导致的疾病并不易感的植物或其种子。例如，解淀粉欧文氏菌在苹果或梨中致病，但并不在番茄中致病。然而，这样的细菌会在番茄中诱发过敏反应。因此，依照本发明的该实施方案，解淀粉欧文氏菌可以施用于番茄植株或种子以增强生长，而不会在该物种中致病。
[0031] 得自菊欧文氏菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白具有对应于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，如下所示：
[0032]
[0033] 这种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的分子量为34kDa，对热稳定，其甘氨酸含量大于16％，并且基本不包含半胱氨酸。菊欧文氏菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白是由其核苷酸序列对应于SEQ.ID.No.2的DNA分子编码，如下所示：
[0034]
[0035]
[0036] 得自解淀粉欧文氏菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白的氨基酸序列对应于SEQ.ID.No.3，如下所示：
[0037]
[0038]
[0039] 这种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的分子量约为39kDa，pI约为4.3，可在100℃热稳定至少10分钟。这种过敏反应诱发剂多肽或蛋白基本不含半胱氨酸。得自解淀粉欧文氏菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白在Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“harpin，由植物病原体解淀粉欧文氏菌产 生的过敏反应的诱发剂，” Science 257：85-88(1992)中有更完全的描述，特此通过引用结合到本文中。编码这种多肽或蛋白的DNA分子具有对应于SEQ.ID.No.4的核苷酸序列，如下所示：
[0040]
[0041] 得自丁香假单胞菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白具有对应于SEQ.ID.No.5的氨基酸序列，如下所示：
[0042]
[0043]
[0044] 这种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的分子量为34-35kDa。含丰富的甘氨酸(约13.5％)，缺乏半胱氨酸和酪氨酸。关于得自丁香假单胞菌的过敏反应诱发剂的其它信息可以在He，S.Y.，H.C.Huang，和A.Collmer，“丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinpss：通过Hrp途径分泌、并在植物中诱发过敏反应的一种蛋白，”Cell 73：1255-1266(1993)中找到，特此通过引用结合列本文中。编码得自丁香假单胞菌的过敏反应诱发剂的DNA分子具有对应于SEO.ID.No.6的核苷酸序列，如下所示：
[0045]
[0046] 得自茄假单胞菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白具有对应于SEQ.ID.No.7的氨基酸序列，如下所示：
[0047]
[0048] 它由其核苷酸序列对应于SEQ.ID.No.8的DNA分子编码，如下所示：
[0049]
[0050] 关于得自茄假单胞菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白的其它信息在Arlat，M.，F.Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A. Boucher，“PopA1，为在特殊牵牛花基因型中诱导过敏样反应的一种蛋白，它通过茄假单胞菌的Hrp途径分泌，”EMBO J.13：543-533(1994)中陈述，特此通过引用结合到本文中。
[0051] 得自野油菜黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.glycines)的过敏反应诱发剂多肽或蛋白具有对应于SEQ.ID.No.9的氨基酸序列，如下所示：
[0052] Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala [0053] 1 5 10 15
[0054] Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr
[0055] 20 25
[0056] 该序列是得自野油菜黄单胞菌大豆致病变种的过敏反应诱发剂多肽或蛋白的仅含有26个残基的氨基末端序列。它对应于在其它野油菜黄单胞菌致病变种中确定的菌毛亚基蛋白。
[0057] 得 自 野 油 菜 黄 单 胞 菌 天 竺 葵 致 病 变 种 (Xanthomonas campestris pv.Pelargonii)的过敏反应诱发剂多肽或蛋白对热稳定、对蛋白酶敏感、分子量为20kDa。它包含一段对应于SEQ.ID.No.10的氨基酸序列，如下所示：
[0058] Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln [0059] 1 5 10 15
[0060] Leu Leu Ala Met
[0061] 20
[0062] 胡萝卜软腐欧文氏菌过敏反应诱发剂蛋白或多肽的分离在Cui等人，“The RsmA Mutants of胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株Ecc71的RsmA突变体在烟草叶中过量表达hrp NEcc并诱发过敏反应样应答，”MPMI，9(7)：565-73(1996)中陈述，特此通过引用结合到本文中。所述过敏反应诱发剂蛋白或多肽在Ahmad等人，“harpin对于斯氏欧文氏菌对 玉米的致病性不是必需的，”8th Int’l.Cong.Molec.Plant-MicrobeInteract.，July 14-19，1996和Ahmad等人，“harpin对于斯氏欧文氏菌对玉米的致病性不是必需的，”Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.，7月27-31，1996中展示，特此通过引用结合到本文中。
[0063] 得自寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、隐地疫霉、樟疫霉、辣椒疫霉、大雄疫霉和柑桔褐腐疫霉的过敏反应诱发剂蛋白或多肽在Kaman等人，“来自疫霉属的胞外蛋白诱发剂：对细菌性和真菌性植物病原菌抗性的大多数特异性和诱导，”Molec.Plant-Microbe Interact.，6(1)：15-25(1993)，Ricci等人，“来自致病真菌疫霉属、在烟草中诱发坏死和获得性抗性的蛋白的结构和活性，”Eur.J.Biochem.，183：555-63(1989)，Ricci等人，“寄生疫霉分离菌在烟草中差别性产生parasiticein以及坏死和抗性的诱发剂，”Plant Path.41：298-307(1992)，Baillreul等人，“一种新的烟草过敏反应的诱发剂：一种真菌糖蛋白诱发细胞死亡、表达防御基因、产生水杨酸并诱导系统获得性抗性，” Plant J.，8(4)：551-60(1995)，和Bonnet等人，“诱发剂在烟草和其它植物中触发的获得性抗性，”Eur.J.Plant Path.，102：181-92(1996)中陈述，特此通过引用结合到本文中。
[0064] 上面的诱发剂都是典型的。其它诱发剂可以如下鉴定：在编码诱发剂的基因得到表达的条件下，培养诱发过敏反应的真菌或细菌。将从培养物上清得到的无细胞制备物浸润合适的植物组织，测试诱发剂活性(即局部坏死)。
[0065] 在本发明的方法中，还有可能使用上述过敏反应诱发剂多肽或蛋白的片段以及来自其它病原体的全长的诱发剂的片段。
[0066] 可以用几种方法产生合适的片段。第一种方法，采用常规分子遗传操作，亚克隆编码一种已知诱发剂蛋白的基因的片段，产生该基因的亚克隆。然后将所述亚克隆体外表达或在细菌细胞内体内表达，产生小一些的蛋白或肽，所述蛋白或肽可以依照后面所述程序测试诱发剂活性。
[0067] 另一种可选择的方法是：用蛋白酶如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌A蛋白酶、或胰蛋白酶消化全长的诱发剂蛋白，产生所述诱发剂蛋白的片段。根据所述诱发剂蛋白的氨基酸序列，不同的蛋白酶有可能在不同位点切割所述诱发剂蛋白。一些得自蛋白水解的片段可能是抗性的活性诱发剂。
[0068] 在另一种方法中，根据对所述蛋白的一级结构的知识，使用PCR技术以及选定的代表所述蛋白特定部分的特异性引物组，可以合成所述诱发剂蛋白基因的片段。然后将这些片段克隆进一种合适的载体，以增殖和表达一种截短的肽或蛋白。
[0069] 也可以使用化学合成来制备合适的片段。使用要产生的诱发剂的已知氨基酸序列来进行这样的合成。或者，将全长的诱发剂在高温高压下处理也会产生片段。然后可以用常规程序(如层析、SDS-PAGE)分离这些片段。
[0070] 有用片段的一个例子是来自茄假单胞菌的过敏反应诱发剂多肽或蛋白的popA1片段，参见Arlat，M.，F.Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“popA1，为在特殊牵牛花基因型中诱导过敏样反应的一种蛋白，它通过茄假单胞菌的Hrp途径分泌，”EMBOJ.13：543-553(1994)，特此通过引用结合到本文中。至于解淀粉欧文氏菌，一种合适的片段可以是，例如，或者SEQ.ID.No.3的从氨基酸1延伸到98并且包括氨基酸1和氨基酸98的多肽，或者SEQ.ID.No.3的从氨基酸137延伸到204并且包括氨基酸137和氨基酸204的多肽，或者二者都是。
[0071] 也(或者)可以用例如那些对所述多肽的特性、二级结构和亲水性有最小影响的氨基酸的缺失或添加来修饰变异体。例如，可以将一段多肽连接到所述蛋白N末端指导所述蛋白共翻译转运或翻译后转运的信号(或前导)序列上。所述多肽也可以连接于一个接头或其它序列，以便于所述多肽的合成、纯化或鉴定。
[0072] 本发明的蛋白或多肽最好是用常规技术以纯化过的形式产生(纯 度优选至少约60％，更优选约80％)。本发明的蛋白或多肽产生后一般并不分泌入重组宿主细胞的生长培养基中。另一种情况下，本发明的蛋白或多肽分泌入生长培养基中。在蛋白不分泌的情况下，为分离所述蛋白，繁殖带有重组质粒的宿主细胞(如大肠杆菌)，用超声处理、热处理或化学处理裂解细胞，离心匀浆物以去除细菌残渣。然后对上清液进行热处理，并通过离心分离过敏反应诱发剂蛋白。在一根尺寸合适的葡聚糖柱或聚丙烯酰胺柱上，对含有本发明的多肽或蛋白的上清液部分进行凝胶过滤，分离所述蛋白。如果需要，可以进一步用离子交换或HPLC纯化蛋白组分。
[0073] 可以使用常规的重组DNA技术，将编码过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子引入细胞。通常这涉及将所述DNA分子插入一个表达系统，对该表达系统来说所述DNA分子是异源的(即非正常存在的)。将所述异源DNA分子以正确的有义取向并在正确的阅读框中插入所述表达系统或载体。所述载体包含插入的蛋白编码序列转录和翻译所必需的元件。 [0074] Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号描述了使用限制酶切割和用DNA连接酶连接，产生重组质粒形式的表达系统，特此通过引用结合到本文中。然后将这些重组质粒通过转化引入单细胞培养物并复制，其中所述单细胞培养物包括原核生物以及在组织培养中培育的真核细胞。
[0075] 重组基因也可以引入病毒中，如痘苗病毒。用质粒转染已感染病毒的细胞，可以产生重组病毒。
[0076] 合适的载体包括但不限于下面的病毒载体，如λ载体系统gt11、gt WES.tB、Charon 4，以及质粒载体，如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101，SV 40、pBluescript II SK+/-或 KS+/-( 参 见Stratagene，La Jolla，Calif的“Stratagene克隆系统”目录(1993)，特此通过引用结合到本文中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(参 见F.W.Studier等人，“使用T7 RNA聚合酶指导克隆基因的表达，” Gene Expression Technology第185卷(1990)，特此通过引用结合到本文中)，以及它们的任何衍生物。可以通过转化、特别是转导、细胞接合作用、带动转移(mobilization)或电穿孔，将重组分子引入细胞。使用本领域内的标准克隆程序将所述DNA序列克隆进载体，本领域内的标准克隆程序如Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)所述，特此通过引用结合到本文中。
[0077] 可以利用各种宿主-载体系统来表达单个或多个蛋白编码序列。主要是所述载体系统必须与所使用的宿主细胞相亲和。宿主-载体系统包括但不限于以下所列：用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物如包含酵母载体的酵母；感染病毒(如痘苗病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；以及感染细菌的植物细胞。这些载体的表达元件在其强度和特异性上有所不同。根据所利用的宿主-载体系统，可以使用多种合适的转录和翻译元件中的任何一个。
[0078] 不同的遗传信号和加工事件控制基因表达的多个水平(如DNA的转录和信使RNA(mRNA)的翻译)。
[0079] DNA的转录依赖于启动子的存在，启动子就是一段指导RNA聚合酶的结合并因此促进mRNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列与原核启动子的DNA序列不同。而且真核启动子及其伴随的遗传信号可能在原核系统中不被识别或不发挥功能，此外，原核启动子在真核细胞中不被识别并且不发挥功能。
[0080] 类似地，mRNA在原核细胞中的翻译依赖于恰当的原核信号的存在，这些信号与真核细胞中的信号不同。mRNA在真核细胞中的有效翻译需要mRNA上一个名为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。这个序列是mRNA的一段短核苷酸序列，位于起始密码子之前，起始密码子通常是AUG，编码蛋白质氨基端的甲硫氨 酸。SD序列与
16S rRNA(核糖体RNA)的3’端互补，可能是通过与该rRNA形成双链体，使核糖体能正确定位，从而促进mRNA结合核糖体。关于使基因表达最大化的综述可参见Roberts和Lauer， Methods in Enzymology，68：473(1979)，特此通过引用结合到本文中。
16S rRNA(核糖体RNA)的3’端互补，可能是通过与该rRNA形成双链体，使核糖体能正确定位，从而促进mRNA结合核糖体。关于使基因表达最大化的综述可参见Roberts和Lauer， Methods in Enzymology，68：473(1979)，特此通过引用结合到本文中。
[0081] 各种启动子的“强度”(即它们促进转录的能力)有所不同。为表达克隆基因的目的，为了获得高水平的转录以及进而高水平的基因表达，最好是使用强启动子。根据所利用的宿主细胞系统，可以使用多种合适启动子中的任何一个。例如，当在大肠杆菌、它的噬菌体或质粒中进行克隆时，可以使用以下启动子来指导邻近DNA区段的高水平转录：如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌λ的PR和PL启动子以及其它启动子，包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等等。此外，可以使用杂种trp-lacUV5(tac)启动子或通过重组DNA技术或其它合成DNA技术产生的其它大肠杆菌启动子，提供给插入基因的转录。
[0082] 可以选择除非受到特异性诱导、否则抑制启动子作用的细菌宿主细胞株和表达载体。在某些操作中，加入特异性诱导物对于插入DNA的有效转录是必要的。例如，加入乳糖或IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，诱导lac操纵子。各种其它操纵子，如trp、pro等，处于不同的控制之下。
[0083] 原核细胞中的有效基因转录和翻译还需要特异性的起始信号。这些转录和翻译的起始信号可能在“强度”上有差异，它们的“强度”是分别根据合成的基因特异性的信使RNA的量以及蛋白的量来衡量的。包含一个启动子的DNA表达载体还可以包含任何组合的不同“强度”转录和/或翻译起始信号。例如，大肠杆菌中的有效翻译要求距起始密码子(ATG)5’约7-9个碱基的一个SD序列，来提供一个核糖体结合位点。因此，可以使用任何能被宿主细胞核糖体利用的SD-ATG组合。这样的组合包括但不限于得自大肠杆菌噬菌体λ的cro基因或N基因、或得自大肠杆菌色氨酸E、D、C、B或A 基因的SD-ATG组合。此外，可以使用任何用重组DNA技术或其它涉及插入合成核苷酸的技术产生的任何SD-ATG组合。
[0084] 一旦已经将分离的编码过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子克隆进表达系统，就可以将其引入宿主细胞。根据所使用的载体/宿主细胞系统，可以采用上面提到的各种形式的转化进行这样的引入。合适的宿主细胞包括但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等等。
[0085] 可以利用本发明的方法处理广泛种类的植物或它们的种子以促进生长。合适的植物包括双子叶植物和单子叶植物。更具体地说，有用的作物可以包括：稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、花椰菜、硬花球花椰菜、芜菁、小萝卜(radish)、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜(squash)、西葫芦、绿皮南瓜、黄瓜、苹果、梨、瓜、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、蜀黍以及甘蔗。合适的观赏植物的例子有：玫瑰、非洲紫苣苔属(Saintpaulia)、牵牛花、天竺葵属植物、一品红、菊花、香石竹和百日草属。
[0086] 本发明的涉及应用过敏反应诱发剂多肽或蛋白的方法在整株植株或植株部分，包括叶、茎、根等受到处理时，可以通过多种程序进行。这可以(但不是必须)涉及将过敏反应诱发剂多肽或蛋白渗入植株。合适的应用方法包括在即将应用诱发剂时表面施用(如高压或低压喷洒)、注入(injection)、撒粉、以及磨擦叶面。在处理植物种子时，根据本发明的应用实施方案，可以通过表面施用(高压或低压喷洒)、包被、浸渍、撒粉或注入，来应用过敏反应诱发剂多肽或蛋白。其它合适的应用方法可以由本领域内的技术人员设想出，只要它们能产生过敏反应诱发剂多肽或蛋白与植株或植物种子的细胞接触。一旦用本发明的过敏反应诱发剂处理后，种子就可以种植在天然或人工土壤中，用常规程序培育以产生植株。按照本发明处理的种子繁 殖出植株后，可以一次或多次施用过敏反应诱发剂多肽或蛋白来处理这些植株，从而增强植株的生长。这样繁殖出来的植株本身又可用于产生种子或无性繁殖体(如插条)，这些种子和无性繁殖体可产生生长增强的植株。
[0087] 过敏反应诱发剂多肽或蛋白可以按照本发明地单独或与其它材料混合起来应用到植物或植物种子上。或者，可以在将过敏反应诱发剂多肽或蛋白单独应用于植物，而在不同时间施用其它材料。
[0088] 适于按照本发明的应用实施方案处理植物或植物种子的组合物包含处于一种载体中的过敏反应诱发剂多肽或蛋白。合适的载体包括水、水溶液、浆液或干粉。在这个实施方案中，该组合物包含多于0.5nM的过敏反应诱发剂多肽或蛋白。
[0089] 虽然并非必要，但这种组合物可以包含辅助的添加剂，包括肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、除草剂以及它们的混合物。合适的肥料包括(NH4)2NO3。合适的杀虫剂的一个例子是马拉硫磷。可用的杀真菌剂包括克菌丹。
[0090] 其它合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、包被剂和磨擦剂。这些材料可用于便利本发明的程序。另外，过敏反应诱发剂多肽或蛋白可以与其它常规种用制剂和处理材料(包括粘土和多糖)一起应用于植物种子。
[0091] 在本发明另一种可选择的涉及使用转基因植物和转基因种子的实施方案中，不必将一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白局部应用到植物或种子上。取而代之的是，依照本领域内广为人知的程序，如生物弹道学(biolistics)或农杆菌介导的转化，产生用编码一种过敏反应诱发剂多肽或蛋白的DNA分子转化的转基因植物。合适的过敏反应诱发剂多肽或蛋白的例子及它们的编码DNA的核酸序列如前所公开。一旦产生了这种类型的转基因植物，就可以按照常规程序培育这些植物，而编码过敏反应诱发剂的基因的存在会导致植物的生长增强。或者，从转基因植物中回收转基因种子。然后可以将这些种 子种植于土壤中，用常规程序培育产生转基因植物。在可以有效赋予增强的生长的条件下，由所种植的转基因种子繁殖出转基因植物。尽管不希望被理论所束缚，但这样的生长增强可以由RNA介导或由于表达诱发剂多肽或蛋白而得到。
[0092] 当依照本发明使用转基因植物和植物种子时，它们还可以另外用其它材料处理，所述材料与在应用过敏反应诱发剂多肽或蛋白物时用于处理植物和种子的材料相同。这些其它材料，包括过敏反应诱发剂，可以按上面提到的程序应用于转基因植物和植物种子，包括高压或低压喷洒、注射、包被、撒粉和浸渍。类似地，在从转基因植物种子繁殖出植物后，可以一次或多次施用过敏反应诱发剂处理这些植物来增强植物生长。这样的植物也可以用常规的植物处理剂(如杀虫剂、肥料等)进行处理。本发明的转基因植物能用于产生种子和无性繁殖体(如插条)，从所述种子或无性繁殖体可以产生生长增强的植株。
[0093] 实施例
[0094] 实施例1-用解淀粉欧文氏菌的过敏反应诱发剂处理番茄种子对发芽率的影响 [0095] 将Marglobe番茄变种的种子浸泡在40ml解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂溶液(“harpin”)中。harpin如下制备：培养包含质粒pCPP2139(参见图1)的大肠杆菌株DH5，超声处理裂解细胞，在沸水中保持5分钟进行热处理，离心除去细胞碎片，然后沉淀蛋白和其它热不稳定的成分。连续稀释得到的制备物(“CFEP”)。根据蛋白印迹分析，这些稀释物(1∶40，1∶80，1∶160，1∶320和1∶640)分别含有20、10、5、2.5和1.25μgm/ml的harpin。在第0天，在一个生长室中，于28℃下将种子在烧杯中的harpin或缓冲液中浸泡24小时。浸泡之后，在第1天将种子播种于装有人工土壤的萌发盆中。这个程序按每种处理100粒种子进行。
[0096] 处理：
[0097] 1.harpin(1∶40)(20μgm/ml)浸泡种子。
[0098] 2.harpin(1∶80)(10μgm/ml)浸泡种子。
[0099] 3.harpin(1∶160)(5μgm/ml)浸泡种子。
[0100] 4.harpin(1∶320)(2.5μgm/ml)浸泡种子。
[0101] 5.harpin(1∶640)(1.25μgm/ml)浸泡种子。
[0102] 6.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)浸泡种子。
[0103] 表1-处理种子后幼苗的数目
[0104]
[0105] 如表1所示，用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄种子，减少了发芽所需时间并大大增加了发芽率。
[0106] 实施例2-用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄种子对番茄株高的影响 [0107] 第0天，在一个生长室中，于28℃下将Marglobe番茄变种的种子浸泡于烧杯中的解淀粉欧文氏菌harpin(1∶15，1∶30，1∶60以及1∶120)或缓冲液中24小时。浸泡之后，在第1天将种子播种于装有人工土壤的萌发盘中。
[0108] 每种处理随机选择十株表现一致的植株并测量。用直尺测量幼苗从土壤表面到植株顶端的高度。
[0109] 处理：
[0110] 1.harpin(1∶15)(52μgm/ml)。
[0111] 2.harpin(1∶30)(26μgm/ml)。
[0112] 3.harpin(1∶60)(13μgm/ml)。
[0113] 4.harpin(1∶120)(6.5μgm/ml)。
[0114] 5.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)。
[0115]
[0116]
[0117] 表5-概要——处理后番茄植株的平均高度
[0118]
[0119] 如表2-5所示，用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄种子增强了植物生长。1∶30的稀释物作用最大——幼苗高度增加16％。
[0120] 实施例3-用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄植株对番茄株高的影响 [0121] 当Marglobe番茄植株4周大时，在一个生长室中，于28℃下，每株植株喷洒6ml含13μgm/ml(1∶60)或8.7μgm/ml(1∶90)harpin的解淀粉欧文氏菌harpin溶液或喷洒
6ml缓冲液(5mM KPO4)。喷洒harpin2周后(6周大的番茄植株)以及2周又5天后，测量番茄植株的高度。每种处理随机选择十株表现一致的植株并测量。用直尺测量幼苗从土壤表面到植株顶端的高度。
6ml缓冲液(5mM KPO4)。喷洒harpin2周后(6周大的番茄植株)以及2周又5天后，测量番茄植株的高度。每种处理随机选择十株表现一致的植株并测量。用直尺测量幼苗从土壤表面到植株顶端的高度。
[0122] 处理：
[0123] 1.harpin(1∶60)(13μgm/ml)。
[0124] 2.harpin(1∶90)(8.7μgm/ml)。
[0125] 3.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)。
[0126] 表6-harpin处理后番茄植株的平均高度
[0127]
[0128] 如表6所示，用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂喷洒番茄幼苗可以增强番茄植株的生长。与缓冲液处理对照相比，记录到这两个剂量的待测过敏反应诱发剂有相似的生长增强。
[0129] 实施例4-用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄种子对番茄株高的影响 [0130] 第0天，在一个生长室中，于28℃下将Marglobe番茄种子浸泡于烧杯中的解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂溶液(“harpin”)(1∶40，1∶80，1∶160，1∶320以及1∶640)或缓冲液中24小时。在harpin或缓冲液中浸泡种子之后，在第1天将它们播种于装有人工土壤的萌发盘中。每种处理随机选择十株表现一致的植株并测量。用直尺测量幼苗从土壤表面到植株顶端的高度。
[0131] 处理：
[0132] 1.harpin(1∶40)(20μgm/ml)。
[0133] 2.harpin(1∶80)(10μgm/ml)。
[0134] 3.harpin(1∶160)(5μgm/ml)。
[0135] 4.harpin(1∶320)(2.5μgm/ml)。
[0136] 5.harpin(1∶640)(1.25μgm/ml)。
[0137] 6.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)。
[0138]
[0139]
[0140] 如表7-10所示，用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄种子可以增强番茄植株的生长。1∶160的稀释物(5μg/ml harpin)作用最大——幼苗高度比用缓冲液处理的植株增加超过20％。
[0141] 实施例5用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄种子对种子发芽率的影响 [0142] 第0天，在一个生长室中，于28℃下将Marglobe番茄种子浸泡于烧杯中的40ml解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂(“harpin”)溶液(来自大肠杆菌DH5(pCPP2139)的CFEP的1∶50或1∶100稀释物，分别含有8μgm/ml和4μgm/ml的过敏反应诱发剂)或缓冲液中24小时。浸泡之后，在第1天将种子播种于装有人工土壤的萌发盘中。每种处理进行4盆，每盆内有20粒种子。
[0143] 处理：
[0144] 1.harpin(8μgm/ml)。
[0145] 2.harpin(8μgm/ml)。
[0146] 3.harpin(8μgm/ml)。
[0147] 4.harpin(8μgm/ml)。
[0148] 5.harpin(4μgm/ml)。
[0149] 6.harpin(4μgm/ml)。
[0150] 7.harpin(4μgm/ml)。
[0151] 8.harpin(4μgm/ml)。
[0152] 9.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)。
[0153] 10.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)。
[0154] 11.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)。
[0155] 12.缓冲液(5mM KPO4，pH 6.8)。
[0156] 表11-harpin处理后幼苗的数目
[0157]
[0158] 如表11所示，用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理番茄种子可以提高番茄种子的发芽率和发芽水平。在试验最后看来，所使用的更高剂量看来比缓冲液更有效。 [0159] 实施例6-用从包含过敏反应诱发剂编码构成物pCPP2139或质粒载体pCPP50的大肠杆菌制备的蛋白处理番茄种子对植株生长的影响
[0160] 将Marglobe番茄种子浸泡在解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂(“harpin”)(得自大肠杆菌DH5α(pCPP2139)(图1))制备物中，或浸泡于作为对照、添加了BSA蛋白的载体制备物(得自DH5α(pCPP50)(图2))。所述对照载体制备物每ml包含33.6μlBSA(10mg/ml)，以提供与pCPP2139制备物所包含的harpin等量的蛋白。第1天，在烧杯中制备1∶50(8.0μg/ml)、1∶100(4.0μg/ml)和1∶200(2.0μg/ml)的稀释物，并在一个受控制的环境室中于28℃下将种子浸泡24小时。浸泡之后，在第2天将种子种植在装有人工土壤的萌发 盘中。移栽后每种处理随机选择表现一致的10株植株，并在三个时间进行测量。
用直尺测量幼苗从土壤表面到植株顶端的高度。
用直尺测量幼苗从土壤表面到植株顶端的高度。
[0161] 处理：
[0162] 1.harpin 1∶50 (8.0μg/ml)
[0163] 2.harpin 1∶100 (4.0μg/ml)
[0164] 3.harpin 1∶200 (2.0μg/ml)
[0165] 4.载体+BSA 1∶50 (0harpin)
[0166] 5.载体+BSA 1∶100 (0harpin)
[0167] 6.载体+BSA 1∶200 (0harpin)
[0168]
[0169]
[0170] 如表12-15所示，用包含编码解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂的基因的大肠杆菌处理，可以增强番茄植株的生长。1∶100的稀释物(4.0μg/ml)作用最大，而更高浓度和更低浓度作用要小。用4.0μg/mlharpin处理与用含有类似量非harpin蛋白的载体对照制备物处理相比，平均幼苗高度增加了约20％。由大肠杆菌株DH5α(pCPP50)(其带有大肠杆菌株DH5α(pCPP2139)的hrpN基因的载体)得到的细胞裂解制备物的成分并不具有与包含harpin的制备物相同的生长促进作用，即使假设其中补充了与含大量harpin蛋白的DH5α(pCPP2139)制备物相同水平的BSA蛋白。
[0171] 实施例7-用从包含过敏反应诱发剂编码构成物pCPP2139或其质粒载体pCPP50的大肠杆菌制备的蛋白处理番茄种子对番茄植株生长的影响
[0172] 第1天，在一个生长室中，于28℃下将Marglobe番茄种子浸泡于烧杯中的解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂溶液(“harpin”)(得自harpin编码质粒pCPP2139载体)以及包含pCPP50载体的溶液的1∶25、1∶50、以及1∶100的稀释物中24小时。浸泡种子之后，在第2天，将它们种植于装有人工土壤的萌发盘中。每种处理随机选择十株表现一致的植株并测量。用直尺测量幼苗从土壤表面到植株顶端的高度。
[0173] 处理：
[0174] 1.harpin 16μgm/ml
[0175] 2.harpin 8μgm/ml
[0176] 3.harpin 4μgm/ml
[0177] 4.载体16μgm/ml
[0178] 5.载体8μgm/ml
[0179] 6.载体4μgm/ml
[0180]
[0181]
[0182] 表18-处理后番茄植株的平均高度
[0183]
[0184] 如表16-18所示，用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理可以增强番茄植株的生长。1∶50稀释物(8.0μg/ml过敏反应诱发剂)作用最大，其中幼苗高度比对照增加了约20％。
[0185] 实施例8-无细胞解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂对马铃薯生长的作用
[0186] 在各自单独的容器中将马铃薯变种Norchip由块茎培养成3周大的植株。每株植株的叶面喷洒以1∶50、1∶100和1∶200稀释的包含解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂(“harpin”)的溶液，或喷洒以1∶50、1∶100和1∶200稀释的包含大肠杆菌蛋白和载体pCPP50的蛋白的对照溶液(“载体”)。在第20天，为以下每项处理随机选择12株表现一致的植株。将每种处理的一株植株在16℃下维持在一个生长室中，两株植株在18-25℃下维持在一个温室台上。处理后25天，分别测量所有植株的苗(茎)。
[0187] 处理：
[0188] 1.harpin 1∶50 16μgm/ml
[0189] 2.harpin 1∶100 8μgm/ml
[0190] 3.harpin 1∶200 4μgm/ml
[0191] 4.载体1∶50 0harpin
[0192] 5.载体1∶100 0harpin
[0193] 6.载体1∶200 0harpin
[0194]
[0195] 如表19和20所示，用解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂处理马铃薯植株增强了苗(茎)的生长。因此，根据茎的数目以及平均长度判断，在温室和生长室培育的植株中，harpin处理的植株的总生长都要强。用中等剂量harpin(8.0μg/ml)处理的马铃薯植株看起来比用更高或更低剂量处理的植株在茎生长上增强更多。在两种生长条件下，用中等剂量的harpin处理导致更强的生长。
[0196] 实施例9-用包含解淀粉欧文氏菌harpin的无细胞诱发剂制备物喷洒番茄的作用 [0197] 将Marglobe植 株 移 栽 后8 天，喷 洒harpin制 备 物( 得 自 大 肠 杆 菌DH5α(pCPP2139))，或喷洒添加了BSA蛋白的载体制备物(得自大肠杆菌DH5α(pCPP50))作为对照。所述对照载体制备物每ml包含33.6μl BSA(10mg/ml)，以提供与pCPP2139制备物所包含的harpin等量的蛋白。制备1∶50(8.0μg/ml)、1∶100(4.0μg/ml)和1∶200(2.0μg/ml)的制备物，并用一台电动喷雾器喷洒到植株上直至形成溢流。每种处理随机选择15株表现一致的植株并分配进行处理。将这些植株在处理前和处理后于28℃下维持在一个受控制的环境室中。
[0198] 处理后几次测量从土壤表面到植株顶端的总高度。在接近土壤表面切断茎后，立即称量番茄植株地上部分的重量。
[0199] 处理：(稀释度和harpin含量)
[0200] 1.harpin 1∶50 (8.0μg/ml)
[0201] 2.harpin 1∶100 (4.0μg/ml)
[0202] 3.harpin 1∶200 (2.0μg/ml)
[0203] 4.载体+BSA 1∶50 (0harpin)
[0204] 5.载体+BSA 1∶100 (0harpin)
[0205] 6.载体+BSA 1∶200 (0harpin)
[0206]
[0207]
[0208]
[0209] 通常，用harpin单次喷洒番茄幼苗比用补充了BSA蛋白的对照(载体)制备物喷洒处理导致更强的后续生长。harpin处理的植株的增强的生长在株高测量和鲜重测量中都看得出来。在三个测试过的浓度中，两个较低浓度导致比高剂量(8.0μg/ml)更强的植株生长(基于两种测量中的任一种)。用两个较低浓度(2和4μg/ml)处理的植株之间的生长几乎没有区别。由大肠杆菌株DH5α(pCPP50)(其带有大肠杆菌株DH5α(pCPP2139)的hrpN基因的载体)得到的细胞裂解制备物的组分并不具有与包含harpin的制备物相同的生长促进作用，即使其中补充了与含大量harpin蛋白的DH5α(pCPP2139)制备物相同水平的BSA蛋白。因此，这个试验表明，harpin是植物生长增强的原因。
[0210] 实施例10-树莓的早着色和早熟
[0211] 进行一个大田试验以评价过敏反应诱发剂(“harpin”)处理对树莓栽培品种Candy产量和成熟参数的作用。在每个40英尺长×3英尺宽(1植株宽)的小区中，移植生长(established)的植株用harpin以2.5mg/10平方英尺处理、不处理(“对照”)、或用工业标准化学品Ronilan以推荐比率处理(“Ronilan”)。处理重复四次并安排在同一个试验田位点重复进行。处理在5-10％开花时开始，然后以7-10天的间隔再施用两次。头两次收成用于评估病害的防治，由后两次收成收集果实产量数据。观察表明，harpin处理的果实比不处理的果实更大并显示红色更深，这表明成熟被加速了1-2周。此时确定最少有10枚果实的每个树丛上成熟果实的数目并概括在表26中。harpin处理的小区中每10-莓树丛的成熟果实比对照或Ronilan处理的小区都多。而后两次收获的合并产量表明，用harpin处理以及用Ronilan处理的小区比未处理的对照产量增加(表27)。
[0212] 表26-1996年6月20日在有十枚或十枚以上浆果的植株上每丛成熟树莓果实的数目
[0213]
[0214] 表27-综合最后两次收获的平均树莓果实产量(重量)(磅)
[0215]
[0216] 实施例11-对食荚菜豆的生长增强
[0217] 采用各种方法处理食荚菜豆变种Bush Blue Lake，并种植在装满商品化盆载混合土的25cm直径的塑料盆中，放置于一个开放温室中，评价各生长参数。处理包括不处理的菜豆种子(“对照”)；用以水作稀释剂制备的1.5％甲基纤维素浆液处理种子(“M/C”)；先用1.5％甲基纤维素处理种子、再叶上施用0.125mg/ml的过敏反应诱发剂(“harpin”)(“M/C+H”)；以及用1.5％甲基纤维素处理加上每50粒种子5.0μg harpin喷洒harpin干粉、然后叶上施用0.125mg/ml的harpin(“M/C-SD+H”)。在第0天播种种子，每盆3粒种子，在发芽时间苗至每盆1株植株。处理重复10次，并在一间开放温室内通过重复(by rep)来随机化。64天后收获豆荚，收集具有可售大小(大小＞10cm×5cm)的豆荚的鲜重作为产量。采用用于区分处理平均值的Fisher氏LSD进行方差分析，分析数据。
[0218] 表28-采用各种方法用解淀粉欧文氏菌harpin处理
[0219] 对市售大小的食荚菜豆豆荚产量的作用
[0220] 处理 可售产量 g1 与不处理的植株(对照)相比的百分数％[0221] M/C-SD+H 70.6 a 452
[0222] M/C-H 58.5 ab 375
[0223] M/C 4 6.3 bc 297
[0224] M/C+H 42.3 bc 271
[0225] M/C-SD 40.0 cd 256
[0226] 对照 15.6 e 100
[0227] 1可售产量包括所有10cm×0.5cm或更大的菜豆豆荚。根据Fisher氏LSD，后面带有相同字母的平均值在P＝005的水平上没有显著差异。
[0228] 如表28所示，用各种应用方法施用解淀粉欧文氏菌harpin，导致可售大小的食荚菜豆豆荚增产。单独用甲基纤维素处理也导致菜豆增产，但当其与harpin组合用于种子处理(喷洒干粉)和叶处理时，产量明显增加。
[0229] 实施例12-对黄瓜叶施用HP-1000TM得到的黄瓜增产
[0230] 以15、30或60μg/ml活性成分(a.i.)的比率叶喷洒过敏反应诱发剂蛋白(以TM下称为HP-1000 )(EDEN Bioscience，Bothell，Washington)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)，处理黄瓜幼苗及移植体。在第一片真叶完全伸展时进行第一次喷洒。第一次喷洒后10天进行第二次应用。所有喷洒都应用一台背携式喷雾器进行，试验还包括一个不TM
处理的对照(UTC)。第二次施用HP-1000 后3天，将来自每种处理的十株植株移栽到随机化的田间小区中，重复三次。这产生了每种处理总共30株植株。移栽后七天，第三次叶喷TM
洒HP-1000 。虽然随后的严重干旱导致显著的用水胁迫，但遵循标准工业化(commercial)收割模式进行了总共六次收割。从每种处理收获得的果实总重都显示在表29中。结果表TM
明，用比率为15和30μg/ml的HP-1000 处理的植株产出了比UTC明显更多的果实。用TM TM
HP-1000 处理的植株产生了中度的增产。这些结果表明，HP-1000 处理的植株显著地比不处理的植株更耐受干旱的恶 劣条件。
处理的对照(UTC)。第二次施用HP-1000 后3天，将来自每种处理的十株植株移栽到随机化的田间小区中，重复三次。这产生了每种处理总共30株植株。移栽后七天，第三次叶喷TM
洒HP-1000 。虽然随后的严重干旱导致显著的用水胁迫，但遵循标准工业化(commercial)收割模式进行了总共六次收割。从每种处理收获得的果实总重都显示在表29中。结果表TM
明，用比率为15和30μg/ml的HP-1000 处理的植株产出了比UTC明显更多的果实。用TM TM
HP-1000 处理的植株产生了中度的增产。这些结果表明，HP-1000 处理的植株显著地比不处理的植株更耐受干旱的恶 劣条件。
[0231] 表29-HP-1000TM处理后得到的黄瓜增产
[0232]
[0233] 1活性成分(a.i.)。2根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0234] 实施例13-由HP-1000TM处理得到的棉花增产
[0235] 在一个随机完全区组(RCB)大田试验中，将棉花种植在四块一样的12×20英尺TM田间小区中。用HP-1000 (EDEN Bioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)、TM
HP-1000 +Pix (Pix (BASFCorp.，Mount Olive，N.J.)是一种生长调节剂，施用以保持棉花植株高度上的坚实(compact in height))或Early Harvest (Griffen Corp.，Valdosta，Ga.)(一种竞争性生长增强剂)处理植株。试验还包括一个不处理的对照(UTC)。
使用一台背携式喷雾器在作物的三个生长时期(第一片真叶、开花前、花期早期)进行所有的叶施用处理。在所有处理中，所有肥料和除草产品都根据常规的农业实践施用。收获前TM
十周，HP-1000 处理的植株与其它处理的植株相比，每株植株上棉桃的数目要显著更高。收TM TM
获时，HP-1000 处理与UTC相比，显示出皮棉产量显著增加(43％)(表30)。当HP-1000与Pix 组合使用时，皮棉产量比UTC增加20％。由于Pix 普遍应用于大面积的棉花，TM
这个结果表明，HP-1000 可以与Pix 成功地进行化学液体混合(tankmixed)。与UTC相比，应用竞争性生长增强剂Early Harvest ，皮棉产量仅增加9％。
HP-1000 +Pix (Pix (BASFCorp.，Mount Olive，N.J.)是一种生长调节剂，施用以保持棉花植株高度上的坚实(compact in height))或Early Harvest (Griffen Corp.，Valdosta，Ga.)(一种竞争性生长增强剂)处理植株。试验还包括一个不处理的对照(UTC)。
使用一台背携式喷雾器在作物的三个生长时期(第一片真叶、开花前、花期早期)进行所有的叶施用处理。在所有处理中，所有肥料和除草产品都根据常规的农业实践施用。收获前TM
十周，HP-1000 处理的植株与其它处理的植株相比，每株植株上棉桃的数目要显著更高。收TM TM
获时，HP-1000 处理与UTC相比，显示出皮棉产量显著增加(43％)(表30)。当HP-1000与Pix 组合使用时，皮棉产量比UTC增加20％。由于Pix 普遍应用于大面积的棉花，TM
这个结果表明，HP-1000 可以与Pix 成功地进行化学液体混合(tankmixed)。与UTC相比，应用竞争性生长增强剂Early Harvest ，皮棉产量仅增加9％。
[0236] 表30-用HP-1000TM、HP-1000TM+Pix 或Early Harvest 处理后得到的皮棉产量增加
[0237]
[0238] 1HP-1000TM的比率是指活性成分(a.i.)的比率；Early Harvest 和Pix 的比率是指制成品的比率。
[0239] 实施例14-由HP-1000TM处理得到中国茄子(Chinese eggplant)的增产
[0240] 向苗圃中培育的Chinese egg植株幼苗以15、30或60μg/ml(a.i.)喷洒一次TMHP-1000 (EDEN Bioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)，然后移植到田间小TM
区中，每种处理重复三次。移栽后两周，第二次施用HP-1000 。第二次喷洒后约两周，第三TM
次即最后一次施用HP-1000 。所有喷洒都使用一台背携式喷雾器进行；试验还包括一个不处理的对照(UTC)。随着季节的变换，每种处理共收获八次。从这些收成得到的数据表明，TM
用HP-1000 处理导致单株果实产量更高。
区中，每种处理重复三次。移栽后两周，第二次施用HP-1000 。第二次喷洒后约两周，第三TM
次即最后一次施用HP-1000 。所有喷洒都使用一台背携式喷雾器进行；试验还包括一个不处理的对照(UTC)。随着季节的变换，每种处理共收获八次。从这些收成得到的数据表明，TM
用HP-1000 处理导致单株果实产量更高。
[0241] 表31-HP-1000TM处理后中国茄子植株的增产
[0242]
[0243] 实施例15-由用HP-1000TM处理得到的稻增产
[0244] 将稻幼苗移栽进田间小区中，重复三次，然后用一台背携式喷 雾器以三种不同比率叶喷洒HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)进行处理。试验中还包括一个不处理的对照(UTC)。移栽后1周第一次施用HP-1000TM，第一次施用三周后进行第二次施用。在稻粒刚好开始灌浆之前，进行第三次即最后一次喷洒。收获的结果显示，以30和60μg/ml叶施用HP-1000TM分别显著增产47％和56％(表32)。
[0245] 表32-用HP-1000TM叶处理后得到的稻增产
[0246]
[0247] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0248] 实施例16-由HP-1000TM处理得到的大豆增产
[0249] 将大豆种植进随机化的田间小区中，每种处理重复三次。使用一台背携式喷雾器TM叶喷洒HP-1000 (EDEN Bioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)，试验中还包括一个不处理的对照(UTC)。在四片真叶期，植株约八英寸高时，开始以三个比率施用TM TM
HP-1000 。第一次喷洒后10天第二次喷洒HP-1000 ，第二次喷洒10天后进行第三次喷洒。
TM
第一次喷洒处理10天后测量到的株高表明，HP-1000 应用导致生长显著增强(表33)。此TM
外，用60μg/ml比率的HP-1000 处理的植株比其它处理的植株早5天开始开花。第三次喷洒后约十天，计数每次重复的十株随机选出的植株上单株大豆豆荚的数目。这些结果表TM
明，由HP-1000 处理得到的生长增强导致显著更高的产量(表34)。
HP-1000 。第一次喷洒后10天第二次喷洒HP-1000 ，第二次喷洒10天后进行第三次喷洒。
TM
第一次喷洒处理10天后测量到的株高表明，HP-1000 应用导致生长显著增强(表33)。此TM
外，用60μg/ml比率的HP-1000 处理的植株比其它处理的植株早5天开始开花。第三次喷洒后约十天，计数每次重复的十株随机选出的植株上单株大豆豆荚的数目。这些结果表TM
明，由HP-1000 处理得到的生长增强导致显著更高的产量(表34)。
[0250] 表33-用HP-1000TM叶处理后大豆株高的增加
[0251]
[0252] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0253] 表34-用HP-1000TM叶处理后大豆结荚(pod set)增加
[0254]
[0255] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0256] 实施例17-由HP-1000TM处理得到的草莓增产
[0257] 用HP-1000TM(EDEN Bioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)对两个草莓变种Camarosa和Selva进行两个大田试验。在一块工业化生产草莓的田中，为每个变种的每种处理建立一个具有四个重复小区(5.33×10英尺)的随机完全区组(RCB)设计。每个小区中双行布置种植草莓植株。试验还包括一个不处理的对照。在施用开始前，所有植TM
株都摘净花和浆果。使用一台背携式喷雾器每六周喷洒40μg/ml比率的HP-1000 。在每次喷洒应用之前，收获每种处理得到的所有成熟果实、称重并根据商业标准评级。对SelvaTM
草莓植株第一次施用HP-1000 后三周内，生长增强可目视辨别为更大的地上生物量以及更茁壮、更绿和更健康的外观。六次收获之后(即这些植株的计划寿命)，合计所有产量的TM
数据并进行分析。对于Camarosa变种，平均最后四次采摘量时，HP-1000 处理的植株得到可售果实的产量比UTC显著增加(27％)(表35)。该变种各处理的头两次采摘量 之间并TM
不表现显著差异。Selva变种更易受到HP-1000 处理的生长增强作用的影响；平均六次采摘量后，Selva草莓变种与UTC相比，产生了具统计学显著性的多64％的可售果实。 [0258] 表35-用HP-1000TM叶处理后得到的草莓增产
株都摘净花和浆果。使用一台背携式喷雾器每六周喷洒40μg/ml比率的HP-1000 。在每次喷洒应用之前，收获每种处理得到的所有成熟果实、称重并根据商业标准评级。对SelvaTM
草莓植株第一次施用HP-1000 后三周内，生长增强可目视辨别为更大的地上生物量以及更茁壮、更绿和更健康的外观。六次收获之后(即这些植株的计划寿命)，合计所有产量的TM
数据并进行分析。对于Camarosa变种，平均最后四次采摘量时，HP-1000 处理的植株得到可售果实的产量比UTC显著增加(27％)(表35)。该变种各处理的头两次采摘量 之间并TM
不表现显著差异。Selva变种更易受到HP-1000 处理的生长增强作用的影响；平均六次采摘量后，Selva草莓变种与UTC相比，产生了具统计学显著性的多64％的可售果实。 [0258] 表35-用HP-1000TM叶处理后得到的草莓增产
[0259]
[0260] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0261] 实施例18-由HP-1000TM处理得到的番茄更早成熟和增产
[0262] 在一块工业化番茄生产田中，在一个随机完全区组(RCB)大田试验中将新鲜市售TM番茄(Solar Set变种)种植在小区(2×30英尺)中，重复5次。处理包括HP-1000 (EDEN Bioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)、一种试验性的竞争性产品
TM
(Actigard (Novartis，Greensboro，N.C.))以及用于病害防治的化学标准品(Kocide (GriffenCorp.，Valdosta，GA))+Maneb (DuPont Agricultural Products，Wilmington，TM
D.E.))。HP-1000 的首次施用是在移栽后立即将50ml浸液(drench)(30μg/ml活性成分)直接浇在幼苗上。此后，使用一台背携式喷雾器每11周应用叶喷洒。移栽后约六周对所有TM
处理进行第一次收获，并且每种处理只收获完全红的、成熟的番茄。结果表明，HP-1000 处TM
理的植株有显著更大量的番茄可供第一次收获(表36)。由HP-1000 处理的植株收获到的番茄估计比其它处理的早10-14天。
TM
(Actigard (Novartis，Greensboro，N.C.))以及用于病害防治的化学标准品(Kocide (GriffenCorp.，Valdosta，GA))+Maneb (DuPont Agricultural Products，Wilmington，TM
D.E.))。HP-1000 的首次施用是在移栽后立即将50ml浸液(drench)(30μg/ml活性成分)直接浇在幼苗上。此后，使用一台背携式喷雾器每11周应用叶喷洒。移栽后约六周对所有TM
处理进行第一次收获，并且每种处理只收获完全红的、成熟的番茄。结果表明，HP-1000 处TM
理的植株有显著更大量的番茄可供第一次收获(表36)。由HP-1000 处理的植株收获到的番茄估计比其它处理的早10-14天。
[0263] 表36-用HP-1000TM叶处理后第一次收获时番茄产量的增加
[0264]
[0265] 1Kocide 和Maneb 的比率是针对制成品而言的。2根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0266] 实施例19-用HP-1000TM处理的草莓种植在未熏蒸土壤中时早开花和生长增强 [0267] 在一个随机完全区组大田试验中，将草莓植株(“plugs”和“裸根”)栽培品种Commander移栽到小区(2×30英尺)中，重复5次。在每块重复小区中移栽约六十株植株。这次大田试验进行如下处理：
[0268]
[0269] 1此前未熏蒸的土壤已经种植野豌豆两年。
[0270] 在晚秋，当寒冷天气可能减缓植物生长时，进行移栽。移栽后两周，用一台背携式TM喷雾器以40μg/ml(活性成分)第一次叶施用HP-1000 。移栽后三周，计数每次重复中所有TM
草莓“塞子”植株上花的数目，将HP-1000 处理与溴代甲烷处理和UTC作比较，收集初步结果。由于“裸根”植株上还未出现开花，因此通过测量3-叶丛中间一片叶子从叶尖到茎的距TM
离，评价每次重复该处理中每株植株的早期叶生长。结果(表37和38)表明，用HP-1000处理分别为“塞子”和“裸根”草莓植株提供了早期增强的花生长和叶大小。
草莓“塞子”植株上花的数目，将HP-1000 处理与溴代甲烷处理和UTC作比较，收集初步结果。由于“裸根”植株上还未出现开花，因此通过测量3-叶丛中间一片叶子从叶尖到茎的距TM
离，评价每次重复该处理中每株植株的早期叶生长。结果(表37和38)表明，用HP-1000处理分别为“塞子”和“裸根”草莓植株提供了早期增强的花生长和叶大小。
[0271] 表37-HP-1000TM叶处理后得到的“plug”草莓移植体的早开花
[0272]
[0273] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0274] 表38-HP-1000TM叶处理后得到的“裸根”草莓移植体的叶生长增强
[0275]
[0276] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0277] 实施例20-施用HP-1000TM得到的Jalapeno胡椒的早期生长增强
[0278] 将Jalapeno胡椒(栽培品种Mittlya)的移植体用HP-1000TM(EDENBioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)(30μg/ml a.i.)的根浸液处理1小时，然后移栽进随机化的田间小区中，重复四次。试验还包括一个不处理的对照(UTC)。从移栽后14天TM开始，用一台背 携式喷雾器以14天的间隔对受处理的植株三次叶喷洒HP-1000 。第三次TM
施用HP-1000 后一周(移栽后54天)，测量每个重复的四株随机选出的植株的株高。这TM
些测量的结果表明，HP-1000 处理过的植株约比UTC植株高约26％(表39)。此外还计数TM
了每株植株的芽数、花数或果实数。这些结果表明，HP-1000 处理过的植株比UTC植株多
61％以上的花、果实或芽(表40)。
施用HP-1000 后一周(移栽后54天)，测量每个重复的四株随机选出的植株的株高。这TM
些测量的结果表明，HP-1000 处理过的植株约比UTC植株高约26％(表39)。此外还计数TM
了每株植株的芽数、花数或果实数。这些结果表明，HP-1000 处理过的植株比UTC植株多
61％以上的花、果实或芽(表40)。
[0279] 表39-HP-1000TM处理后得到的Jalapeno胡椒株高的增加
[0280]1
[0281] 根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。TM
[0282] 表40-HP-1000 处理后Jalapeno胡椒的花数、果实数或芽数的增加
[0283]
[0284] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0285] 实施例21-应用HP-1000TM得到的烟草生长增强
[0286] 将烟草幼苗移栽进随机化的田间小区，重复三次。移栽后，以三个比率之一(15、TM30或60μg/ml活性成分)叶喷洒HP-1000 (EDENBioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)。六十天之后，第二次叶施用HP-1000。第二次施用后两天，对每种处理的10株随机选出的植株测量株高、计数单株叶数并测量叶大小(面积)。这些测量的结果表明，TM
用HP-1000 进行处理显著增强了烟草植物的生长(表41、42和43)。株高增加了6-13％，TM
同时用HP-1000 以30和60μg/ml处理的植株平均单株叶数比UTC多1片以上。然而，最TM
显著的是，用HP-1000 以15、30和60μg/ml处理导致叶面积的相应增加。单 株叶数多1片和平均叶大小(面积)增加的烟草植株表现出商业性的显著反应。
用HP-1000 进行处理显著增强了烟草植物的生长(表41、42和43)。株高增加了6-13％，TM
同时用HP-1000 以30和60μg/ml处理的植株平均单株叶数比UTC多1片以上。然而，最TM
显著的是，用HP-1000 以15、30和60μg/ml处理导致叶面积的相应增加。单 株叶数多1片和平均叶大小(面积)增加的烟草植株表现出商业性的显著反应。
[0287] 表41-HP-1000TM处理后烟草株高的增加
[0288]TM
[0289] 表42-HP-1000 处理后烟草单株叶数的增加
[0290]
[0291] 表43-HP-1000TM处理后烟草叶面积的增加
[0292]
[0293] 实施例22-应用HP-1000TM得到的冬小麦生长增强
[0294] 以每100磅种子3盎司制成品(3％活性成分)的比率，将HP-1000TM(EDENBioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)干粉“撒粉”在冬小麦种子上。然后用常规播种设备将这些种子播种进100英尺长、11.7英尺宽的随机化试验小区中。其它处TM
理包括：以每100 磅种子1盎司制成品向种子“撒粉”HP-1000 干粉(3％活性成分)；用TM
浓度为20μg/ml活性成分的HP-1000 溶液浸泡种子四小时、风干并种植；用标准化学品TM
(Dividend )杀真菌剂“撒粉”；以及一个不处理的对照(UTC)。种植后8天，HP-1000 处理的种子开始出苗，而UTC和化学标准品处理的种子直到预期的正常时间，即种植后约14天才出苗。种植后41天，从田中取出幼苗并进行评估。目测并判断以3盎司/100磅“撒TM
粉”HP-1000 处理的小麦的根重量是其它任何一种处理的约两倍。
理包括：以每100 磅种子1盎司制成品向种子“撒粉”HP-1000 干粉(3％活性成分)；用TM
浓度为20μg/ml活性成分的HP-1000 溶液浸泡种子四小时、风干并种植；用标准化学品TM
(Dividend )杀真菌剂“撒粉”；以及一个不处理的对照(UTC)。种植后8天，HP-1000 处理的种子开始出苗，而UTC和化学标准品处理的种子直到预期的正常时间，即种植后约14天才出苗。种植后41天，从田中取出幼苗并进行评估。目测并判断以3盎司/100磅“撒TM
粉”HP-1000 处理的小麦的根重量是其它任何一种处理的约两倍。
[0295] 大田试验之后，设计一个温室试验对这些结果获得确证。处理包括种植前以每100TM磅种子3盎司的比率向小麦种子撒HP-1000 (10％活性成分)干粉；以溶液浓度为20mg/mlTM
的HP-1000 浸泡种子、然后种植；以及一个不处理的对照(UTC)。将从每种处理得到的小麦种子以每盆25粒种子的比率种植，每种处理用5盆作为重复。种植后十五天，从每个处理盆中取出十株随机选择的幼苗，仔细地弄干净，并测量根长度。由于单株幼苗的地上部分TM
并不表现任何处理效果，因此用HP-1000 处理导致的根生长增强并不影响样本选择。由两TM
种HP-1000 处理得到的根生长增强都显著强于UTC(表49)；然而撒粉处理的种子看起来表现出略好的结果。
的HP-1000 浸泡种子、然后种植；以及一个不处理的对照(UTC)。将从每种处理得到的小麦种子以每盆25粒种子的比率种植，每种处理用5盆作为重复。种植后十五天，从每个处理盆中取出十株随机选择的幼苗，仔细地弄干净，并测量根长度。由于单株幼苗的地上部分TM
并不表现任何处理效果，因此用HP-1000 处理导致的根生长增强并不影响样本选择。由两TM
种HP-1000 处理得到的根生长增强都显著强于UTC(表49)；然而撒粉处理的种子看起来表现出略好的结果。
[0296] 表44-HP-1000TM处理后小麦幼苗的根生长的增强
[0297]1
[0298] 根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。TM
[0299] 实施例23-施用HP-1000 得到的黄瓜生长增强
[0300] 对工业化生产的黄瓜的大田试验包括四种处理：两种比率(20或 40μg/ml)的TMHP-1000 (EDEN Bioscience)(解淀粉欧文氏菌过敏反应诱发剂制剂)，一种用于病害防治的化学标准品(Bravo (Zeneca AgProducts，Wilmington，Del.)+Maneb )和一个不处理的对照(UTC)。每种处理在3×75英尺的小区中重复四次，每种处理的植株间隔约2英TM
尺。从长出第一片真叶开始叶喷洒HP-1000 ，并以14天的间隔重复直到最后收获，总共进行六次施用。如果条件允许，每七天或更短时间间隔施用标准杀真菌剂混合物。第一次施TM TM
用HP-1000 约两个月后(五次喷洒HP-1000 之后)开始工业化收获，第一次收获约14天之后进行最后的收获。
TM
尺。从长出第一片真叶开始叶喷洒HP-1000 ，并以14天的间隔重复直到最后收获，总共进行六次施用。如果条件允许，每七天或更短时间间隔施用标准杀真菌剂混合物。第一次施TM TM
用HP-1000 约两个月后(五次喷洒HP-1000 之后)开始工业化收获，第一次收获约14天之后进行最后的收获。
TM
[0301] 由第一次收获得到的结果表明，用HP-1000 处理通过增加收获黄瓜的总数而不是单个黄瓜的平均重量而增加了黄瓜平均产量(表45-47)。在最后一次收获中也注意到有TM相同的趋势(表48-49)。在商业上很重要的是，由HP-1000 处理得到的增产并非通过显著增加黄瓜的平均大小获得。
TM
TM
[0302] 表45-HP-1000 处理后第一次收获时黄瓜产量的增加
[0303]1
[0304] 根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。TM
[0305] 表46-HP-1000 处理后第一次收获时黄瓜果实数目的增加
[0306]
[0307] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0308] 表47-HP-1000TM处理后第一次收获时黄瓜的平均重量
[0309]
[0310] 表48-HP-1000TM处理后第三次收获时黄瓜产量的增加
[0311]
[0312] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0313] 表49-HP-1000TM处理后第三次收获时黄瓜果实数目的增加
[0314]
[0315] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0316] 表50-HP-1000TM处理后第三次收获时黄瓜的平均重量
[0317]
[0318] 1根据Duncan氏MRT，后面带有不同字母的平均值在P＝0.05的水平上有显著差异。
[0319] 实施例24-得自丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinpss诱导番茄的生长增强 [0320] 为测试harpinpss(即得自丁香假单胞菌丁香致病变种的过敏反应诱发剂)(He，S.Y.，等人，“丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinpss.通过Hrp途径分泌、并在植物中诱发过敏反应的一种蛋白，”Cell 73：1255-66(1993)，特此通过引用结合到本文中)是否也刺激植物生长，将番茄种子(Marglobe变种)播种在装有人工土壤的8英寸盆中。播种后10天，将幼苗移栽到单独的盆中。试验的整个过程中，植株间的肥料、水灌溉、温度和土壤湿度维持一致。移栽后16天，测量起始株高并第一次施用harpinpss，这一天被称为第0天。第二次施用在第15天进行。在第10天和第30天收集另外的生长数据。在第30天收集的最后一次数据包括株高和鲜重。
[0321] 通过发酵包含带有编码harpinpss的基因(即hrpZ)的质粒的大肠杆菌DH5，产生试验中所用的harpinpss。收获细胞，重悬浮于5mM磷酸钾缓冲液，超声处理进行破碎。将超声处理的材料煮沸5分钟，然后10,000rpm离心10分钟。上清液可被认为是无细胞诱发剂制备物(CFEP)。使用与用来制备细胞悬浮缓冲液的相同缓冲液制备20和50μg/ml harpinpss溶液。由包含相同质粒但不包含hrpZ基因的相同菌株制备的CFEP用作对照处理的材料。
[0322] 将润湿剂Pinene II(Drexel Chemical Co.，Memphis，Tenn.)加入 harpinpss溶液中，达到0.1％的浓度，然后将harpinpss喷洒到番茄植株上直到形成溢流。
[0323] 表51显示在harpinpss处理组和对照组间有显著差异。harpinpss处理的番茄高度增加超过10％。这个数据支持harpinpss与得自解淀粉欧文氏菌的过敏反应诱发剂相似地起作用的说法，因为当其应用于番茄和许多其它植物物种时，具有生长增强的作用。除番茄高度显著增加外，harpinpss处理的番茄的生物量更多、叶子大、花成果(flowerseteing)早以及总体上外观更健康。
[0324] 表51-Harpinpss增强番茄植株的生长
[0325]1
[0326] 株高测量精确至0.5cm。第0天是指记录初始株高并进行第一次施用的那一天。2
[0327] 给出平均值的同时在圆括号中给出了SD(所有处理组的n＝20)。3
[0328] 不同字母(a和b)表明平均值间有显著差别(P＝0.05)。首先用ANOVA，然后用Fisher LSD评估差异。
[0331]
[0332]
[0333]
[0334]
[0335]
[0336]
[0337]
[0338]
[0339]
[0340]
[0341]
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