粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂及制备方法
阅读：477发布：2024-02-15
专利汇可以提供粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种粉虱座壳孢黄色 无纺布 菌剂及制备方法，即高效防治桔园、茶园刺吸式口器 害虫 的 真菌 杀虫剂 ——粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的生产工艺方法。该方法包括五道生产工序，即菌种的取得、一级斜面菌种培养、液体 种子 培养、液体 发酵 罐生产和黄色无纺布菌条的接种培养。本发明生产的杀虫剂，对害虫的防治效果持久，对于桔园和茶园中趋黄习性的粉虱类害虫杀虫效果明显且稳定，受天气影响相对较小，工艺稳定，投资少，占地小，生产无三废问题。，下面是粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂及制备方法专利的具体信息内容。
1.一种粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：制备步骤包括：菌种的取得、一级斜面菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产和无纺布菌条的接种培养；
具体制备步骤包括：
A、菌种的取得:
AsG0910菌株，其保藏号为CGMCC No.3523，分离自柑桔粉虱的粉虱座壳孢（Aschersonia aleyrodis）；
B、一级斜面菌种培养:
将分离纯化的菌种接种于PDA培养基斜面，放入25℃培养箱，培养20-22天，待菌丝长满斜面并产孢时，转入摇瓶进行液体种子培养；
C、液体种子培养:
在500m1三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5 pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40±1℃，在超净工作台内，从斜面菌种子刮取2支培养好的一级斜面菌种的孢子粉到无菌的体积浓度为0.01%的Tween80水溶液中，刮取试管的规格为180mm×15mm，利用高速分散器使孢子分散均匀，然后将该菌悬浮液接液体培养基中，置于恒温振荡培养箱，24-26℃,
160转/分，培养22天即可；
D、液体发酵生产:采用三级发酵；
(1)、一级种子罐生产
取50L气升式发酵罐，装入35 L液体培养基，温度95℃-100℃，并加入消泡剂
10.5m1，在0.15MPa压力下，保压25-40min，消毒冷却后将4瓶步骤（3）培养好的500m1摇瓶种子接入培养，24-26℃，通气量l∶0.5 V/V·min，保压0.05-0.07MPa，经144-168 hr通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；
(2)、二级种子罐生产
取100L气升式发酵罐，装入70L液体培养基，温度95℃-100℃，并加入消泡剂 18m1，在0.15MPa压力下；
保压25-40min，消毒冷却后将一级种子罐种子35L全部接入二级种子罐培养，温度
24-26℃，通气量1:0.5 V/V·min，保压0.05-0.07MPa，经144-168 hr通气培养，达到对数生长期后，接入三级种子罐；
(3)、三级种子罐生产
取1T气升式发酵罐，装入700L液体培养基液体，pH 6.0-7.0，加入的热水温度
95℃-100℃，并加入消泡剂 210m1，通入蒸汽加热到121 ℃，保压30min，冷却至24-26 ℃，将二级种子罐培养好的液体种子70 L全部接入，通气培养，通气量1:0.4-0.5V/V.min，搅拌转速150r/m,罐压0.05-0.07MPa，培养时间312-336 hr；
当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1%以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐；
E、将黄色无纺布条在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入
100L发酵液的比例浸入已培养好的发酵液，在20-28℃，湿度为RH93%的培养室架上平铺培养5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20-28℃，湿度为RH90%的培养室继续培养5-7天，菌条上长满大量孢子，风干即可。
2.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述的斜面培养基液包括: 去皮马铃薯200g，蛋白胨10g,葡萄糖40g,琼脂20g，水l000ml。
3.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述的液体种子培养基包括:在1000m1培养基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10g NaCl，各组分混合后加水补至1000m1，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。
4.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述的气升式发酵罐中的液体培养基包括：在1000m1培养基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10g NaCl，加麸皮煮汁，即在800 ml水中加麸皮60g煮30min，一层纱布过滤，去除残渣，各组分混合后加水补至1000m1，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。
5.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述液体发酵生产步骤中三级发酵过程中采用的消泡剂均为泡敌，用量为培养液，即发酵液总量的0.03%，即35L中加量为10.5m1，70L培养料中加21m1， 700L培养料中加210m1。
6.根据权利要求1所述的粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法，其特征在于：所述的无纺布条，颜色为黄色，长60cm，宽5 cm,厚0.4 cm。
粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂及制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种杀虫真菌的新剂型生产方法，具体地说是一种分离柑桔粉虱的粉虱座壳孢（Aschersonia aleyrodis） AsG0910菌株，能高效防治桔园、茶园刺吸式口器害虫的黄色无纺布菌剂的生产方法。
[0002] 背景技术
[0003] 化学杀虫剂以快速作用方式保护作物免受损失的同时也留下了日益严重的后果，引发了一系列环境和社会问题。害虫抗药性迅速增加，防治成本不断抬高，农业生态环境日趋恶化，环境污染日趋严重，形成了越用药越泛滥，越泛滥越用药的恶性循环。因此，发展生物杀虫剂，应用现代生物技术控制害虫是21世纪农业可持续发展的重要课题。 [0004] 生物制剂中，杀虫真菌制剂作用方式独特，常通过昆虫体壁接触感染致死昆虫。而细菌、病毒等昆虫病原微生物必须经昆虫口器摄入到消化道内才能感染并致死昆虫，因此对一般的咀嚼式口器害虫有效，而无法对作用于将口针插于植物韧皮部吸食汁液的蚜虫类刺吸式口器害虫。由于作用方式独特，杀虫真菌不仅对咀嚼式口器害虫有效，更对刺吸式口器害虫有效。开发和应用真菌生物杀虫剂受到各国的重视。目前世界上开发了蜡蚧轮枝菌、球孢白僵菌、金龟子绿僵菌、拟青霉和粉虱座壳孢等真菌杀虫剂，注册生产了20多个产品。 [0005] 粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis Webber)属丝孢菌类，腔孢纲，球孢目，鲜壳孢科，座壳属，主要侵染粉虱、介壳虫等刺吸式口器害虫，广泛分布于拉丁美洲、南亚和东南亚地区。1921年，美国人Berger发明了一种利用马铃薯大量生产该菌的技术来防治柑桔粉虱(Dialeurodes citri)。然而，由于有人对它们的效果显著性产生怀疑，加上廉价广谱化学杀虫剂的广泛应用，这项研究不久便停顿下来。上世纪60年代化学农药的副作用暴露以后，座壳孢菌在生物防治上的应用又重新得到重视，特别是在东欧和亚洲。20世纪60年代初前苏联从我国和越南等地引进扁座壳孢和粉虱座壳孢等4个种，取得大面积防治柑桔粉虱的良好效果。福建应用挂枝法引进粉虱座壳孢成功防治了柑桔粉虱，10年推广面积达10万亩次。四川、浙江、台湾，还有华南、西南地区的各省相继等推广这一技术，达到明显效果。但是这种人工挂枝法费工、费时，应用上受到时间、地点、条件等因素限制。 [0006] 前苏联利用分生孢子通过固体、双相发酵的方法来进行大规模试验性生产，以商品名Aseronija登记注册。荷兰和前捷克斯洛伐克用芽生孢子通过液体发酵培养进行小规模试验 生产，产品的主成分是芽生孢子，用于温室等场所的粉虱和介壳虫等害虫防治，该菌制剂产品由于效果较慢，对使用环境有一定要求(如高湿度的要求)；在发展过程中，曾受到化学农药的竞争压力影响，导致市场占有率有所下降。我国目前有该菌与化学农药的混合剂的报道(专利200810029251.7“虱座壳孢与高效氯氰菊酯的复配杀虫剂”、专利
200810029250.2“粉虱座壳孢与阿维菌素的复配杀虫剂”、专利200810027583.1“粉虱座壳孢与啶虫脒的复配杀虫剂”、专利200710031518.1“粉虱座壳孢与吡虫啉的复配杀虫剂”)，但是这些化学农药在有机茶园和果园中，仍然是禁用的，况且也会杀伤天敌。 发明内容
200810029250.2“粉虱座壳孢与阿维菌素的复配杀虫剂”、专利200810027583.1“粉虱座壳孢与啶虫脒的复配杀虫剂”、专利200710031518.1“粉虱座壳孢与吡虫啉的复配杀虫剂”)，但是这些化学农药在有机茶园和果园中，仍然是禁用的，况且也会杀伤天敌。 发明内容
[0007] 为了解决上述问题，本发明将生物防治与物理防治结合起来，无纺布菌条与黄色诱虫方法相结合。无纺布作为真菌培养基载体，能保持和满足在无纺布上生长的粉虱座壳孢孢子萌发所需的湿度；黄色能引诱害虫，增加与真菌孢子的接触机会，增强侵染，造成害虫流行病的发生，以控制害虫种群。本发明提供一种对于桔园和茶园中具趋黄习性的粉虱类刺吸式口器害虫有良好杀灭效果的粉虱座壳孢黄色无纺布菌条生产工艺方法。 [0008] 本发明粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂：所述菌剂以粉虱座壳孢为有效成分，将粉虱座壳孢菌株经过培养、发酵后后的发酵液中浸入无纺布条，并在无纺布条上培养出孢子得到粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂。
[0009] 本发明粉虱座壳孢黄色无纺布菌剂的制备方法：制备步骤包括：菌种的取得、一级斜面菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产和无纺布菌条的接种培养。 [0010] 本发明中所用到的菌种为粉虱座壳孢菌株AsG0910菌株，该菌株已经于2009年12月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3523，分离自柑桔粉虱的粉虱座壳孢[Aschersonia aleyrodis]，分类命名Aschersonia aleyrodis。
[0011] 该粉虱座壳孢菌株AsG0910菌株2009年10月从江西省赣州市郊柑桔园的柑桔上柑桔粉虱分离，通过如下分离方法，经分离纯化而获得，经分离纯化而获得。 [0012] 分离方法：在Kenji Kitazawa等(1984)方法上加以改进，即：首先将子座切成约1mm的均匀、整齐的薄片，于75％酒精中浸10s左右，取出用无菌水漂洗3次，每次约3min至5min，放置于含2％的青霉素和4％的链霉素的PDA平板中，每平板可放置4个薄片，培养2d后，观察生长状况；若薄片上已长出白色菌丝，而薄片周围有杂菌长出，用手术刀小心地将薄片从原平板移到新平板中继续培养；若薄片部分已被杂菌覆盖，用无菌手术刀小心切下白色菌丝于新平板培养；若无杂菌出现，则将薄片保留在原平板培养。培养至产孢(7d左右)，于新平板划线，挑单斑转接到斜面保存。
[0013] Kenji Kitazawa 等 (1984) 方 法：Kenji Kitazawa，Ichiro Fujisawa andShun-ichi Imabayashi(1984).Isolation of(Verticillium)lecanii(Zimm.)Viegasaffecting aphids and greenhouse whitefly in Japan.Ann.Phytopath.Soc.Japan，50，574-581。
[0014] 由于虫生真菌具有可观的扩散效果，较长的土壤宿存能力，独特的体壁侵染方式，以及害虫抗性发展缓慢和容易生产等显著优点，而且毒力测定的结果证明以粉虱座壳孢为代表的真菌杀虫剂对桔园、茶园刺吸式口器害虫如各种粉虱等有强大的毒力。只要选择良好的施用方式和正确的剂型，就能取得优于其他生物或化学农药无可比拟的良好效果。 [0015] 本发明工艺生产的黄极无纺布菌条剂型具有独特的先进性：一是对害虫的防治效果持久。由于无纺布上的真菌孢子生存活性远高于孢子粉，而且，真菌还可以利用无纺布上的营养不断生长产孢，孢子存活力明显加长，有利于杀灭害虫；二是无纺布真菌菌条剂型在田间寿命很长，受天气影响相对较小。无纺布上的孢子主要是靠飘移而接触虫体的，与昆虫接触的机会相对较多：环境中有利因子出现的时间较长，只要条件具备就会侵染害虫，受环境制约的幅度较小；三是黄色引诱害虫，增加无纺布上的孢子与昆虫接触的机会；四是本发明工艺生产的粉虱座壳孢菌是条针对桔园、茶园刺吸式口器害虫如各种粉虱，杀虫效果明显且稳定；五是本发明生产工艺不复杂、工艺稳定、易调控、成功率高。六是投资少，占地小、无三废问题，尤其适于甲小企业采用。
具体实施方式
[0016] 具体制备步骤包括：
[0017] A、菌种的取得：
[0018] AsG0910菌株，其保藏号为CGMCC No.3523，分离自柑桔粉虱的粉虱座壳孢[Aschersoniaaleyrodis]
[0019] B、一级斜面菌种培养：
[0020] 将分离纯化的菌种接种于PDA培养基斜面，放入25℃培养箱，培养20-22天，待菌丝长满斜面并产孢时，转入摇瓶进行液体种子培养；
[0021] C、液体种子培养：
[0022] 在500ml三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40±1℃，在超净工作台内，从斜面菌种子刮取2支培养好的一级斜面菌种的孢子粉到无菌的体积浓度为0.01％的Tween80水溶液中，刮取试管的规格为180mm×15mm，利用高速分散器使孢子分散均匀，然后将该菌悬浮液接液体培养基中，置于恒温振荡培养箱，24-26℃， 160转/分，培养22天即可；
[0023] D、液体发酵生产：采用三级发酵。
[0024] (1)、一级种子罐生产
[0025] 取50L气升式发酵罐，装入35L液体培养基，温度95℃-100℃，并加入消泡剂(泡敌)10.5ml，在0.15MPa压力下，保压25-40min，消毒冷却后将4瓶步骤(3)培养好的500ml摇瓶种子接入培养，24-26℃，通气量1∶0.5V/V·min，保压0.05-0.07MPa，经144-168hr通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；
[0026] (2)、二级种子罐生产
[0027] 取100L气升式发酵罐，装入70L液体培养基，温度95℃-100℃，并加入消泡剂(泡敌)18ml，在0.15MPa压力下。保压25-40min，消毒冷却后将一级种子罐种子35L全部接入二级种子罐培养，温度24-26℃，通气量1∶0.5V/V·min，保压0.05-0.07MPa，经144-168hr通气培养，达到对数生长期后，接入三级种子罐；
[0028] (3)、三级种子罐生产
[0029] 取1T气升式发酵罐，装入700L液体培养基液体，pH 6.0-7.0，加入的热水温度95℃-100℃，并加入消泡剂(泡敌)210ml，通入蒸汽加热到121℃，保压30min，冷却至
24-26℃，将二级种子罐培养好的液体种子70L全部接入，通气培养，通气量1∶0.4-0.5V/V.min，搅拌转速150r/m，罐压0.05-0.07MPa，培养时间312-336hr；
24-26℃，将二级种子罐培养好的液体种子70L全部接入，通气培养，通气量1∶0.4-0.5V/V.min，搅拌转速150r/m，罐压0.05-0.07MPa，培养时间312-336hr；
[0030] 当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1％以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐； [0031] E、将黄色无纺布条在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入100L发酵液的比例浸入已培养好的发酵液，在20-28℃，湿度为RH93％的培养室架上平铺培养5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20-28℃，湿度为RH90％的培养室继续培养5-7天，菌条上长满大量孢子，风干即可。
[0033] 所述的液体种子培养基包括：在1000ml培养基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10g NaCl，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和Na0H水溶液调pH至7.0。
[0034] 所述的气升式发酵罐中的液体培养基包括：在1000ml培养基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10g NaCl，加麸皮煮汁，即在800ml水中加麸皮60g煮30min，一层纱布过滤，去除残渣，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。
[0035] 所述的消泡剂为泡敌，用量为培养液，即发酵液总量的0.03％，即35L中加量为10.5ml，70L培养料中加21ml，700L培养料中加210ml。
[0036] 所述的无纺布条，颜色为黄色，长60cm，宽5cm，厚0.4cm。
[0037] 以下为本发明的几个实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。 [0038] 实施例1
[0039] 该粉虱座壳孢无纺布菌条生产工艺方法，包括五道生产工序：
[0040] 1、菌种：
[0041] AsG0910菌株，其保藏号为CGMCC No.3523，分离自柑桔粉虱的粉虱座壳孢[Aschersoniaaleyrodis]
[0042] 2、一级斜面菌种培养：
[0043] 将分离纯化的菌种接种于PDA培养基斜面，放入25℃培养箱，培养20-22天，待菌丝长满斜面并产孢时，转入摇瓶培养；
[0044] 3、液体种子培养：
[0045] 在500ml三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40℃左右，在超净工作台内，从斜面菌种子刮取2支培养好的一级斜面菌种(试管规格180mm×15mm)的孢子粉到无菌Tween80(体积浓度0.01％)水中，利用高速分散器使孢子分散均匀，然后将该菌悬浮液接液体培养基中，置于恒温振荡培养箱，24-26℃，160转/分，培养22天即可；
[0046] 4、液体发酵生产：该工序分为三个步骤即采用三级发酵
[0047] (1)、一级种子罐生产
[0048] 取50L气升式发酵罐，装入35L液体培养基，温度95℃，并加入消泡剂泡敌10.5ml，在0.15MPa压力下，保压25-40min，消毒冷却后将4瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养，24-26℃，通气量1∶0.5，保压0.05-0.07MPa，经144-168hr通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；
[0049] (2)、二级种子罐生产
[0050] 取100L气升式发酵罐，装入70L液体培养基，温度95℃，并加入消泡剂泡敌18ml，在0.15MPa压力下。保压25-40min，消毒冷却后将一级种子罐种子35L全部接入二级种子罐培养，温度24-26℃，通气量1∶0.5，保压0.05-0.07MPa，经144-168hr通气培养，达到对数生长期后，接人三级种子罐；
[0051] (3)、三级种子罐生产
[0052] 取1T气升式发酵罐，装入700L液体培养基液体，pH 6.0-7.0，加入的热水温度95℃，并加入消泡剂泡敌210ml，通入蒸汽加热到121℃，保压30min，冷却至24-26℃，将二级种子罐培养好的液体种子70L全部接入，通气培养，通气量1∶0.4-0.5V/V.min，搅拌转速150r/m，罐压0.05-0.07MPa，培养时间312-336hr；
[0053] 当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1％以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐； [0054] 5、菌条灭菌及接种培养
[0055] 将黄色无纺布条在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入100L发酵液的比例接(浸)入已培养好的发酵液，在20-28℃，RH93％的培养室架上平铺培养5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20-28℃，RH90％的培养室继续培养5-7天，菌条上长满大量孢子，风干即可。
[0056] 实施例2
[0057] A、菌种的取得：
[0058] AsG0910菌株，其保藏号为CGMCC No.3523，分离自柑桔粉虱的粉虱座壳孢[Aschersoniaaleyrodis]
[0059] B、一级斜面菌种培养：
[0060] 将分离纯化的菌种接种于PDA培养基斜面，放入25℃培养箱，培养20天，待菌丝长满斜面并产孢时，转入摇瓶进行液体种子培养；
[0061] C、液体种子培养：
[0062] 在500ml三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40±1℃，在超净工作台内，从斜面菌种子刮取2支培养好的一级斜面菌种的孢子粉到无菌的体积浓度为0.01％的Tween80水溶液中，刮取试管的规格为180mm×15mm，利用高速分散器使孢子分散均匀，然后将该菌悬浮液接液体培养基中，置于恒温振荡培养箱，24℃，160转/分，培养22天即可；
[0063] D、液体发酵生产：采用三级发酵。
[0064] (1)、一级种子罐生产
[0065] 取50L气升式发酵罐，装入35L液体培养基，温度95℃，并加入消泡剂泡敌10.5ml，在0.15MPa压力下，保压25min，消毒冷却后将4瓶步骤(3)培养好的500ml摇瓶种子接入培养，24℃，通气量1∶0.5V/V·min，保压0.05MPa，经144hr通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；
[0066] (2)、二级种子罐生产
[0067] 取100L气升式发酵罐，装入70L液体培养基，温度95℃，并加入消泡剂泡敌18ml，在0.15MPa压力下。保压25min，消毒冷却后将一级种子罐种子35L全部接入二级种子罐培养，温度24℃，通气量1∶0.5V/V·min，保压0.05MPa，经144hr通气培养，达到对数生长期后，接人三级种子罐；
[0068] (3)、三级种子罐生产
[0069] 取1T气升式发酵罐，装入700L液体培养基液体，pH 6.0，加入的热水温度95℃，并加入消泡剂泡敌210ml，通入蒸汽加热到121℃，保压30min，冷却至24℃，将二级种子罐培养好的液体种子70L全部接入，通气培养，通气量1∶0.4V/V.min，搅拌转速150r/m，罐压0.05MPa，培养时间312hr；
[0070] 当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1％以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐； [0071] E、将黄色无纺布条在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入100L发酵液的比例浸入已培养好的发酵液，在20℃，湿度为RH93％的培养室架上平铺培养
5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20℃，湿度为RH90％的培养室继续培养5天，菌条上长满大量孢子，风干即可。
5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20℃，湿度为RH90％的培养室继续培养5天，菌条上长满大量孢子，风干即可。
[0072] 斜面培养基液包括：去皮马铃薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂20g，水1000ml。
[0073] 液体种子培养基包括：在1000ml培养基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10g NaCl，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。
[0074] 气升式发酵罐中的液体培养基包括：在1000ml培养基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10gNaCl，加麸皮煮汁，即在800ml水中加麸皮60g煮30min，一层纱布过滤，去除残渣，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。
[0075] 消泡剂为泡敌，用量为培养液，即发酵液总量的0.03％，即35L中加量为10.5ml，70L培养料中加21ml，700L培养料中加210ml。
[0076] 无纺布条，颜色为黄色，长60cm，宽5cm，厚0.4cm。
[0077] 实施例3
[0078] A、菌种的取得：
[0079] AsG0910菌株，其保藏号为CGMCC No.3523，分离自柑桔粉虱的粉虱座壳孢[Aschersoniaaleyrodis]
[0080] B、一级斜面菌种培养：
[0081] 将分离纯化的菌种接种于PDA培养基斜面，放入25℃培养箱，培养22天，待菌丝长满斜面并产孢时，转入摇瓶进行液体种子培养；
[0082] C、液体种子培养：
[0083] 在500ml三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40±1℃，在超净工作台内，从斜面菌种子刮取2支培养好的一级斜面菌种的孢子粉到无菌的体积浓度为0.01％的Tween80水溶液中，刮取试管的规格为180mm×15mm，利用高速分散器使孢子分散均匀，然后将该菌悬浮液接液体培养基中，置于恒温振荡培养箱，26℃，160转/分，培养22天即可；
[0084] D、液体发酵生产：采用三级发酵。
[0085] (1)、一级种子罐生产
[0086] 取50L气升式发酵罐，装入35L液体培养基，温度95℃，并加入消泡剂泡敌10.5ml，在0.15MPa压力下，保压25min，消毒冷却后将4瓶步骤(3)培养好的500ml摇瓶种子接入培养，26℃，通气量1∶0.5V/V·min，保压0.07MPa，经168hr通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；
[0087] (2)、二级种子罐生产
[0088] 取100L气升式发酵罐，装入70L液体培养基，温度95℃，并加入消泡剂泡敌18ml，在0.15MPa压力下。保压40min，消毒冷却后将一级种子罐种子35L全部接入二级种子罐培养，温度26℃，通气量1∶0.5V/V·min，保压0.07MPa，经168hr通气培养，达到对数生长期后，接人三级种子罐；
[0089] (3)、三级种子罐生产
[0090] 取1T气升式发酵罐，装入700L液体培养基液体，pH 7.0，加入的热水温度95℃，并加入消泡剂泡敌210ml，通入蒸汽加热到121℃，保压30min，冷却至26℃，将二级种子罐培养好的液体种子70L全部接入，通气培养，通气量1∶0.5V/V.min，搅拌转速150r/m，罐压0.07MPa，培养时间336hr；
[0091] 当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1％以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐； [0092] E、将黄色无纺布条在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入100L发酵液的比例浸入已培养好的发酵液，在28℃，湿度为RH93％的培养室架上平铺培养
5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在28℃，湿度为RH90％的培养室继续培养7天，菌条上长满大量孢子，风干即可。
5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在28℃，湿度为RH90％的培养室继续培养7天，菌条上长满大量孢子，风干即可。
[0093] 斜面培养基液包括：去皮马铃薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂20g，水1000ml。
[0094] 液体种子培养基包括：在1000ml培养基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10g NaCl，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。
[0095] 气升式发酵罐中的液体培养基包括：在1000ml培养基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10gNaCl，加麸皮煮汁，即在800ml水中加麸皮60g煮30min，一层纱布过滤，去除残渣，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和NaOH水溶液调pH至7.0。
[0096] 消泡剂为泡敌，用量为培养液，即发酵液总量的0.03％，即35L中加量为10.5ml，70L培养料中加21ml，700L培养料中加210ml。
[0097] 无纺布条，颜色为黄色，长60cm，宽5cm，厚0.4cm。
[0098] 使用效果实施例
[0099] 座壳孢菌AsG0910无纺布菌剂的使用过程和防治柑桔粉虱的效果
[0100] 试验所用的桔园为典型山丘桔园，桔垅(宽约1.52.0m)呈阶梯状分布，坡度约45度，坡底至坡顶高约30m。这类桔园在南方丘陵柑桔种植区非常典型，常受柑桔粉虱为害。8 2
所用菌剂为LFZ0408黄色无纺布菌条，平均含孢量为3.9×10 孢子/cm，将菌条悬挂在柑桔树上，每棵树东、南、西、北、中五个方向悬挂，每个方位分上下两个部位，每棵树挂10条无纺布菌条。处理1，10棵树每棵树挂10条黄色无纺布菌；处理2，20棵树每棵树挂10条
7
白色无纺布菌；处理3，每棵树4喷LFZ0408菌株孢子悬浮液菌剂，孢子浓度为1.9×10 孢子/mL；对照区不作任何处理。3个重复，每个重复0.167亩。
所用菌剂为LFZ0408黄色无纺布菌条，平均含孢量为3.9×10 孢子/cm，将菌条悬挂在柑桔树上，每棵树东、南、西、北、中五个方向悬挂，每个方位分上下两个部位，每棵树挂10条无纺布菌条。处理1，10棵树每棵树挂10条黄色无纺布菌；处理2，20棵树每棵树挂10条
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白色无纺布菌；处理3，每棵树4喷LFZ0408菌株孢子悬浮液菌剂，孢子浓度为1.9×10 孢子/mL；对照区不作任何处理。3个重复，每个重复0.167亩。
[0101] 3周后，按照东、南、西、北四个方向，每个方向分上、中、下三个层次计数虫口密度，以药后虫口减退率计算校正防效，并用新复极差进行显著性测定。
[0102] 退减率(％)＝[(药前虫口基数-处理后虫口数)/药前虫口基数]×100 [0103] 校正防效(％)＝[(处理区减退率-对照区减退率)/(100-对照区减退率)]×100
[0104] 感染率的估计：随机取5棵树，每棵树按照东、南、西、北四个方向，每个方向分上、中、下三个层次，各采2片(共24片/树)嫩叶，带回室内镜检，统计柑桔粉虱数亡虫数，将死虫移出放于盛有湿吸水纸的培养皿内的载玻片上，25℃保湿培养，以虫体表而长出座壳孢菌子座为有效致死，统计有效致死虫数，感染率(％)＝有效致死虫数/柑桔粉虱数亡虫数×100。
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