(一)技术领域

本发明涉及厌氧微生物应用技术的改进，具体讲是一种生物制剂——非特 异免疫激活剂的制备方法，其属于生物工程技术领域。

(二)背景技术

在当前的水产养殖中，普遍存在过度追求产量、忽视质量的现象。结果导 致养殖密度过大，水质污染加重，从而造成病害时常发生，特别是近几年来， 水产养殖动物中病毒病大规模暴发，给水产养殖业造成了巨大损失。因此控制 疾病的发生对水产养殖业可持续发展具有重要意义。在水产病害防治领域中， 传统上是采用抗生素来防治和控制病害的发生。这样的传统做法存在诸多弊端， 如滥用抗生素而造成抗生素污染，进而使病害生物产生抗药性，或者由于滥用 药物，而造成药物残留超标等负面效应。单纯靠抗生素药物对防治病毒病是根 本没有效果的。再由于水产养殖动物的自身免疫的非特异性特点，特别是虾贝 类皆为无脊椎动物，因此不具有特异性免疫系统，不能针对特定的病原产生抗 体。因而在水产病害防治中，几乎不能应用疫苗来防治水产养殖动物的病毒病。 用现有的技术方法防治病毒病存在缺陷。在水产养殖中，有关免疫激活剂的研 究与应用，在国际上目前都还处在初始阶段，许多技术不成熟，且缺乏有效的 技术指标来评价其应用的效果。如日本全国农业协同组合连合会公开的“甲壳 动物的饲料和饲料添加剂”(ZL95104855.4)，其主要利用细菌肽聚糖、维生素 E和维生素C之间的配伍，将三者按一定比例添入饲料中，发现可以提高甲壳 动物的对病原微生物的抗感染能力，主要表现在血细胞的吞噬活力，及提高在 弧菌感染条件下的存活率。实际维生素本身也具有上述作用功能。用上述配方 进行抗病毒实验时，发现在病毒感染条件下，实验组与对照组死亡率不存在显 著的差别(P＞0.05)，表明其作用效果不理想。再者，ZL95104855.4文献仅笼统 地介绍了细菌肽聚糖的制得信息，对于细菌肽聚糖的提取信息仅笼统地披露： “将由培养肉汤中分离出来的细菌细胞进行声处理，并用表面活性剂溶液纯 化。”

据文献报道：细菌等原核生物的细胞壁内含有一类由聚糖链、肽亚单位和 间肽桥(interpeptide bridge)组成的大分子聚合物即肽聚糖。细菌细胞壁内完 整的肽聚糖是由氨基糖骨架和肽链组成。它的一级结构为：N-乙酰葡糖胺(G) 和N-乙酰胞壁酸(M)残基以β-1，4键交替连接形成聚糖股，每股含10-65个 二糖单位。胞壁酸是氨基葡萄糖的乳酰醚(lactyether)，其乳酰基部分和由4 个氨基酸分子组成的肽链相连(杨秀山1982)。肽聚糖中连接在N-乙酰胞壁酸 上的肽链之间，一般是由一条链的第4个氨基酸的羧基和另一条相邻的链的第 3个氨基酸的自由氨基以肽键交联(间肽桥)，间肽桥多由1-6个氨基酸分子的 残基组成。不同的肽聚糖中出现的氨基酸数是有限的，亚肽单位及间肽桥上氨 基酸的组成及排列上的不同，决定了肽聚糖种类的多样性(和致中1992)。不同 的原核生物，其细胞壁内的肽聚糖的组成有特异性，肽聚糖被水解后，它的活 性常会增加。未见更详细的关于肽聚糖提取方法的文献报道。

(三)发明内容：

本发明的目的是提供一种非特异免疫激活剂(以下简称：NSI)及其制备方 法，其可以通过口服或人工注射的方法，达到能够有效的广泛的提高水产养殖 动物的非特异免疫力，增强生物抗病力，促进健康生长之效果。本非特异免疫 激活剂均能有效的提高鱼类、虾类及贝类的非特异性免疫，增强对各类病原的 抵抗力，具体讲是提高抗病毒性疾病、细菌性疾病、真菌类疾病及寄生虫感染， 提高水产养殖动物的养殖成活率，减少抗生素用量，提高水产品质量。保护生 态环境及人民健康。制成的非特异免疫激活剂产品为纯生物制品，使用安全， 对生物及环境没有任何污染，能混合后添加到养殖用饲料中或喷洒于饵料表面， 也能用于水产养殖动物的育苗水体内，能与其它饲料添加剂或药物配伍。

本发明的目的是由以下技术方案完成，研制了一种非特异免疫激活剂的制 备方法，包括经厌氧发酵培养，再从发酵液中分离收集菌体，获取菌体细胞壁 中的活性非特异免疫激活制剂的过程。所述发酵培养的菌种是双歧杆菌DSM 20210，或双歧杆菌ATCC25866，或双歧杆菌ATCC25867，或双歧杆菌ATCC25525； 所述获取菌体细胞壁中的活性非特异免疫激活制剂的过程是：

(1).收集菌体：取发酵完成的菌液，经4000-8000g(离心力F单位英文缩 写)、4℃的离心处理20-30分钟，弃去上清液，保留收集的该菌体沉淀，再用 0.8％生理盐水洗涤至该菌体为白色；

(2).裂解细胞：按1∶4(g/ml)的比例，将白色的该菌体与细胞裂解剂混 合，并置入95℃水浴中，恒温处理且连续搅拌1小时，再立即冷却至室温，并 用双蒸水彻底洗涤；

(3).四次洗涤离心除去裂解剂：用浓度梯度的甲醇水溶液对经(2).步处理 的菌体，分别进行三次洗涤、离心处理，其中离心是以5000-6000g，分步按浓 度梯度洗涤处理；之后用丙酮洗涤，且经4000-5000g的离心处理，再将收集的 该菌体沉淀进行0～4℃的低温干燥处理；

(4).水解预处理：将(3).中得到的干燥产物，按每500g该产物加1 L的pH6.2 磷酸盐缓冲液和0.3gEDTA液的比例，配制混合液，保持恒温80℃达4小时，再 冷却至37℃；

(5).酶解处理：向(4).中冷却的混合液中加入适量1-5g/L的溶菌酶，保持 恒温37℃下作用24小时；之后补加1-3g/L的溶菌酶，37℃下处理12小时；

(6).再次酶解处理：用适量2-5g/L的蛋白酶加入到溶菌的该混合液中，在 50℃温度下处理24小时，即得到含有效活性浓度为0.4-0.8％的寡糖肽类和含有 丙氨酸∶谷氨酸∶赖氨酸∶甘氨酸的摩尔数比＝3∶1∶1∶1的组合物，该组合 物是具有淡甜香气味的黄褐色液体——非特异免疫激活剂主料制剂；

或将该黄褐色液体干燥处理，即得到性状具有特殊甜香气味的，深褐色的 粘稠物——含有效浓度为4-8％的寡糖肽类活性成分的和含有丙氨酸∶谷氨酸∶ 赖氨酸∶甘氨酸的摩尔数比＝3∶1∶1∶1的组合物——非特异免疫激活剂粗品 制剂。

所述的(2).步中的细胞裂解剂，其是非离子型表面活性剂。

所述的非离子型表面活性剂，其或是0.5％TritonX100，或是2％SDS。

所述的(3).步中浓度梯度的甲醇水溶液，其梯度浓度为30％、70％、100％， 或为20％、60％、100％。

所述的(6).中的蛋白酶，其或是木瓜蛋白酶，或是链霉蛋白酶。

所述非特异免疫激活剂主料制剂的使用方法是：将所述的非特异免疫激活 剂主料制剂直接按以下重量比与辅料混合，之后，根据生产需求，添加适量浓 度的上述混合物于饲料原料中，经饲料加工机，加工成水产动物口服的养殖饲 料：

组分                                             重量比

非特异免疫激活剂主料制剂                       100——1000份；

促吸收剂                                       0.5——2000份；

免疫协同剂                                     0.5——500份；

诱食剂                                         1——3000份。

所述的促吸收剂为：脱氧胆酸钠(NaDC)或/和为脑磷脂(CE)；所述的免疫协 同剂为：或为亚硒酸钠，或/和为维生素A，或/和为维生素C；所述的诱食剂， 其为苷氨酸三甲丙脂，或为甜菜碱。

本发明所述非特异免疫激活制剂的另一种制备方法也是：获取菌体细胞壁 中的活性非特异免疫激活制剂成分，其过程是：

(1).收集菌体：取发酵完成的菌液，经5000-8000g、4℃的离心处理20- 30分钟，弃去上清液，保留收集的该菌体沉淀，再用0.8％生理盐水洗涤并以 6000～8000g离心处理，得到白色的湿菌体；

(2).恒温水浴：将收集的该湿菌体100g于65℃水浴，恒温处理40分钟，之 后冷却至室温；

(3).裂解细胞：按1∶4(g/ml)的比例，将冷却至室温的该湿菌体与细胞裂 解剂混合，并置入95℃水浴1小时，连续搅拌，之后立即冷却至室温，并用双 蒸水彻底洗涤；

(4).四次洗涤、离心除去裂解剂：用浓度梯度的甲醇水溶液对经(3).步处理 的该湿菌体，分别进行洗涤、5000-6000g离心的分步梯度浓度处理；之后用丙 酮洗涤，经4000-5000g的离心处理，再将收集的该菌体沉淀进行0～4℃的低温 干燥处理；

(5).酶解除核酸：将(4).中得到的干燥该菌体沉淀加入300ml的含脱氧核糖 核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)的pH7.2的三羟甲基氨基甲烷—盐酸 (Tris·HCl)缓冲液；在37℃恒温下，孵育24小时；再经5000-6000g、4℃ 离心处理40分钟，收集该菌体沉淀；

(6).酶解除杂蛋白：用含量2mg/ml的胰蛋白酶和含量0.5mg/ml的α-糜蛋 白酶的三羟甲基氨基甲烷—盐酸(Tris·HCl)缓冲液300ml，加入到(5).中处 理的该菌体沉淀中，并在37℃恒温下，消化24小时；再以5000-6000g、4℃ 离心处理40分钟，收集的该菌体沉淀；

(7).二次酶解除去杂蛋白：用150ml的含5mg/ml的胃蛋白酶的0.01M盐酸 溶液，处理(6).中收集的该菌体沉淀，后经5000-6000g、4℃离心处理40分钟， 收集的该菌体沉淀；再用300ml的含量5mg/ml的蛋白酶E的三羟甲基氨基甲 烷—盐酸(pH7.4的Tris·HCl)缓冲液，在37℃恒温下消化处理24小时；最 后以5000-6000g、4℃离心处理40分钟，收集该菌体沉淀；

(8).三步脱脂：将上述蛋白酶消化过的收集该菌体，再经以下三步处理：

①.加300ml甲醇，以5000g、4℃离心处理40分钟，弃去上清液；

②.加300ml甲醇∶氯仿的混合液(1∶1 V/V)，以5000g、4℃离心处理40 分钟，弃去上清液；

③.加300ml氯仿洗涤，再以5000g、4℃离心处理40分钟，弃去上清液；

(9).透析处理：将上述(8).中③步的提取物在0～4℃下干燥处理，再用200ml 的含量1mg/ml的蛋白酶E的三羟甲基氨基甲烷—盐酸(pH7.4的Tris·HCl) 缓冲液处理干燥的提取物；在37℃恒温下处理24小时；再将恒温处理的该提 取物装入透析袋内，用蒸馏水连续透析50小时；

(10).脱盐透析处理：将上述透析袋内的产物加入：50ml、0.05M的盐酸，且 在85℃下处理5分钟，之后立即冷却至室温；再以10000-12000g、4℃离心处 理30分钟，收集该菌体沉淀；再用水透析5天，之后将该菌体沉淀冻干保存；

(11).糖蛋白水解：将(10).中获得的冻干产物，按产物重量/缓冲液体积为1∶5 的比例，加入pH6.2的磷酸盐缓冲液，再加入适量1-3g/L的溶菌酶和0.1g/L EDTA 液，在37℃恒温下处理24小时；之后用1-5g/L的链霉蛋白酶，或用精制木瓜 酶，50℃水解处理24小时；

(12).水透析干燥处理：将上述水解处理液于蒸馏水中透析50小时，在0℃下 低温干燥，即得注射用非特异免疫激活剂干粉制剂，该干粉的性状：含活性成 份寡糖肽类大于95％，糖含量40-49％，干粉制剂品外观呈白色粉末，水溶液浑 浊。

所述非特异免疫激活剂的另一种制备方法中，所述的(3).步中细胞裂解剂 是0.5％浓度的TritonX100，或是2％SDS；所述的(4).步中浓度梯度的甲醇水溶 液，其浓度梯度为30％、70％、100％，或为20％、60％、100％。

所述非特异免疫激活剂另一种注射用干粉制剂的使用方法是：将所述的注 射用干粉制剂是用生理盐水稀释1000倍(W/V)，在121℃下灭菌15分钟，于- 20℃下冰箱存放；按每公斤鱼体重的注射量为：50——150μl/Kg。

本发明的优点在于：

A)通过应用本非特异免疫激活剂主料制剂或粗料制剂作为鱼、虾、贝类的 饲料添加剂，用于激活养殖生物的非特异免疫力，从而达到促进对鱼、虾、贝 类的抗病原生物(细菌、病毒、寄生虫)的感染力，促进了鱼、虾、贝类的生 长发育，提高了饲料转化率，加强了贝类、虾等育苗期变态成活率。具体效果 如下：

(1)本发明的免疫激活剂制剂促对虾抗病毒病养殖实验结果，见表1-表3：

表1南美白对虾摄食添加免疫激活剂制剂的饵料30后，

抗病毒感染情况(对虾体长6-9cm)：   NSI添加量(克/吨饲料)   对虾数 养殖30天后开始感染感染20天后的存活率(％)     20     100     28     100     100     43     500     100     70     0     100     0

(2)本发明的免疫激活剂制剂促中国对虾生长实验结果：

表2  养殖中国对虾30天后，对虾体长增长率(对虾体长4-6cm)：     NSI添加量     (克/吨饲料)     对虾数 30天后的体长增长率     (％)     20     100     18     100     100     25     500     100     40     0     100     15

(3)免疫激活剂促日本对虾非特异免疫因子活力实验结果：

   表3养殖日本对虾30天后，对虾体液中酚氧化酶、碱性磷酸酶、

   酸性磷酸活力及凝集活力(对虾体长9-11cm) NSI添加量 (克/吨饲     料)   酚氧化酶     活力  碱性磷酸酶活力     (金氏单位/     100ml) 酸性磷酸酶活(金 氏单位/100ml)     凝集活     力     20     100     15.1     5.2     1∶64     100     320     20.6     7.9     1∶128     500     502     35.0     10.4     1∶256     0     64     8.4     43     1∶64

B)本发明制备的非特异免疫激活剂(NSI)另一种注射用干粉制剂作为鱼类、 甲鱼等水生脊椎动物注射用激活剂。其(NSI)有增强鱼类头肾细胞吞噬活力、溶 菌酶活力等作用。尤其是该注射用激活剂注射用于甲鱼，其效果有明显地增强 甲鱼的巨噬细胞的吞噬功能，增加甲鱼生长速度。还有该注射用激活剂注射用 于罗非鱼，其效果有明显地增强罗非鱼对爱德华氏菌的抵抗力。该注射用激活 剂还可增强虹鳟鱼、真鲷等鱼类的抗弧菌感染力。见图1：不同剂量的非特异免 疫激活剂注射罗非鲱鱼后，用爱德华氏菌进行感染实验后，8天内各组的成活率。

(四)附图及其实施例

本发明的实施例不能限制本发明的权利保护范围，但可以支持本发明的权 利保护范围。

图1为非特异免疫激活剂注射养殖鱼再感染爱德华氏菌后的成活率曲线图。

本发明所使用的菌种是由本申请人的实验室收藏，是一种双歧杆菌DSM 20210，也适用于双歧杆菌ATCC25866及适用于双歧杆菌ATCC25867， ATCC25525。

本发明的厌氧细菌发酵条件如下：

培养基：葡萄糖10g，乳糖10g，胰蛋白胨10g，酵母膏6g，牛肉膏6 g，MgSO4·2H2O 0.2g，Na2HPO4·12H2O 10g，KH2PO4 6g，加蒸馏水至1000ml， 用NaOH调pH至7.0；灭菌116℃，20min；发酵时间20小时，发酵完成时pH＝4.2 -4.6，细菌浓度约在5×108～9×109cfu/ml。

本发明所述提取菌体细胞壁中的活性非特异免疫激活制剂的过程是：

(1).收集菌体：取发酵完成的菌液，经4000-8000g、4℃的离心处理20- 30分钟，弃去上清液，保留收集的该菌体沉淀，再用0.8％生理盐水洗涤至该菌 体为白色；

(2).裂解细胞：按1∶4(g/ml)的比例，将白色的该菌体与细胞裂解剂— —非离子型表面活性剂中的TritonX100混合，并置入95℃水浴中，恒温处理且 连续搅拌1小时，再立即冷却至室温，并用双蒸水彻底洗涤；

(3).四次洗涤离心去除裂解剂：用浓度梯度为30％、70％、100％的甲醇水溶 液对经(2).步处理的该菌体，进行三次洗涤、离心处理，其中离心是以5000- 6000g，分步按浓度梯度洗涤处理；之后用丙酮洗涤，且经4000-5000g的离心 处理，再将收集的该菌体沉淀进行0～4℃的低温干燥处理；

(4).水解预处理：将(3).中得到的干燥产物，取每500g该产物加1L的pH6.2 磷酸盐缓冲液和0.3gEDTA液的比例，配制混合液，且保持80℃恒温达4小时， 再冷却至37℃；

(5).酶解处理：在(4).中冷却的该混合液中加入适量1-5g/L的溶菌酶，且 恒温37℃下处理24小时；之后加1-3g/L的溶菌酶，37℃下处理24小时；

(6).再次酶解处理：用适量2-5g/L的蛋白酶(或是木瓜蛋白酶，或是链霉 蛋白酶)加入到溶菌的该混合液中，在50℃温度下处理24小时，即得到含有 0.4-0.8％的活性寡糖肽类和含有丙氨酸∶谷氨酸∶赖氨酸∶甘氨酸的摩尔数比 ＝3∶1∶1∶1的组合物，该组合物是具有淡甜香气味的黄褐色液体——非特异 免疫激活剂主料制剂；

或将该黄褐色液体干燥处理，即得到具有特殊甜香气味的，深褐色性状的 粘稠物——含有4-8％的寡糖肽类活性成分的和含有丙氨酸∶谷氨酸∶赖氨酸∶ 甘氨酸的摩尔数比＝3∶1∶1∶1的组合物——非特异免疫激活剂粗品制剂。

在本发明的非特异免疫激活剂中，其具有生物活性的物质主要是来自细菌 细胞壁中的肽聚糖，该肽聚糖分子量的大小与其生物活性密切相关。采用本发 明中所述的生化提取技术，可以分离纯化出细菌完整的肽聚糖。完整肽聚糖主 要由N-乙酰葡糖氨(NAG)、N-乙酰胞壁酸(NAM)及特定的肽链组成，分析上 述三者含量，即可计算出肽聚糖的含量。本发明所采用的检测肽聚糖的方法是： 首先，分离提纯细菌细胞壁中完整的肽聚糖；之后测定N-乙酰胞壁酸(NAM) 的百分含量及N-乙酰葡糖氨(NAG)的百分含量；再次用液相色谱技术测定肽 链中氨基酸组成及百分含量。

其中，N-乙酰胞壁酸(NAM)含量的测定方法如下：取100mg样品经6N HCI、 105℃水解24小时，过滤，用等当量NaOH中和。取水解后的样品溶液、10ug/ml 标准乳酸溶液、空白(蒸馏水)各1ml，分别加入0.5ml 20％CuSO4溶液，混匀。 用蒸馏水准确定容至5.0ml，各加入0.2g CaO粉末，用细搅棒仔细搅匀，放置 30min，2500rpm，15min，小心吸出上清液各1ml，分别加入1滴20％CuSO4溶 液，混匀，滴加6ml浓H2SO4溶液，充分混匀后，沸水浴5min，自来水冷却后， 加入0.2ml对-羟基联苯试剂，混匀，30℃恒温水浴30min，使之形成颜色， 然后在沸水浴中沸煮90s，迅速冷却，在波长560nm处比色，根据绘制的标准曲 线求得NAM的含量。

其中，N-乙酰葡糖氨(NAG)含量的测定方法如下：配制N-乙酰氨基己糖 标准溶液80ug/ml，分别精密吸取标准溶液0，0.05，0.1，0.15，0.20，0.25ml， 补水至0.25ml。样品经6N HCI、105℃水解24小时，过滤，用等当量NaOH中 和，每0.6ml加入饱和NaHCO30.2ml，新配制的5％(V/V)乙酸酐0.2ml，室 温10min，以将氨基葡萄糖乙酰化，沸水浴3min，以除去多余酸酐，冷却。向 0.25ml样品及各浓度标准溶液加入0.1ml K2B4O7溶液(0.8M，pH用NaOH溶 液调至9.1)，沸水浴3min，加入3ml DMAB(二甲氨基苯甲醛，0.01g/ml)溶液， 迅速混匀，37℃水浴20min，冷却后测其吸光度A544nm，根据绘制的标准曲线， 计算NAG的含量。

本发明的非特异免疫激活剂主料制剂作为口服制剂在饲料中的配方：

表4，每吨饲料水产饲料中添加口服免疫激活剂制剂配方(单位：Kg)

本发明的非特异免疫激活剂(NSI)作为用于鱼类、甲鱼等水生脊椎动物注射 用的一种干粉制剂，其制备方法也是提取菌体细胞壁中的活性非特异免疫激活 剂成分，其过程是：

(1).收集菌体：取发酵完成的菌液，经5000-8000g、4℃的离心处理20- 30分钟，弃去上清液，保留收集的该菌体沉淀，再用0.8％生理盐水洗涤并以 6000～8000g离心处理，得到白色的湿菌体；

(2).恒温水浴：将收集的该湿菌体100g于65℃水浴，恒温处理40分钟，之 后冷却至室温；

(3).裂解细胞：按1∶4(g/ml)的比例，将冷却至室温的该湿菌体与细胞裂 解剂(0.5％浓度的TritonX100或2％的SDS)混合，并置入95℃水浴1小时，连 续搅拌，之后立即冷却至室温，并用双蒸水彻底洗涤；

(4).四次洗涤、离心：用浓度梯度为30％、70％、100％的甲醇水溶液对经(3). 步处理的该湿菌体，分别进行洗涤、5000-6000g离心的分步梯度浓度处理；之 后用丙酮洗涤，经4000-5000g的离心处理，再将收集的该菌体沉淀进行0～4 ℃的低温干燥处理；

(5).酶解除核酸：将(4).中得到的干燥该菌体沉淀加入300ml的含脱氧核糖 核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)的pH7.2的三羟甲基氨基甲烷—盐酸 (Tris·HCl)缓冲液；在37℃恒温下，孵育24小时；再经5000-6000g、4℃ 离心处理40分钟，收集该菌体沉淀；

(6).酶解除杂蛋白：用含量2mg/ml的胰蛋白酶和含量0.5mg/ml的α-糜蛋 白酶的三羟甲基氨基甲烷—盐酸(Tris·HCl)缓冲液300ml，加入到(5).中处 理的该菌体沉淀中，并在37℃恒温下，消化24小时；再以5000-6000g、4℃ 离心处理40分钟，收集的该菌体沉淀；

(7).二次酶解除杂蛋白：用150ml的含量5mg/ml的胃蛋白酶的0.01M盐酸 溶液，处理(6).中收集的该菌体沉淀，后经5000-6000g、4℃离心处理40分钟， 收集的该菌体沉淀；再用300ml的含量5mg/ml的蛋白酶E的三羟甲基氨基甲 烷—盐酸(pH7.4的Tris·HCl)缓冲液，在37℃恒温下消化处理24小时；最 后以5000-6000g、4℃离心处理40分钟，收集该菌体沉淀；

(8).三步脱脂：将上述蛋白酶消化过的收集该菌体，再经以下三步处理：

①.加300ml甲醇，以5000g、4℃离心处理40分钟，弃去上清液；

②.加300ml甲醇∶氯仿的混合液(1∶1V/V)，以5000g、4℃离心处理40 分钟，弃去上清液；

③.加300ml氯仿洗涤，再以5000g、4℃离心处理40分钟，弃去上清液；

(9).透析处理：将上述(8).中③步的提取物在0～4℃下干燥处理，再用200ml 的含量1mg/ml的蛋白酶E的三羟甲基氨基甲烷—盐酸(pH7.4的Tris·HCl) 缓冲液处理干燥的提取物；在37℃恒温下处理24小时；再将恒温处理的该提 取物装入透析袋内，用蒸馏水连续透析50小时；

(10).脱盐透析处理：将上述透析袋内的产物加入：50ml、0.05M的盐酸，且 在85℃下处理5分钟，之后立即冷却至室温；再以10000-12000g、4℃离心处 理30分钟，收集该菌体沉淀；再用水透析5天，之后将该菌体沉淀冻干保存；

(11).糖蛋白水解：将(10).中获得的冻干产物，按产物重量/缓冲液体积为1∶5 的比例，加入pH6.2的磷酸盐缓冲液，再加入适量1g/L的溶菌酶和0.1g/L EDTA 液，在37℃恒温下处理24小时；之后用1g/L的链霉蛋白酶，50℃水解处理 24小时；

(12).水透析干燥处理：将上述水解处理液于蒸馏水中透析50小时，在0℃下 低温干燥，即得注射用非特异免疫激活剂干粉制剂，该干粉的性状：含活性成 份寡糖肽类大于95％，糖含量40-49％，产品呈白色粉末，水溶液浑浊。

本发明的注射用非特异免疫激活剂干粉制剂的活性成份寡糖肽类含量测定 方法同上述所采用的检测肽聚糖的方法：首先，测定样品中N-乙酰胞壁酸 (NAM)及N-乙酰葡糖氨(NAG)的百分含量；再次用液相色谱技术测定肽链中 氨基酸组成及百分含量。

所述非特异免疫激活剂另一种注射用于粉制剂的使用方法所述的注射用干 粉制剂是用生理盐水稀释1000倍(W/V)，在121℃下灭菌15分钟，于-20℃下 冰箱存放；按每公斤鱼体重的注射量为：50——150μl/Kg。具体使用该干粉制 剂的应用实例如下，见表5： 表5按每公斤鱼体重注射不同剂量NSI对不同鱼类头肾细胞吞噬率影响实验结 果