一种水产诱食剂及其制备方法
阅读：945发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种水产诱食剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 水 产 诱食剂 ，其活性成分为屎肠球菌CGMCC No.9134的 发酵 液或发酵液的上清液。本发明的屎肠球菌CGMCC No.9134具有优异的耐热、耐胆盐性能，还具有优良的耐 海盐 性。本发明的诱食剂能有效促进水产动物的采食，促进肠道 益生菌 的定殖。，下面是一种水产诱食剂及其制备方法专利的具体信息内容。
一种水产诱食剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生态领域，具体涉及一种水产诱食剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 由于饲料或水产动物自身等因素的影响，投喂的饲料往往不能被迅速摄食和吸收利用。为了提高水产动物对配合饲料的利用效率，不仅需要研究各种水产动物的营养需求，配制适合的饲料，还需在饲料中添加能促进水产动物摄食的引诱物质（即诱食剂）。
[0003] 目前市场相关产品种类多样，但是效果不明显，以香味物质“诱人”为主。市场上诱食剂主要分为如下几种：氨基酸类、动植物提取物、生物碱、含硫化合物、中药类、脂肪酸等等。目前，国家已经明文规定，禁止诸如DMPT等化学诱食剂使用。因此，开发绿色、高效的诱食剂是必要的。
[0004] 屎肠球菌制作菌粉用于水产行业已有先例，有的作为饲料添加剂，有的作为水质改良剂，有的作为微生态改良剂，但是，作为液态制剂，直接用于水产动物诱食，尚无先例。
[0005] 水产微生态液态制剂在货架期期间，经常会产生胀气现象，产品包含的产气细菌继续代谢，产生大量气体，使包装鼓胀。细菌继续代谢影响了产品组分的稳定性，同时，产品打开使用时容易喷溅，严重时甚至胀破包装产生类似爆炸的巨响。查阅资料以及收集市场产品信息可知：大部分水产微生态产品，例如：市场销售的PSB光合细菌原液、虾蟹乐宝、EM菌等，说明书上标注“微胀气”字样，说明目前并没有效果非常明显的防胀气方法。
发明内容
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供一种水产诱食剂。
[0009] 其中，所述屎肠球菌CGMCC No.9134的发酵液中的活菌数为1×109cfu/ml以上。
[0011] 其中，发酵条件如下：温度20-40℃，转速50-200rpm，罐压为0.01-0.09兆帕，通风量为1:0.1-1:0.5vvm，培养10h-24h至活菌数为1×109cfu/ml以上。
[0012] 本发明屎肠球菌分离自猪肠道，并经过紫外诱变筛选获得。
[0013] 屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134的特征为：
[0014] （1）屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134菌液80℃处理5min，存活率为0.18%，相对出发菌株提高22倍。
[0015] （2）屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134菌液用0.3%的猪胆盐处理3h，存活率为20.80%，相对出发菌株提高3.04倍。
[0016] （3）屎肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.9134菌液用0.6%的猪胆盐处理3h，存活率为21.6%，相对出发菌株提高27.69倍。
[0017] 将本发明的屎肠球菌新菌株于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，登记号：CGMCC No.9134。
[0018] 本发明水产诱食剂主要成分为小肽、氨基酸、有机酸及乳酸菌等，对养殖动物进食有较强诱导作用，改善饲料的适口性，缩短吃料时间；其中，活性乳酸菌（>109CFU/mL），乳酸菌能抑制消化道中病原微生物的生长繁殖，提高养殖动物消化吸收能力，增强水产动物免疫力。
[0020] 图1：屎肠球菌出发菌株的菌体形态。
[0021] 图2：热耐受性试验。
[0022] 图3：耐胆盐试验。
[0023] 图4：耐海盐试验。
[0024] 图5：本发明诱食剂保藏稳定性试验。
[0025] 图6：食丸诱捕试验统计图。
[0026] 图7：小试拌料试验结果统计图。
[0027] 图8：对虾肠道乳酸菌检测过程图。
[0028] 图9：对虾肠道乳酸菌检测平板。
[0029] 图10：对虾肠道乳酸菌含量检测统计图。
[0030] 图11：试验塘对虾日摄食量统计图。
具体实施方式
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032] 实施例1
[0033] 本发明所述的屎肠球菌选育方法，包括以下步骤：
[0034] (1) 生长曲线的测量：出发菌株来源于猪肠道，经鉴定为屎肠球菌，革兰氏染色，菌体形态见图1。将其活化两次，接入500mL液体培养基（1L三角瓶）中，37℃培养，每两小时测一次OD值。横坐标为时间，纵坐标为OD值，绘制生长曲线。同时用螺旋自动接种仪测量菌浓度。
[0035] (2) 菌悬液的制备：将出发菌活化1 2次后，接种于500mL液体培养基（1L三角瓶）~中，根据生长曲线，37℃振荡培养4-10h到对数生长期，取菌液用灭菌的生理盐水洗菌3次，
8
将其配制成浓度为1×10cfu/mL菌悬液。
8
将其配制成浓度为1×10cfu/mL菌悬液。
[0036] (3) 致死率：取6个直径为6 cm的无菌培养皿，每平皿加入3 5 mL菌液。紫外预热~20-30min，在搅拌状态下，选用15-20 W的紫外灯，照射距离为28 cm，照射时间分别为10s 、
20s、40s、60s、2min、4min。根据诱变时间做适当稀释，各取100 μL涂平板，每个稀释度有3个平行。将原液稀释至10-6，10-7作为对照，每个稀释度有3个平行。避光，37℃培养3d。计算致死率，结果见下表。
20s、40s、60s、2min、4min。根据诱变时间做适当稀释，各取100 μL涂平板，每个稀释度有3个平行。将原液稀释至10-6，10-7作为对照，每个稀释度有3个平行。避光，37℃培养3d。计算致死率，结果见下表。
[0037] 表1 紫外诱变致死率
[0038]
[0039] (4)诱变选育：选择致死率在70% 85%的诱变时间，对出发菌株进行紫外诱变取2个~直径为6cm的无菌培养皿，每平皿加入3 5 mL菌液。紫外预热20 30min，在搅拌状态下，选用~ ~
15 20 W的紫外灯，照射距离为28 cm，照射时间为致死率在70% 85%的诱变时间即10 s和~ ~
20s，将诱变后的菌液接种的新鲜的液体培养基中，45℃、50℃和55℃避光培养2 3天。菌液~
变浑浊后，用螺旋自动接种将其分离，挑选菌落形态与出发菌株变化较大的菌株100 300~
株，对其80℃处理5min，比较突变株的存活率。将存活率较高的10 60株4℃保藏，再其进行~
胆盐耐受性比较。获得1株较好的菌株。
15 20 W的紫外灯，照射距离为28 cm，照射时间为致死率在70% 85%的诱变时间即10 s和~ ~
20s，将诱变后的菌液接种的新鲜的液体培养基中，45℃、50℃和55℃避光培养2 3天。菌液~
变浑浊后，用螺旋自动接种将其分离，挑选菌落形态与出发菌株变化较大的菌株100 300~
株，对其80℃处理5min，比较突变株的存活率。将存活率较高的10 60株4℃保藏，再其进行~
胆盐耐受性比较。获得1株较好的菌株。
[0040] （5）稳定性：将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，37℃，恒温培养箱培养1天，连续传代10次，测定其热耐受和胆盐耐受性，即得。
[0041] 实施例3 耐热测定
[0042] 将本发明的屎肠球菌CGMCC No.9134进行液体活化，37℃过夜，取1mL，经过80℃水浴处理5min，稀释，取适当的稀释度进行涂布MRS平板，3个平行。以未经高温处理菌液为对照，稀释涂布。按照公式（1）计算菌株存活率。
[0043] （1）
[0044] 结果如图2所示。有图2可知，UE01（屎肠球菌CGMCC No.9134）存活率最高，达到0.18%，与出发菌株相比，提高22.31倍。
[0045] 实施例4 耐胆盐测定
[0046] 将本发明的屎肠球菌CGMCC No.9134进行液体活化，37℃过夜，取1mL，8000rpm离心10min，加入1mL含有0.3%猪胆盐的MRS培养基，37℃静置3h。稀释，取适当的稀释度进行涂布MRS平板，3个平行。以未经处理菌液为对照，稀释涂布。按照公式（1）计算菌株存活率。经过胆盐0.3%处理3h，菌株结果见图3。有图3可知，将UE01（屎肠球菌CGMCC No.9134）与出发菌株进行胆盐0.6%处理3h，检测其耐受性，其存活率分别为21.6％和0.78％，UE01较出发菌株提高了27.69倍。
[0047] 实施例5耐海盐测定
[0048] 采用3°海盐水配置MRS，将活化好的屎肠球菌CGMCC No.9134与出发菌株，等浓度接种到其中，30℃培养16h，涂布计数。结果由图4可见，UE01（屎肠球菌CGMCC No.9134）的活菌数达到2.63×1010 cfu。
[0049] 实施例6水产诱食剂的制备
[0050] 1）培养基灭菌：
[0051] 培养基配方：10g/L果糖、50g/L牛肉膏、10g/L酵母膏、15g/L硫酸镁、15g/L NaCl、15%CaCO3。
[0052] 配制培养基，注水（自来水即可），灭菌温度为115℃，时间为20min，调节pH值至6.8；
[0053] 2）稳定理化指标：
[0055] 3）接种发酵：
[0056] 按照1%的比例接种，培养条件：温度20℃，转速50rpm，罐压为0.01兆帕，通风量为1:0.1vvm。该状态下，培养10h下罐，下罐时活菌数为1×109cfu/ml以上。
[0057] 4）后处理：
[0058] 将发酵后的发酵液中，按照质量分数5%添加海盐，按照质量分数2.5%添加黄原胶，海水盐增加发酵液渗透压，抑制屎肠球菌代谢，从而防止其产生气体，但并不造成乳酸菌死亡，有效解决了胀气的问题；黄原胶维持发酵液液相均一稳定，保证发酵液不分层。
[0059] 5）下罐灌装：
[0060] 发酵后，将发酵液灌装、压盖、贴标和装箱，灌装即得。
[0061] 实施例7水产诱食剂的制备
[0062] 1）培养基灭菌：
[0063] 培养基配方：10g/L果糖、50g/L牛肉膏、10g/L酵母膏、15g/L硫酸镁、15g/L NaCl、15%CaCO3。
[0064] 配制培养基，注水（自来水即可），灭菌温度为115℃，时间为20min，调节pH值至6.8；
[0065] 2）稳定理化指标：
[0066] 发酵罐转速50rpm，通风1:0.1vvm，罐压维持在0.01MPa，液体理化指标稳定后，标定溶解氧。
[0067] 3）接种发酵：
[0068] 按照10%的比例接种，培养条件：温度20℃，转速50rpm，罐压为0.01兆帕，通风量为9
1:0.1vvm。该状态下，培养10h下罐，下罐时活菌数为1×10cfu/ml以上。
1:0.1vvm。该状态下，培养10h下罐，下罐时活菌数为1×10cfu/ml以上。
[0069] 4）后处理：
[0070] 发酵液经陶瓷膜过滤，去除菌体。
[0071] 5）下罐灌装：
[0072] 将上清液灌装、压盖、贴标和装箱后即得。
[0073] 试验例1稳定性试验
[0074] 试验分为两个处理：试验组（实施例6制备的发酵液+0.25%黄原胶）、空白发酵液组（实施例6制备的发酵液），每个处理3个重复。试验时间：30天。
[0075] 结果如图5所示，添加黄原胶的发酵液液相均一稳定，30天未分层。而空白发酵液体系不稳定，发生分层。
[0076] 测定了保藏6个月之后产品的活菌数，结果如表2所示。结果表明本发明的诱食剂产品活菌数高，产品在长时间保存期间，活菌数基本维持不变。
[0077] 表2本发明诱食剂架期乳酸菌活菌数测定结果
[0078]室温储存时间（月） 乳酸菌数（cfu/ml） pH
1 1.53×109 5.03
9
2 2.68×10 4.24
3 2.54×1011 4.68
4 3.43×1011 5.01
5 3.3×1012 5.14
10
6 4.4×10 5.13
1 1.53×109 5.03
9
2 2.68×10 4.24
3 2.54×1011 4.68
4 3.43×1011 5.01
5 3.3×1012 5.14
10
6 4.4×10 5.13
[0079] 试验例2 食丸诱捕试验
[0080] 1）食丸制备
[0081] 食丸主要采用谷元粉、面粉、色素、水及试验样品混合，由模具压制成直径0.15mm的饼状食丸，大小均一。
[0082] 2）试验条件
[0083] 选择50头体重为15g左右的健康南美白对虾作为试验研究对象。
[0084] 3）排除视觉偏好
[0085] 制备赤、橙、红、绿、青、蓝、紫等多色食丸，分别取每种颜色食丸15个，与无色食丸做对比，统计南美白对虾对不同颜色食丸的捕获与采食数量，结果表明，南美白对虾对颜色没有特别偏好。
[0086] 4）排除色素味觉干扰
[0087] 制备无色素食丸与含色素食丸进行对比，统计南美白对虾对有、无色素食丸的捕获与采食数量，结果表明，南美白对虾采食不受该种色素影响。
[0088] 5）试验
[0089] 制备无色及有色食丸，有色素食丸添加一定量试验产品（实施例6制备的诱食剂、ＤＭＰＴ（二甲基-β-乙酸噻亭），ＤＭＴ（硫代甜菜碱），同时投入水池同一位置，投入饵料10min后，统计南美白对虾对不同颜色食丸的捕获与采食数量，依统计结果判断南美白对虾对产品的好恶。
[0090] 结果表明（详见图6）：南美白对虾对添加本发明诱食剂的食丸摄食最多，其次为DMPT、DMT及无添加剂食丸，最终添加本发明诱食剂食丸剩余最少，本发明诱食剂的诱食效果优于DMPT、DMT等化学诱食剂。
[0091] 本试验包含小试验，排除了对虾视觉上对某种颜色的偏好；同时，染色剂选择美国原装进口惠尔通Wilton翻糖蛋糕色素，通过试验，排除染色剂携带气味对试验结果的影响。
[0092] 试验例3 小试拌料试验结果
[0093] 1）饵料制备
[0094] 称取2.0g大北农对虾配合饵料2份，空白组不添加任何添加剂，对照组按照重量比2.5%的使用量添加实施例6制备的诱食剂，均加入少量池水润湿备用。
[0095] 2）试验条件
[0096] 选择50头体重为15g左右的健康南美白对虾作为试验研究对象。
[0097] 3）试验
[0098] 将空白饵料及添加本发明诱食剂的饵料同时投入水池两端位置，摄像、拍照记录试验状况，依据影像资料，统计南美白对虾对两组饵料的捕获与采食数量，依统计结果判断南美白对虾对本发明诱食剂的好恶。4）试验结果
[0099] 结果表明（详见图7）：经过对图片及影像资料分析，在添加本发明诱食剂的饵料区域摄食的南美白对虾数量占试验对虾总数量的70%，本发明诱食剂的诱食效果明显。
[0100] 试验例4 肠道乳酸菌监测结果
[0101] 将使用本发明诱食剂及对照虾池（未使用本发明诱食剂）的对虾进行解剖，取其肠道，对肠道所含乳酸菌进行检测（图8），结果发现使用本发明的诱食剂，使对虾肠道乳酸菌含量大大增加，乳酸菌在对虾肠道能成功定植（图9）。本发明诱食剂拌喂后，对虾肠道乳酸菌数目提升了100倍（图10）。
[0102] 试验例5
[0103] 本试验于2013年11月10日至30日选取广东省广州市金海水产养殖基地2口南美白对虾养殖池塘作为研究对象，通过设置饵料台，对养殖池塘对虾摄食状况的监测与统计来研究判断本发明诱食剂的诱食效果。其中，试验塘（添加实施例6的诱食剂）与对照塘基本状况见下表3：
[0104] 表3 试验塘和对照塘的基本情况
[0106] 结果表明：试验塘对虾平均摄食速度较快，对虾摄食量比对照组提高约10﹪；在阴雨天中，保持了对虾正常摄食，增强了对虾的抗逆性，具体摄食状况详见图11。
[0107] 2014年1月8日至30日于福建漳浦县冬棚对虾高位池，统计结果表明：本发明诱食剂诱食效果明显，高位池对虾摄食量从每餐40斤提升至45斤；对虾活力、状态明显提升。
[0108] 试验例6
[0109] 本试验于2014年1月6日至20日选取辽宁省锦州市2口海参苗室作为研究对象，通过设置饵料网片，对海参苗室海参摄食状况的监测与统计来研究判断本发明诱食剂的诱食效果。其中，试验塘（添加实施例6制备的诱食剂）与对照塘基本状况相同。
[0110] 试验结果表明：提高摄食率，同量饵料进食时间缩短3-4小时；网片附着率高，爱上片，增进摄食量；海参状态好，抵抗力增加，消化吸收好；粪便整齐，无异味，产生有害气体少，倒池时间延长2-4天，从而得到更多生长时间；网片摄食彻底，利于清洗、整理，降低维护成本。
[0111] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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