复配生孢梭菌抑制剂
阅读：465发布：2020-05-13
专利汇可以提供复配生孢梭菌抑制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种复配生孢梭菌 抑制剂 ，属于 抑菌剂 领域。本发明复配生孢梭菌抑制剂为ɛ‑聚赖 氨 酸 盐酸 盐、 肉桂酸 钾 、壳聚糖和月桂酸单甘油酯的混合溶液；所述ɛ‑聚赖氨酸盐酸盐的 质量 分数为0.008%‑0.020%，肉桂酸钾的质量分数为0.035%‑0.055%，壳聚糖的质量分数为0.028%‑0.045%，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.010%‑0.025%。ɛ‑聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖、GML复 配对 抑制芽孢梭菌具有明显的增效作用。本发明的天然复配抑菌剂达到甚至超过了亚 硝酸 盐的抑菌作用，完全可以替代亚硝酸盐。，下面是复配生孢梭菌抑制剂专利的具体信息内容。
1.一种复配生孢梭菌抑制剂，其特征在于：所述复配生孢梭菌抑制剂为ɛ-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖和月桂酸单甘油酯的混合溶液；所述ɛ-聚赖氨酸盐酸盐的质量分数为0.008%-0.020%，肉桂酸钾的质量分数为0.035%-0.055%，壳聚糖的质量分数为0.028%-
0.045%，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.010%-0.025%。
2.如权利要求1所述复配生孢梭菌抑制剂，其特征在于：ɛ-聚赖氨酸盐酸盐的质量分数为0.011%-0.015%，肉桂酸钾的质量分数为0.040%-0.045%，壳聚糖的质量分数为0.035%-
0.040%，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.013%-0.018%。
3.如权利要求2所述复配生孢梭菌抑制剂，其特征在于：ɛ-聚赖氨酸盐酸盐的质量分数为0.013%，肉桂酸钾的质量分数为0.042%，壳聚糖的质量分数为0.037%，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.016%。
4.如权利要求1-3任一项所述复配生孢梭菌抑制剂，其特征在于：所述ɛ-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖采用无菌水溶解，所述月桂酸单甘油酯先采用乙醇溶液溶解，然后与ɛ-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖的无菌水溶液混合。
复配生孢梭菌抑制剂
技术领域
背景技术
[0002] 肉毒梭菌是厌氧、革兰氏阳性，危害极大的一种易引起食品腐败的菌，不仅会造成经济损失，而且其产生的神经毒素会导致人们严重的肌肉松弛和神经麻痹。为了减少此类中毒事件的发生，食品企业常添加亚硝酸盐进行有效控制，但是亚硝酸盐具有剧毒性、致畸性和致癌性，又存在新的安全隐患。生孢梭菌也是能引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，由于不产毒素，常作为B、E、F型的肉毒梭菌的科研替代菌。因此研究抑制生孢梭菌的制剂意义重大。
[0003] 近年来随着食品添加剂的广泛兴起与使用，食品腐败问题得到初步解决的同时，一些添加剂也会对人体健康造成威胁，比如亚硝酸盐。因此，使用天然食品添加剂完全替代或部分替代合成添加剂吸引了人们的注意力。现在已开发应用的天然防腐剂主要被分为三类：植物性、动物性以及微生物性。Vermeiren等学者在对真空包装蒸煮火腿防腐研究中，将乳酸菌Lactobacillus sakei subsp.Carnosus(10A)用于其中，发现其可以抑制肠膜明串珠菌和叶绿假单胞菌；Ekwenye等通过研究发现大蒜及银杏提取物对大肠杆菌和伤寒沙门氏菌的生长具有有效抑制作用。
[0004] 复合防腐抑菌主要有以下优点：广谱抑菌、药效及安全性提高、延长贮存期及防止二次污染等。因此，现今更注重复配防腐剂的尝试与开发。一般不同抑菌剂同时使用时，它们之间的作用效果主要分为三种：复合增效、叠加或拮抗作用。Park等通过研究肉类火腿制作过程中，添加0.2％的Chitosan与0.005％的NaNO2复配抑菌剂的保鲜效果与只添加0.01％NaNO2时相同，这样降低了亚硝酸盐的使用量，提高了安全性。顾仁勇等在研究猪肉保鲜的过程中，将0.05％Nisin和0.05％的LZM混合液用于其中，结果表明有益于其保鲜期。
李柯欣等学者的研究表明，0.4g/kgNatamycin与8g/kg的山梨酸钾复配使用可延长月饼保质期，长达60d以上。Gutierrez J等认为通过将植物提取物进行复配，可以降低精油的抑菌浓度，精油用量减少，精油对感官上的刺激也随之减少。
李柯欣等学者的研究表明，0.4g/kgNatamycin与8g/kg的山梨酸钾复配使用可延长月饼保质期，长达60d以上。Gutierrez J等认为通过将植物提取物进行复配，可以降低精油的抑菌浓度，精油用量减少，精油对感官上的刺激也随之减少。
[0005] 目前，国内关于生孢梭菌的研究主要集中在生孢梭菌芽孢耐热性、药品食品质量控制方法的选择、植物提取物的体外抗菌研究及医学研究方面。国外有研究使用EOS和亚硝酸盐或植物提取物和亚硝酸盐对生孢梭菌的抗菌作用，然而，关于多种抑菌剂复合替代亚硝酸盐的研究相对较少。因此提供一种可以有效替代亚硝酸盐的抑菌剂具有重大的经济效益和社会效益。
发明内容
[0006] 为了弥补现有技术的不足，解决现有技术中没有可有效替代亚硝酸盐以抑制生孢梭菌的天然防腐剂的问题，本发明提供了一种复配生孢梭菌抑制剂。
[0007] 本发明的技术方案为：
[0008] 一种复配生孢梭菌抑制剂，所述复配生孢梭菌抑制剂为ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖和月桂酸单甘油酯的混合溶液；所述ε-聚赖氨酸盐酸盐的质量分数为0.008％-0.020％，肉桂酸钾的质量分数为0.035％-0.055％，壳聚糖的质量分数为
0.028％-0.045％，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.010％-0.025％。
0.028％-0.045％，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.010％-0.025％。
[0009] 作为优选方案，ε-聚赖氨酸盐酸盐的质量分数为0.011％-0.015％，肉桂酸钾的质量分数为0.040％-0.045％，壳聚糖的质量分数为0.035％-0.040％，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.013％-0.018％。
[0010] 进一步地，ε-聚赖氨酸盐酸盐的质量分数为0.013％，肉桂酸钾的质量分数为0.042％，壳聚糖的质量分数为0.037％，月桂酸单甘油酯的质量分数为0.016％。
[0012] 本发明的有益效果为：
[0013] 本发明当ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖、GML(月桂酸单甘油酯)浓度分别为0.013％，0.042％，0.037％，0.016％进行复配应用时，对生孢梭菌抑制效果最好，此时经重复验证试验得抑菌率为93.7％，明显高于单一抑菌剂作用时的抑菌率，即，ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖、GML复配对抑制芽孢梭菌具有明显的增效作用。本发明的天然复配抑菌剂达到甚至超过了亚硝酸盐的抑菌作用，完全可以替代亚硝酸盐。附图说明
[0014] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0015] 图1为ε-聚赖氨酸盐酸盐与肉桂酸钾对抑菌率的影响图；
[0016] 图2为ε-聚赖氨酸盐酸盐与GML对抑菌率的影响图；
[0017] 图3为肉桂酸钾与GML对抑菌率的影响图；
[0018] 图4为壳聚糖与GML对抑菌率的影响图；
[0019] 图5为生孢梭菌生长曲线图；图中“sterile distilled water”表示为无菌蒸馏水阴性对照生孢梭菌生长曲线；“sodium nitrite”表示为亚硝酸钠阳性对照生孢梭菌生长曲线；“complex antimicrobi alagents”表示为本发明复配抑菌剂处理的生孢梭菌生长曲线；
[0020] 图6为生孢梭菌经处理后的SEM图；其中(a)表示无菌蒸馏水处理的生孢梭菌生孢梭菌生长SEM图；(b)表示亚硝酸钠处理的生孢梭菌生孢梭菌生长SEM图；(c)表示本发明复配抑菌剂处理的生孢梭菌生孢梭菌生长SEM图。
具体实施方式
[0021] 实施例1
[0022] 1.1菌种培养
[0023] 取齐鲁工业大学菌种保藏中心的生孢梭菌菌种，经0.9％无菌氯化钠溶液3mL稀释，后加至7mL无菌胰酶消化碎肉半流体培养基中，混匀，于35℃条件下培养20h。随后取1mL经复苏的上述菌液加至7mL无菌胰酶消化碎肉半流体培养基中，混匀，再于35℃条件下培养20h。再取1mL上述复壮后的菌液加至7mL无菌液体硫乙醇酸盐培养基中，混匀后置35℃培养
20h，得工作菌种。
20h，得工作菌种。
[0024] 选择与存放菌液管径相同的试管，取9.8mL 1％的稀H2SO4于试管中，然后取0.2mL 0.25％的BaCl2溶液缓慢滴加入稀硫酸溶液中，摇匀，测定在625nm波长下的OD值(0.5麦氏单位，OD值为0.08～0.1)，检测合格后，封口并于4℃条件下保存备用。比浊管每次使用时需用力摇匀，复检比浊度。
[0025] 将上述工作菌种接种于已灭菌处理的液体硫乙醇酸盐培养基中，采用比浊的方法，将菌液稀释到与标准比浊管相同浊度后，再经0.9％的无菌NaCl溶液按10倍系列稀释，7
稀释至约10CFU/mL时，作为工作菌液。
稀释至约10CFU/mL时，作为工作菌液。
[0026] 1.2复配抑菌剂配制
[0027] 试验复配抑菌剂：
[0028] ε-聚赖氨酸盐酸盐，肉桂酸钾，壳聚糖，月桂酸单甘油酯进行复配。
[0029] 其中，ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖采用无菌水溶解；月桂酸单甘油酯先采用95％的乙醇溶液溶解，然后与ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖的无菌水溶液混合。
[0030] 对照复配抑菌剂：
[0031] ε-聚赖氨酸盐酸盐，肉桂酸，壳聚糖，月桂酸单甘油酯进行复配。
[0032] 其中，ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸、壳聚糖采用无菌水溶解；月桂酸单甘油酯先采用95％的乙醇溶液溶解，然后与ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸、壳聚糖的无菌水溶液混合。
[0033] 1.3复配抑菌剂MIC的测定
[0034] 在无菌操作台中，将工作菌液接入液体硫乙醇酸盐培养基，然后用移液枪(1000μL)移取适量接种过的液体培养基于比色皿中，再将1mL配制好的用于复配的抑菌剂的混合溶液移入比色皿中，测定OD3值。按照同样的加液比，向试管中加入5mL混合液，放置于34.3℃恒温培养箱中培养24.3h后，移取一定量菌液至比色皿中，在波长600nm下测得OD4值，试验重复进行三次，取平均值。当|OD3－OD4|≤0.05时，可得出该复合抑菌剂浓度为MIC。
[0035] 1.4复配抑菌剂抑菌效果的判定
[0036] 1)抑菌率的测定
[0037] 以加无菌蒸馏水的培养液作阴性对照，以加亚硝酸钠溶液的培养液作阳性对照。根据下列公式计算抑菌率：
[0038] Y(％)＝(A-B)/A×100％ (1)
[0039] 式中A—空白对照组(无菌蒸馏水处理组)的生孢梭菌菌液的OD值；
[0040] B—加入抑菌剂的生孢梭菌菌液的OD值。
[0041] 阴性对照、阳性对照与本发明复配抑菌剂处理的生孢梭菌生长曲线图如图5所示。从图5可以看出，在生孢梭菌的生长曲线中，对照组和试验组的菌体生长周期大致相同。但从对数期开始，各组菌体数量差别开始变大，其中菌体数量为：空白对照组的最多，亚硝酸钠组次之，复配抑菌剂组的菌体数量最少，到稳定生长期之后，各组之间细菌浓度相差明显；与NaNO2作用的曲线相比，复配抑菌剂那组曲线上升最小，即对生孢梭菌的抑制作用更明显，培养8h后，亚硝酸钠组生孢梭菌的吸光值较原菌减少了约30％，而复配抑菌剂组较原菌则减少了约50％，由此可知复配抑菌剂的抑制效果更好，且抑菌剂的抑制作用主要表现在对数生长期，对生孢梭菌生长周期影响不大。
[0042] 通过SEM分析来评价生孢梭菌的形态学变化，阴性对照、阳性对照与本发明复配抑菌剂处理的生孢梭菌的形态变化如图6所示。空白对照组(无菌蒸馏水组)的生孢梭菌如图6(a)细胞形态规则，大小均匀，呈典型杆状，表面看起来充满光泽且饱满。用亚硝酸钠处理的生孢梭菌细胞如图6(b)伸长或膨胀，表面出现小孔，形态差异变大，且呈现聚集状态。用复配抑菌剂处理的生孢梭菌细胞如图6(c)缩短变粗呈不规则球状，表面出现了凹陷，形成聚集和粘附，并且这些细胞的大小和分布不均匀。由这些结果推测得抑菌剂可对生孢梭菌细胞产生损伤，使其形态结构变化，正常功能受损，导致其死亡，并且细胞受损伤的程度与复配抑菌剂作用时间正相关，不同抑菌剂对生孢梭菌的损害程度不同。
[0043] 2)抑菌效果
[0044] 通过前期实验，选用试验复配抑菌剂、对照复配抑菌剂、亚硝酸钠阳性对照，观察其抑菌情况并由公式(1)计算抑菌率如表1。
[0045] 表1不同抑菌剂的抑菌率(％)
[0046] 1 2 3
试验复配抑菌剂 70.2±0.66 74.1±0.75 54.0±0.19
对照复配抑菌剂 59.3±0.35 58.5±0.58 48.9±0.84
亚硝酸钠 68.7±0.69 70.8±0.77 60.1±1.08
试验复配抑菌剂 70.2±0.66 74.1±0.75 54.0±0.19
对照复配抑菌剂 59.3±0.35 58.5±0.58 48.9±0.84
亚硝酸钠 68.7±0.69 70.8±0.77 60.1±1.08
[0047] 注：浓度1为国标中或推荐最大添加量，2、3按2倍梯度依次稀释。
[0048] 由表1可知，本发明复配抑菌剂的抑菌率优于亚硝酸钠的抑菌率，可替换亚硝酸钠作为抑菌剂使用。然而，将本发明中的肉桂酸钾替换为肉桂酸，抑菌效果大打折扣。
[0049] 3)复配抑菌剂抑菌效果响应面试验分析
[0050] a.数学模型的建立及显著性分析
[0051] 对所得试验数据进行多元回归拟合分析，所得的抑菌率与各组分之间的方程式为：
[0052] Y＝91.50+10.86X1+2.35X2+1.52X3+2.34X4-2.55X1X2-0.63X1X3+3.00X1X4-[0053] 0.40X2X3+1.85X2X4+2.37X3X4-10.54X12-3.80X22-3.22X32-5.89X42
[0054] 由以上回归方程得以看出，式中四个一次项的回归系数的绝对值的顺序为：X1(ε-聚赖氨酸盐酸盐)﹥X2(肉桂酸钾)﹥X4(GML)﹥X3(壳聚糖)，说明ε-聚赖氨酸盐酸盐在复配抑菌剂中发挥的抑菌效果中所起的作用最明显，然后是肉桂酸钾，再者是GML，壳聚糖发挥的抑菌作用最小。
[0055] 表2响应面实验结果
[0056]
[0057]
[0058] 表3响应面回归分析
[0059]
[0060] 注：*表示在α＝0.05水平上显著；**表示在α＝0.01水平上极显著。
[0061] 当“P值”<0.01时，表示该项极显著，当“P值”<0.05时，则表示该项显著。由表3可知，所用4种抑菌剂的一次项，均为P<0.01，即都能有效抑制生孢梭菌，并且线性效果极显著。同时，由表中各偏回归系数的显著性检验得，X2X4的P值<0.05，它们之间的交互效应明显，X1X2、X1X4、X3X4之间的交互效应极显著。对于二次项，X12、X22、X32、X42的P<0.01，表明这4种抑菌剂对抑菌率的影响不仅成线性效应，也成曲面效应。从表4.5中可以得出，F回归＝95.04，P<0.0001，表明该二次多元模型极显著；F失拟＝1.04，P＝0.5313>0.05，表明本模型的失拟度小，即该二次方程模型能准确的预测抑菌剂的最优浓度组合；表中调整负相关系数RAd2＝0.9792，表示该模型可以准确预测97.92％的抑菌率，CV＝1.68％，表明该模型的重现性好，综合可知，该模型能够被采用，用来预测响应值。
[0062] b.复配抑菌剂相互作用的响应曲面分析
[0063] ε-聚赖氨酸盐酸盐与肉桂酸钾、壳聚糖、GML相互作用曲面见图1-4所示。
[0064] 当壳聚糖与GML浓度一定时，由图1可知ε-聚赖氨酸盐酸盐与肉桂酸钾的交互作用对抑菌率的影响。当ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度不变时，随肉桂酸钾浓度的增大，抑菌率先变大，在420μg/mL时，抑菌率最大，当浓度连续增大时抑菌率缓慢变小；当肉桂酸钾浓度一定时，随ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度的增大，抑菌率在130μg/mL时，抑菌率最大，当浓度接连增大时抑菌率缓慢减小。此图表明ε-聚赖氨酸盐酸盐与肉桂酸钾对抑菌率的交互作用显著。
[0065] 当壳聚糖与肉桂酸钾浓度一定时，由图2可知ε-聚赖氨酸盐酸盐与GML的交互作用对抑菌率的影响。当ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度不变时，随GML浓度的增加，抑菌率先变大，在140～170μg/mL之间时，抑菌率最大，当浓度接连增大时抑菌率缓慢减小；当GML浓度一定时，随ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度的增大，抑菌率在130μg/mL时，抑菌率最大，当浓度继续变大时抑菌率缓慢降低。此图表明ε-聚赖氨酸盐酸盐与GML对抑菌率的交互作用显著，并且由等高线可得ε-聚赖氨酸盐酸盐与GML的交互作用比其他组合显著。
[0066] 当壳聚糖与ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度一定时，由图3可知肉桂酸钾与GML的交互作用对抑菌率的影响。当肉桂酸钾浓度不变时，随GML浓度的增加，抑菌率先变大，在140～170μg/mL之间时，抑菌率最高，当浓度接连增大时抑菌率缓慢减小；当GML浓度一定时，随肉桂酸钾浓度的增大，抑菌率在420μg/mL时，抑菌率最大，当浓度继续变大时抑菌率缓慢减低。此图表明GML与肉桂酸钾对抑菌率的交互影响是显著的。
[0067] 当肉桂酸钾与ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度一定时，由图4可知壳聚糖与GML的交互影响对抑菌率的作用。当壳聚糖的浓度不变时，随GML浓度的增大，抑菌率先变大，在140～170μg/mL之间时，抑菌率最高，当浓度接连增大时抑菌率缓慢减小；当GML浓度一定时，随着壳聚糖浓度的增加，抑菌率在350～425μg/mL之间时，抑菌率最大，当浓度继续增大时抑菌率缓慢减小。此图表明GML与Chitosan对抑菌率的交互作用是显著的。
[0068] c.抑菌剂最佳浓度的验证试验
[0069] 使用Design-Expert 8.0.6软件中的极速上升分析法，最终得出4种抑菌剂的浓度为：ε-聚赖氨酸盐酸盐0.013％，肉桂酸钾0.042％，壳聚糖0.037％，GML0.016％，此时预测抑菌率为95.5％，实测三次结果的平均值为93.7％，相对误差为1.88％。
[0070] 本发明复配抑菌试验得出，当ε-聚赖氨酸盐酸盐、肉桂酸钾、壳聚糖、GML浓度分别为0.013％，0.042％，0.037％，0.016％进行复配应用时，对生孢梭菌抑制效果最好，此时经重复验证试验得抑菌率为93.7％，虽与预测值有一定偏差，但明显高于单一抑菌剂作用时的抑菌率，具有明显增效作用；并且抑菌效果优于亚硝酸钠，完全可以替代亚硝酸钠。
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