柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用
阅读：306发布：2020-05-22
专利汇可以提供柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用，属于 植物 基因工程技术领域。本发明柑橘漆酶家族基因CsiLAC4获得方法包括以下步骤：从柑橘 叶片 中提取获得总RNA；（2）将步骤（1）所得RNA反转录获得cDNA；（3）以所得cDNA为模板，用正向引物F1和反向引物R1进行第一轮PCR扩增；（4）以第一轮增产物为模板，正向引物F1和反向引物R2巢式PCR扩增获得所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4。柑橘漆酶家族基因CsiLAC4应用于提高植物耐 硼 毒能 力 方面，为植物抵抗非 生物 逆境分子育种提供新的基因资源。，下面是柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用专利的具体信息内容。
1.柑橘漆酶家族基因CsiLAC4，其特征在于：所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.根据权利要求1所述的柑橘漆酶家族基因CsiLAC4，其特征在于，所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述的柑橘漆酶家族基因CsiLAC4在提高植物耐硼毒能力方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥或柑橘；所述柑橘为‘雪柑’或‘酸柚’。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥时，包括以下步骤：
1) 获得权利要求1所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4；
2) 将所得柑橘漆酶家族基因CsiLAC4与质粒载体连接获得超量表达载体；
3) 将步骤2）所得超量表达载体导入根癌农杆菌中获得重组根癌农杆菌； 4) 将步骤
3）所得重组根癌农杆菌侵染拟南芥，获得过表达柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的拟南芥。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1)为：以柑橘叶片cDNA为模板，进行巢式PCR扩增获得柑橘漆酶家族基因CsiLAC4；巢式PCR扩增所用引物对包括正向引物F1和反向引物R1和R2；所述正向引物F1的序列如SEQ ID No .3所示；所述反向引物R1的序列如SEQ ID No .4所示；所述反向引物R2的序列如SEQ ID No .5所示。
柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 硼（boron，B）是植物生长、发育和进行有性生殖不可或缺的微量元素之一。但硼适合植物生长的浓度范围很窄，因而极易出现缺乏或中毒现象。硼毒害通常发生在富硼土壤中。在大量使用脱盐海水灌溉的干旱和半干旱地区，或含硼工业污染物排放严重的农业生
态系统中，硼毒害是导致多种农作物减产和品质下降的重要原因。即便在硼缺乏生态区，不恰当的硼肥施用也常引起植物的硼中毒现象。最近的研究表明，在我国东南沿海柑橘主产
区，硼肥的施用方式不当是导致柑橘硼毒害的关键因素。
态系统中，硼毒害是导致多种农作物减产和品质下降的重要原因。即便在硼缺乏生态区，不恰当的硼肥施用也常引起植物的硼中毒现象。最近的研究表明，在我国东南沿海柑橘主产
区，硼肥的施用方式不当是导致柑橘硼毒害的关键因素。
[0003] 柑橘是世界排名第一的经济果树。我国柑橘栽培面积与年产量目前均位列世界第一。柑橘硼毒害是近年来柑橘栽培生产中突发的一种生理性病害，在美洲、 欧洲和亚洲均已有报道。2015年，有学者对福建平和全县近80万亩的柑橘果园进行随机抽样调查，发现超过74%的果园中树体硼含量超标，硼毒害成为柑橘生产中急需解决的问题。全国柑橘产区硼毒害在近年的发生情况愈发普遍。培育优质、抗逆柑橘新品种是解决柑橘硼毒害的最有效
手段。然而，由于柑橘遗传背景复杂、世代周期长，常规育种方法无法满足现代柑橘产业发展对优新品种的需求。
手段。然而，由于柑橘遗传背景复杂、世代周期长，常规育种方法无法满足现代柑橘产业发展对优新品种的需求。
[0004] 研究表明，植物种间或种内不同品系间的硼毒害耐受能力差异显著。但植物如何抵御硼毒害的机理尚不明确。当前最为人们普遍接受的植物耐硼毒害机制是“基于转运蛋
白的硼外排机制”。在禾本科植物中，大麦（Hordeum vulgare）通过在根尖上调表达外排转运蛋白（BOR家族）减少对硼的吸收或下调表达外排转运受体（NIP家族）减少根系内硼向地上部的转运，或经叶片中上调表达外排转运蛋白基因BOR2，降低体内硼的累积，从而获得对硼毒害的耐受性。类似的机制随后也在拟南芥中得到确认。但“外排机制”无法解释诸如柑橘等许多物种中存在的“不同个体中具有相同的总硼含量却表现出截然不同的硼毒害耐受
性”这一现象。我们的最新研究表明，柑橘中受miR397调控的漆酶家族基因CsiLAC4可能参与木质素的次生代谢，其在木质部中特异性表达，可能减少硼由木质部向韧皮部的转运，从而降低过量硼对韧皮组织的毒害。因此，研究CsiLAC4的生物学功能及其在硼胁迫下作用机理对解析木本植物的耐硼毒害机制，以及培育耐硼毒害新品种来说均具有十分重要的意
义。目前，尚未见相关的研究报道。
白的硼外排机制”。在禾本科植物中，大麦（Hordeum vulgare）通过在根尖上调表达外排转运蛋白（BOR家族）减少对硼的吸收或下调表达外排转运受体（NIP家族）减少根系内硼向地上部的转运，或经叶片中上调表达外排转运蛋白基因BOR2，降低体内硼的累积，从而获得对硼毒害的耐受性。类似的机制随后也在拟南芥中得到确认。但“外排机制”无法解释诸如柑橘等许多物种中存在的“不同个体中具有相同的总硼含量却表现出截然不同的硼毒害耐受
性”这一现象。我们的最新研究表明，柑橘中受miR397调控的漆酶家族基因CsiLAC4可能参与木质素的次生代谢，其在木质部中特异性表达，可能减少硼由木质部向韧皮部的转运，从而降低过量硼对韧皮组织的毒害。因此，研究CsiLAC4的生物学功能及其在硼胁迫下作用机理对解析木本植物的耐硼毒害机制，以及培育耐硼毒害新品种来说均具有十分重要的意
义。目前，尚未见相关的研究报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了柑橘漆酶家族基因CsiLAC4，柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的核苷酸序列如
SEQ ID No. 1所示。在本发明中，所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4优选的来源于‘雪柑’
（Citrus sinensis），所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4包含1668 bp的开放阅读框。
SEQ ID No. 1所示。在本发明中，所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4优选的来源于‘雪柑’
（Citrus sinensis），所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4包含1668 bp的开放阅读框。
[0007] 优选的，所述柑橘为‘雪柑’或‘酸柚’。
[0008] 在本发明中柑橘漆酶家族基因CsiLAC4获得方法包括以下步骤：（1）从柑橘叶片中提取获得总RNA；（2）将步骤（1）所得RNA反转录获得cDNA；（3）以所得cDNA为模板，用正向引物F1和反向引物R1进行第一轮PCR扩增；（4）以第一轮增产物为模板，正向引物F1和反向引物R2巢式PCR扩增获得所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4。
[0009] 所述柑橘叶片为‘雪柑’叶片采用终浓度为400 μM硼毒害处理15周的‘雪柑’实生苗1/3植株高度处的叶片，所述柑橘RNA的提取采用分子生物学领域常规的植物组织RNA提取方法。反转录采用分子生物学领域的常规方法，优选的采用SMART™ RACE cDNA
Amplification Kit（Clontech）反转录试剂盒进行，具体方法步骤参照所述试剂盒的说明书。
Amplification Kit（Clontech）反转录试剂盒进行，具体方法步骤参照所述试剂盒的说明书。
[0010] 所述正向引物F1的 序列如SEQ ID No .3所示 ，具体为 5’-CGGATCCATGGACTCCTGGGTT
CGGCTTCT-3’；所述反向引物R1的序列如SEQ ID No. 4所示，具体为5’-
GCTACATCCTTCT
TCTCCAGCAAAC-3’；所述反向引物R2的序列如SEQ ID No. 5所示，具体为5’-CGAGCTCT
TAACACTTTGGAAGATCACTTGGAGGT-3’。
CGGCTTCT-3’；所述反向引物R1的序列如SEQ ID No. 4所示，具体为5’-
GCTACATCCTTCT
TCTCCAGCAAAC-3’；所述反向引物R2的序列如SEQ ID No. 5所示，具体为5’-CGAGCTCT
TAACACTTTGGAAGATCACTTGGAGGT-3’。
[0011] 所述巢式PCR扩增体系优选的为25 μL体系，所述扩增体系包括1 μL “100×稀释模板cDNA”或“500×第一轮PCR产物”，2×Trans TaqR DNA polymerase High Fidelity
(HiFi)，1.0 μM正向引物和1.0 μM的反向引物。2× Trans TaqR DNA polymerase High
Fidelity (HiFi)优选的购自北京全式金公司。本发明中所述扩增反应的程序优选的为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，循环完成后72 ℃延伸3 min。
(HiFi)，1.0 μM正向引物和1.0 μM的反向引物。2× Trans TaqR DNA polymerase High
Fidelity (HiFi)优选的购自北京全式金公司。本发明中所述扩增反应的程序优选的为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，循环完成后72 ℃延伸3 min。
[0012] 扩增获得所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4后，优选的将扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收后测序验证获得所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的核苷酸序列。
[0013] 对柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的核苷酸序列进行分析，获得柑橘漆酶家族基因CsiLAC4编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。所述CsiLAC4编码
的蛋白质包括555个氨基酸，等电点为7.15，理论分子量为60.39 KDa。本发明所述的蛋白质的亚细胞定位在细胞壁，属于胞外蛋白；能够有效的增强植株硼毒胁迫下的木质素次生合
成能力，从而提高了植株的耐硼毒性。
的蛋白质包括555个氨基酸，等电点为7.15，理论分子量为60.39 KDa。本发明所述的蛋白质的亚细胞定位在细胞壁，属于胞外蛋白；能够有效的增强植株硼毒胁迫下的木质素次生合
成能力，从而提高了植株的耐硼毒性。
[0014] 本发明提供了所述的柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的应用。
[0015] 在本发明中，所述植物优选的包括拟南芥。当本发明所述植物为拟南芥时，包括如下步骤：1) 获得柑橘漆酶家族基因CsiLAC4；2) 将柑橘漆酶家族基因CsiLAC4与质粒载体连接获得超量表达载体；3) 将步骤2）所得超量表达载体转入根癌农杆菌中获得重组根癌
农杆菌；4) 将步骤3）所得重组根癌农杆菌侵染拟南芥花序，获得过表达柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的拟南芥。
农杆菌；4) 将步骤3）所得重组根癌农杆菌侵染拟南芥花序，获得过表达柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的拟南芥。
[0016] 上述步骤1) 获得柑橘漆酶家族基因CsiLAC4优选的为：以‘雪柑’叶片cDNA为模板，进行巢式PCR扩增得到柑橘漆酶家族基因CsiLAC4；在本发明中所述巢式PCR扩增获得柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的具体方法和步骤参见上述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的获得方
法。
法。
[0017] 上述步骤2) 将柑橘漆酶家族基因CsiLAC4与载体连接获得超量表达载体；将步骤1）将所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4与载体连接获得超量表达载体，在本发明中所述载体
优选的为pCHF3载体，所述超量表达载体的构建方法包括以下步骤：将柑橘漆酶家族基因
CsiLAC4与pCHF3载体分别进行双酶切获得酶切片段和酶切载体；然后将所述酶切片段与所
述酶切载体连接获得超量表达载体。
优选的为pCHF3载体，所述超量表达载体的构建方法包括以下步骤：将柑橘漆酶家族基因
CsiLAC4与pCHF3载体分别进行双酶切获得酶切片段和酶切载体；然后将所述酶切片段与所
述酶切载体连接获得超量表达载体。
[0018] 构建超量表达载体过程中双酶切所用的限制性内切酶组合优选的为Bam H I和Sac I。在本发明中，所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4酶切的最优选温度为37 ℃，所述双酶切的时间优选为2 h；构建超量表达载体过程中所述CsiLAC4酶切的体系总体积优选的为50 μL，包含插入CsiLAC4的pEASY-T质粒1.5 μg，10× CutSmart缓冲液5 μL，Bam H I和Sac I各1 μL。在本发明中，所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4双酶切后，琼脂糖胶回收纯化酶切产物获得柑橘漆酶家族基因CsiLAC4酶切片段。在本发明中，所述pCHF3双酶切的优选温度为
37 ℃，所述pCHF3双酶切的优选时间为2 h；所述载体双酶切反应体积优选的为50 μL，包含所述pCHF3载体1.5 μg，10× CutSmart缓冲液5 μL，Bam H I和Asc I各1 μL，或Bam H I和Sac I各1 μL，双蒸水补足体系至50 μL。本发明在所述pCHF3双酶切后，胶回收法纯化酶切产物获得酶切pCHF3载体。
37 ℃，所述pCHF3双酶切的优选时间为2 h；所述载体双酶切反应体积优选的为50 μL，包含所述pCHF3载体1.5 μg，10× CutSmart缓冲液5 μL，Bam H I和Asc I各1 μL，或Bam H I和Sac I各1 μL，双蒸水补足体系至50 μL。本发明在所述pCHF3双酶切后，胶回收法纯化酶切产物获得酶切pCHF3载体。
[0019] 本发明在获得所述柑橘漆酶家族基因CsiLAC4酶切片段和pCHF3酶切载体后将酶切片段与酶切载体连接获得超量表达载体。在本发明连接反应中，所述柑橘漆酶家族基因
CsiLAC4酶切片段与所述酶切pCHF3载体的摩尔比为3：1。在本发明中所述连接反应的总体
积优选的为10 μL，包括10×连接Buffer 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切柑橘漆酶家族基因CsiLAC4回收片段2 ul，双酶切pCHF3回收载体6 μL。在本发明中，所述连接反应的优选温度为4 ℃；所述连接反应的时间优选为16 h。本发明在所述连接反应结束后收集所述连接
产物获得超量表达载体。
CsiLAC4酶切片段与所述酶切pCHF3载体的摩尔比为3：1。在本发明中所述连接反应的总体
积优选的为10 μL，包括10×连接Buffer 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切柑橘漆酶家族基因CsiLAC4回收片段2 ul，双酶切pCHF3回收载体6 μL。在本发明中，所述连接反应的优选温度为4 ℃；所述连接反应的时间优选为16 h。本发明在所述连接反应结束后收集所述连接
产物获得超量表达载体。
[0020] 本发明在获得超量表达载体后，优选的将所述超量表达载体转化大肠杆菌菌株DH5α，采用本领域常规的菌落PCR测序验证方法验证所述重组表达载体是否构建成功。
[0021] 本发明在获得pCHF3超量表达载体后，将所述超量表达载体转入根癌农杆菌EHA105中获得重组根癌农杆菌；在本发明中，将所述超量表达载体转入根癌农杆菌的方法
优选的为冻融法，在本发明中具体冻融法的方法步骤参照（萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年）。
优选的为冻融法，在本发明中具体冻融法的方法步骤参照（萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年）。
[0022] 本发明在获得所述重组根癌农杆菌后，将所述重组根癌农杆菌侵染拟南芥，获得过表达柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的拟南芥。在本发明中，所述重组根癌农杆菌侵染拟南芥的方法优先的为花序浸染法，在本发明中具体的花序浸染法的具体步骤参照：（Zhang X, Henr iques R, Lin S, Niu Q, Chua N. Agrobacterium-mediated transformation of
Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols, 2006, 1
(2): 1-6. doi:10.1038/nprot.2006.97）
本发明在获得所述转基因拟南芥株系后，优选的还进行了转基因阳性植株的PCR验证。
在本发明中所述PCR验证优选的为以Kanamycin抗性基因的特异引物PCR扩增检测。在获得
的拟南芥株系中，能扩增出预期大小的片段，则表明为阳性转基因株系。
Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols, 2006, 1
(2): 1-6. doi:10.1038/nprot.2006.97）
本发明在获得所述转基因拟南芥株系后，优选的还进行了转基因阳性植株的PCR验证。
在本发明中所述PCR验证优选的为以Kanamycin抗性基因的特异引物PCR扩增检测。在获得
的拟南芥株系中，能扩增出预期大小的片段，则表明为阳性转基因株系。
[0023] 本发明的有益效果：本发明提供的柑橘漆酶家族基因CsiLAC4，经转基因功能验证具有提高植物耐硼毒能力的作用，过表达柑橘漆酶家族基因CsiLAC4能够有效地降低转基
因植株根系对硼的吸收与转运，从而提高植株对硼毒害的耐受能力。本发明提供的柑橘漆
酶家族基因CsiLAC4为植物抵抗非生物逆境分子育种提供新的基因资源，该遗传资源的开
发利用有利于降低硼工业污染地区、大量施用脱盐海水灌溉的盐碱地，以及干旱半干旱地
区的农业生产成本和实现环境友好；柑橘漆酶家族基因CsiLAC4能够应用于耐硼毒害转基
因植物品种的培育，柑橘漆酶家族基因CsiLAC4过表达转基因植物，在硼胁迫条件下木质素的含量要比野生型高，植株体内总硼含量和自由态硼浓度更低，而生长、发育状况更好，表明柑橘漆酶家族基因CsiLAC4转基因植物耐硼毒能力提升。
附图说明
因植株根系对硼的吸收与转运，从而提高植株对硼毒害的耐受能力。本发明提供的柑橘漆
酶家族基因CsiLAC4为植物抵抗非生物逆境分子育种提供新的基因资源，该遗传资源的开
发利用有利于降低硼工业污染地区、大量施用脱盐海水灌溉的盐碱地，以及干旱半干旱地
区的农业生产成本和实现环境友好；柑橘漆酶家族基因CsiLAC4能够应用于耐硼毒害转基
因植物品种的培育，柑橘漆酶家族基因CsiLAC4过表达转基因植物，在硼胁迫条件下木质素的含量要比野生型高，植株体内总硼含量和自由态硼浓度更低，而生长、发育状况更好，表明柑橘漆酶家族基因CsiLAC4转基因植物耐硼毒能力提升。
附图说明
[0024] 图1硼毒害处理柑橘叶片总RNA； C. sinensis：‘雪柑’； C. grandis：‘酸柚’。
[0025] 图2长期硼毒害处理对‘雪柑’和‘酸柚’叶片中CsiLAC4表达水平的影响；Control：10 μM硼酸处理； B-toxicity：400 μM硼酸处理； C. sinensis：‘雪柑’； C. grandis：‘酸柚’。
[0026] 图3硼毒害对‘雪柑’和‘酸柚’细胞壁主要成分含量的影响；C. sinensis：‘雪柑’； C. grandis：‘酸柚’；（a）：细胞壁粗提物；（b）：果胶；（c）：半纤维素1；（d）；半纤维素2；（e）：纤维素；（f）：木质素；不同字母示差异达显著水平（P < 0.05，independent sample t-test）
图4 CsiLAC4蛋白的亚细胞定位；Light：光镜下的细胞形态；GFP ：绿色荧光信号；
DAPI：细胞核信号；Merged：重合图像。
图4 CsiLAC4蛋白的亚细胞定位；Light：光镜下的细胞形态；GFP ：绿色荧光信号；
DAPI：细胞核信号；Merged：重合图像。
[0027] 图5 CsiLAC4转基因阳性植株的PCR验证结果；dH2O：阴性对照；pCHF3-CsiLAC4-GFP：阳性对照。
[0028] 图6不同硼浓度处理对CsiLAC4转基因拟南芥表型的影响；A：不同硼浓度（B concentration）处理植株地上部鲜重（Fresh weight）、根长（Root length）、上胚轴长度（Hypocotyl length）统计结果；Wild type：野生型拟南芥；OXCsiLAC4：CsiLAC4转基因拟南芥；B：不同硼浓度处理上胚轴长度的影响；C：不同硼浓度处理根长的影响。
[0029] 图7不同硼浓度处理对CsiLAC4转基因拟南芥地上部硼含量（A）和上胚轴维管束结构（B）的影响；B中浅色背景图为光镜下的上胚轴横截面形态，深色背景图为荧光显微镜下的上胚轴维管束中木质素的自发荧光（亮区）；Total B：总硼含量；Free B：自由态硼含量；
Wild type：野生型拟南芥；OXCsilAC4：CsiLAC4转基因拟南芥。
Wild type：野生型拟南芥；OXCsilAC4：CsiLAC4转基因拟南芥。
具体实施方式
[0030] 下面结合实施例对本发明提供的柑橘漆酶家族基因CsiLAC4及其应用进行详细的说明。
[0031] 实施例1柑橘漆酶家族基因CsiLAC4全长cDNA的克隆根据柑橘漆酶家族基因CsiLAC4的基因序列使用Primer premier 5 .0设计引物，结合
RT-PCR与巢式PCR方法从雪柑上扩增出其全长。详细步骤如下：
材料为种植于福建省农业科学院果树研究所柑橘温网室的‘雪柑’实生苗，苗龄为11
周。经每隔1天施以添加400 μM硼酸Hoagland's营养液进行为期15周的硼毒害处理后，取位于基部以上第 20 - 25 片成叶（1/3 植株高度位置），立即用液氮进行速冻。采用TRIzol法提取总RNA，具体方法如下：
实验前的准备：用10％（v/v）DEPC水处理实验所需的各类移液枪头、离心管、研钵以及
研棒。所需实验用品均要提前处理12 h以上，高温高压灭菌，烘干备用。
RT-PCR与巢式PCR方法从雪柑上扩增出其全长。详细步骤如下：
材料为种植于福建省农业科学院果树研究所柑橘温网室的‘雪柑’实生苗，苗龄为11
周。经每隔1天施以添加400 μM硼酸Hoagland's营养液进行为期15周的硼毒害处理后，取位于基部以上第 20 - 25 片成叶（1/3 植株高度位置），立即用液氮进行速冻。采用TRIzol法提取总RNA，具体方法如下：
实验前的准备：用10％（v/v）DEPC水处理实验所需的各类移液枪头、离心管、研钵以及
研棒。所需实验用品均要提前处理12 h以上，高温高压灭菌，烘干备用。
[0032] ①取‘雪柑’叶片，在研钵中倒入液氮，迅速将样品充分研磨成粉末状，取0.1 g组织粉末迅速转移至装有1 mL TRIzol提取液的1.5 mL离心管中，充分震荡后室温裂解5-10 min。
[0033] ②加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置2-3分钟，4 ℃，12,000 × g离心10 min。 ③转移上层水相至另一干净的1.5 mL离心管内， 加入0.5 mL异丙醇，室温静置10
min，4 ℃，12,000 × g离心10 min。
min，4 ℃，12,000 × g离心10 min。
[0034] ④倾去上清，加入1 mL 75%（v/v）乙醇，震荡5-10 s，4 ℃，7,500 × g离心5 min。
[0035] ⑤重复步骤④一次。
[0037] ⑦加入50 ul DEPC处理水，室温放置5-10 min溶解，取1 uL用Nano-Drop仪进行检测浓度为1350 ng/uL。琼脂糖凝胶电泳检测纯度及完整性后（图1）保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。
[0038] ⑧取1 μg总RNA样品，加入1 U DNase I 37 ℃处理30min后置于冰上。SMART™ RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）逆转录合成全长cDNA第一链。所得的第一链
cDNA用于柑橘漆酶家族基因CsiLAC4基因的巢式PCR扩增。
cDNA用于柑橘漆酶家族基因CsiLAC4基因的巢式PCR扩增。
[0039] 第一轮PCR体系：PCR程序:
第二轮（巢式）PCR体系：
PCR程序:
扩增产物经0.8wt％的琼脂糖凝胶电泳后产生单一条带，切胶并用回收试剂盒按《使用
说明》步骤回收特异目的条带。回收纯化的片段与pEASY-T1载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为3:1连接。反应总体积是5μL，其中pEASY-T1载体1 μL，PCR纯化产物，4 μL。4 ℃过夜连接。热击法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证（与上述基因扩增时的巢式PCR程序一致）并测序（由生工生物工程公司完成）。
第二轮（巢式）PCR体系：
PCR程序:
扩增产物经0.8wt％的琼脂糖凝胶电泳后产生单一条带，切胶并用回收试剂盒按《使用
说明》步骤回收特异目的条带。回收纯化的片段与pEASY-T1载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为3:1连接。反应总体积是5μL，其中pEASY-T1载体1 μL，PCR纯化产物，4 μL。4 ℃过夜连接。热击法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证（与上述基因扩增时的巢式PCR程序一致）并测序（由生工生物工程公司完成）。
[0040] 实施例2长期硼毒害胁迫下CsiLAC4基因的qRT-PCR分析及其与细胞壁次生代谢的关系
为了分析硼毒害敏感‘酸柚’和硼毒害不敏感‘雪柑’中柑橘漆酶家族基因CsiLAC4基因
对长期硼毒害胁迫的响应模式，使用Real-time PCR技术对CsiLAC4基因的表达模式进行分
析。
为了分析硼毒害敏感‘酸柚’和硼毒害不敏感‘雪柑’中柑橘漆酶家族基因CsiLAC4基因
对长期硼毒害胁迫的响应模式，使用Real-time PCR技术对CsiLAC4基因的表达模式进行分
析。
[0041] 使用Primer premier 5 .0软件设计CsiLAC4基因以及内参基因β-actin的qRT-PCR特异引物，CsiLAC4的qRT-PCR特异引物正向和反向引物序列分别为SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；β-actin的qRT-PCR特异引物正向和反向引物序列分别为SEQ ID No. 8和
SEQ ID No. 9所示。
SEQ ID No. 9所示。
[0042] 采用TRIzol法分别提取经每隔1天施以添加10 μM硼酸（Control）或400 μM硼酸（B-toxicity）的Hoagland's营养液进行为期15周硼胁迫处理的硼毒害敏感‘酸柚’和硼毒害不敏感‘雪柑’叶片的总RNA，cDNA第一链的合成参照Maxima First Strand cDNA
Synthesis Kit（Thermo Scientific™，USA）反转录试剂盒的操作手册进行。在10 μL的qRT-PCR反应体系中加入：5 μL 2 × Mix，0 .1 μL cDNA，正、向引物各0.25 μL，4.4 μL水；
以β-actin为内参基因。定量PCR的程序如下：
在‘雪柑’叶片中，长期硼毒害处理引起 CsiLAC4表达显著上调；而在‘酸柚’叶片中硼
毒害引起CsiLAC4表达显著下调（图2）。‘酸柚’叶片中CsiLAC4显著下调引起细胞壁干物质比重下降，主要引起果胶、半纤维素1（HC1）和半纤维素2（HC2）成分含量的下降，但不降低Klason木质素含量。相反，硼毒害虽然对‘雪柑’叶片细胞壁干物质百分比没有显著影响，但是CsiLAC4的上调表达引起细胞壁主要成分含量发生显著变化，主要表现为HC1含量降低和
Klason木质素含量增加（图3）。
Synthesis Kit（Thermo Scientific™，USA）反转录试剂盒的操作手册进行。在10 μL的qRT-PCR反应体系中加入：5 μL 2 × Mix，0 .1 μL cDNA，正、向引物各0.25 μL，4.4 μL水；
以β-actin为内参基因。定量PCR的程序如下：
在‘雪柑’叶片中，长期硼毒害处理引起 CsiLAC4表达显著上调；而在‘酸柚’叶片中硼
毒害引起CsiLAC4表达显著下调（图2）。‘酸柚’叶片中CsiLAC4显著下调引起细胞壁干物质比重下降，主要引起果胶、半纤维素1（HC1）和半纤维素2（HC2）成分含量的下降，但不降低Klason木质素含量。相反，硼毒害虽然对‘雪柑’叶片细胞壁干物质百分比没有显著影响，但是CsiLAC4的上调表达引起细胞壁主要成分含量发生显著变化，主要表现为HC1含量降低和
Klason木质素含量增加（图3）。
[0043] 实施例3 柑橘漆酶家族基因CsiLAC4基因的亚细胞定位根据CsiLAC4基因的核苷酸序列和pCHF3-GFP载体图，在CsiLAC4基因序列前后分别加
入Bam H I和Sac I酶切位点。酶切位点的序列如下所示：
带酶切位点的引物序列如下所示：
SEQ ID No. 3正向引物：CGGATCCATGGACTCCTGGGTTCGGCTTCT ，其中下划线部分为Bam
H I酶切位点；
SEQ ID No. 10反向引物：CGGCGCGCCAACACTTTGGAAGATCACTTGGAGGT，其中下划线部分
为Asc I酶切位点。
入Bam H I和Sac I酶切位点。酶切位点的序列如下所示：
带酶切位点的引物序列如下所示：
SEQ ID No. 3正向引物：CGGATCCATGGACTCCTGGGTTCGGCTTCT ，其中下划线部分为Bam
H I酶切位点；
SEQ ID No. 10反向引物：CGGCGCGCCAACACTTTGGAAGATCACTTGGAGGT，其中下划线部分
为Asc I酶切位点。
[0044] 以测序结果正确的含CsiLAC4基因的pEASY-T提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物扩增，所用PCR程序为实例1中的巢式PCR程序。
[0045] CsiLAC4序列3′去除了AA两个碱基，目的去除终止密码子TAA，让基因与GFP融合。PCR产物经0.8％（wt）琼脂糖凝胶电泳、胶回收试剂盒回收。纯化的PCR片段送测序公司，测序确认后将其和pCHF3-GFP载体质粒分别用Bam H I和Asc I进行双酶切。酶切体系为50 μ
L，包括CsiLAC4的PCR纯化产物35 μL或pCHF3-GFP载体1.5 μg，10× CutSmart缓冲液5 μL，Bam H I和Asc I各1 μL，双蒸水补足至总体积50 μL，37 ℃酶切2 h。胶回收酶切过后的产物CsiLAC4基因和pCHF3-GFP载体。两者经T4-DNA连接酶连接，连接体系为10 μL，其中10×连接Buffer 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切CsiLAC4回收片段2 ul，双酶切pCHF3回收载体6 μL，4 ℃过夜。转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆进一步测序确认序列。将得到的重组载体命名为pCHF3-CsiLAC4-GFP。
L，包括CsiLAC4的PCR纯化产物35 μL或pCHF3-GFP载体1.5 μg，10× CutSmart缓冲液5 μL，Bam H I和Asc I各1 μL，双蒸水补足至总体积50 μL，37 ℃酶切2 h。胶回收酶切过后的产物CsiLAC4基因和pCHF3-GFP载体。两者经T4-DNA连接酶连接，连接体系为10 μL，其中10×连接Buffer 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切CsiLAC4回收片段2 ul，双酶切pCHF3回收载体6 μL，4 ℃过夜。转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆进一步测序确认序列。将得到的重组载体命名为pCHF3-CsiLAC4-GFP。
[0046] 冻融法（萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社， 2002年）将重组载体pCHF3-CsiLAC4-GFP和pCHF3-GFP空载质粒分别导入根癌农杆菌EHA105中获取重组根癌农杆菌。阳性重组EHA105克隆用含终浓度为20 mg/L利福平和终浓度为50 mg/L
卡那霉素的LB液体培养基在28 ℃，220 rpm恒温摇床震荡培养48 h。培养液经10,000 rpm
离心1 min收集菌体，质量百分比浓度为5%蔗糖溶液（含体积百分比为0.02% Silwet L-77，终浓度为100 mM乙酰丁香酮）重悬浮（OD600=0.5）。重悬液与洋葱内表皮共培养48-72 h。通过GFP荧光的位置来确定CsiLAC4蛋白的亚细胞定位情况。结果如图4所示，其中CsiLAC4-
GFP产生的绿色荧光分布在洋葱表皮细胞的外壁上；空载体的绿色荧光主要分布在细胞核
内和细胞质中，而在细胞壁中未发现绿色荧光。表明CsiLAC4基因定位于细胞壁上，是一个胞外蛋白。
卡那霉素的LB液体培养基在28 ℃，220 rpm恒温摇床震荡培养48 h。培养液经10,000 rpm
离心1 min收集菌体，质量百分比浓度为5%蔗糖溶液（含体积百分比为0.02% Silwet L-77，终浓度为100 mM乙酰丁香酮）重悬浮（OD600=0.5）。重悬液与洋葱内表皮共培养48-72 h。通过GFP荧光的位置来确定CsiLAC4蛋白的亚细胞定位情况。结果如图4所示，其中CsiLAC4-
GFP产生的绿色荧光分布在洋葱表皮细胞的外壁上；空载体的绿色荧光主要分布在细胞核
内和细胞质中，而在细胞壁中未发现绿色荧光。表明CsiLAC4基因定位于细胞壁上，是一个胞外蛋白。
[0047] 实施例4柑橘漆酶家族基因CsiLAC4在提高拟南芥耐硼毒能力中的应用（1）植物转化载体构建
TIANprep Mini Plasmid Kit II（TIANGEN，Beijing）质粒小提试剂盒提取测序确认正确的含CsiLAC4基因序列的pEASY-T质粒和pCHF3-GFP载体质粒，分别用Bam H I和Sac I进
行双酶切。酶切体系均为50 μL，分别包括含CsiLAC4基因序列的pEASY-T质粒或pCHF3-GFP载体1.5 μg，10× CutSmart缓冲液5 μL，Bam H I和Asc I各1 μL，双蒸水补足至总体积50 μL，37 ℃酶切2 h。胶回收酶切过后的产物CsiLAC4基因片段和pCHF3-GFP载体，将两者经T4-DNA连接酶连接，连接体系为10 μL，包含10×连接Buffer 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切CsiLAC4回收片段与双酶切pCHF3回收载体按摩尔比3:1计算，4 ℃过夜。转化大肠杆菌感受态DH5α，阳性克隆经测序公司进一步确认序列。将得到的超量表达载体命名为pCHF3-
CsiLAC4。
TIANprep Mini Plasmid Kit II（TIANGEN，Beijing）质粒小提试剂盒提取测序确认正确的含CsiLAC4基因序列的pEASY-T质粒和pCHF3-GFP载体质粒，分别用Bam H I和Sac I进
行双酶切。酶切体系均为50 μL，分别包括含CsiLAC4基因序列的pEASY-T质粒或pCHF3-GFP载体1.5 μg，10× CutSmart缓冲液5 μL，Bam H I和Asc I各1 μL，双蒸水补足至总体积50 μL，37 ℃酶切2 h。胶回收酶切过后的产物CsiLAC4基因片段和pCHF3-GFP载体，将两者经T4-DNA连接酶连接，连接体系为10 μL，包含10×连接Buffer 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，双酶切CsiLAC4回收片段与双酶切pCHF3回收载体按摩尔比3:1计算，4 ℃过夜。转化大肠杆菌感受态DH5α，阳性克隆经测序公司进一步确认序列。将得到的超量表达载体命名为pCHF3-
CsiLAC4。
[0048] 将超量表达载体pCHF3-CsiLAC4导入根癌农杆菌EHA105的方法与实例3中的冻融法相同。经PCR确认的pCHF3-CsiLAC4菌株经LB液体培养后采用甘油保存于-80 ℃冰箱中。
[0049] （2）农杆菌介导的拟南芥遗传转化及转基因植株筛选①野生型拟南芥的培养：野生型拟南芥种子于4 ℃冰箱中储藏3-4 d以打破休眠。随后
将种子播种于8 cm × 8 cm塑料盆内。用保鲜膜将盆口包好。20 ℃人工气候箱内培养，光/暗周期为16 h /8 h。待种子萌发后挑破保鲜膜让芽长出。
将种子播种于8 cm × 8 cm塑料盆内。用保鲜膜将盆口包好。20 ℃人工气候箱内培养，光/暗周期为16 h /8 h。待种子萌发后挑破保鲜膜让芽长出。
[0050] ②农杆菌培养：取超低温冰箱（-80 ℃）中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了终浓度为50 mg/L卡那霉素的LB平板培养基上划线，28 ℃培养后刮取划线菌斑，加入液体LB基本培养基中，28 ℃，250 rpm振荡培养，待菌液浓度达到OD600=0.8时，10,000 rpm离心1 min收集菌体，质量百分比浓度为5%蔗糖溶液（含体积百分比浓度0.02% 的Silwet L-77，终浓度为100 mM的乙酰丁香酮）重悬浮至OD600=0.5。新鲜制备的菌悬液用于浸染。
[0051] ③拟南芥花序浸染：待盆内4/5拟南芥花序长至10 cm长时，将花盆倒扣让花序全部浸入新鲜制备的菌悬液中，轻微搅拌菌悬液10 s后取出，抖去多余菌液，用塑料薄膜或保鲜膜将花序连同花盆一起封好，室温水平放置以保湿16-24h。移除覆盖薄膜并将花盆重新
移入20 ℃人工气候箱内培养（光/暗周期为16 h /8 h）继续培养1个月，停止浇水，等待种夹成熟后收取T1代种子。
移入20 ℃人工气候箱内培养（光/暗周期为16 h /8 h）继续培养1个月，停止浇水，等待种夹成熟后收取T1代种子。
[0052] ④转基因拟南芥的筛选：收获的T1代拟南芥种子经4 ℃春化处理打破休眠后，70%（v/v）乙醇处理1 min，0.1%（v/v） HgCl（含0.05% （v/v）Tween-20）消毒10 min，无菌水彻底漂洗5次，0.05%（wt）琼脂悬浮种子并播种于含终浓度为50 mg/L卡那霉素和终浓度为100 mg/L头孢霉素的MS固体选择培养基平板上。将平板置于20℃连续光照培养箱中培养7-10
d，将T1代阳性转基因拟南芥小苗移栽植于灭菌的营养土中继续培养并进行PCR验证。
d，将T1代阳性转基因拟南芥小苗移栽植于灭菌的营养土中继续培养并进行PCR验证。
[0053] ⑤转基因拟南芥的PCR验证：取T1代阳性转基因拟南芥叶片，加液氮充分研磨后，取0.1 g粉末用Plant DNA Mini Kit（Omega）按照《使用说明》步骤提取DNA。使用Primer premier 5 .0软件设计Kanamycin抗性标签基因正向、反向引物，序列分别如SEQ ID No.
11和SEQ ID No. 12所示。
11和SEQ ID No. 12所示。
[0054] PCR体系：PCR程序:
（3）CsiLAC4转基因拟南芥的耐硼毒害功能检测
收取CsiLAC4转基因拟南芥3个T1代株系的自交种子（T2），春化后分别播种于含终浓度
为50 mg/L卡那霉素和终浓度为100 mg/L头孢霉素的MS固体选择培养基平板上进行筛选，
收获T2株系的纯合自交种子（T3），保存于4 ℃冰箱内用作耐硼毒害功能检测。
（3）CsiLAC4转基因拟南芥的耐硼毒害功能检测
收取CsiLAC4转基因拟南芥3个T1代株系的自交种子（T2），春化后分别播种于含终浓度
为50 mg/L卡那霉素和终浓度为100 mg/L头孢霉素的MS固体选择培养基平板上进行筛选，
收获T2株系的纯合自交种子（T3），保存于4 ℃冰箱内用作耐硼毒害功能检测。
[0055] 为了鉴定CsiLAC4转基因拟南芥是否耐硼毒害胁迫，将拟南芥对照系（野生型）和CsiLAC4转基因拟南芥T3系进行硼毒害胁迫处理。检测时，野生型（Wild type）和T3代种子经70%（v/v）乙醇处理1 min，0.1%（w/v）HgCl（含0.05%（v/v）Tween-20）消毒10 min，无菌水漂洗5次，播种于添加有不同浓度硼酸的1/2 MS固体培养基平板上。将平板置于20℃连续光照培养箱中培养14 d后，观察其表型，并分别测量地上部鲜重、根长、上胚轴长度。野生型拟南芥根长随培养基中硼酸浓度的增加显著缩短，而在CsiLAC4转基因拟南芥在终浓度低于2 mM硼酸处理下根长的缩短趋势不明显，只在终浓度高于2 mM硼酸处理条件下出现显著根生
长抑制。野生型和CsiLAC4转基因拟南芥地上部鲜重均随培养基中硼酸浓度的增加呈下降
趋势，但各个硼酸浓度处理的CsiLAC4转基因拟南芥地上部鲜重均显著高于野生型。野生型拟南芥上胚轴长度随硼酸浓度增加呈现增长趋势，但不明显；CsiLAC4转基因拟南芥在终浓度低于2 mM硼酸处理条件下上胚轴长度极显著增长，随后呈下降趋势（图6）。我们的结果表明，T3代转基因植株明显比野生型表现更耐硼毒害。
长抑制。野生型和CsiLAC4转基因拟南芥地上部鲜重均随培养基中硼酸浓度的增加呈下降
趋势，但各个硼酸浓度处理的CsiLAC4转基因拟南芥地上部鲜重均显著高于野生型。野生型拟南芥上胚轴长度随硼酸浓度增加呈现增长趋势，但不明显；CsiLAC4转基因拟南芥在终浓度低于2 mM硼酸处理条件下上胚轴长度极显著增长，随后呈下降趋势（图6）。我们的结果表明，T3代转基因植株明显比野生型表现更耐硼毒害。
[0056] 植物对硼毒害的耐受性与体内的硼含量——尤其是自由态硼的浓度有关。通过测定野生型拟南芥与CsiLAC4转基因株系拟南芥地上部分的硼浓度，我们发现，在终浓度低于
2 mM的硼酸处理条件下，野生型与转基因植株的总硼与自由态硼的含量均随培养基中的硼
浓度增加而显著上升，但同一硼酸水平下，转基因植株的总硼与自由态硼浓度均分别显著
低于野生型的总硼与自由态硼浓度（图7A）。表明过表达CsiLAC4基因能够有效的增强转基因植株的耐硼毒害能力。
2 mM的硼酸处理条件下，野生型与转基因植株的总硼与自由态硼的含量均随培养基中的硼
浓度增加而显著上升，但同一硼酸水平下，转基因植株的总硼与自由态硼浓度均分别显著
低于野生型的总硼与自由态硼浓度（图7A）。表明过表达CsiLAC4基因能够有效的增强转基因植株的耐硼毒害能力。
[0057] CsiLAC4隶属于漆酶基因家族，参与木质素的次生代谢。以不同浓度硼酸处理的上胚轴为材料，开展维管组织的解剖学研究，结果表明，10 μM硼酸处理对CsiLAC4转基因株系维管组织次生代谢无明显影响，但随着培养基中硼酸浓度的增加，维管束鞘发生明显的木
质素次生沉积；当硼酸浓度达到2 mM时，维管束鞘不再沉积木质素，但木质部中的导管分子数量显著增加（图7B）。表明CsiLAC4基因参与的木质素次生合成调控需要高浓度硼的参与。
质素次生沉积；当硼酸浓度达到2 mM时，维管束鞘不再沉积木质素，但木质部中的导管分子数量显著增加（图7B）。表明CsiLAC4基因参与的木质素次生合成调控需要高浓度硼的参与。
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