水稻OsI2蛋白、编码该蛋白的基因及应用
阅读：1019发布：2020-08-30
专利汇可以提供水稻OsI2蛋白、编码该蛋白的基因及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种与 水 稻抗逆性相关的OsI2蛋白及编码具有水稻OsI2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ IDNO.2中第89-364位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.2中第89-364位的核苷酸序列杂交。本发明提供的水稻OsI2基因在增强 植物 (水稻、拟南芥、 烟草 等)抗逆性(包括但不限于抗旱、耐低温、耐高盐等非 生物 逆境胁迫)方面具有明显的作用，具有很大的应用价值，能够明显减少 农作物 在干旱、半干旱或者高盐、低温等条件下生物产量的损失；另外，水稻OsI2基因在缩短小穗枝梗长度，调节水稻果穗形态等方面作用明显。，下面是水稻OsI2蛋白、编码该蛋白的基因及应用专利的具体信息内容。
1.水稻OsI2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述水稻OsI2蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列与SEQID No.2所示的从
89-364位的核苷酸序列具有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从
89-364位的核苷酸序列杂交。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQID No.2所示的从
89-364位的核苷酸序列。
5.一种核酸探针分子，其特征在于，其由权利要求2-4任一项所述水稻OsI2基因序列的8-100个连续核苷酸组成。
6.含有权利要求2-4任一项所述基因的载体。
7.含有权利要求6所述载体的宿主细胞。
8.含有权利要求2-4任一项所述基因的转化植物细胞。
9.权利要求2-4任一项所述基因在提高植物抗逆性中的应用。
10.权利要求2-4任一项所述基因在缩短水稻穗一次枝梗和二次枝梗，调节水稻穗型使之紧凑化中的应用。
水稻OsI2蛋白、编码该蛋白的基因及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻OsI2蛋白、编码该蛋白的基因及应用。
背景技术
[0002] 水稻是农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国的粮食、水和生态安全具有重要意义。利用基因工程技术进行分子育种，将抗旱基因转入优良的水稻品种中，从而改良其抗旱性，培育既抗旱又高产优质的农作物新品种是抗旱育种的有效途径之一。
[0003] 发掘抗旱基因是抗旱分子育种的基础。已发表的抗旱相关基因及其蛋白的研究越来越多。目前，虽然与植物抵御非生物逆境有关的基因及蛋白不断被发掘鉴定出来，同时还有更多和复杂的基因及蛋白被证明与植物抗逆有关，但是其作用机理和结构模式尚不清晰。OsI2基因及其编码蛋白即属于这一类。植物核基因组的基因编码模式大多使用一般密码子编码，但是也有极少数质体及线粒体基因的编码方式比较特别，采用特殊密码子编码蛋白。所以正确解析鉴定抗旱相关基因的编码方式，对正确了解蛋白功能至关重要。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种与水稻抗逆性相关的OsI2蛋白及编码该蛋白的基因。
[0005] 本发明的另一目的是提供编码水稻OsI2蛋白的基因在提高植物非生物逆境条件下的抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、抗盐等)中的应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种水稻OsI2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007] 编码上述水稻OsI2蛋白的基因，优选地，其编码的核苷酸序列与SEQ ID No.2所示的从89-364位的核苷酸序列具有至少70％的同源性；或者所述基因编码的核苷酸序列能与SEQ ID NO.2中从89-364位的核苷酸序列杂交。
[0008] 更优选地，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的从89-364位的核苷酸序列。
[0009] 本发明还提供一种核酸探针分子，其含有上述水稻OsI2基因编码序列的8-100个连续核苷酸，优选地，含有上述水稻OsI2基因编码序列的15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码水稻OsI2相关的核酸分子。
[0010] 本发明还提供含有上述水稻OsI2基因的载体。
[0011] 本发明还提供含有上述水稻OsI2基因载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为真核细胞。
[0012] 本发明还提供含有上述水稻OsI2基因的转化植物细胞。优选地，所述植物为水稻。
[0013] 本发明还提供上述水稻OsI2基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、抗盐等)中的应用。
[0014] 本发明进一步提供上述水稻OsI2基因在缩短水稻穗一次枝梗和二次枝梗，调节水稻穗型使之紧凑化中的应用。
[0015] 本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
[0016] 前述的水稻OsI2蛋白，其为具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多肽或其保守性变异多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。
[0017] 在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
[0018] 在本发明中，术语“水稻抗逆蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有水稻OsI2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2中第89-364位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ IDNO.2序列的编码框第89-364位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.2中第89-364位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。本发明采用线粒体偏爱密码子编码蛋白。
[0019] 该术语还包括能在中度严谨条件(70-85％序列一致性)下，优选地，在高度严紧条件(85％以上序列一致性)下与SEQ ID NO.2中从核苷酸第89-364位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.2中从核苷酸第89-364位的核苷酸序列的同源性至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的核苷酸序列。
[0020] 该术语还包括能编码具有与天然的水稻OsI2相同功能的蛋白的SEQ ID NO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，优选为1-60个，更优选为1-20个，最优选为1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，优选为30个以内，更优选为10个以内，最优选为5个以内)核苷酸。
[0021] 在本发明中，术语“水稻抗旱蛋白或多肽”、“调节叶绿体发育蛋白或多肽”，指具有水稻OsI2蛋白活性的SEQ ID NO.1序列的多肽。该术语还包括具有与天然水稻OsI2相同功能的SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，优选为1-30个，更优选为1-20个，最优选为1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，优选为10个以内，更优选为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻OsI2蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0022] 本发明的水稻OsI2多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与水稻OsI2相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白，以及利用水稻OsI2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0023] 在本发明中，“水稻OsI2保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.1的氨基酸序列相比，有至多10个，优选为至多8个，更优选为至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽按照表1进行替换而产生。
[0024] 表1可替换氨基酸
[0025]替换前的残基 替换后的残基 优选的替换残基
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
[0026]
[0027] 本发明还包括水稻OsI2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻OsI2相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的具有代表性的多肽。
[0028] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
[0029] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的水稻OsI2多肽时，可以将水稻OsI2编码序列可操作地连接表达调控序列，从而形成水稻OsI2蛋白表达载体。
[0030] 在本发明中，“可操作地连接”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连接多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连接编码序列。一般，“可操作地连接”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0032] 还可用Northern印迹法技术分析水稻OsI2基因产物的表达，即分析水稻OsI2的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
[0033] 此外，根据本发明的水稻OsI2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选水稻OsI2相关同源基因或同源蛋白。
[0034] 为了得到与水稻OsI2相关基因相关的水稻cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选水稻cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对水稻OsI2相关的全部或部分做放射活性标记而得。最适合于筛选的cDNA文库是来自水稻的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech、Stratagene、Palo Alto、Cal.等。这种筛选方法可以识别与水稻OsI2相关的基因家族的核苷酸序列。
[0035] 本发明的水稻OsI2相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增获得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确顺序拼接在一起。
[0036] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0037] 此外，还可通过化学合成法将突变引入本发明蛋白序列中。
[0038] 除了重组法之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以 生 产 (Stewart 等，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接，以产生全长的分子。
[0039] 利用本发明的水稻OsI2蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与水稻OsI2相关基因或蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0040] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0041] (1)本发明的水稻OsI2基因及其编码蛋白在植物抗旱性方面具有明显作用，能够显著降低在干旱土地上种植的各种农作物生物产量的损失，具有很大的应用价值。
[0042] (2)利用转基因技术得到改良的含有本发明水稻OsI2基因的转化植物在包括干旱、低温、高盐等条件下，生长、生存状况明显优于野生型植物，表明了水稻OsI2基因能够明显提高植物的抗逆性。
[0044] 图1为干旱胁迫下水稻IRAT109中OsI2基因的表达量变化，其中A、B分别为叶片、根系中的表达变化值。
[0045] 图2为干旱胁迫下OsI2基因在IRAT109分蘖期和孕穗期的表达量变化，其中A、B分别为分蘖期、孕穗期的表达变化值。
[0047] 图4为转OsI2烟草苗期干旱胁迫实验结果。
[0048] 图5表明转OsI2烟草对不同浓度ABA抗性增强。
[0049] 图6表明超表达OsI2转基因烟草叶片持水能力增强。
[0050] 图7为超表达OsI2拟南芥植株，芽期NaCl(100mmol/L)胁迫实验结果。
[0051] 图8为超表达OsI2拟南芥植株，芽期甘露醇(150mmol/L)胁迫实验结果。
[0052] 图9为超表达OsI2拟南芥植株，苗期PEG6000(20％)模拟干旱胁迫实验结果。
具体实施方式
[0053] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0054] 以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如Sambrook等，《分子克隆实验指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。实施例1水稻基因OsI2在水稻品种IRAT109中表达谱分析
[0055] 1.PEG模拟旱处理苗期水稻
[0056] IRAT109种子(由上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存)催芽后，采用营养液培养的方式培养水稻，至四叶一心；然后用20％的PEG6000溶液模拟干旱胁迫，并在不同的时间点取样，提取总RNA。实验以同时期的水培材料为对照(ck)。
[0057] 2.自然干旱处理水稻
[0058] IRAT109种子催芽后，移栽到土中培养，分蘖盛期(六叶一心)、孕穗期(减数分裂时期)进行旱处理。在各个时期，当盆中土层无水时开始断水，同时作为旱处理的开始，在旱处理时期的每天同一时间剪取植株叶片，投入液氮中冷冻用于RNA提取。
[0059] 3.RNA的提取：取部分组织，在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有TRIzol试剂(天根生化科技有限公司)的1.5mL EP管，充分振荡后，室温放置5分钟，于4℃，12000r/min离心15min后，上清液移至新的1.5mL EP管中，氯仿去蛋白后，等体积异丙醇沉淀RNA，溶解后用Dnase消化降解残留DNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
[0060] 4.定量PCR(qRT-PCR)分析
[0061] 定量PCR体系与方法：qRT-PCR反应使用美国 7000定量PCR仪，使用Takara公司的定量PCR试剂盒。每个PCR反应重复三次。反应体系包TM
含SYBR Premix Ex Taq (2×)12.5μL，正、反向引物(定量PCR扩增引物序列为：F：
5’-AGAAACACTTTCTTCTTCG-3’，R：5’-ATAGATAAAGGCATGCATCG-3’)各0.5μL，各种处理的cDNA模板1μL，加水补足体积至20μL。反应条件如下：95℃10s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，设定在每个循环中60℃1s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其它具体操作详见仪器使用说明书。
含SYBR Premix Ex Taq (2×)12.5μL，正、反向引物(定量PCR扩增引物序列为：F：
5’-AGAAACACTTTCTTCTTCG-3’，R：5’-ATAGATAAAGGCATGCATCG-3’)各0.5μL，各种处理的cDNA模板1μL，加水补足体积至20μL。反应条件如下：95℃10s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，设定在每个循环中60℃1s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其它具体操作详见仪器使用说明书。
[0062] 目的基因与参照基因的扩增效率：任取一样品分别稀释10、100、1000、10000倍，取1～10000倍各稀释样品1μL进行定量PCR，方法同上，重复三次，计算目的基因与参照基因的平均CT值以及ΔCT值，通过cDNA浓度梯度的log值对ΔCT值作图，根据直线斜率绝对值判断扩增效率(Kenneth等，2001)。
[0063] 结果分析方法：每种处理样品重复三次，取平均CT值，利用2-ΔΔCT法进行结果分析。
[0064] 根据水稻干旱胁迫芯片表达谱分析结果显示，干旱胁迫后OsI2基因在水稻叶片中的表达量明显增强，上调倍数达230倍以上，即OsI2基因的表达受到干旱胁迫的诱导。
[0065] 图1结果显示，干旱胁迫处理对苗期水稻OsI2基因在根和叶中的表达有不同程度的影响，在叶中的表达量相对较高。在叶中(图1)，随干旱处理时间延长，OsI2表达量逐步增高，在处理后8h时达最高(是对照条件下的138倍)，处理20h时表达量又出现了回落(是对照条件下的28倍)。在根中(图2)OsI2的表达也受干旱胁迫的诱导，并且受干旱胁迫诱导上升表达的反应比叶片中更灵敏，在干旱胁迫处理0.5h时表达量即达到最高(是对照条件的65倍)，在处理3h和8h以及随后的20h，表达量较高峰值逐步下降。由此可见，OsI2在水稻中的表达受干旱胁迫的诱导而增加，并且随着处理时间的延伸，整体呈现先升高在逐步下降的趋势。
[0066] 自然干旱处理实验结果表明(图2)，干旱处理对水稻OsI2基因在分蘖期和孕穗期中的表达都有不同程度的影响；但是OsI2基因的表达量均随着干旱胁迫程度的增加而增加，即分蘖期或孕穗期间旱处理水稻叶片OsI2基因的表达量均高于正常水处理，说明干旱胁迫诱导OsI2基因表达量增加。在分蘖期，随干旱处理时间延长，OsI2表达量相比对照(10d)有增高的趋势，在处理14d达最高(是对照的21.7倍)，差异达到极显著水平。OsI2在孕穗期也是呈现相似的变化趋势，在处理9d时表达量最高(是对照的10.86倍)。无论是在分蘖期还是在孕穗期，旱处理初期均比正常水分条件下表达量略有增加，而在分蘖期OsI2基因受干旱的影响比孕穗期更为敏感(前者表达量增幅较大，14d旱处理为12d旱处理的6.76倍)，即分蘖期OsI2基因表达量变化较大，说明在分蘖期间OsI2基因对水分缺少较为敏感。由此可知，干旱对OsI2的表达有显著的影响，在正常水分条件下OsI2基因在孕穗期的表达量比分蘖期高，但受干旱胁迫影响较分蘖期要小，即不同发育时期的水稻中，OsI2基因对水分缺乏的敏感性有明显差异。
[0067] 实施例2水稻OsI2基因的克隆
[0068] 1.幼苗培育
[0070] 2.RNA的提取：按照实施例1中的方法提取RNA。
[0071] 3.基因的全长克隆
[0072] 根据GeneBank中水稻数据库信息中提供的序列信息，设计引物，采用两端末端快速扩增法(RACE法)获得包括完整ORF在内的cDNA序列信息；然后据此设计引物，用RT-PCR方法进行cDNA全长克隆。
[0073] 根据其预测序列扩增基因的保守片段；以保守片段序列为基础进行cDNA末端TM快速扩增(RACE)。RACE实验过程遵照BD SMART RACE cDNA Amplification Kit使用手册。然后对保守片段、5`及3`RACE所得序列进行回收，并连接到pGEMT-Easy载体(购自美国Promega公司)上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序，并将序列进行拼接。根据拼接序列信息，设计扩增引物5’-ACTCAACTCGATCGACCATATAC-3’和
5’-ATACCATGCCTCTTTATTGC-3’，通过RT-PCR法得到一个包含有完整开放阅读框在内的cDNA序列(SEQ ID NO.2)，长度为540bp；回收扩增产物，连接该序列到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。通过生物信息学方法分析编码蛋白方式，认为其通过植物线粒体密码子编码蛋白序列。查询Gramene网站，发现OsI2基因位于抗旱QTL区间内。
5’-ATACCATGCCTCTTTATTGC-3’，通过RT-PCR法得到一个包含有完整开放阅读框在内的cDNA序列(SEQ ID NO.2)，长度为540bp；回收扩增产物，连接该序列到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。通过生物信息学方法分析编码蛋白方式，认为其通过植物线粒体密码子编码蛋白序列。查询Gramene网站，发现OsI2基因位于抗旱QTL区间内。
[0074] 其中，SEQ ID NO.2的信息如下：
[0075] (i)序列特征：
[0076] (A)长度：540bp
[0077] (B)类型：核苷酸
[0078] (C)链性：单链(mRNA，cDNA)，双链(对应染色体基因位点DNA序列)
[0079] (D)拓扑结构：线性
[0080] (ii)分子类型：mRNA，cDNA，DNA
[0081] (iii)序列描述：SEQ ID NO.2
[0082] 实施例3水稻OsI2基因的序列信息与同源性分析
[0083] 本发明水稻OsI2全长cDNA的长度为540bp，其序列如SEQ ID NO.2所示，其中开放读框位于89-364位核苷酸(276个核苷酸)。根据全长cDNA推导出水稻OsI2的氨基酸序列，共92个氨基酸残基，分子量为10.4k道尔顿，等电点(pI)为4.72，其序列如SEQ ID NO.1所示。
[0084] 将水稻OsI2的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenB ank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现OsI2基因在核苷酸与Os07g0142100基因100％同源，有99％的序列同源性。但是以上数据库中Os07g0142100基因以及与其相关的EST均没有功能注释。OsI2基因位于水稻抗旱QTL区间内，同时从实施例中可以看出，OsI2基因在干旱条件下明显增强表达，因此，可以认为水稻OsI2基因与水稻的抗旱性相关。
[0085] 在已有的各公共数据库中没有找到与水稻OsI2蛋白高度同源的氨基酸序列；推测这与其特殊的编码方式有关。
[0086] 实施例4水稻OsI2蛋白或多肽在水稻中进行过表达及转基因植株的获得[0087] 步骤1：含目的基因(水稻OsI2基因)的表达载体的构建
[0088] 根据水稻基因OsI2的全长序列(SEQ ID NO.2)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻基因OsI2的cDNA克隆至中间载体(如pBI121)，进一步克隆到双元表达载体(如pCAMBIA1300)上，在保证阅读框架正确的前提下再将该双元表达载体转入农杆菌中，并转化模式植物拟南芥、烟草以及水稻(寒优湘晴和秀水123)(上述植物材料均购自上海市农业生物基因中心)。
[0089] 步骤2：水稻愈伤诱导
[0090] 将水稻种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。
[0091] 愈伤诱导培养基：采用表2的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
[0092] 步骤3：继代培养
[0093] 把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。
[0094] 继代培养基：采用表2的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL 2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
[0095] 步骤4：农杆菌和愈伤组织共培养
[0096] 挑取步骤1的农杆菌阳性转化子，接种于1mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30分钟至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20分钟左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5天。
[0097] 悬浮培养液：采用表2的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL2，4-D(浓度1mg/mL)，配成100ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。
使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。
使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。
[0098] 共培养培养基：采用表2的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL 2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。
[0099] 步骤5：筛选培养
[0100] 共培养3天后，将愈伤组织转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。
[0101] 筛选培养基：采用表3的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL2，4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mLHn和1mL Cn(100ppm)。
[0102] 步骤6：分化培养
[0103] 挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。
[0104] 分化培养基：采用表3的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
[0105] 步骤7：生根培养
[0106] 待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。
[0107] 生根培养基：采用表3的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。
[0108] 步骤8：转化植株培养
[0110] 培养基成分如表2和表3所示。
[0111] 表2培养基成分
[0112]
[0113] 表3培养基成分
[0114]
[0115]
[0116] 实施例5水稻OsI2蛋白或多肽在烟草中进行过表达及烟草转基因植株的获得[0117] 步骤1：表达载体获得，同实施例4。
[0118] 步骤2：圆盘法转化烟草叶片
[0119] 用灭菌水清洗烟草叶片，1％NaClO4浸泡5-10min，灭菌水洗3次，将灭菌过的叶片移至平板上，切成5-10mm四方形叶片，带有表达载体的菌液倒入平板内，浸泡叶片5min后移入灭菌过的滤纸上，吸干多余的菌液，最后移入MS-NBagar培养基，3000lux光下培养，共培养3d。(MS-NB＝MS+NAA0.1mg/l+BA1.0mg/l，琼脂0.8％)
[0120] 第4-5日，500μg/mlCef(头孢霉素)洗3min，吸干后移入MS-NB+cef(500μg/ml)培养基上除农杆菌。
[0121] 步骤3：抗性愈伤筛选
[0122] 第11-12日，转入MS-NB+kan(100μg/ml)+cef(500μg/ml)进行抗性愈伤筛选[0123] 步骤4：出苗及生根
[0124] 约三周后，将已经分化出芽的(4-5片叶)移入MS+kan100ppm中生根；约一周后，将转化植株移至蛭石盆栽。
[0125] 实施例6水稻OsI2蛋白或多肽在拟南芥中进行过表达及拟南芥转基因植株的获得
[0126] 步骤1：转化载体获得同实施例4。
[0127] 步骤2：拟南芥植株培养
[0128] 将野生型拟南芥种子撒播在填充了蛭石∶泥潭∶珍珠岩(比例为8∶8∶1)小钵内，在温度为22～25℃，湿度约60％，2000lux光下培养。植株长至始花期开始下一步工作。
[0129] 步骤3：侵染转化
[0130] 含目的基因的农杆菌的培养液与浸染液的制备用液体LB培养基100ml，加利福平(30μg/ml)，卡那霉素(70μg/ml)，180r/min的条件下震荡培养含目的基因的农杆菌20h左右；待农杆菌生长至对数生长期，将菌液倒入离心管离心，倒掉上清液，加入悬浮液(含5％蔗糖和0.04％的吐温-80)重新悬浮沉淀，用作浸染液；选取初果期的健壮植株，带盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整个花序浸泡于浸染液中，而叶片尽量不与浸染液接触；
10min后将盆取下，横放于暗箱中约24h；然后将处理过的拟南芥植株放于正常培养条件下使其正常生长。按照此方法每隔三天用含目的基因的农杆菌浸染液处理一次，如此将拟南芥处理三次。收获种子，其中包括约1％的含有目的基因的种子。
10min后将盆取下，横放于暗箱中约24h；然后将处理过的拟南芥植株放于正常培养条件下使其正常生长。按照此方法每隔三天用含目的基因的农杆菌浸染液处理一次，如此将拟南芥处理三次。收获种子，其中包括约1％的含有目的基因的种子。
[0131] 实施例7含水稻基因OsI2的转基因水稻植株的抗逆性鉴定
[0132] 鉴于水稻基因OsI2位于抗旱QTL区段内，经过对IRAT109苗期干旱胁迫及生殖生长期干旱胁迫下的基因进行了定量PCR分析，结果表明该基因在水分胁迫(干旱、低温及高盐)条件下表达时明显增加。因此对含水稻OsI2基因的转基因水稻(秀水123及寒优湘晴)生殖生长期水分胁迫实验，分析水稻基因OsI2的抗逆(包括但不限于抗旱、抗盐、耐低温等)作用。
[0133] 生殖生长期水分胁迫实验，采用土壤自然干旱法。水稻在大田中栽培生长，按照一般的水稻栽培方式培养。实验材料种植方式：野生型和转OsI2基因超表达株系(5个不同转化子株系)，每株系各种三个小区重复，每重复三行，每行7株。在水稻的生殖生长开始后，断水进行干旱胁迫处理，在植株进入幼穗分化期左右时形成水分胁迫。到野生型水稻(分别为秀水123和寒优湘晴)出现明显胁迫症状时复水，直至收获。实验中对植株进行以下性状的考察：生物学产量、百粒重、每穗颖花数、每穗实粒数、结实率以及穗型。
[0134] 试验结果表明，在正常水分条件和干旱胁迫下，转OsI2基因水稻(秀水123及寒优湘晴)在干旱条件下转OsI2基因水稻(秀水123及寒优湘晴)能够更好的保持细胞水分，结实率、百粒重、生物学产量均明显提高，证明基因OsI2能够明显提高水稻抗旱、耐旱能力。在恢复灌溉后，转OsI2基因水稻与野生型水稻(秀水123及寒优湘晴)相比，叶片恢复到正常状况的比例更高、速度更快，而且能够迅速生长出更多高位分蘖，表明基因OsI2促进水稻在水分胁迫伤害之后恢复生长，能提高植物的复原抗旱性。
[0135] 生殖生长期抗旱试验证明，水稻基因OsI2能够提高植物的避旱、抗旱、耐旱和复原抗旱性。
[0136] 对比转基因植株和非转基因植株在干旱条件下成熟后穗型的变化发现，含有过量OsI2蛋白或多肽的植株，小穗的枝梗变短，整个穗型变得紧凑。所以水稻基因OsI2能够通过调整小穗的枝梗长度，影响水稻穗型，使之紧凑化。
[0137] 实施例8含水稻基因OsI2的转基因烟草植株的抗逆性鉴定
[0138] 转OsI2烟草T1代和对照种子在含150mmol/L甘露醇的1/2MS培养基上发芽一周，观察其表型。从图3中可以看出与野生型(WT)对照相比，转基因株系S1、S2、S3芽期生长均受甘露醇抑制。
[0139] 将转基因烟草和野生型对照植株断水处理，10d然后复水5天，观察植株表型。结果表明(图4)，与对照相比，转OsI2基因植株能够迅速恢复，叶多死亡范围小，显著提高耐干旱能力。
[0140] 用不同浓度的ABA浓度处理烟草离体叶片，5d后考察叶片颜色和萎蔫程度。转OsI2烟草各株系(S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11、S12、S13、)叶片持绿能力明显强于野生型对照(图5)，叶片卷曲程度也较轻，表明转OsI2烟草增强了对ABA胁迫的耐受能力。
[0141] 通过测定转OsI2的烟草野生型对照离体苗期叶片相对含水量的测定，考察叶片的持水能力。结果表明(图6)，转基因株系叶片相对含水量下降相对缓慢，持水能力明显高于WT对照叶片。
[0142] 实施例9含水稻基因OsI2的转基因拟南芥植株的抗逆性鉴定
[0143] 将野生型对照和转OsI2基因拟南芥种子，置分别含NaCl(100mmol/L)、甘露醇(150mmol/L)等渗透胁迫物质的1/2MS培养基上，进行发芽实验。结果表明(图7)，在盐胁迫下，野生型拟南芥芽期根系生长受到明显抑制，而转基因株系S1、S2根系生长相对良好。苗期转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性增强，根系生长没有收到明显抑制。而在甘露醇胁迫下，转基因株系生长明显受到限制，植株及根系均比对照植株弱(图8)。这一系列实验结果表明，超表达OsI2基因提高了芽期拟南芥植株对盐胁迫抗性增加，但是不利于增强对甘露醇抗性。
[0144] 以质量体积比为20％的PEG6000模拟干旱条件，处理转OsI2拟南芥以及WT对照株系幼苗。实验表明，在20％PEG6000干旱处理10d情况下表型差异最为显著(图9)，对照株系大部分植株死亡，而转OsI2拟南芥株系S1、S2则表现出高抗模拟干旱胁迫，植株存活率明显高于对照。即超表达OsI2基因提高了苗期拟南芥植株对干旱胁迫抗性。
[0145] 通过以上实验可以证明OsI2基因能够调节一些逆境相关性状，增强水稻、烟草以及拟南芥等植物对干旱胁迫的耐受性。
[0146] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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