技术领域
[0001] 本
发明涉及一株乙酰微小杆菌及其在防治植物寄生线虫病上的应用，属于
微生物技术领域。
背景技术
[0002] 植物寄生线虫是一种常见的土传病害，目前已成为制约世界农业发展的重要因素之一，据统计，全球每年因植物寄生线虫病损失高达1570亿美元。由于植物寄生线虫病具有“易感染、难防治、危害大”的特点，因而又被称为植物癌症。
[0003] 应用化学药剂防治在当前农业生产中占据着主导地位，用于防治植物寄生线虫的化学
农药称为杀线剂，分为熏蒸剂和非熏蒸剂两种，在过去的几十年里，化学杀线剂具有经济、速效的特点深受农民的欢迎。但是，随着人们环保意识的加强，国家对于绿色农业和健康农业的重视，化学杀线剂因其高残留、高毒性、高
风险性等弊端，其应用正逐步受到限制。
[0004] 随着人们对根结线虫病的重视以及研究的不断深入，一些
化学防治的取代方法不断被发掘，
生物防治作为其中之一，现已成为植物寄生线虫防治的研究热点。植物寄生线虫的生物防治是指利用根结线虫的天敌生物或是它们的代谢产物杀伤或抑制线虫，以减轻病害的发生。生物防治因其环境友好、作用效果明显、无残留、使用过程对人畜安全等特点得到了研究以及产业层面的关注。目前，虽然对生防菌的研究越来越多，但是已注册登记并实际应用到农业生产中的所占比例还很小，且菌种较为单一，其中很重要的原因就是生防菌在田间防治效果不稳定，大大限制了生物防治的发展。
发明内容
[0005] 本发明针对
现有技术的不足，提供一株乙酰微小杆菌可应用于植物寄生线虫病的生物防治。
[0006] 一株乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)AMCC 101217，简称AMCC 101217菌株，从
根际土壤中分离得到，已于2018年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16305。
[0007] AMCC101217菌株的主要生物学特性为：菌落形状呈不规则圆形，边缘不整齐，不透明，菌落
颜色为橘黄色，且随培养时间加长而加深，革兰氏
染色镜检观察为阳性，细胞培养前期呈杆状，后期呈椭圆形。
[0008] 所述菌株乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)AMCC 101217，从根际土壤中分离得到，简称AMCC 101217。
[0009] 上述AMCC 101217微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0010] (1)菌种活化：将乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)AMCC 101217接种于LB固体培养基平板上，于35-37℃培养22-27h；
[0011] (2)
种子液制备：将活化好的AMCC101217接种于LB液体培养基中，于35-37℃，150-220rpm培养18-22h；
[0012] (3)种子液扩大培养：将步骤(2)中的种子液以5-8％的接种量接种到种子液扩大培养基中，所述的扩大培养基为LB液体培养基，于35-37℃，150-220rpm培养10-13h；
[0013] (4)
发酵培养：将步骤(3)中扩大培养的种子液以5-8％的接种量接种到LANDY发酵培养基，35-37℃，150-220rpm培养22-27h，得到AMCC101217液体菌剂；
[0014] 所述LANDY发酵培养基，每升包括如下组分：
葡萄糖18.0-20.0g，L-谷
氨酸4.0-5.0g，
磷酸二氢
钾0.8-1.0g，七
水硫酸镁0.4-0.5g，
氯化钾0.4-0.5g，
酵母粉1.0-1.2g，L-苯-3 -3 -3
丙氨酸(1.8-2.4)×10 g，硫酸锰(4.5-5)×10 g，硫酸
铜(0.16-0.18)×10 g，七水硫酸亚
铁(0.15-0.17)×10-3g，余量水，pH6.8-7.3。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤(1)接种后LB固体培养基平板，于37℃培养24h。
[0016] 根据本发明优选的，所述步骤(2)接种后的LB液体培养基于37℃，180rpm培养18h。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤(3)接种后的种子液扩大培养基，于37℃，200rpm，培养10h。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中发酵培养于37℃，200rpm培养24h。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中的LANDY发酵培养基，每升包括如下组分：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，磷酸二氢钾1.0g，七水
硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，酵母粉1.0g，L-苯丙氨酸2×10-3g，硫酸锰5×10-3g，硫酸铜0.16×10-3g，七水硫酸亚铁0.15×10-3g，余量水，pH7.0。
[0020] 一种液体微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有AMCC101217菌株，菌体浓度为1.0×107-2.5×108CFU/mL。
[0021] 上述乙酰微小杆菌AMCC101217菌株在防治由一种或多种线虫引起的病害中的应用。
[0022] 根据本发明优选的，所述线虫为：南方根结线虫、象
耳豆根结线虫、松材线虫之一或两种以上的组合。
[0023] 上述乙酰微小杆菌AMCC101217菌剂在防治由一种或多种线虫引起的病害中的应用。
[0024] 根据本发明优选的，所述线虫为：南方根结线虫、象耳豆根结线虫、松材线虫之一或两种以上的组合。
[0025] 所述AMCC101217菌株对多种植物寄生线虫具有明显的杀伤效果，其发酵上清液12h对南方根结线虫二龄幼虫致死率为86.61％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达
92.56％；对象耳豆根结线虫二龄幼虫致死率为81.36％，对象耳豆根结线虫卵孵化抑制率可达81.36％；对松材线虫幼虫致死率为90.21％。
[0026] 本发明的有益效果
[0027] 1、本发明涉及的AMCC101217菌株对多种植物寄生线虫具有明显的杀伤效果，其发酵上清液12h对南方根结线虫二龄幼虫致死率为86.61％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达92.56％；对象耳豆根结线虫二龄幼虫致死率为81.36％，对象耳豆根结线虫卵孵化抑制率可达81.36％；对松材线虫幼虫致死率为90.21％。
[0028] 2、本发明涉及的AMCC101217菌株盆栽实验中，该菌能够显著抑制根结线虫，其
卵囊数、根结数、虫口
密度相比于空白对照分别下降了84.69％、65.86％和73.24％。
附图说明
[0029] 图1：AMCC101217的菌落形态及显微形态照片
[0030] 图中，A为AMCC101217在LB固体培养基的菌落形态，B为培养12h的菌体电镜形态，C为培养48h后菌体的电镜形态。
[0031] 图2：AMCC101217的全基因组图谱
[0032] 图中，从内到外依次为GC skew、GC含量、非编码RNA、gene的COG注释。
具体实施方式
[0033] 下面通过具体
实施例对本发明作进一步阐述，但保护范围不限于此。
[0034] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化
试剂公司购买得到的；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0035] 乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)AMCC10077购自山东农业微生物菌种资源保藏与利用中心。
[0036] 实施例1
[0037] AMCC101217菌株的分离、鉴定及保藏，具体步骤如下：
[0038] (1)AMCC101217菌株的分离筛选过程
[0039] 从植物根际土壤中筛选出一株杀线虫菌株，编号为AMCC101217。
[0040] (2)AMCC101217菌株的鉴定
[0041] ①AMCC101217菌株的主要生物学特性：菌落形状呈不规则圆形，边缘不整齐，不透明，菌落颜色为橘黄色，且随培养时间加长而加深；革兰氏染色镜检观察为阳性，细胞培养前期呈杆状，后期呈椭圆形。
[0042] ②AMCC101217全基因组测序
[0043] 将斜面保存的AMCC101217转接活化后接种于LANDY液体培养基中，200rpm，37℃摇床培养16h后取10mL菌液12000rpm，4℃离心5min，弃去上清后得到大量的AMCC101217菌体；将菌体置于液氮冻存10min后，提取细菌基因组；利用PacBio RS II方法测定全基因组序列。结果表明，AMCC101217基因组大小为3283403bp，GC含量为47.21％，并含有一个
125000bp大小的质粒。
[0044] 所述LANDY培养基，每升包括如下组分：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，酵母粉1.0g，L-苯丙氨酸2×10-3g，硫酸锰5×10-3g，硫酸铜0.16×10-3g，七水硫酸亚铁0.15×10-3g，余量水，pH7.0。
[0045] 结合AMCC101217菌株的主要生物学特性以及基因组序列的鉴定结果，确定该菌种为乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)已于2018年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16305。
[0046] 实施例2
[0047] AMCC101217菌株杀线虫能
力测定
[0048] 用接种环挑取斜面保存的AMCC101217菌株划线于LB平板上活化；将活化好的菌种接种于LANDY培养基中，37℃，200rpm摇床培养48h后，12000rpm离心10min，收集上清液。
[0049] 杀南方根结线虫/象耳豆根结线虫实验：
[0050] 将挑取的南方根结线虫/象耳豆根结线虫卵囊洗净，放在0.5％的
次氯酸钠溶液中消毒3min、用无菌水反复冲洗3次，挑取卵囊置于贝曼漏斗孵化，每隔2d收集二龄幼虫；采用24孔板液体浸渍法进行抗线虫活性的测定；在24孔板中分别加入100μL南方根结线虫/象耳豆根结线虫二龄幼虫悬液(约200条)、100μL发酵上清液和300μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，每个样品重复3次，以空白培养基代替发酵液作为阴性对照，28℃放置12h统计线虫死亡率。
[0051] 卵孵化抑制实验：将挑取的南方根结线虫/象耳豆根结线虫卵囊洗净，放在0.5％的次氯酸钠溶液中消毒3min、用无菌水反复冲洗3次后用
镊子碾开收集虫卵；采用24孔板液体浸渍法进行卵孵化抑制性测定；在24孔板中分别加入100μL卵悬液(约200粒)、100μL发酵上清液和300μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，每个样品重复3次，以空白培养基代替发酵液作为阴性对照，28℃放置12h统计孵化率。
[0052] 杀松材线虫实验：将表面消毒的松材线虫接种于长满
灰葡萄孢的PDA平板上，28℃培养10d后用无菌水将松材线虫冲洗下来，调节浓度至2000条/mL。采用24孔板液体浸渍法进行抗线虫活性的测定。在24孔板中分别加入100μL松材线虫二龄幼虫悬液(约200条)、100μL发酵上清液和300μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，每个样品重复3次，以空白培养基代替发酵液作为阴性对照，28℃放置12h统计线虫死亡率。
[0053] 校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100[0054] 卵孵化抑制率(％)＝(对照孵化率-处理孵化率)/(1-处理孵化率)×100[0055] 结果表明：该菌对多种植物寄生线虫具有明显的杀伤效果，其发酵上清液12h对南方根结线虫二龄幼虫致死率为86.61％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达92.56％；对象耳豆根结线虫二龄幼虫致死率为81.36％，对象耳豆根结线虫卵孵化抑制率可达81.36％；对松材线虫幼虫致死率为90.21％。
[0056] 实施例3
[0057] AMCC101217菌剂的制备
[0058] (1)菌种活化：将乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)AMCC 101217划线接种于LB固体培养基平板上，于37℃培养24h。
[0059] (2)种子液制备：将活化好的AMCC101217接种于装有LB液体培养基的三
角瓶中，于恒温
振荡器中37℃，180rpm振荡培养18h。
[0060] (3)种子液扩大培养：将步骤(2)中的种子液以7％的接种量接种到种子罐液体培养基中，扩大培养基为LB液体培养基，于37℃，200rpm培养10h。
[0061] (4)发酵培养：将步骤(3)中扩大培养的种子液以7％的接种量接种到LANDY发酵培8
养基，37℃培养24h，得到AMCC101217液体菌剂，活菌数1.5×10 CFU/mL灌装至1L带盖塑料瓶中。
[0062] 所述LANDY培养基，每升包括如下组分：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，酵母粉1.0g，L-苯丙氨酸2×10-3g，硫酸锰5×10-3g，硫-3 -3
酸铜0.16×10 g，七水硫酸亚铁0.15×10 g，余量水，pH7.0。
[0063] 对比例
[0064] 与实施例2的不同之处在于，将实施例中AMCC101217菌种更换为乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)AMCC10077。
[0065] 结果表明，乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)AMCC10077对三种线虫均无杀伤效果，对虫卵孵化也无抑制效果。
[0066] 效果例
[0067] AMCC101217菌剂盆栽实验
[0068] (1)CK：80mL LANDY培养基；
[0069] (2)T1：80mL市售阿维菌素2000倍稀释液；
[0070] (3)T2：80mL AMCC101217(实施例3制备的)液体菌剂。
[0071] 盆栽所用土壤含有根结线虫，其虫口密度调整为15条/g，采集自患病番茄
温室大棚中，所用番茄品种为线虫易感品种白果强丰，所用花盆大小为10cm×10cm，加入上述土壤量为800g/盆；上述菌剂、阿维菌素及LANDY培养基均采用提前灌根施入的方式使用，每个处理6个平行，处理3天后，移栽健壮的长有四片真叶的番茄苗，并于光照
培养箱内培养，培养条件为光照，光照强度66％，12h，28℃；黑暗12h，24℃。期间正常浇水，不再施入其他药剂，30天后，将植株根部土壤清理干净，并将分离土壤留样检测，统计根结数、卵囊数、虫口密度等指标。
[0072] 应用Excel
软件进行数据的
整理，采用SPSS 17.0进行数据分析，样品与对照组之间用单因素方差分析中的邓肯氏新复极差(Duncan’s)检验对试验数据进行统计分析。
[0073] 盆栽实验结果如表1所示：AMCC101217菌剂可有效地防治番茄根结线虫病，其卵囊数、根结数、虫口密度相比于空白对照分别下降了84.69％、65.86％和73.24％；该菌同时也有效地减轻了根结线虫病对番茄的危害，与空白对照相比，其地上部干鲜重及地下部干鲜重均差异极显著。
[0074] 表1
[0075]
[0076] 注：NG，根结数；NEM，卵囊数；JD，虫口密度；SFW，地上部鲜重；SDW，地上部干重；RFW，地下部鲜重；RDW，地下部干重。
