技术领域
[0001] 本
发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测猪萨姆氏后圆线虫的特异性引物及其应用。
背景技术
[0002] 猪后圆线虫为圆形目、后圆科、后圆属，是猪萨姆氏后圆线虫、复阴后圆线虫、长刺后圆线虫3种后圆线虫的总称，猪后圆线虫病是一种由线虫寄生于猪支气管和细支气管的线虫病，由于虫体呈丝状，寄生于
肺脏，故又称猪肺丝虫病或肺线虫病。
[0003] 猪后圆线虫对羊、
牛、猪均易感，偶见于羊、鹿、牛和其他反刍兽，亦偶见于人，主要发生在幼猪，死亡率较高，危害较大。猪肺丝虫病呈地方性流行，在河谷区和低热区多发。在我国，江西省猪后圆线虫病感染率为40％，辽宁省为59.81％，湖南省为5.93％，河北省为18.5％，江苏省为43.6％，四川省为20.7，并呈明显的逐年上升趋势。
[0004] 对猪后圆线虫病的准确诊断是有效防控此病的前提，现有的检测方法主要根据临床症状、流行病学情况、病理变化、进行初步诊断，并进一步结合
粪便检查虫卵进行确诊，虽然现有检测方法简单易行，对成虫有一定的准确性，但对于形态上难以区分种类。特别是各种线虫在虫卵和幼虫阶段难以区分，而且猪萨姆氏后圆线虫、猪复阴后圆线虫、猪长刺后圆线虫3种后圆线虫彼此也难以区分，同时现有的检测方法检测效率、检测准确性较低、检测结果受检测人员经验影响大。
[0005] 因此，有必要对现有猪萨姆氏后圆线虫检测做进一步开发，提供一种检测方法检测效率高、检测准确性高、检测结果受检测人员经验影响小的检测
试剂盒及其使用方法。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和
缺陷，提供一种用于检测猪萨姆氏后圆线虫的特异性引物及其应用，其具有检测结果准确、检测效率高的优点。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
[0008] 本发明提供一种可用于检测猪萨姆氏后圆线虫的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物MsJB3F和下游引物MsJB4.5R，
[0009] 所述Ms JB3F的核苷酸序列为5'-GAAAGAATTCATGAATTCAAAATT-3'；
[0010] 所述Ms JB4.5R的核苷酸序列为5'-GAAATTYATATTGTATTTAATTTTTG-3'。
[0011] 通过比对多种猪后圆线虫cox1基因，针对较稳定保守区设计所述MsJB3F和MsJB4.5R，预期扩增
片段大小约为400bp左右。引物序列中G+C含量为40％～60％，上下游引物不存在二级结构，互配可能性低，引物具有特异性。
[0012] 本发明还提供一种可用于检测猪萨姆氏后圆线虫的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物
混合液，所述引物混合液包括上述的特异性引物。
[0013] 上述的检测试剂盒，还包括阳性对照液，所述阳性对照液包括猪萨姆氏后圆线虫DNA。
[0014] 上述的检测试剂盒，所述DNA裂解液主要由100mM NaCl 70μl、pH值为8.0的10mMTris-Cl 30μl、pH值为8.0的25mM EDTA 150μl、1％W/V十二烷基
硫酸钠30μl和1.7μg/μL蛋白酶K200μl组成。
[0015] 上述的检测试剂盒，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、25mM MgCl2溶液和2.0mM脱
氧核糖核苷
酸溶液。
[0016] 上述的检测试剂盒，所述引物混合液中所述MsJB3F和MsJB4.5R的浓度均为100pmol/μL。
[0017] 本发明还提供一种如上述的特异性引物在检测猪萨姆氏后圆线虫的应用。
[0018] 上述的应用，利用所述特异性引物制成检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液主要由上述的特异性引物组成，所述检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
[0019] (1)DNA的提取：取待测虫体样品用双蒸
水反复吹打冲洗，移去双蒸水，加入DNA裂解液置于37～55℃温箱中16-18h，再提取DNA，制备得到样品DNA；
[0020] (2)PCR扩增：取灭菌ddH2O、PCR反应液、Taq酶和引物混合液按适合的PCR反应体系加入离心管中，混匀后分装放入多个离心管中制得多份分装液，取步骤(1)制备的样品DNA，每一样品DNA对应加入一份分装液中并标号，混匀，置于PCR扩增仪上按适合的PCR扩增条件反应，制得PCR扩增产物；
[0021] (3)PCR产物观察：取步骤(2)制备的PCR扩增产物依标号加样于1.0％琼脂糖凝胶上，120～130V
电压电泳20～40分钟后，置于紫外透射仪下观察是否出现条带，若存在400bp～410bp大小的条带，则待测虫体样品为猪萨姆氏后圆线虫；若不存在400bp～410bp大小的条带，则待检测虫体样品不是猪萨姆氏后圆线虫。
[0022] 上述的检测试剂盒的使用方法，所述步骤(2)中PCR反应体系为PCR缓冲液2～3μL、25mM的MgCl2溶液3～4μL、2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液2μL、5U/μL的Taq酶0.25～0.3μL、样品DNA、引物混合液0.8～1.2μL，余量为灭菌ddH2O补至25μL。
[0023] 上述的检测试剂盒的使用方法，所述步骤(2)中PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec、52～58℃
退火30sec、72℃延伸30sec，共38个循环；72℃延伸5min。
[0025] 1、通过设计MsJB3F和MsJB4.5R可以有效扩增出目的片段，从而检测出猪萨姆氏后圆线虫，同时对同属的猪复阴后圆线虫和猪长刺后圆线虫无反应，从基因层面上相区别；
[0026] 2、检测试剂盒的特异性高、检测准确、检测效率高；
[0027] 3、通过检测试剂盒的使用方法，可以扩增出清晰的条带，用于检测分析，且操作一致性高；
[0028] 4、检测试剂盒本身便于运输、存放保质时间长。
附图说明
[0029] 为了更清楚地说明本发明
实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030] 图1，为使用本发明提供的检测试剂盒一较佳实施例的PCR扩增产物电泳图；
[0031] 图2，为本发明提供的检测试剂盒用于检测不同线虫一较佳实施例的PCR扩增产物电泳图；
[0032] 图3，为本发明提供的检测试剂盒存放10个月后制备的PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式
[0033] 为了便于理解本发明，下文将结合
说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0034] 除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0035] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0036] 除非另有特别说明，本发明中用到DNA提取试剂盒为普洛麦格(北京)
生物技术有限公司提供的WizardTM DNA Clean-Up System。
[0037] 实施例1
[0038] 本发明提供一种可用于检测猪萨姆氏后圆线虫的特异性引物，特异性引物包括上游引物MsJB3F和下游引物MsJB4.5R，
[0039] 所述Ms JB3F的核苷酸序列为5'-GAAAGAATTCATGAATTCAAAATT-3'；
[0040] 所述Ms JB4.5R的核苷酸序列为5'-GAAATTYATATTGTATTTAATTTTTG-3'。
[0041] 本发明提供一种可用于检测猪萨姆氏后圆线虫的检测试剂盒。检测试剂盒主要由DNA裂解液、PCR反应液、阳性对照液和引物混合液组成。
[0042] DNA裂解液主要由100mM NaCl 70μl、pH值为8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值为8.0的25mM EDTA 150μl、1％W/V十二烷基硫酸钠30μl和1.7μg/μL蛋白酶K 200μl组成。
[0043] PCR反应液包括PCR缓冲液、25mM MgCl2溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。
[0044] 阳性对照液含有猪萨姆氏后圆线虫DNA。
[0045] 引物混合液包括特异性引物，特异性引物包括MsJB3F和MsJB4.5R，其中MsJB3F和MsJB4.5R的浓度均为100pmol/μL。MsJB3F和MsJB4.5R分别为猪萨姆氏后圆线虫的cox1序列特异性上下游引物，预期扩增片段大小约为400bp。
[0046] 本发明还提供一种上述的特异性引物在检测猪复阴后圆线虫的应用。利用特异性引物制成检测试剂盒，检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及阳性对照液和引物混合液，引物混合液包括特异性引物。检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0047] (1)DNA的提取：取待测虫体样品置于1.5mL的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗6次以上，移去离心管中的水，加DNA裂解液消化
蛋白质，释放基因组DNA，55℃温箱16-18h，制得虫体悬液，将制备的虫体悬液按DNA提取试剂盒使用说明提取样品DNA，提取得到的样品DNA直接使用或放于-20℃
冰箱保存备用。
[0048] (2)PCR扩增：选择适合的PCR反应体系，设n为样品DNA数量，以(n+3)倍PCR反应体系的配比向离心管中依次加入灭菌ddH2O、PCR缓冲液、MgCl2、脱氧核糖核苷酸、引物混合液、Taq酶，在本实施例中，样品DNA的数量为3，则向离心管中依次加入84μL灭菌ddH2O、21μL PCR缓冲液、12μL MgCl2、6μL脱氧核糖核苷酸、3μLMsJB3F、3μLMsJB4.5R、1.5μL Taq酶，漩涡震荡混匀，混匀后分装放入5个0.2μL的离心管中制得5份分装液，每管放置24μL。取步骤(1)制备的样品DNA，每一样品DNA对应加入一份分装液中并标号，混匀，置于PCR扩增仪上按适合的PCR扩增条件反应，制得PCR扩增产物；
[0049] 同时设置阴性对照以确保检测试剂盒无污染、实验操作规范、实验结果可信，阴性对照采用前述步骤处理，不同之处在于，在分装液中不加入样品DNA，加入相同体积的ddH2O；设置阳性对照方便与样品PCR扩增产物进行比对，确保实验结果可信，阳性对照采用前述步骤处理，不同之处在于，在分装液中不加入样品DNA，加入相同体积的阳性对照液。
[0050] 请参阅表1，为25μL PCR反应体系。具体的，在本实施例中PCR反应体系采用25μL体系，在其他实施例中也可以根据需要对表1的配比进行等比例的更改。
[0051] 表1 25μL PCR反应体系
[0052]
[0053] PCR扩增条件为：
[0054]
[0055] (3)PCR产物观察：取步骤(2)中制备的样品DNA的PCR扩增产物、阴性对照的PCR扩增产物和阳性对照的PCR扩增产物分别加样于1.0％琼脂糖凝胶上，128V电泳30分钟，置于紫外透射仪下观察结果并拍照分析，若存在400bp～410bp大小的条带，则待测虫体样品为猪萨姆氏后圆线虫；若不存在400bp～410bp大小的条带，则待检测虫体样品不是猪萨姆氏后圆线虫。
[0056] 请参阅图1，为使用本发明提供的检测试剂盒一较佳实施例的电泳图。其中，泳道M为Marker；泳道1～3为猪萨姆氏后圆线虫样品得到的PCR扩增产物，泳道4为阴性对照，泳道5为阳性对照。由图1可得出，泳道1～3均出现一条清晰的条带，条带的大小为400bp左右，符合引物设计。阴性对照无反应。阳性对照出现一条400bp左右的清晰条带，与泳道1～3条带
位置一样，符合实验设计。对步骤(2)中制得的PCR扩增产物进行测序，再将测序结果与NCBI基因
数据库进行比对，与引物设计相符合，为猪萨姆氏后圆线虫DNA。
[0057] 实施例2
[0058] 采用本发明提供的检测试剂盒以及本发明提供的检测试剂盒的使用方法，对猪蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、日本血吸虫、猪萨姆氏后圆线虫、猪复阴后圆线虫、猪长刺后圆线虫进行检测。具体方法如下：
[0059] (1)DNA的提取：取经过DNA有效性验证的猪蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、日本血吸虫、猪萨姆氏后圆线虫、复阴后圆线虫、长刺后圆线虫的DNA样品备用；
[0060] (2)PCR扩增：按适合的PCR反应体系的9倍，向离心管中依次加入灭菌ddH2O、缓冲液、MgCl2、脱氧核糖核苷酸、引物混合液、Taq酶，漩涡震荡混匀，混匀后分装放入多个0.2μL的离心管中制得多份分装液，每一离心管放置24μL，取步骤(1)制备的每一样品DNA加入一份分装液中并标号，混匀，置于PCR扩增仪上按适合的PCR扩增条件反应，制得PCR扩增产物；
[0061] 同时设置阴性对照和阳性对照，阴性对照采用前述步骤制备，不同之处在于，在分装液中不加入样品DNA，加入相同体积的ddH2O，阳性对照采用前述步骤制备，不同之处在于，在分装液中不加入样品DNA，加入相同体积的阳性对照液。
[0062] 具体的，在本实施例中采用25μL PCR反应体系。请参阅表2，为25μL PCR反应体系。
[0063] 表2 25μL PCR反应体系
[0064]
[0065] PCR扩增条件为：
[0066]
[0067] (3)PCR产物观察：取步骤(2)中制备样品DNA的PCR扩增产物、阴性对照的PCR扩增产物和阳性对照的PCR扩增产物加样于1.0％琼脂糖凝胶上128V电泳30分钟，置于紫外透射仪下观察结果并拍照分析，若存在400bp～410bp大小的条带，则待测虫体样品为猪萨姆氏后圆线虫；若不存在400bp～410bp大小的条带，则待检测虫体样品不是猪萨姆氏后圆线虫。
[0068] 请参阅图2，为本发明提供的检测试剂盒用于检测不同线虫一较佳实施例的PCR扩增产物电泳图。其中，泳道M为Marker；泳道1～7分别为经过DNA有效性验证的不同虫体样品的PCR扩增产物，依次为猪蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、日本血吸虫、猪萨姆氏后圆线虫、猪复阴后圆线虫、猪长刺后圆线虫。由图1可得出，泳道1～4均无条带，证明检测试剂盒对猪蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、日本血吸虫无反应。泳道5有一条清晰的条带，条带的大小为400bp左右，符合引物设计，为猪萨姆氏后圆线虫扩增产物。泳道6～8均无条带，证明检测试剂盒对猪复阴后圆线虫和猪长刺后圆线虫无反应。对步骤(2)制备的PCR扩增产物进行测序，再将测序结果与NCBI基因数据库进行比对，与引物设计相符合，测序结果为猪萨姆氏后圆线虫DNA，进一步验证检测试剂盒能有效检测出猪萨姆氏后圆线虫，并与其它线虫相区别。
[0069] 猪蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、日本血吸虫在形态结构和生物学分类上与猪后圆线虫相似，猪萨姆氏后圆线虫、猪复阴后圆线虫和猪长刺后圆线虫同属于后圆线虫，上述线虫现有的检测方法均难以区分。采用猪萨姆氏后圆线虫检测试剂盒能有效检测出长刺圆线虫，同时对于相似的猪蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、日本血吸虫，以及同属的猪复阴后圆线虫和猪长刺后圆线虫相区别，其特异性强。
[0070] 将检测试剂盒在4℃和-20℃保存，设置放置1个月，2个月，3个月、4个月，5个月，6个月、7个月、8个月、9个月、10个月，采用上述分别放置不同时间的检测试剂盒进行检测，检测方法参照上述检测试剂盒的使用方法。请参阅图3，为本发明提供的检测试剂盒存放10个月后制备的PCR扩增产物的电泳图。其中泳道M为Mark，泳道1～5为使用4℃下存放10个月的检测试剂盒的扩增产物，6～10为使用-20℃下存放10个月的检测试剂盒的扩增产物猪萨姆氏后圆线虫，泳道11为：阴性对照。由图2可以观察到泳道1～～10均能产生清晰的条带，并且条带大小与引物设计一致。对扩增产物进行测序，再将测序结果与NCBI基因数据库进行比对，与引物设计相符合为猪萨姆氏后圆线虫DNA。表明采用存放10个月的检测试剂盒依然可以有效检测出猪萨姆氏后圆线虫，即检测试剂盒可在4℃和-20℃下至少保存10个月。
