在药物活性成分，特别是治疗蛋白质的延长释放领域中，在很多情形 中，要尽可能地确保患者的血浆蛋白或肽浓度接近健康对象的值。
这个目标因为蛋白质在血浆里存在的时间短而不能实现，因此需要重 复注射治疗蛋白质。故治疗蛋白质的血浆浓度具有“锯齿”形，其特征是 高浓度的峰和极低浓度的谷。峰浓度远大于健康对象体内的基础浓度，由 于治疗蛋白质如白细胞介素IL2的高毒性，其具有非常显著的有害效应。 另外，谷浓度低于治疗效果所需的浓度，所以患者接受的治疗覆盖较少， 而承受严重的长期后果。
此外，为保证患者的治疗蛋白质血浆浓度接近其治疗的理想值，所讨 论的药物制剂必须允许延长释放治疗蛋白质，以限制血浆浓度随着时间变 化。
而且，这种活性制剂优选应该符合以下为所属领域的技术人员所熟知 的规范：
1-延长释放活性的和非变性的治疗蛋白质，例如人或合成蛋白质，以 使血浆浓度保持在治疗水平；
2-足够低的注射粘度以便于注射；
3-生物适应性和生物可降解性的形式；
4-无毒并且无免疫原性的形式；
5-优良的局部耐受性的形式。
为了实现这些目标，现有技术提出的最佳方法之一是开发用于延长释 放治疗蛋白质的形式，其由加载治疗蛋白质的纳米颗粒的低粘度液体悬浮 液组成。这些悬浮液有助于天然的治疗蛋白质的给药。
Flamel Technologies已经提出了一种方法，其中治疗蛋白质和含有疏水 基团和亲水基团的共聚氨基酸的纳米颗粒结合。
专利US-B-5904936描述了一种两性分子聚氨基酸共聚物的平均尺寸 0.01-0.5μm的亚微米颗粒(NPV)和平均尺寸0.5-20μm的微米颗粒(MPV)， 所述共聚物包括至少两种类型的氨基酸，一种是中性和疏水性的，另一种 是可电离的。在水性溶液中，蛋白质如胰岛素被自然地吸附到这些颗粒上。 这种聚氨基酸共聚物是例如聚(L-亮氨酸-嵌段-L-谷氨酸钠)的嵌段共聚物。 该专利描述了通过向聚-Leu/Glu的胶体悬浮液加入单价阳离子盐(硫酸铵) 或多价阳离子盐(Fe2+、Fe3+、Zn2+、Ca2+、Al2+、Al3+或Cu2+)、酸(HCl)或阳 离子聚合物(聚赖氨酸)引发的NPV向MPV的聚集。
专利申请WO-A-2005/033181公开了线性的、两性的、阴离子的均聚 氨基酸，其含有天冬氨酸单元或谷氨酸单元，并且其末端带有含有8-30碳 原子的疏水基团。具体地说，该“疏水改性的”远螯均聚氨基酸是例如带 有PheOC18/C18末端的聚[GluONa]或带有PheOC18/α-生育酚末端的聚 [GluONa]。在水中，这些“疏水改性的”远螯均聚氨基酸自发地形成一种 纳米颗粒胶体悬浮液，所述纳米颗粒在pH 7.4的水性悬浮液中易于和至少 一种活性蛋白质(胰岛素)相结合。
根据US-B-5904936和WO-A-2005/033181，由悬浮液“矢量化的”活 性蛋白质(如胰岛素)的体内释放时间能够有利地增加。
在PCT申请WO-A-05/051416中描述的药物形式也部分实现了释放时 间的增加。在该专利申请中，一种疏水改性的聚(L-谷氨酸钠)的纳米颗粒 (0.001-0.5μm)的胶体悬浮液在一定浓度下注射，使得在皮下注射后，其和 内源性的血清白蛋白接触，在患者的注射部位形成凝胶体。然后这种蛋白 质缓慢释放，通常超过一周的时间。然而，当给药的治疗蛋白质浓度相对 高时，例如人生长激素的情形时，其释放时间只能局限在几天。
不论何种情形，这些涉及疏水改性的聚氨基酸纳米颗粒或微米颗粒胶 体的现有技术都没有公开能够实现以下目的的制剂：
(I)在胃肠外注射例如皮下注射后增加活性蛋白质的释放时间，尤其是 当蛋白质浓度高时，
(II)和/或，在含有所述活性蛋白质的制剂注射后降低其浓度峰值。

在这些条件下，本发明的一个目的是提供一种药物制剂，用于AP的延 长释放，它克服了现有技术的缺陷，具体地说，能够使胃肠外(例如皮下) 注射后，非变性AP(例如治疗蛋白质和肽和小分子)，如人或合成蛋白质的 体内释放时间得到延长。
本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，能够使胃肠外(例如皮下) 注射后，高浓度治疗蛋白质和肽的体内释放时间得到延长，例如那些几 mg/ml的。
本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，用于体内AP的延长释放， 该制剂在物理化学和生理条件下均储存稳定。
本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，用于体内AP的延长释放， 它至少具有以下性质：生物相容性、生物降解性、非毒性、优良的局部耐 受性。
本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，用于AP在体内的缓慢延长 释放，所述制剂包括聚合物PO的微米颗粒，聚合物PO和至少一种AP自 动结合或者能够和至少一种AP自动结合，PO是一种带有疏水基团(GH)和 可电离基团(GI)的水溶性的生物可降解的聚合物，能够在水中自发形成胶体 纳米颗粒的悬浮液。
本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，含有前面所述的聚合物PO 的微米颗粒，其在皮下注射后释放治疗蛋白质或者肽的时间比在该AP和聚 合物PO的胶体悬浮液的水性介质中混合的相同蛋白质给药后的释放时间 更长。
本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，用于AP在体内的缓慢延长 释放，这种制剂包括聚合物PO的微米颗粒，聚合物PO和至少一种AP自 动结合，该聚合物PO例如是一种聚氨基酸，其主链由天冬氨酸残基和/或 谷氨酸残基构成，这些残基中的至少部分残基通过在链中和/或链端接枝至 少一个疏水性基团GH而被改性，PO还是生物降解性的、水溶性的和两性 的。
本发明的另一个目的是提供前面所列目标中所指的制剂和/或该制剂 前体的衍生产品。
申请人的贡献是，发现了根据WO 05/051416所述制剂的纳米颗粒聚集 成为带有确定的比例的和基团GI极性相反的多价离子的微米颗粒，可导致 特定数量的微颗粒的选择，使这些微颗粒相结合的AP(例如蛋白质或肽)的 释放时间得以显著地延长。
申请人的另一贡献是，发现了特定的多价离子可以使根据本发明的制 剂具有优良的耐受性。
因此本发明涉及一种用于延长释放AP的液体药物制剂，其含有基于聚 合物(PO)微米颗粒的低粘度的水性胶体悬浮液，
i.该聚合物PO
是水溶性、生物降解性、两性分子的共聚物，带有疏水性基团(GH)和 至少部分电离的可电离的亲水性基团(GI)，
并且在pH 7.0，等渗条件下自发地在水中形成纳米颗粒的胶体悬浮液，
ii.所述颗粒在水pH 7.0，等渗条件下能够自发地和至少一种活性成分 (AP)非共价地相结合，
制剂的特征在于，PO的微米颗粒以T试验测定的尺寸在0.5-100μm之 间，优选在1-70μm之间，特别优选在2-40μm之间，其特征还在于它还 包括化合价小于或等于4的多价离子，优选二价离子，三价离子或其混合 物，所述离子和聚合物的基团GI的极性相反，所述多价离子加入的目的是 使聚合物的纳米颗粒聚集成一定数量的微米颗粒，使得比例r值在0.3-10 之间、优选在0.6-5.0之间，特别优选在0.8-3.0之间，r以M试验测定，其 定义为公式$r=n\times \frac{\left[\mathrm{IM}\right]}{\left[\mathrm{GI}\right]},$ 其中
-n是所述多价离子的化合价，
-[IM]是多价离子的摩尔浓度，
-[GI]是可电离基团的摩尔浓度。
根据本发明选择的这些微米颗粒通过大量两性共聚物的纳米颗粒的聚 集生成。这种聚集优选由和共聚物所带的可电离基团GI(至少部分电离)极 性相反的多价离子的存在而引起。通过和属于不同纳米颗粒的聚合物链复 合，这些和共聚物的基团GI极性相反的多价离子引起聚合物的纳米颗粒絮 结成微米颗粒。
该AP能够在共聚物PO的纳米颗粒聚集成微米颗粒之前自然地和其结 合，和/或在聚集期间和/或之后自然地和微米颗粒结合。
此外，根据本发明的制剂是无毒的并且具有良好的局部耐受性。
公开的全文中，术语“亚微颗粒”或“纳米颗粒”和本发明制剂的具有微 米级尺寸的微米颗粒不同，它们表示颗粒尺寸(在下述的T’试验中测定)大于 或等于1nm并且小于500nm，优选5-250nm。
根据本发明的目的，术语“蛋白质”表示蛋白质或者肽，无论其为寡肽 或多肽。这种蛋白质或肽可以是改性的或者未改性的，例如接枝一个或多 个聚乙二醇基团。
这里公开的内容中，活性成分由AP指代；AP表示至少一种活性成分。
根据本发明的目的，这里公开的内容中，用于描述一种或多种AP和聚 合物PO(例如聚氨基酸)关系的术语“结合”(名词和动词)表示AP非共价地结 合到聚合物PO，例如通过静电和/或疏水相互作用和/或氢键和/或立体位阻。
离心的角速度以rpm表示(每分钟转数)，每分钟一转(r/min)的单位是 $1\mathrm{rpm}=\frac{2\pi }{60}\mathrm{rad}.s^{-1}.$
通过激光衍射测量微颗粒尺寸的T试验
a-T1试验，其中微颗粒的形式为水性分散物
1装置和操作条件
  激光颗粒测量仪 Malvern Mastersizer 2000 模块 Hydro 2000SM湿样分散单位 分散的载体流体体积 150ml 波长(蓝和红) 466和632nm 搅拌速度 2400rpm 分析范围 0.02μm-2000μm 光学模型(Mie氏理论) 所用的折光指数值： 分散流体(水) 聚苯乙烯橡胶 M流体＝1.33+i.0 m聚苯乙烯橡胶＝1.59+i.0 触发分析的遮拦值 5％-20％
  捕获时间 10s
2样品制备
用于分析的样品通过在5ml的试管中用600μl去离子水稀释400μl样品然 后在Vortex上搅拌10s(10±5)制备。
3样品分析
湿样分散系统中剩余的循环流体倒出，加入新鲜的去离子水。Hydro 2000SM的搅拌速度单位设置在2400rpm.
测试在下面提到的试验条件下开始：
1-校正激光束
2-记录背景噪音
这些步骤之后操作员按照以下方式加入分析样品：
滴加稀释的样品(用Pasteur管)，直到遮拦值为5％-20％，开始捕获。
获得数据和D50有关，它是一个数值，即被分析目标中直径小于该值的占 50％。
在三个不同样品中检测D50值三次，然后取其平均值。
b-T2试验，其中微颗粒处于干燥形式
1装置和操作条件
  激光颗粒测量仪 Malvern Mastersizer 2000 模块 Hydro2000SM湿样分散单位 分散的载体流体体积 150ml 波长(蓝和红) 466和632nm 搅拌速度 2000rpm 分析范围 0.02μm-2000μm 光学模型(Mie氏理论) 所用的折光指数值： 分散流体(水) 聚苯乙烯橡胶 m流体＝1.39+i.0 m聚苯乙烯橡胶＝1.59+i.0 触发分析的遮拦值 5％-20％
  捕获时间 10s
2样品制备
-制备Span 80的0.1％庚烷溶液(于20ml烧瓶中称量0.01g粉末化的Span 80，然后加入庚烷至最终重量为10g)。
-称6mg粉末于5ml的试管中。
-加入0.7g含0.1％ Span 80的庚烷于该试管中。
-试管置于超声池中2分钟以彻底分散粉末。
3样品分析
湿样分散系统中剩余的循环流体倒出，加入庚烷。Hydro 2000SM的搅拌 速度单位设置在2400rpm.
测试在下面提到的试验条件下开始：
1-校正激光束
2-记录背景噪音
这些步骤之后操作员按照以下方式加入分析样品：
滴加稀释的样品(用Pasteur管)，直到遮拦值为5％-20％，开始捕获。
获得数据和D50有关，它是一个数值，即被分析目标中直径小于该值的占 50％。
在三个不同样品中检测D50值三次，然后取其平均值。
通过弹性光散射测量纳米颗粒尺寸的T′试验
根据本发明的聚合物PO颗粒的平均水力直径通过下面定义的规程Md测 量：
制备介质为0.15M NaCl浓度为1或2mg/ml的PO溶液，搅拌24h。这些溶液 先通过0.8-0.2μm的滤膜，然后在Malvern Compact Goniometer System用垂直偏 振的波长632.8nm的He-Ne激光束进行动力光散射分析。聚合物PO颗粒的水力 直径由电场自相关函数通过加和方法计算获得，其在“Surfactant Science Series” 丛书，第22卷，Surfactant Solutions(Ed.R.Zana，chap.3，M.Dekker，1984)中有 描述。
通过离子色谱检测多价离子含量的M试验
多价离子Mg2+的量化将作为一个例子。该方法和检测其他阳离子的方法基 本相同(只是对照组变化)。
1装置和试剂
离子色谱
配备传导率检测器、阳离子自行-再生抑制器和自动调温箱的Dionex ICS2500离子色谱系统
柱(Dionex)：Ion Pac CS165x250mm柱
保护柱(Dionex)：Ion Pac CG165x50mm保护柱
阳离子抑制器(Dionex)：CSRS-ULTRA II-4mm
用于离子色谱的塑料瓶(Dionex)
去离子水(MilliQ)
0.1N盐酸(HCl)
甲磺酸(MSA)(Aldrich)
多价离子的硫酸盐：例如MgSO4(Aldrich)
2溶液的制备
溶剂：0.01N HCl
100ml0.1N HCl加入到含有约500ml MilliQ水的1升烧瓶中。用MilliQ水 补足至1升，然后磁力搅拌。
流动相：30mM MSA
使用锥形瓶，将2升MilliQ水加入到离子色谱的2升塑料瓶中。用自动吸 液管加入3.89ml到MSA。
烧瓶置于装置中，氦气鼓泡使该相混合并脱气。
3对照组和样品的制备
对照组的制备
在Mg2+浓度1mg/l-2.6mg/l制备三个对照组。
  MgSO4 0.01N HCl SM1 100ml烧瓶 50mg 补足至100ml 磁力搅拌
  SM2 100ml烧瓶 80mg 补足至100ml 磁力搅拌 SM3 100ml烧瓶 130mg 补足至100ml 磁力搅拌
制备储备液的稀释液。
  SMx 0.01NHCl T1 100ml烧瓶 1ml 补足至100ml T2 100ml烧瓶 1ml 补足至100ml T3 100ml烧瓶 1ml 补足至100ml
样品的制备
取样前颗粒制剂在Vortex充分搅拌，然后用自动吸液管混合。
通过调整重量和稀释体积获得至少一种稀释液，其预期的Mg2+浓度在1 mg/l-2.6mg/l。稀释液在0.01N HCl中获得以使聚合物沉淀。如果必要可 进行连续稀释。
该溶液磁力搅拌至少30分钟。
通过0.45μm滤膜后转移到烧瓶中。
每个样品准备两个制品。
4离子色谱条件
  进样体积 25μl 流速 1ml/min 分析时间 25min 检测 传导率μS/min 洗脱液 30mM MSA 柱温 40℃ 抑制器 阳离子 电流 87mA
5结果处理
标准线的确定
采用序列中的所有对照组获得回归线。相关系数必须>0.99。
该线的方程如下：
Y＝a X+b
其中，Y＝镁峰的面积
X＝对照溶液的浓度(mg/l)
样品中镁离子含量的检测
$M=\frac{(Y_{\mathrm{assay}}-b)\times V_d}{a\times P_e}$
M＝Mg2+含量(g/l)
Yassay＝所分析的镁峰的面积
a＝标准线的斜率
b＝标准线起点的纵坐标
Vd＝稀释体积(ml)
Pe＝样品重量(mg)
最终结果是2次分析的平均值。离子色谱中通常接受的变量系数为10％， 该方法验证时还会再确认。
比率r的计算
在上面的方案中我们讨论了镁含量的测定。其它多价离子(Ca2+、Zn2+、 Al3+等)的含量T按照类似的方法以相同的方式测定。
一旦按照这种方式测定了M的值，它就用于计算多价离子的摩尔浓度IM： $\left[\mathrm{IM}\right]=\frac{M}{M_{\mathrm{ion}}},$ 其中Mion是多价离子的摩尔重量，单位g/mol。
知道可电离聚合物的结构，尤其是其理论聚合程度DP、其理论分子量 Mp及其疏水接枝率(即，通过疏水性接枝改性的基团的部分αH)，就能 够计算一定的聚合物浓度C的可电离基团的摩尔浓度(以g/l表示)：
$\left[\mathrm{GI}\right]=(1-{\alpha }_H)\times \frac{C\times \mathrm{DP}}{M_p}$
这用于计算$r=n\times \frac{\left[\mathrm{IM}\right]}{\left[\mathrm{GI}\right]},$ 其中n是多价离子的化合价。
优选地，根据本发明的制剂的特征在于微米颗粒具有0.05-1.0，优选 0.07-0.7，特别优选0.1-0.5的表观聚合物密度dapp，其以下面描述的试验D测定。
测定表观密度dapp的试验D
具有聚合物浓度C(mg/g)的微颗粒悬浮液用磁力搅拌使其均质化。用微吸 管取2ml倍数的颗粒悬浮液置于一预先称出皮重的离心管中。置于该管中的微 颗粒悬浮液称重(重量m，单位g)。该管置于离心机中并于8000rpm离心30分钟。 用合适的微吸管精确移去上清液。这用于计算沉淀物的体积Vsed(ml)：
Vsed＝Vtot-Vsur.
表观聚合物密度dapp(g/cm3)通过下式算出：
$d_{\mathrm{app}}=\frac{\frac{m\times c}{1000}}{V_{\mathrm{sed}}}$
加载AP的微米颗粒的悬浮液能够有价值地使AP(例如治疗蛋白质或肽) 的释放时间得到显著延长，并且使血浆浓度峰值降低。
具体地说，和现有技术的制剂相比，尤其是和专利申请WO 05/051416 相比，AP的释放时间得到显著的延长。由于AP(例如治疗蛋白质)完全是生 物活性的并且是未变性的，根据本发明的制剂所实现的AP体内释放时间的 延长更具有价值。
因此，根据本发明的制剂的一个有利的功能性特征是AP的释放时间Tr 比不含有多价离子的相同制剂的释放时间tr长，优选Tr大于或等于1.1 x tr， 特别优选Tr大于或等于1.5 x tr，两者均以试验L测定。
用于测定AP从根据本发明的微颗粒释放的试验L
将吸附性聚丙烯材料裁成2x2cm的正方形。
磷酸盐缓冲溶液(称为PBS)通过将一片PBS(Aldrich)溶解于200ml水中制 备。这样可以获得含有0.01M磷酸盐缓冲液+0.0027M氯化钾和0.137M氯化 钠的溶液200ml。
含有30mg/g的牛白蛋白缓冲溶液(称为BSA)通过将6g牛血清蛋白，流分 V(SAFC)溶解于预先制备好的294g PBS中制得。
两个50ml的Falcon管，分别含有用于浸泡吸附材料的PBS和BSA溶液， 储存于冰箱中。
4或5ml的这些溶液置于5ml容量的密封管中(两种介质每种准备5个样 品)。它们储存在冰箱中。
15小时间隔后，这些含有连续相当5ml管再置于37℃下1小时。
这些正方形的吸附材料于37℃浸泡1小时，其中5个浸泡在PBS中，5个浸 泡在BSA中(如果注射有问题则更多)。
用27G针(1ml注射器)将0.5ml制剂注射到每个正方形吸附材料的中央 (与其表面平行)，事先在纸上用海绵擦拭。
标记注射的那一面。
该步骤应用于10个正方形吸收材料，它们直到后期才浸泡到连续相中， 以使所有的动力学同步。这些正方形吸收材料以注射点和管的顶部靠近的 方式放置。
这些样品置于固定器中并且全部都放入37℃的烘箱中，振摇。
振摇会显著影响释放的动力学，因此需要控制：振摇设置在40，两个障 碍栏的距离为9cm。
在不同时间点取100μl得连续相。
通过HPLC分析蛋白
使用了两种洗脱相：
-洗脱相A：1260ml水/680ml乙腈/60ml THF/1.8ml TFA
-洗脱相B：630ml乙腈/340水/30ml THF/0.8ml TFA
HPLC条件的比较见下表：


然后，连续介质中的蛋白质浓度按照时间作图。
当曲线处于最高点并且稳定后，释放的蛋白质总量可以从该曲线读出： 为了使试验有效，该值必须代表最初加入蛋白的至少40％。时间Tr，即释放 50％所加入的AP所需的时间，可以随后从该曲线读出。
根据一个优选地特征，根据本发明的液体药物制剂的特征在于，悬浮 液的微米颗粒能够在水性液体中通过向聚合物PO纳米颗粒和可选的一种 AP的混悬液加入含有多价离子，优选二价离子的盐获得，所述离子和聚合 物PO的基团GI的极性相反。
在一个优选地实施方式中，根据本发明的制剂包括一种和PO的颗粒结 合的AP。
这种制剂的优点是可以胃肠外注射并且在注射条件下是液体。
根据本发明，术语“液体”、“低粘度”或“极低粘度”优选对应于20℃时的 动力学粘度低于或等于1000mPa.s。优选地，该制剂的动力学粘度，以20 ℃时1000s-1的剪切梯度测定，优选小于或等于500mPa.s，特别优选2-200 mPa.s，例如1.0-100mPa.s或1.0-50mPa.s。
动力学粘度的测定
动力学粘度的对照测量可以在20℃时使用配备锥板式几何学(4cm，2°) 的AR1000流变仪(TA仪器)完成。粘度v在1000s-1的剪切梯度测定。
低粘度可以使本发明的制剂容易以胃肠外方式注射，尤其是通过粘膜、 肌内、皮内、腹腔或脑内途径或尤其是注射到肿瘤中。
根据本发明的制剂也可以通过口腔、鼻腔、肺部、阴道、眼部或颊部 途径给药。
本发明制剂的液体状态或低粘度可同时存在于对应于室温的注射温度 (例如4-30℃)和生理温度。
对本发明有用的聚合物PO是带有疏水基团GH和可电离基团GI的水溶 性生物可降解聚合物。和链的剩余部分相比，疏水基团的数目可以少一些， 并且可以从侧面连接到链上或者插在链中，并且可以随机分布(无规共聚物) 或者以序列或者接枝的形式分布(嵌段共聚物或连续共聚物)。
在本发明的一个优选地实施方式中，疏水基团GH从侧面连接到链上。
不受限制地，疏水改性的聚合物PO可以选自以下组群：聚氨基酸、(多) 肽、明胶、蛋白质、多糖-优选自以下亚组：卜多糖或壳聚糖或粘多糖或右 旋糖苷或半乳甘露聚糖或聚透明质酸-及其混合物。
在本发明的一个优选实施方式中，PO选自两性分子的(共)聚氨基酸。
根据本发明的目的和公开的内容，术语“聚氨基酸”覆盖天然和合成的 聚氨基酸，以及包括10到20个“氨基酸残基”的氨基酸低聚物和包括超过20 个“氨基酸”残基的聚氨基酸。
优选地，本发明有用的聚氨基酸是低聚物或均聚物，含有谷氨酸或天 冬氨酸重复单元，或共聚物体，含有这两种类型“氨基酸”残基的混合物。 这些聚合物中所述的残基是具有D、L或D/L构形的氨基酸，就谷氨酸或谷 氨酸残基来说，其通过它们的α或γ位结合，就天冬氨酸或天冬氨酸残基来 说，其通过它们的的α或β位结合。
优选的聚氨基酸主链的“氨基酸”残基是具有L构形和α型键合的那些 残基。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，PO是天冬氨酸残基和/或谷氨 酸残基形成的聚氨基酸，至少一些这些残基中带有包含至少一个疏水基GH 的接枝。PCT申请WO-A-00/30618中特别描述了这些类型的聚氨基酸。
第一种可能，聚合物可以由下列通式(I)定义：

其中：
■其中，R1是H，C2到C10的直链烷基或C3到C10的支链烷基，苄基，末端 氨基酸单元或-R4-[GH]；
■R2是H，C2到C10的直链酰基或C3到C10的支链酰基基团，聚谷氨酸或 -R4-[GH]；
■R3是H或阳离子单元，优选自：
-金属阳离子，优选自包括钠，钾，钙和镁的亚组，
-有机阳离子，优选自亚组：
●基于胺的阳离子，
●基于低聚胺的阳离子，
●基于聚胺的阳离子(优选聚乙烯亚胺)，
●基于氨基酸的阳离子，优选自包括基于赖氨酸或精氨酸的阳离子 类；
-以及阳离子聚氨基酸，优选自包括聚赖氨酸和低聚赖氨酸的亚组；
■R4是直接键或基于1到4个氨基酸残基的“间隔子”；
■独立地，A是基团-CH2-(天冬氨酸单元)或-CH2-CH2-(谷氨酸单元)；
■n/(n+m)为摩尔接枝率，pH为7，25℃时溶于水中PO的摩尔连接率值足够 低，以形成PO超微化颗粒的胶体悬浮液，n/(n+m)优选在1和25mol％之间， 特别优选在1和15mol％之间；
■n+m为聚合度，其在10到1000之间，优选在50和300之间；以及
■GH是疏水基。
在本发明的一个优选的具体实施方式中，该制剂的特征在于所述疏水 基团GH衍生自醇前体，选自以下组群：辛醇，十二烷醇，十四醇，鲸蜡醇， 十八碳醇，油醇，生育酚和胆固醇，并且R4是直接键。
第二种可能，PO可以是以下通式(II)、(III)和(IV)中的一种：


其中：
■GH是疏水基；
■R30是C2到C6的直链烷基；
■R3’是H或阳离子单元，优选自：
-金属阳离子，优选自包括钠，钾，钙和镁的亚组，
-有机阳离子，优选自亚组：
●基于胺的阳离子，
●基于低聚胺的阳离子，
●基于聚胺的阳离子(优选聚乙烯亚胺)，和
●基于氨基酸的阳离子，优选自包括基于赖氨酸或精氨酸的阳离子 类；
-以及阳离子聚氨基酸，优选自包括聚赖氨酸和低聚赖氨酸的亚组；
■R50是C2到C6的烷基，二烷基或二胺基；
■R4是直接键或基于1到4个氨基酸残基的“间隔子”；
■独立地，A是基团-CH2-(天冬氨酸单元)或-CH2-CH2-(谷氨酸单元)；并且
■(n′+m′)和n″为聚合度，其在10到1000之间，优选50到300之间。
优选地，PO的GH基团彼此独立，为下式的单价基团：

其中：
-R5是甲基(丙氨酸)，异丙基(缬氨酸)，异丁基(亮氨酸)，仲丁基(异亮氨酸 基)或苄基(苯丙氨酸)；
-R6是含6到30个碳原子的疏水基团；以及
-1为0到6。
根据本发明的一个显著特征，PO的所有或部分疏水基R6是独立的，选 自以下组群：
■含6到30个碳原子的直链或支链烷氧基以及含至少一个杂原子(优选O、N 或S)或至少一个不饱和单元，
■含6到30个碳原子的烷氧基，其具有一个或多个碳环，可选地，含至少 一个不饱和单元或至少一个杂原子(优选O、N或S)，以及
■含7到30个碳原子的烷氧基芳基或芳氧基烷基，并且含至少一个不饱和 单元或至少一个杂原子(优选O、N或S)。
在实践上，并且没有限制性地，聚合物PO的接枝的疏水基团R6衍生自 醇前体，选自以下组群：辛醇，十二烷醇，十四醇，鲸蜡醇，十八碳醇， 油醇，生育酚和胆固醇。
优选地，聚氨基酸的主链是：
α-L-谷氨酸根或α-L-谷氨酸均聚物；
α-L-天冬氨酸根或α-L-天冬氨酸均聚物；
或α-L-天冬氨酸根/α-L-谷氨酸根或α-L天冬氨酸/α-L-谷氨酸共聚物。
优选地，PO的聚氨基酸主链的天冬氨酸和/或谷氨酸残基的分布使得 到的聚合物是无序的或嵌段型的或多嵌段型的。
根据另一种定义，用于根据本发明制剂的PO的分子量在2000和 100,000g/mol之间，优选在5000和40,000g/mol之间。
在一个具体实施方式中，根据本发明的制剂的PO带有至少一个聚二醇 类接枝，其与谷氨酸根和/或天冬氨酸根残基键合。
优选地，该聚二醇类接枝为下式(V)所示：

其中：
-R’4是直接键或1到4个氨基酸残基的“间隔子”；
-X是选自氧、氮和硫的杂原子；
-R7和R8独立地为H或直链的C1到C4烷基；以及
-n”’为10到1000，优选地，为50到300。
在实践中，聚二醇是例如聚乙二醇。
根据本发明，所需聚二醇接枝的摩尔百分率为1到30％。
此外，聚氨基酸PO在下述方面非常有价值，即它们以可调节的接枝率 分散在pH为7.4(如，以磷酸盐缓冲液调节)的水中，形成胶态悬浮液。
而且，一些活性成分AP，例如蛋白质，肽或小分子，可以自发地与包 括这些聚氨基酸PO的纳米颗粒结合。
应该理解的是，包含可电离基团的PO可以是中性的(如COOH)或电离的 (COO-)，视pH和组合物而定。因此，在水相中的溶解度直接取决于可电离 基团的比例和pH。当水溶液中有羧基时，抗衡离子可以是金属阳离子(例如 钠、钙或镁)，或有机阳离子(例如三羟乙基胺，三羟甲基氨基甲烷)，或聚 胺(如聚乙烯亚胺)。
用于本发明制剂的聚氨基酸类的PO可以通过例如为本领域技术人员 所知的方法得到。无序聚氨基酸可以通过普通的偶联反应，将疏水基(预先 被“间隔子”功能化)直接连接到聚合物上而得到。嵌段或复块聚氨基酸PO 可以通过相应氨基酸N-羧基酐(NCA)的连续聚合得到。
例如，共聚谷氨酸根或共聚天冬氨酸聚氨基酸或嵌段，复块或无序谷 氨酸根/天冬氨酸根共聚物由常规方法制备。
为得到α型聚氨基酸，最常用的方法是基于氨基酸N-羧基酐(NCA)的 聚合，对该方法描述在题为“Biopolymers”，1976，15，1869的文章以及 H.R.Kricheldorf所作的题为“α-amino acid N-carboxy anhydrides and related heterocycles”，Springer Verlag(1987)的书中。NCA衍生物优选为 NCA-O-Me、NCA-O-Et或NCA-O-Bz衍生物(Me＝甲基，Et＝乙基，Bz＝苄 基)。然后将聚合物在适当的条件下水解，以得到它的酸形式聚合物。这些 方法基于申请人的专利FR-A-2801226。本发明使用的许多聚合物，例如， 分子量不同的聚(α-L-天冬氨酸)、聚(α-L-谷氨酸)、聚(α-D-谷氨酸)和聚(γ-L- 谷氨酸)类，均可在市场上买到。α-β型的聚天冬氨酸聚合物经天冬氨酸的 缩合(以得到聚琥珀酰亚胺)，然后是碱水解得到(参考Tomida等人的 polymer，1997，38，4733-36)。
接枝物与聚合物酸根的偶合通过聚氨基酸在碳二亚胺作为偶联剂、以 及可选地，催化剂例如4-二甲基氨基吡啶的存在下，于适当的溶剂中进行 反应，溶剂例如为二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲亚砜 (DMSO)。碳二亚胺可以是二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺。接枝率 由组分和反应物的化学当量控制，或通过反应时间控制。通过常规的肽偶 合或通过在酸催化之下直接缩合，以“间隔子”功能化疏水基。这些技术均 为所属领域的技术人员所熟知。
由预先与疏水性接枝合成的NCA衍生物来合成嵌段或复块共聚物。 例如，疏水NCA衍生物与NCA-O-Bz进行异分子聚合，然后通过水解选择 性除去苄基。
在优选地具体实施方式中，本发明的制剂包括至少一种AP，其基于一 种PO的纳米颗粒和至少一种AP在水溶液介质中，通过非共价结合而得。
制备时，PO和/或AP可以是固态(优选为粉末)和/或液态(优选为胶体 的水性悬浮液)。
按照本发明公开的内容，AP/PO结合，AP通过一个或多个非共价化学 键和聚合物PO[例如，一个或多个聚氨基酸]相连。
本发明的一种或多种AP与PO的结合技术，特别描述在专利申请 WO-A-00/30618中。这些技术将至少一种AP加入到包含PO纳米颗粒的液 体介质中，以得到载有一种或多种AP的纳米颗粒的胶体悬浮液。
根据本发明的目的，术语“多价离子”指二价离子、三价离子、四价离 子以及这些离子的混合物。
当PO具有阴离子基团GI时，所述多价离子是多价阳离子，优选二价阳 离子并且特别优选自包括Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+及其混合物的组群， 和/或三价离子，特别优选自包括Al3+、Fe3+及其混合物的组群。
除多价离子外，根据本发明的制剂可以包括单价离子(例如阳离子)，它 们在纳米颗粒聚集成微米颗粒的过程中可以起作用。
这些多价离子优选以水性(有机或矿物)盐溶液的形式，例如多价离子的 硫酸盐、氯化物、乙酸盐、葡糖酸盐或谷氨酸盐(或其它阴离子氨基酸)的溶 液加入到本发明的制剂中。
为了改善其稳定性，该制剂优选含有至少一种稳定剂，选自以下组群：
→至少一种聚合物PO的纳米颗粒，PO是一种水溶性的、可生物降解的、 两性分子的共聚物，其带有疏水性基团(GH)和至少部分电离的可电离的 亲水性基团(GI)，其能够在等渗条件下，pH＝7.0时在水中自发地形成一 种纳米颗粒的胶体悬浮液；
→聚二醇类，优选聚乙二醇类；
→共聚二醇类，优选乙二醇/丙二醇共聚物(泊洛沙姆、Pluronic或Lutrol类 的)；
→纤维素聚合物及其衍生物，优选羧基烷基纤维素(例如羧甲基纤维素)或 烷基纤维素(如甲基纤维素)；
→山梨聚糖和一种或多种脂肪酸的酯类，优选吐温或聚山梨醇酯类的聚氧 烯烃(例如聚氧乙烯)二醇和至少一种酸(例如油酸)的酯类；
→基于磷脂和聚烯烃二醇的表面活性剂，优选聚乙二醇；
→氢化或非氢化的糖类，例如海藻糖、山梨醇、甘露醇或蔗糖；
→多元醇，如丙二醇或甘油；
→明胶类，优选水解明胶；
→含氮(共)聚物，优选自含有聚丙烯酰胺、聚-N-乙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷 酮(PVP)和聚-N-乙烯内酰胺的组群；
→聚乙烯醇类(PVA)；
→及其混合物。
根据本发明的优选的稳定剂中的一种由至少一种聚合物PO的纳米颗粒 构成，所述PO和构成所述微米颗粒的聚合物相同(优选)或不同。
制剂中所用稳定剂的量优选0.01-10％重量，特别优选0.1-0.5％重量。
至于含有纳米颗粒的稳定剂，它们优选以1.5-3.5％重量用于所述制剂， 例如2.0-3.0％(≈2.5％)重量。
关于AP，优选自以下组群：蛋白质、醣蛋白、与一个或多个聚二醇链 结合的蛋白质[优选聚乙二醇(PEG)链：“聚乙二醇化的蛋白质”]、肽、聚糖、 脂糖、寡聚核苷酸、多核苷酸及其混合物，并且特别优选自以下亚组群： 血红蛋白、催产素、后叶加压素、促肾上腺皮质激素、表皮生长因子、血 小板源性生长因子(PDGF)、造血刺激因子及其混合物、VIII因子和IX因子、 血色素、细胞色素、泌乳刺激素、白蛋白、黄体激素释放激素(LHRH)、LHRH 拮抗剂、LHRH竞争剂、人、猪或牛生长因子(GH)、生长激素释放因子、 胰岛素、生长激素抑制素、胰高血糖素、白介素或其混合物(IL-2、IL-11、 IL-12)、α-、β-或γ-干扰素、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、 分泌素、降钙素、脑啡肽、内吗啡肽、血管紧张素、促甲状腺素释放激素 (TRH)、肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因 子(M-CSF)、肝素酶、骨成形素蛋白(BMP)、hANP、类高血糖素样肽(GLP-1)、 VEG-F、重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)、肾素、细胞因子、缓激肽、杆 菌肽、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽、环孢菌素类、和酶、 细胞因子、抗体、抗原和疫苗的合成类似物和药学活性改性物和片段。
在一个变化例中，活性成分是“小的”、疏水的、疏水的或两性分子的 有机分子，其类型属于蒽环霉素、紫杉醇或喜树碱家族，或是肽(如亮丙瑞 林或环孢子菌素)以及它们的混合物。
本发明的内容中，“小”分子特别指非蛋白小分子，如没有氨基酸的小 分子。
在另一个变化例中，所述AP优选自以下活性物质类别：治疗酗酒的药 物、治疗阿尔茨海默病毒药物、麻醉药、治疗肢端肥大症的药物、镇痛药 物、平喘药、治疗过敏的药物、抗肿瘤药、抗炎药、抗凝血剂和抗血栓形 成剂、抗惊厥药、抗癫痫药、抗糖尿病药、止吐药、抗青光眼药、抗组胺 药、抗感染药、抗生素、抗真菌药、抗病毒药、抗帕金森病药、抗胆碱药、 止咳药、碳酸酐酶抑制剂、心血管药物、降血脂药、抗心律失常药、血管 扩张药、抗心绞痛药、抗高血压药、血管保护剂、胆碱酯酶抑制剂、治疗 中枢神经系统失调的药物、中枢神经系统刺激剂、避孕药、生殖促进药、 分娩促进药和抑制剂、治疗粘液粘稠病的药物、多巴胺受体激动剂、治疗 子宫内膜异位的药物、治疗勃起障碍的药物、治疗生育的药物、治疗胃肠 道疾病的药物、免疫调节剂和免疫抑制剂、治疗记忆疾病的药物、抗偏头 痛药、肌松药、核苷类似物、治疗骨质疏松的药物、拟副交感神经药、前 列腺素、心理治疗药、镇静药、催眠和镇定药、安定药、抗焦虑药、精神 振奋药、抗抑郁药、治疗皮肤病的药物、甾体和激素、安非他明、减肥药、 非镇痛型止痛药、抗癫痫药、巴比妥类、苯并二氮杂卓类、催眠药、放松 药、精神药品以及这些产品的联合使用。
从定量的角度看，不与微米颗粒结合的AP[非结合AP]的重量百分率为 以下数值时特别有价值：
-[非结合AP]≤1，
-优选[非结合AP]≤0.5。
在一个变化例中，AP可以是一定剂量的重组人生长激素hGH，例如 0.2-2mg/kg，并且优选0.5-1mg/kg。
在另一个变化例中，AP可以是一定剂量的胰岛素，例如0.2-2UI/kg， 并且优选0.5-1UI/kg。
在另一个变化例中，AP可以是一定剂量的α-2b干扰素，例如20-100 μg/kg，并且优选40-80μg/kg。
优选地，根据本发明的制剂用于制备药物，尤其用于胃肠外、粘膜、皮下、 肌内、皮内给药、腹腔给药或脑内途径给药，或注射到肿瘤中，或口服、 经鼻、经肺部、经阴道、或经眼部途径给药。
根据本发明另一个特征、本发明涉及上述制剂的制备方法。
该制剂制备方法的特征主要在于：
a.取至少一种PO纳米颗粒的胶体悬浮液，
b.可选地，优选在水性溶液中，将该PO的纳米颗粒的胶体悬浮液与至少一 种AP混合，
c.可选地，过滤所得的悬浮液，
d.加入和聚合物PO的基团GI极性相反的多价离子(优选以盐的形式)，所述 多价离子加入到量使得按照下式定义的比值r在0.3-10，优选0.6-5.0，特 别优选0.8-3.0之间，
$r=n\times \frac{\left[\mathrm{IM}\right]}{\left[\mathrm{GI}\right]},$ 其中
-n是多价离子的化合价，
-[IM]是多价离子的摩尔浓度，
-[GI]是可电离基团GI的摩尔浓度，以及
e.如有必要，调节pH和/或摩尔渗透压浓度(例如通过渗滤)。
根据本发明的制剂优选在室温下(e.g.25℃)制备。
可以展望AP和微米颗粒的不同结合方式(参见上文)。优选地，通过聚 集的方式使AP和用以形成微米颗粒纳米颗粒结合。也可以使AP直接和微米 颗粒结合。两种结合方法可以联合使用。
为了和纳米颗粒或微米颗粒结合，AP优选以水性悬浮液或溶液的形式 和PO的纳米颗粒或微米颗粒的胶体悬浮液相混合。在一个实施方式中，AP 可以固体形式使用，然后和纳米颗粒或微米颗粒的悬浮液混合。
本发明还涉及衍生自包含于根据本发明的制剂的PO的纳米颗粒和微米 颗粒的固体产品。
在实践中，这些衍生产品可以尤其主要由粉末、凝胶、植入物或薄膜 组成。
因此本发明涉及衍生自根据本发明的制剂的产品，它们和其制备方法 无关。因此，这里的衍生产品的特征在于它是非液体形式的并且它包括聚 合物(PO)的微米颗粒。
i.该聚合物PO
●是水溶性的、生物降解性的、两性分子的共聚物，带有疏水性基团 (GH)和可电离的亲水性基团(GI)，
●并且在水中、pH 7.0，等渗条件下自然地形成纳米颗粒的胶体悬浮 液，
ii.所述颗粒在水pH 7.0，等渗条件下能够自然地和至少一种活性成分(AP) 非共价地相结合；
PO的这些微米颗粒具有一定尺寸，以T试验测定，在0.5-100μm之间， 优选在1-70μm之间并且特别优选在2-40μm之间；
还在于它包括和聚合物的基团GI的极性相反的多价离子，优选二价离 子的衍生物，以下式定义的比值r在0.3-10之间、优选0.6-5.0之间并且特别 优选0.8-3.0之间，
$r=n\times \frac{\left[\mathrm{IM}\right]}{\left[\mathrm{GI}\right]},$ 其中
-n是所述多价离子的化合价，
-[IM]是多价离子的摩尔浓度，
-[GI]是可电离基团的摩尔浓度。
这种衍生产品可以由例如粉末或凝胶组成。
本发明还涉及根据本发明的制剂的衍生产品，其作为中间体产生于根 据本发明的制剂的制备。本发明因此还涉及至少一种这些衍生产品的制备 方法。该方法的特征主要在于干燥微米颗粒的悬浮液以得到固体形式，优 选能够储存或给药的微米颗粒的粉末。
这些衍生产品提供了制备根据本发明的制剂的另一种方法，这种方法 的特征主要在于：
◆取至少一种由上面定义的方法获得的衍生产品，
◆将衍生产品和水或重构的水性溶液S相混合。
在后面的情形中，该液体药物制剂可以在使用前通过在注射前将固体 衍生产品(例如粉末)和水或S相混合立即重构获得。
例如，S可以含有一种水性溶液并且可以简单地是注射用水。
而且，S可以任选地含有：
-至少一种缓冲液或可注射盐(磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、氯化 钠)，浓度为例如0.001M-0.1M，优选0.005M-0.02M，这种缓冲液或这种 可注射盐能够调节溶液的pH；和
-至少一种可注射的表面活性剂，优选聚山梨醇酯，例如吐20或吐 80，或者是泊洛沙姆类的，例如F38、F68或F127， 浓度为例如0.01％-2％，优选0.05-0.5％。
S还可以包括增加密度的试剂，例如糖类，如蔗糖、D-甘露醇或海藻糖， 浓度为0.1％-10％，并且优选0.5-5％。这种重构溶液还可以含有可注射的增 粘聚合物，选自包括多糖、合成聚合物(如羧甲基纤维素钠)、聚乙烯醇、聚 乙烯吡咯烷酮、聚二醇(如聚乙二醇)及其混合物的组群。
更为通常地，可以加入到根据本发明的制剂的赋形剂的例子是本领域 技术人员所知的抗微生物剂、缓冲剂、抗氧化剂和渗透压调剂。可参考 Injectable Drug Development一书，P.K.Gupta等，Interpharm Press，Denver， Colorado，1999。
根据本发明，可以展望使用过滤除菌的方式，在孔径0.2μm的滤膜上， 提供根据本发明的制剂的聚集成微米颗粒的纳米颗粒悬浮液。因此根据上 面描述的方法在无菌条件下的聚集可以使制剂直接注射给病人。
根据本发明的制剂的主要性质包括，在相同的pH、相同的蛋白质浓度 下和相同的聚合物浓度下给药，其释放AP的时间比相同的聚合物的纳米颗 粒的胶体悬浮液更长。
本发明还涉及药物的制备方法，特别是用于胃肠外、粘膜、皮下、肌 内、皮内给药、腹腔给药或脑内途径给药或肿瘤内给药，或口服、经鼻、 经肺部、经阴道、或经眼部途径给药的药物，其特征主要在于使用了上面 定义的制剂本身，或根据上面定义的方法获得的制剂，或任何衍生自所述 制剂的产品，或任何所述制剂的前体。
虽然根据本发明的制剂优选用于药物，但不排除用于化妆品，饮食品 或植物检疫制剂，该制剂包括至少一种上述PO和至少一种AP。
本发明还涉及一种治疗方法，其主要在于通过胃肠外、粘膜、皮下、 肌内、皮内给药、腹腔给药或脑内途径给药或肿瘤内给药，或通过口服、 经鼻、经肺部、经阴道、或经眼部途径给予本说明书中描述的制剂。
在本发明的一个具体变化例中，该治疗方法在于通过胃肠外注射、皮 下注射、肌内注射、皮内注射、腹腔注射或脑内途径注射或注射到肿瘤内 给药，优选以在注射位点形成贮库的方式给药上述制剂。
通过以下实施例将更清楚地理解本发明，且本发明的优点和实施方式 将更显而易见，所述实施例描述了由聚氨基酸与疏水基连接形成的PO的合 成，以及它们转变为AP的持续释放体系，即本发明的制剂(稳定的水溶胶体 悬浮液)，并阐述了这种体系不仅可以和治疗蛋白质结合，而且，特别是可 以形成胶凝体/交联的能力，以在体内以非常持久的方式释放治疗蛋白质。
附图说明
唯一的附图是一曲线，显示试验L中，根据其是否包含在PO纳米颗粒[■ 纳米颗粒23mg/g]或实施例8所制备的PO微颗粒[◆微颗粒73mg/g]中，人 生长激素[hGH相对于所注射总浓度的％]的释放和时间[t：分钟]的函数。

实施例1：两性分子聚合物PO
用α-生育酚作为合成来源接枝聚谷氨酸的合成
在80℃加热15gα-L-聚谷氨酸(相对于聚氧乙烯标准的分子量为 16,900Da左右，其通过聚合NCAGluOMe然后水解得到，如专利申请 FR-A-2801226所描述)直到其溶解在288ml二甲基甲酰胺(DMF)里。将溶液 冷却至15℃，连续加入预先溶解在8ml DMF里的2.5g D，L-α-生育酚(>98％， 购自Fluka)、预先溶解在1ml DMF里的280mg4-二甲基氨基吡啶和预先溶 解在6ml DMF里的1.6g二异丙基碳二亚胺。搅拌3小时后，将反应介质倒入 1200ml含有15％的氯化钠和盐酸(pH＝2)的水中。然后通过过滤并用0.1N 盐酸、水和二异丙醚洗涤来回收沉淀的聚合物。然后该聚合物在40℃真空 箱中干燥，得到的产率约为90％。用体积排除色谱法测得的相对于聚氧乙 烯标准的分子量为15,500。用质子NMR光谱法评估的生育酚的接枝比例为 5.1mol％。将其溶解在水中，并将pH调节(中和羧酸盐)至7±1，获得聚合 物在水中的纳米颗粒悬浮液。
实施例2：制备100g装载有hGH的聚合物PO纳米颗粒的胶体悬浮液
2.1制备两性分子聚合物PO的胶体溶液
聚合物置于溶液中过夜以达到30℃恒温。
称出35.3g实施例1的聚合物PO。
用26.65g无菌注射用水稀释(对于浓度为28.4mg/g的聚合物PO)。
磁力搅拌该聚合物溶液。
加入1.89g的5.13M NaCl水溶液(30％w/w)将该溶液的摩尔渗透压浓 度调整至300±20mOsm。
加入0.38g的1N NaOH溶液将pH调节至7.4±0.2。
得到浓度为15.61mg/g的聚合物溶液64.22g。
2.2蛋白质和聚合物的结合
重组人生长激素(称为hGH)溶液在25℃解冻90分钟。
然后将35.92g的hGH溶液(浓缩的，3.9mg/g)在搅拌下加入64.15g预先 制备的聚合物胶体溶液中。
装载有蛋白质的该溶液在室温下陈化2小时。
然后将其通过0.8-0.2μm的过滤器并陈化过夜。
得到100g用于注射的制剂，其含有1.4mg/g的hGH和10mg/g的PO型聚 合物。
实施例3：用MgCl2制备微米颗粒悬浮液
该悬浮液由实施例2制得的溶液制备，所述溶液具有调整后的pH和摩尔 渗透压浓度，并含有10.0mg/g的PO。
a)使用递送速度为约20ml/h的动作受控的注射器，在搅拌下(第9号装 置)加入1M MgCl2溶液使溶液絮凝。这种情况下表示添加阳离子的比例：
$r=2\times \frac{\left[{\mathrm{Mg}}^{2+}\right]}{\left[\mathrm{Glu}\right]}$
等于3.36。得到含有8.51mg/g的PO的溶液。
b)在2500rpm的速度下离心25分钟。清澈的上清液的摩尔渗透压浓度 是646mOsm。
c)用无菌水(初始溶液体积的1/8)洗涤残余物，并在2500rpm的速度下离 心10分钟。清澈的上清液的摩尔渗透压浓度是350mOsm。
d)在2500rpm的速度下离心10分钟。
该制剂的特性如下：
  pH 6.64 摩尔渗透压浓度 349mOsm [PO] 50.77mg/g 粒径D50(根据T1试验) 20μm
实施例4：用CaCl2并在降低的pH下制备微颗粒悬浮液
该悬浮液由实施例2制得的溶液制备，所述溶液具有1.2mg/g的hGH和 25.9mg/g的PO的最终特性。
a)使用递送速度为约70ml/h的动作受控的注射器，在搅拌下(600rpm) 加入0.1N HCl，将初始制剂的pH调节至5.52。
b)使用递送速度为约39ml/h的动作受控的注射器，在搅拌下(600rpm) 加入1M CaCl2溶液使聚合物絮凝。这种情况下表示添加阳离子的比例：
$r=2\times \frac{\left[{\mathrm{Ca}}^{2+}\right]}{\left[\mathrm{Glu}\right]}$
等于1.68。
c)在2500rpm的速度下离心8分钟。清澈的上清液的pH为4.73且摩尔渗 透压浓度为653mOsm。
d)用MilliQ水(初始溶液体积的1/8)洗涤残余物并在2500rpm的速度下 离心4分钟。清澈的上清液的pH为4.72且摩尔渗透压浓度为378mOsm。
e)在2500rpm的速度下离心4分钟来浓缩残余物，得到浓缩的悬浮液。
所得悬浮液具有以下特性：
  pH 4.88 摩尔渗透压浓度 386mOsm [PO] 122.88mg/g [hGH] 4.9mg/g 粒径D50(根据T1试验) 23μm
实施例5：用CaCl2制备微颗粒悬浮液
该悬浮液由实施例2制得的溶液制备，所述溶液具有1.2mg/g的hGH和 26.01mg/g的PO的最终特性。
a)使用递送速度为约40.3ml/h的动作受控的注射器，在搅拌下(600 rpm)加入1M CaCl2溶液使初始制剂絮凝，直到比例r为3.36。得到含有0.93 mg/g的hGH和20.28mg/g的PO的制剂。
b)在2500rpm的速度下离心4分钟。清澈的上清液的pH为6.34且摩尔渗 透压浓度为832mOsm。
c)用MilliQ水(初始溶液体积的1/3)洗涤残余物并在2500rpm的速度下 离心8分钟。清澈的上清液的pH为6.56且摩尔渗透压浓度为334mOsm。
d)通过在2500rpm的速度下离心8分钟来浓缩残余物，得到浓缩的悬浮 液。
所得悬浮液具有以下特性：
  pH 6.25 摩尔渗透压浓度 343mOsm [PO] 101.87mg/g [hGH] 4.7mg/g 粒径D50(根据T1试验) 13μm
实施例6：用ZnCl2制备微颗粒悬浮液
该悬浮液由实施例2制得的溶液制备，所述溶液具有1.4mg/g的hGH和 10.00mg/g的PO的最终特性。
a)使用递送速度为约20ml/h的动作受控的注射器，在搅拌下(第9号装 置)加入1M ZnCl2溶液使溶液絮凝，直到比例r为1.54。得到含有9.64mg/g 的PO的溶液。
b)在2500rpm的速度下离心4分钟。清澈的上清液的摩尔渗透压浓度为 389mOsm。
c)用无菌水(初始溶液体积的1/13)洗涤残余物并在2500rpm的速度下离 心8分钟。清澈的上清液的摩尔渗透压浓度为237mOsm。
d)用0.9％ NaCl(初始溶液体积的1/8)洗涤残余物。在2500rpm的速度下 离心8分钟。清澈的上清液的摩尔渗透压浓度为253mOsm。计算的理论浓 度则为64.97mg/ml。
所得悬浮液具有以下特性：
  pH 5.86 摩尔渗透压浓度 256mOsm [PO] 63.51mg/g 粒径D50(根据T1试验) 9μm
实施例7：在条件1下用MgCl2制备微颗粒悬浮液
该悬浮液由实施例2制得的溶液制备，所述溶液具有0.48mg/g的hGH和 23.05mg/g的PO的最终特性，具有调整后的pH和摩尔渗透压浓度。
a)用0.9％ NaCl稀释至10.0mg/g。
b)使用递送速度为约20ml/h的动作受控的注射器，在搅拌下(第10号装 置)加入1M MgCl2溶液使溶液絮凝，直到比例r为6.93。得到含有8.59mg/g 的PO的溶液。
c)在2500rpm的速度下离心10分钟。清澈的上清液的摩尔渗透压浓度 为654mOsm。
d)用无菌水(初始溶液体积的1/7)洗涤残余物并在2500rpm的速度下离 心10分钟。清澈的上清液的摩尔渗透压浓度为291mOsm。
所得悬浮液具有以下特性：
  pH 6.56 摩尔渗透压浓度 323mOsm [PO] 75.7mg/g [hGH] 1.3mg/g 粒径D50(根据T1试验) 8.6μm
实施例8：在条件2下用MgCl2制备颗粒悬浮液
该悬浮液由实施例2制得的溶液制备，所述溶液具有1.33mg/g的hGH和 10.10mg/g的PO的最终特性，具有调整后的pH和摩尔渗透压浓度。
a)在氮气流存在下，使用递送速度为约8ml/min的泵，在搅拌下(500 rpm)加入2M MgCl2，6H2O溶液使溶液絮凝，直到比例r为10.01。得到含有 8.98mg/g的PO和摩尔渗透压浓度为914mOsm的溶液。
b)在搅拌下陈化3小时。
c)使用Microza组件(UJP-0047R-Pall)，其比表面积为0.02m2。该组 件首先经历状态良好化(通过浸泡在水中除去甘油和乙醇)、去除内毒素(用 7％NaOH然后用水冲洗)和高压灭菌。
d)用摩尔渗透压浓度为900mOsm的MgCl2溶液使该组件处于良好状 态。
e)用无菌水(絮凝制剂体积的1.04倍)洗涤，所述无菌水以8ml/min的速 度加入以保持总体积恒定。该循环由25％功率的泵确保，压力保持在0.3巴。 该步骤持续3小时。清澈的滤液的摩尔渗透压浓度为459mOsm。
f)使用Microza组件(0.02m2)，其循环由25％功率的泵确保。以4.4 ml/min的透过流率浓缩。该步骤持续160分钟。滤液的最终摩尔渗透压浓度 为324mOsm。
该制剂为白色流体悬浮液，具有以下特性：
  摩尔渗透压浓度 329mOsm [Mg] 6.8mg/g [颗粒] 43.6mg/g [hGH] 4.56mg/g r(根据M试验) 2.30 Tr(根据L试验) 16h dapp(根据D试验) 0.15
实施例9：在条件3下用MgCl2制备稳定的颗粒悬浮液
a)制备实施例2制得的PO溶液，以下称为初始制剂hGH 1.4mg/g/PO 10mg/g。
重组人生长激素溶液在25℃解冻2小时([hGH]＝3.9mg/ml，pH＝7.2， 330mOsm)。
稀释并调节聚合物PO(300mOsm，pH＝7.4，15.6mg/g)。
将hGH溶液倒在聚合物上，然后使hGH/PO混合物(1.4/10mg/g)脱气。
在室温下过夜实现结合。

b)制备颗粒hGH5mg/g/Mg微颗粒40mg/g
通过控制加入2M MgCl2使初始制剂絮凝，比例r为9.01，之后整体置放 陈化1小时(熟化)。
通过切向微滤(购自Pall的Microza组件，其比表面积为0.32m2)洗涤悬浮 液，直到摩尔渗透压浓度为约300mOsm。然后浓缩使PO浓度为38至41 mg/g。


c)制备hGH5mg/g/Mg颗粒40mg/g/PO 23mg/g的混合制剂
通过加入冻干形式的PO型聚合物使微颗粒稳定。
在搅拌下将冻干物加入悬浮液中。
整体置放在真空下(30mbar)搅拌，直到次日。

实施例10：通过本发明方法的第一种实施方式由微颗粒悬浮液制备装载有 hGH的干微米颗粒
首先，在实施例8a)到e)步骤(絮凝、陈化、洗涤)所述的条件下制备装 载有hGH的微颗粒悬浮液。洗涤悬浮液直到摩尔渗透压浓度为约280 mOsm。将含有约10mg/g聚合物的悬浮液在液氮中冷冻76小时之后，在 Bioblock ALPHA1-4LSC设备上冻干。
悬浮液的重组和表征
40mg粉末中加入1ml注射用水。手动搅拌该溶液数秒，以实现粉末的 均匀润湿。该溶液放置10分钟。手动搅拌数秒使其均匀，并用21G的针抽取， 得到1ml用于注射的溶液。
该悬浮液的性质描述如下。

实施例11：通过本发明方法的第二种实施方式由微颗粒悬浮液制备装载有 hGH的聚合物的干微米颗粒
首先，在实施例8a)到e)步骤(絮凝、陈化、洗涤)所述的条件下制备装 载有hGH的颗粒悬浮液。洗涤悬浮液直到摩尔渗透压浓度为约280mOsm。 然后将含有约10mg/g聚合物的悬浮液在Büchi B290雾化装置上干燥。以5 ml/min的速度抽出液体溶液，并通过供氮(7bar-500l/h)的喷嘴雾化。抽出 速度(干空气)为40m3/h。进口温度维持在90℃，这促使这些条件下的出口 温度为45℃。
在这些条件下，所得颗粒的粒径D(0.5)(根据T2试验)为5μm(50％的体 积由直径<5μm的颗粒占据)。
悬浮液的重组和表征
30mg粉末中加入1ml注射用水。手动搅拌该溶液数秒，以实现粉末的 均匀润湿。该溶液放置10分钟。手动搅拌数秒使其均匀，并用21G的针抽取， 得到1ml用于注射的溶液。
该悬浮液的性质描述如下。

实施例12：皮下注射基于两性分子聚氨基酸的纳米颗粒和微颗粒形式的不 同制剂之后，狗中hGH的药代动力学
用下列制剂处理12只小猎犬(重量7到10kg)：
  制剂 狗的编 号 [hGH] (mg/ml) [PO] (mg/ml) 剂量 (mg/kg) 剂量体积 (ml/kg) hGHIR 4 4 0 1 0.23 制剂1 4 5 22.6 1 0.22 制剂2 4 5 117.5 1 0.20
hGH IR相当于重组人生长激素溶液([hGH]＝4mg/ml，pH＝7.2，330 mOsm)。
根据实施例2制备制剂1，根据实施例7制备制剂2。hGH由ELISA(DSL 10-1900kit)分析。
下表比较了药代动力学数据：
  制剂 Cmax±SD (ng/ml) T>5ng/ml±SD (h) AUC0-last±SD (ng.h/ml) RBA (％) T50％auc±SD (h) hGH IR 582±155 18±3 3209±276 100 4±1 制剂1 135±37 44±6 2579±516 80 25±5 制剂2 25±5 129±26 1759±246 55 121±33
其中：
-Cmax是最大血清hGH浓度，
-T>5ng/ml是血清hGH浓度大于5ng/ml的时间，
-AUC表示血清hGH浓度作为时间函数的曲线下面积，
-RBA表示相对于速释制剂的生物利用度，
-T50％auc表示释放总hGH的50％所需的时间。
hGH IR具有速释曲线，其最大血清浓度为582±155ng/ml，在2小时的 中位时间后达到。之后hGH根据单指数降低被相当迅速地消除(表观T1/2约为 2小时)。24小时以后循环hGH不可测量。
制剂1具有延缓的hGH释放曲线，其具有慢吸收相，之后在24小时的中 位时间后达到可比较的最大血清浓度(分别是44±6和37±4ng/ml)。48小时 以后消除斜率显示缺乏可测量的hGH(血清浓度为4.8±3.1ng/ml)。
该制剂在这种情况下显示hGH较慢地释放入血室中，如围绕24小时的 Cmax中的变化所阐明。然而，这种现象不像是显著延长了hGH在血清中的存 在，因为48小时的循环浓度似乎是0。制剂1的AUC相对于参照物IR似乎轻 微地减少：生物利用度为80％。
另一方面，制剂2提供了药代动力学曲线的主要修正，其具有伴随有4 小时的滞后时间的非常慢的释放，然后在108小时的中位时间(范围：72-168 小时)后达到最大血清浓度25±5ng/ml。制剂2的药代动力学的总体趋势是 一种类输注型的假稳态形式的非常平坦的曲线。循环hGH水平在168小时至 240小时(7至10天)回到不可测量的浓度。
该制剂具有小得多的AUC：相对生物利用度损失45％(RBA＝55％)。
实施例13：皮下注射基于两性分子聚氨基酸的微颗粒形式的制剂之后，狗 中hGH的药代动力学
用下列制剂处理12只小猎犬(重量7到10kg)：
  制剂 狗的编 号 [hGH] (mg/ml) [PO] (mg/ml) pH/ mOsm 剂量 (mg/kg) 剂量体积 (ml/kg) hGH IR 6 4.1 0 7.4/321 5x0.1/ 天 0.024 制剂3 6 4.3 64.2 6.4/409 0.5 0.122
hGH IR相当于重组人生长激素溶液([hGH]＝4.1mg/ml，pH＝7.2，330 mOsm)。根据实施例9制备制剂3。
下表比较了药代动力学数据：
  制剂 Cmax±SD (ng/ml) T>1 ng/ml±SD (h) AUC0-last±SD (ng.h/ml) RBA (％) T50％auc±SD (h) hGH IR 90±24 39 258±26 100 2±0.3 制剂3 26±16 108±38 999±294 77 66±14
其中：
-Cmax是最大血清hGH浓度，
-T>1ng/mL是血清hGH浓度大于1ng/ml的时间，
-AUC表示血清hGH浓度作为时间函数的曲线下面积，
-RBA表示相对于速释制剂的生物利用度，
-T50％auc表示释放总hGH的50％所需的时间。
微颗粒在超过5天的时间内释放hGH，生物利用度损失23％。
对比例14：hGH从PO的本发明微颗粒和纳米颗粒中的体外释放(L试验)
L试验进行了hGH从PO纳米颗粒(实施例2)和PO的微颗粒(实施例8)中 的释放比较。连续相是30mg/g的白蛋白缓冲液。
唯一的附图显示制剂在可注射的浓度条件下释放50％蛋白质(hGH)所 需的时间：
-含有23mg/g的纳米颗粒：tr＝40min，即0.67h
-含有73mg/g的微颗粒：Tr＝973min，即16.22h
包含在微颗粒中的hGH的释放比包含在纳米颗粒中的hGH的释放慢24 倍。
实施例15：制备含有聚合物PO微颗粒和胰岛素(100UI/烧瓶)的冻干粉的单 个烧瓶
制备浓缩至500UI/g(17，5mg/g)的350g胰岛素溶液：
将6.4g重组人胰岛素(粉末)(28，6UI/g，含水量：4.5％)引入玻璃烧瓶。 加入157g水，在低磁力搅拌下将胰岛素分散。加入46.6g 0.1N HCl，直到 得到酸性胰岛素的清澈溶液。然后加入69.8g 0.1N的碳酸钠，以获得pH为7 至8的最终清澈溶液。加入70.2g的水将该溶液稀释至所需的浓度。
与聚合物PO溶液混合：
将所得的326g浓缩胰岛素溶液缓慢倒入(伴随磁力搅拌)3426g聚合物 PO溶液(浓缩至11mg/g)中。该混合物通过0.2μm的过滤器并在低搅拌下放 置过夜。在无菌环境下进行下面的步骤。
絮凝-洗涤-浓缩：
通过控制添加377g 2M MgCl2使前述制剂絮凝(比例r为7.2)。陈化1小 时后，通过切向微滤(购自Pall的Microza组件，其比表面积为0.32m2)洗涤 该悬浮液，直到摩尔渗透压浓度为约340mOsm并浓缩至PO浓度为约27 mg/g。在该悬浮液中加入1N NaOH溶液(约6g)将pH调至6.5。得到含有约 100UI/g胰岛素(精确值可通过在连接C18的硅胶柱上进行HPLC获得)的悬 浮液。
加入聚乙烯吡咯烷酮：
由可注射的聚乙烯吡咯烷酮粉末(例如K17)得到200g浓缩至约40mg/g 的聚乙烯吡咯烷酮原液通过0.2μm的无菌过滤器。然后在无菌条件下将120 g滤液加入1200g前述悬浮液中，混合物搅拌15分钟。
所得悬浮液含有91UI/g的胰岛素。
冻干：
将前述悬浮液分配在单个烧瓶中，每个烧瓶100UI(约1.1g前述悬浮液/ 烧瓶)：烧瓶在无菌条件下冻干一个循环72小时。然后密封直到使用。
实施例16：实施例15得到的颗粒/胰岛素烧瓶的重构
该悬浮液按照如下步骤临时重构(在使用前)：
用注射器和针将1ml水加入烧瓶中，所述烧瓶含有前实施例所得的100 UI的胰岛素。
手动搅拌烧瓶数秒以得到均匀(乳状)悬浮液：该悬浮液用注射器抽出， 例如用30G的针注射。
重构的悬浮液含有：
-23mg/ml的聚合物PO
-100UI/ml的胰岛素(3.5mg/ml)
-4mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮
-0.18mmol/ml的Mg2+(r＝2.8)。
该重构的悬浮液的特性如下：

在20℃下测定的动力学粘度等于5mPa.s。
实施例17：皮下注射基于两性分子聚氨基酸的微颗粒形式的制剂之后，狗 中hGH的药代动力学
在2个周期的交叉试验中用以下制剂连续处理两组小猎犬(每组6 只，重量10.4±0.6kg)；

该试验的参照物是Sanofi-Aventis提供的改良的胰岛素类似物 (甘精胰岛素)。两个氨基酸残基在人胰岛素一级结构上的修饰由于就地沉淀 而赋予在24小时周期内延长释放的某些特性。
根据实施例16制备制剂4。
血糖由酶法(己糖激酶)在自动生化分析仪(Advia1650，Bayer Diagnostics)上测定。
药代动力学结果的分析基于基础血糖的百分比和时间的函数。
下表比较了药代动力学数据：

其中：
-Cmin是已观察到的基础血糖的最小百分比，
-APGC0-36h表示基础血糖和基础血糖百分比之间的面积作为剂量后0 到36小时的函数，
-T50％APGC表示获得50％的APGC0-36h所需的时间。
参照物Lantus的给药允许血糖从第一小时起迅速减少。然后甘精胰岛 素的低血糖行为保持18至36小时的时期(平均在30小时后血糖回到其基础 水平)。
作为比较，制剂4的给药也允许血糖从第一小时起迅速减少。然后，基 础血糖的百分比平均维持稳态直到36小时。制剂4得到的Cmin明显高于参照 物Lantus得到的值(p<0.005，一对、单边研究t-试验)，这能够可观地减少 糖尿病病人严重低血糖阶段。
制剂4的作用时间明显大于长效作用的参照物Lantus的作用时间。这 由制剂4明显较高的T50％APGC值证实(p<0.005，一对、单边研究t-试验)。与 参照物Lantus相比，没有观察到制剂4的APGC0-36h的损失。
实施例18：制备聚合物PO和干扰素α-2b微颗粒的冻干粉
制备含15mg/g的聚合物PO和0.19mg/g的d′IFN的溶液
将166g 16.5mg/g聚合物PO溶液加入500ml烧瓶中。加入2.3g 0.3M蛋 氨酸溶液。冷冻的IFNα-2b溶液(浓缩至2.4mg/g)在25℃解冻1小时，将13g 这种冷冻的溶液加入含有聚合物溶液的烧瓶中。该混合物在室温下放置14 小时。
该溶液通0.2μm无菌过滤器。所有以下步骤在无菌条件下进行。
絮凝-洗涤-浓缩：
通过控制加入148.5g 2M MgCl2使129.5g前述制剂絮凝(比例r为7.0)。 该悬浮液分配在4个烧瓶中(每个烧瓶37g)并在3000rpm/min的速度下离心 15分钟。小心不接触离心残余物的情况下，从烧瓶中移出30.5g上清液。然 后用17g无菌水洗涤每个烧瓶中的残余物。该步骤中，摩尔渗透压浓度为约 300mOsm。
冻干：
将前述悬浮液分配在冻干期间允许保持悬浮液无菌的型 的盘中：然后该盘在无菌条件下用实验冻干器(Christ)冻干一个循环 72小时。
实施例19：由实施例18制得的冻干粉末重构含有干扰素α-2b的微颗粒悬 浮液
为确定精确地获得制剂中干扰素含量为0.5mg/g要使用的粉末的量， 进行预重构试验，干扰素α-2b由连接C18的硅胶柱的HPLC分析。
悬浮液按照如下步骤临时重构(使用前)：
将13.58g水加到1.22g冻干粉上，悬浮液用磁力棒均质化1小时。
得到的悬浮液是均匀的(乳状)：悬浮液用注射器抽取并例如用30G 针注射。
重构的悬浮液含有：
-46mg/ml聚合物PO
-0.5mg/ml干扰素α-2b
-0.34mmol/ml的Mg2+(r＝2.6)。
该重组悬浮液的特性如下：

实施例20：皮下注射基于两性分子聚氨基酸的微颗粒形式的制剂之后，狗 中hGH的药代动力学
用以下制剂处理8只小猎犬(重量9±0.6kg)：
  制剂 狗的编 号 [IFN] (mg/ml) [PO] (mg/ml) pH/ mOsm 剂量 (μg/kg) 剂量体 积 (ml/kg) IFN IR 4 0，5 0 6.45/ 354 60 0.12 制剂5 4 0，5 46 6.1/ 705 60 0.12
IFN IR相当于重组人干扰素溶液(PCGEn，批次IB05.0516，具有调节 后的浓度、pH和摩尔渗透压浓度([IFN]＝0.5mg/ml，pH＝6.45，354mOsm).
制剂5根据实施例19由相同批次的干扰素(PCGen)制备。
下表比较了药代动力学数据：
  制剂 Cmax±SD (ng/mL) T>50pg/mL±SD (h) AUC0-all±SD (ng.h/ml) RBA (％) T50％auc±SD (h) IFN IR 25.2± 0.4 22.6±0.6 162.5± 27.2 100 5.1±0.7 制剂5 0.9±0.6 219.8±29.8 95.5±47.5 >59 96.7±31.7
其中：
-Cmax是最大血清IFN浓度，
-T>50pg/ml是血清IFN浓度大于50pg/ml的时间，
-AUC表示血清IFN浓度作为时间函数的曲线下面积，
-RBA表示相对于速释制剂的生物利用度，
-T50％auc表示释放总IFN的50％所需的时间。
IFN IR具有速释曲线，其最大血清浓度为25.2±0.4ng/ml，在5小时的 中位时间(范围3-5h)后达到。24小时以后循环IFN不可测量。
制剂1提供了IFN药代动力学曲线的主要修正，其释放非常缓慢，最大 血清浓度为0.9±0.6ng/ml(比IR浓度低28倍)，在108小时的中位时间(范围 66-144h)后达到。药代动力学的总体趋势是假稳态形式的平坦曲线。循环 IFN水平在168小时至240小时(7至10天)回到不可测量的浓度。
该制剂具有较小的AUC：相对生物利用度损失41％(RBA＝59％)。 T50％auc比IFN IR的T50％auc大了约19倍。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1、用于延长AP释放的液体药物制剂，其含有基于聚合物(PO)微米颗 粒的低粘度水性胶体悬浮液，
i.该聚合物PO
是水溶性、可生物降解、两性分子的(共)聚合物，带有疏水性基团(GH) 和至少部分电离的可电离的亲水性基团(GI)，
以及在pH 7.0和等渗条件下在水中自发地形成纳米颗粒的胶体悬浮 液，
ii.所述颗粒在pH 7.0和等渗条件下能够自发地和至少一种活性成分 (AP)非共价结合；
其特征在于，该PO的微米颗粒以T试验测定的尺寸为0.5-100μm， 优选为1-70μm，特别优选为2-40μm，其还包括化合价小于或等于4的多 价离子，优选二价离子、三价离子或其混合物，所述多价离子和该聚合物 的可电离基团GI的极性相反，所述多价离子加入的目的是使聚合物的纳米 颗粒聚集成一定数量的微米颗粒，从而使M试验测定的比例r值为0.3-10、 优选为0.6-5.0，更优选为0.80-3.0，所述r的定义公式为$r=n\times \frac{\left[\mathrm{IM}\right]}{\left[\mathrm{GI}\right]}$ ，其中：
-n是所述多价离子的化合价，
-[IM]是多价离子的摩尔浓度，
-[GI]是可电离基团GI的摩尔浓度。
2、如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述微米颗粒以D试验测定 的表观聚合物密度dapp为0.05-1.0，优选为0.07-0.7，特别优选为0.1-0.5。
3、如权利要求1所述的制剂，其特征在于，相对于不含有多价离子的相 同的可注射制剂的释放时间tr，指定AP的释放时间Tr增加了，所述Tr和tr均以L 试验测定，这种增加使Tr大于或等于1.1 x tr，优选使Tr大于或等于1.5 x tr。
4、如权利要求1所述的制剂，其特征在于，其包含至少一种与PO的微 颗粒结合的AP。
5、如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述制剂以20℃时1000s-1的 剪切梯度测定的动力学粘度小于或等于500mPa.s，优选2-200mPa.s。
6、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述的疏水基团(GH) 从侧面连接到链上。
7、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述聚合物PO选自 下列成分构成的组：聚氨基酸、(多)肽、明胶、蛋白质、多糖-优选自以下 亚组：卜多糖和/或壳聚糖和/或粘多糖-及其混合物。
8、如权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述疏水改性的聚合物PO 选自(共)聚氨基酸。
9、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述聚合物(PO) 是聚氨基酸，其主链由天冬氨酸残基或谷氨酸残基构成，至少部分这些残 基通过在其链中或链端接枝至少一个疏水性基团(GH)而被改性。
10、如权利要求6至9中任一项所述的制剂，其特征在于，所述疏水改 性的聚合物PO由以下通式(I)定义：

其中：
■R1是H，C2到C10的直链烷基或C3到C10的支链烷基、苄基、氨基酸末 端残基或-R4-[GH]；
■R2是H，C2到C10的直链酰基或C3到C10的支链酰基基团，焦谷氨酸酯 或-R4-[GH]；
■R3是H或阳离子体，优选自：
-金属阳离子，优选自包括钠、钾、钙和镁的亚组，
-有机阳离子，优选自下列亚组：
·基于胺的阳离子，
·基于低聚胺的阳离子，
·基于聚胺的阳离子(特别优选聚乙烯亚胺)，和
·基于一种或多种氨基酸的阳离子，优选自包括基于赖氨酸或精氨酸 的阳离子类；
-以及阳离子聚氨基酸，其优选自包括聚赖氨酸和低聚赖氨酸的亚组；
·R4是直接键或基于1到4个氨基酸残基的“间隔子”；
■A独立地为基团-CH2-(天冬氨酸残基)或-CH2-CH2-(谷氨酸残基)；
■n/(n+m)定义为摩尔接枝率，其值对于在pH为7，25℃时溶于水中的PO足 够低，以形成PO的亚微颗粒的胶体悬浮液，n/(n+m)优选为1至25mol％， 特别优选为1至15mol％；
■n+m为10至1000，优选为50至300；以及
■GH是疏水基。
11、如权利要求10所述的制剂，其特征在于，所述疏水基团GH衍生 自醇前体，所述醇前体选自以下组：辛醇、十二烷醇、十四醇、鲸蜡醇、 十八碳醇、油醇、生育酚和胆固醇，并且R4是直接键。
12、如权利要求7至9中任一所述的制剂，其特征在于，所述PO具有 以下通式(II)、(III)和(IV)之一：

其中：
■GH是疏水基；
■R30是C2到C6的直链烷基；
■R3’是H或阳离子单元，优选自：
-金属阳离子，优选自包括钠、钾、钙和镁的亚组，
-有机阳离子，优选自亚组：
·基于胺的阳离子，
·基于低聚胺的阳离子，
·基于聚胺的阳离子(优选聚乙烯亚胺)，
·基于氨基酸的阳离子，优选自包括基于赖氨酸或精氨酸的阳离子 类；
-以及阳离子聚氨基酸，优选自包括聚赖氨酸和低聚赖氨酸的亚组；
■R50是C2到C6的烷基、二烷氧基或二胺基；
■R4是直接键或基于1到4个氨基酸残基的“间隔子”；
■A独立地为基团-CH2-(天冬氨酸残基)或-CH2-CH2-(谷氨酸残基)；和 (n′+m′)和n″为聚合度，其为10到1000，优选50到300。
13、如权利要求10所述的制剂，其特征在于，所述PO的n基团GH 彼此独立地为下式的单价基团：

其中：
-R5是甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、异丁基(亮氨酸)、仲丁基(异亮氨酸 基)或苄基(苯丙氨酸)基团；
-R6是含6到30个碳原子的疏水基团；以及
1为0到6。
14、如权利要求13所述的制剂，其特征在于，所述PO的全部或部分疏 水基R6独立地选自以下基团：
■含6到30个碳原子并能含至少一个杂原子(优选O、N或S)或至少一个不饱 和单元的直链或支链烷氧基，
■含6到30个碳原子的烷氧基，其具有一个或多个融合碳环，可选地，其 包含至少一个不饱和单元和/或至少一个杂原子(优选O、N或S)，以及
■具有7到30个碳原子并能含至少一个不饱和单元或至少一个杂原子(优选 O、N或S)的烷氧芳基或芳氧烷基。
15、如权利要求13或14所述的制剂，其特征在于，所述PO的接枝的 疏水基团R6衍生自醇前体，选自以下组：辛醇、十二烷醇、十四醇、鲸蜡 醇、十八碳醇、油醇、生育酚和胆固醇。
16、如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述聚氨基酸的主链是α-L- 谷氨酸根或α-L-谷氨酸均聚物。
17、如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述聚氨基酸的主链是α-L- 天冬氨酸根或α-L-天冬氨酸均聚物。
18、如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述聚氨基酸的主链是α-L- 天冬氨酸根/α-L-谷氨酸根或α-L-天冬氨酸/α-L-谷氨酸共聚物。
19、如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述PO的分子量为2000 至100,000g/mol，优选为5000至40,000g/mol。
20、如权利要求1所述的制剂，其特征在于，PO具有阴离子基团GI， 且所述多价离子是多价阳离子，优选为二价阳离子，特别优选自包括Mg2+、 Ca2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+及其混合物的组，或三价阳离子，特别优选自包括 Al3+、Fe3+及其混合物的组。
21、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述制剂含有至 少一种稳定剂，选自下列成分：
→至少一种聚合物PO的纳米颗粒，PO是水溶性、可生物降解、两性分 子的共聚物，其带有疏水性基团(GH)和至少部分电离的可电离的亲水性基 团(GI)，能够在pH＝7.0和等渗条件下在水中自发地形成纳米颗粒的胶体悬 浮液；
→聚二醇类，优选聚乙二醇类；
→共聚二醇类，优选乙二醇/丙二醇共聚物(泊洛沙姆、Pluronic或Lutrol 类)；
→纤维素聚合物及其衍生物，优选羧基烷基纤维素(例如羧甲基纤维素) 或烷基纤维素(如甲基纤维素)；
→山梨聚糖和一种或多种脂肪酸的酯类，优选吐温或聚山梨醇酯类的 聚氧烯烃(例如聚氧乙烯)二醇和至少一种酸(例如油酸)的酯类；
→基于磷脂和聚烯烃二醇(优选聚乙二醇)的表面活性剂；
→氢化或非氢化的糖类，例如海藻糖、山梨醇、甘露醇或蔗糖；
→多元醇，如丙二醇或甘油；
→明胶类，优选水解明胶；
→含氮(共)聚物，优选自含有聚丙烯酰胺、聚-N-乙烯酰胺、聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)和聚-N-乙烯内酰胺的组；
→聚乙烯醇类(PVA)；
→及上述物质的混合物。
22、如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述AP选自以下组：蛋 白质、醣蛋白、与一个或多个聚二醇链结合的蛋白质[优选聚乙二醇(PEG) 链：“聚乙二醇化的蛋白质”]、肽、聚糖、脂糖、寡聚核苷酸、多核苷酸及 其混合物，并且特别优选自以下亚组：血红蛋白、催产素、后叶加压素、 促肾上腺皮质激素、表皮生长因子、血小板源性生长因子(PDGF)、造血刺 激因子及其混合物、VIII因子和IX因子、血色素、细胞色素、泌乳刺激素、 白蛋白、黄体激素释放激素(LHRH)、LHRH拮抗剂、LHRH竞争剂、人、猪 或牛生长因子(GH)、生长激素释放因子、胰岛素、生长激素抑制素、胰高 血糖素、白介素或其混合物(IL-2、IL-11、IL-12)、α-、β-或γ-干扰素、胃泌 素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、分泌素、降钙素、脑啡肽、内 吗啡肽、血管紧张素、促甲状腺素释放激素(TRH)、肿瘤坏死因子(TNF)、 神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肝素酶、骨成形素 蛋白(BMP)、人心房钠尿肽(hANP)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、VEG-F、重 组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)、肾素、细胞因子、缓激肽、杆菌肽、多粘 菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽、环孢菌素类，以及酶、细胞因子、 抗体、抗原和疫苗的合成类似物和药学活性改性物和片段。
23、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述AP是“小的” 疏水的、亲水的或两性分子的有机分子。
24、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述活性成分选 自以下活性物质族：治疗酗酒的药物、治疗阿尔茨海默病毒药物、麻醉药、 治疗肢端肥大症的药物、镇痛药物、平喘药、治疗过敏的药物、抗肿瘤药、 抗炎药、抗凝血剂和抗血栓形成剂、抗惊厥药、抗癫痫药、抗糖尿病药、 止吐药、抗青光眼药、抗组胺药、抗感染药、抗生素、抗真菌药、抗病毒 药、抗帕金森病药、抗胆碱药、止咳药、碳酸酐酶抑制剂、心血管药物、 降血脂药、抗心律失常药、血管扩张药、抗心绞痛药、抗高血压药、血管 保护剂、胆碱酯酶抑制剂、治疗中枢神经系统失调的药物、中枢神经系统 刺激剂、避孕药、生殖促进药、分娩促进药和抑制剂、治疗粘液粘稠病的 药物、多巴胺受体激动剂、治疗子宫内膜异位的药物、治疗勃起障碍的药 物、治疗生育的药物、治疗胃肠道疾病的药物、免疫调节剂和免疫抑制剂、 治疗记忆疾病的药物、抗偏头痛药、肌松药、核苷类似物、治疗骨质疏松 的药物、拟副交感神经药、前列腺素、心理治疗药、镇静药、催眠和镇定 药、安定药、抗焦虑药、精神振奋药、抗抑郁药、治疗皮肤病的药物、甾 体和激素、安非他明、减肥药、非镇痛型止痛药、抗癫痫药、巴比妥类、 苯并二氮杂卓类、催眠药、放松药、精神药品以及这些产品的联合使用。
25、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，不与微米颗粒结 合的AP[非结合AP]的重量百分率为：
-[非结合AP]≤1，
-优选[非结合AP]≤0.5。
26、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述AP是重组人 生长激素hGH。
27、如权利要求1至25中任一所述的制剂，其特征在于，所述AP是胰 岛素。
28、如权利要求1至25中任一所述的制剂，其特征在于，所述AP是干 扰素α-2b。
29、如前述任一权利要求所述的制剂，其特征在于，所述制剂用于制 备药物，尤其用于胃肠外、粘膜、皮下、肌内、皮内、腹腔或脑内途径给 药，或肿瘤内给药，或口服、经鼻、经肺、经阴道或经眼部途径给药。
30、制备前述任一权利要求所述制剂的方法，其特征在于该方法主要 在于：
a.取或制备至少一种PO纳米颗粒的胶体悬浮液，
b.优选在水溶液中，可选地将该PO纳米颗粒的胶体悬浮液与至少一种 AP混合，
c.可选地，过滤所得的悬浮液，
d.加入和聚合物PO的基团GI极性相反的多价离子(优选以盐的形式)， 所述多价离子加入的量使得按照下式定义的比值r为0.3-10，优选0.6-5.0， 特别优选0.8-3.0，
$r=n\times \frac{\left[\mathrm{IM}\right]}{\left[\mathrm{GI}\right]},$ 其中
-n是所述多价离子的化合价，
-[IM]是多价离子的摩尔浓度，
-[GI]是可电离基团GI的摩尔浓度，以及
e.必要时，调节pH或摩尔渗透压浓度。
31、如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述AP是水性悬浮液或 溶液的形式，用于和PO的纳米颗粒或微颗粒的胶体悬浮液相混合。
32、制备衍生自权利要求1至29中任一项所述的制剂或衍生自权利要求 30所述的方法得到的制剂的产品的方法，其特征在于该方法主要在于：干 燥所述微米颗粒悬浮液以得到微米颗粒的能够贮存或给药的固体形式，优 选为粉末。
33、制备权利要求1至29中任一项所述制剂的方法，其特征在于该方法 主要在于：
◆取至少一种由权利要求32的方法获得的衍生产品(装载或不装载 AP)，
◆将这种衍生产品和水或重构的水性溶液S相混合。
34、由权利要求1至29中任一项所述的制剂得到的衍生产品，其特征在 于，该产品是非液体形式，且该产品含有聚合物(PO)的微米颗粒，
i.该聚合物PO
是水溶性、生物降解性、两性分子的(共)聚合物，带有疏水性基团(GH) 和可电离的亲水性基团(GI)，
并且在pH 7.0和等渗条件下在水中自发地形成纳米颗粒的胶体悬浮 液，
ii.所述颗粒在pH 7.0和等渗条件下能够自发地和至少一种活性成分 (AP)非共价结合；
这些PO的微米颗粒以T试验测定的尺寸为0.5-100μm，优选为1-70μm 特别优选为2-40μm；
所述产品包括多价离子的衍生物，优选二价离子的衍生物，所述离子 具有和聚合物的基团GI相反的极性，比例r由公式$r=n\times \frac{\left[\mathrm{IM}\right]}{\left[\mathrm{GI}\right]}$ 定义，其中
-n是所述多价离子的化合价，
-[IM]是多价离子的摩尔浓度，
-[GI]是可电离基团的摩尔浓度，
其值为0.3-10、优选0.6-5.0，特别优选0.80-3.0。
35、如权利要求34所述的衍生产品，其特征在于，该产品由粉末或凝 胶组成。
36、制备药物的方法，所述药物尤其用于胃肠外、粘膜、皮下、肌内、 皮内、腹腔或脑内途径给药，或肿瘤内给药，或口服、经鼻、经肺、经阴 道或经眼部途径给药，其特征在于该方法主要在于使用如权利要求1至29中 任一所述的制剂、和/或由权利要求30至32中任一所述的方法得到的制剂、 和/或由所述制剂得到的任何衍生产品、和/或所述制剂的任何前体中的至少 一种。