具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且具有高产孢能力的抗生素敏感性芽孢杆菌属菌株专利检索-链霉素杀虫剂农药农用化学品和农药专利检索查询-专利查询网

具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微 生物作用并且具有高产孢能力的抗生素敏感性芽孢杆菌属菌株

阅读：730发布：2021-04-14

专利汇可以提供具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且具有高产孢能力的抗生素敏感性芽孢杆菌属菌株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，所述芽孢杆菌属菌株的特征在于：(i)对氨苄西林(ampicillin)、万古霉素(vancomycin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素 (streptomycin)、红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)、四环素 (tetracycline)以及氯霉素(chloramphenicol)具有敏感性；(ii)具有对抗大肠杆菌(E.coli)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的抗微生物活性；以及(iii)在孵育2天后进行测量时具有至少80％的产孢百分比。本发明进一步涉及一种用于选择这些菌株的方法。根据本发明的所鉴定出的菌株中的许多是菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株。所述解淀粉芽孢杆菌中的一些被进一步鉴定为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)，而其它被鉴定为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)。本发明的芽孢杆菌属菌株可以用作动物饲料的饲料添加剂，其中它具有益生作用。，下面是具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且具有高产孢能力的抗生素敏感性芽孢杆菌属菌株专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，所述菌株的特征在于：
(i)对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性；
(ii)具有对抗大肠杆菌(E.coli)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的抗微生物活性；以及
(iii)在孵育2天后进行测量时具有至少80％的产孢百分比。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株选自由菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)组成的组或由菌种莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)组成的组。
3.如权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株是莫哈韦芽孢杆菌。
4.如权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株是解淀粉芽孢杆菌。
5.如权利要求1或2所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株是枯草芽孢杆菌。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的芽孢杆菌属菌株，所述菌株选自由以下各项组成的组：
(a)具有保藏号DSM 25839的莫哈韦芽孢杆菌菌株CHCC 15510；
(b)具有保藏号DSM 25840的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15516、具有保藏号DSM 27032的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15536以及具有保藏号DSM 27033的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15539；以及
(c)具有保藏号DSM 25841的枯草芽孢杆菌菌株CHCC 15541；
以及(a)、(b)或(c)的突变株。
7.一种用于选择具有以下特征的芽孢杆菌属菌株的方法：
(i)对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性；
(ii)具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性；以及
(iii)在孵育2天后进行测量时具有至少80％的产孢百分比，
所述方法包括以下步骤：
(i)从芽孢杆菌属菌株池中选择并且分离对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性的芽孢杆菌属菌株，(ii)从芽孢杆菌属菌株池中选择并且分离具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性的芽孢杆菌属菌株，
(iii)从芽孢杆菌属菌株池中选择并且分离在孵育2天后进行测量时具有至少80％的产孢百分比的芽孢杆菌属菌株，
(iv)针对营养细胞在pH 4的敏感性对芽孢杆菌属菌株池进行测定，以及
(v)针对胆汁抗性对芽孢杆菌属菌株池进行测定。
8.一种用于获得以下菌株的突变株的方法：
(a)具有保藏号DSM 25839的莫哈韦芽孢杆菌菌株CHCC 15510；
(b)具有保藏号DSM 25840的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15516、具有保藏号DSM 27032的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15536或具有保藏号DSM 27033的解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC
15539；或
(c)具有保藏号DSM 25841的枯草芽孢杆菌菌株CHCC 15541；
所述方法包括：
任选地对所述菌株进行诱变处理，以及
选择具有以下特性的突变株：
(i)对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性；
(ii)具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性，以及
(iii)在孵育2天后进行测量时具有至少80％的产孢百分比。
9.一种芽孢杆菌组合物，所述芽孢杆菌组合物包含至少一种如权利要求1至5中任一项所述的芽孢杆菌属菌株的细胞。
10.如权利要求9所述的芽孢杆菌组合物，所述芽孢杆菌组合物包含至少两种如权利要求1至5中任一项所述的菌株的细胞。
11.如权利要求9或10所述的芽孢杆菌组合物，所述芽孢杆菌组合物包含至少三种如权利要求1至5中任一项所述的菌株的细胞。
12.如权利要求9至11中任一项所述的芽孢杆菌组合物，其中所述芽孢杆菌属菌株的细胞是芽孢。
13.一种用于生产动物饲料或预混合料的方法，所述方法包括将如权利要求10至12中任一项所述的芽孢杆菌组合物添加至动物饲料中。
14.一种用于饲喂动物的方法，所述方法包括向动物施用如权利要求9至12中任一项所述的芽孢杆菌组合物或根据如权利要求13所述的方法所生产的动物饲料或预混合料。
15.如权利要求14所述的用于饲喂动物的方法，其中所述动物是选自由以下各项组成的组的动物：家禽、反刍动物、小牛、猪、兔、马、鱼以及宠物。

说明书全文

具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微 生物作用并且具

有高产孢能力的抗生素敏感性芽孢杆菌属菌株

技术领域

[0001] 在动物饲料行业中将芽孢杆菌属菌种(Bacillus spp)用于益生菌解决方案，并且基于芽孢杆菌的益生菌对于生产动物的生产和健康的积极作用是众所周知的(Spiehs等,2008；Cutting,2011)。它们的使用与芽孢杆菌能够代替抗生素或减少抗生素的使用有关，所述抗生素在动物饲料行业中被用作生长促进剂。

[0002] 然而，对针对常用于人类的抗生素不具有抗生素抗性的芽孢杆菌属菌株的需求仍未得到满足。本发明提供了分离的芽孢杆菌属菌株，所述分离的芽孢杆菌属菌株的特征在于对氨苄西林(ampicillin)、万古霉素(vancomycin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)、四环素(tetracycline)以及氯霉素(chloramphenicol)具有敏感性并且还具有对抗诸如大肠杆菌(E.coli)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)之类的主要病原体的抗微生物活性。在第2天进行测量时，所述菌株进一步具有至少80％的产孢百分比，从而使得有可能高效地生产安全并且有用的芽孢杆菌芽孢以用于动物饲料生产。

[0003] 本发明进一步涉及本发明的芽孢杆菌属菌株的芽孢用于生产动物饲料添加剂、特别是用于猪和家禽的产品的用途，其中所述菌株具有益生(健康、饲料利用率以及生长促进)作用。

背景技术

[0004] 猪，特别是仔猪，易患新生动物泄泻症，即腹泻，所述新生动物泄泻症可能由诸如大肠杆菌(Escherichia coli/E.coli)以及A型和C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens/C.perfringens)之类的细菌所引起。如果不进行治疗，新生动物泄泻症可能会导致死亡损失和严重的生产损失，包括体重减轻。

[0005] 大肠杆菌是仔猪腹泻的主要原因，并且在养殖场中所使用的抗生素中有50％至75％是用来对抗断奶后腹泻，所述断奶后腹泻主要由大肠杆菌所引起。腹泻是断奶幼畜和生长期幼畜(最多40 kg)所面临的最大问题，并且大肠杆菌是最重要的会引起腹泻的病原体(Klose等,2010)。

[0006] 猪的肠道梭菌感染主要在断奶前的时期出现，但还与在肥育期侵害猪的出血性肠综合征有关。虽然针对C型产气荚膜梭菌进行免疫接种已极大地降低了断奶前死亡率，但当前没有可商购的疫苗可供用于对抗A型产气荚膜梭菌。A型产气荚膜梭菌感染目前随着断奶前猪的发病率不断增加而被重视，并且诊断和防治的方法与用于C型感染的诊断和防治方法相比均不同且更为复杂。

[0007] 家禽的多种感染和疾病由包括大肠杆菌和产气荚膜梭菌在内的病原性细菌所引起。由病原体所引起的感染和疾病会导致死亡率升高、性能下降以及生产成本增加。此外，这些病原体中有许多可能会向人类传播。禽类大肠杆菌病是一种由大肠杆菌引起的全身感染并且最常出现在年幼的肉仔鸡和幼禽中。

[0008] 益生菌在动物健康应用中被用以维持健康肠道微生物区系，包括减少诸如梭状芽孢杆菌(Clostridia)和大肠杆菌之类的有害细菌以及增加诸如乳酸杆菌属菌种(Lactobacillus spp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium)之类的有益细菌。益生菌非常适合于维持病原性细菌与有益细菌之间的健康平衡，这是因为不同于抗生素，它们不会不加区别地破坏细菌，它们也不会产生病原性细菌的抗生素抗性菌株。认为益生菌通过以下多种机制维持健康肠道微生物区系：竞争性排斥病原性细菌、经由产生抗微生物性物质来减少病原性细菌、增强有益肠道微生物区系的生长和活力、以及刺激动物的全身性免疫应答。

[0009] 鉴于上述内容，期望用一种或多种芽孢杆菌属菌株来治疗或预防猪和家禽的因大肠杆菌和/或梭状芽孢杆菌感染所致的疾病。

[0010] Guo等,2006描述了对作为潜在益生菌的芽孢杆菌属菌株进行的筛选以及在猪中对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MA139进行的测试。从肉仔鸡、猪、土壤、发酵食物以及中草药中采集了124个样品。从这些样品中分离出750种需氧型芽孢形成菌株。使用滤纸片平板扩散测定法(disc plate diffusion assay)来测试针对大肠杆菌K88和K99、沙门氏菌(Salmonella)以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制活性。测试具有最佳活性的6种芽孢杆菌在模拟GIT条件(pH 2和0.3％的胆汁盐)下的存活率。枯草芽孢杆菌MA139是最佳的候选者并且在使用90头仔猪进行的28天饲喂试验中在仔猪中对枯草芽孢杆菌MA139进行体内测试。ADG和饲料利用率提高。乳酸菌增加，粪便中的大肠杆菌减少。然而，未测试对抗产气荚膜梭菌的抗微生物活性和对抗生素的敏感性。

[0011] Barbosa等,2005描述了从有机(接触土壤)养殖的肉仔鸡的粪便中分离出237种芽孢杆菌。对31种分离株进行了表征。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)存在于这些当中。多种枯草芽孢杆菌菌株对产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌显示出抑制作用。地衣芽孢杆菌还显示出对抗产气荚膜梭菌的作用。然而，所选的芽孢杆菌分离株中无一种表现出如本申请中所定义的对抗大肠杆菌的抗微生物活性。所选择的一种芽孢杆菌分离株对大肠杆菌菌株O78:K80显示出生长强度降低作用，但未显示出完全的抑制作用，并且未显示出对抗所测试的其它大肠杆菌菌株的作用(参见表5)。未提供有关孵育2天后的产孢百分比或对万古霉素、卡那霉素、链霉素以及克林霉素的敏感性的数据。

[0012] Chaiyawan等,2010公开了一种芽孢杆菌属菌株菌种T3-1，所述芽孢杆菌属菌株菌种T3-1对医疗中广泛使用的抗生素敏感并且显示出对抗产气荚膜梭菌ATCC 15191的抗微生物活性。所述菌株不具有对抗大肠杆菌O157的抗微生物活性。未提供有关孵育2天后的产孢百分比的数据。

[0013] Benitez等,2011最近描述了完整或失活的大肠杆菌的存在增强了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LBM 5006菌株对抗微生物肽的合成。

[0014] US 7,754,469涉及用于治疗家禽的微生物和方法，并且US 8,021,654涉及使用芽孢杆菌属菌株治疗猪的方法。

[0015] 然而，在这些文章或专利中没有一篇中存在任何有关选择如下芽孢杆菌属菌株的描述或建议，所述芽孢杆菌属菌株对常用于人类的抗生素具有敏感性，具有对抗产气荚膜梭菌和大肠杆菌这两者的抗微生物活性并且具有高产孢百分比，以使得所述菌株可用于高效产孢并且因此可用于芽孢杆菌属益生菌生产。

[0016] 现有技术文献(例如Barbosa等,2005；Chaiyawan等,2010；以及Guo等,2006)中没有一篇公开了对常用于人类的抗生素具有敏感性、具有在抑制生长的意义上对抗产气荚膜梭菌和大肠杆菌这两者的抗微生物活性并且具有高产孢百分比的菌株。

[0017] 综上所述，与筛选芽孢杆菌属菌株有关的现有技术并未提供本发明的三个区别特征，即对常用于人类的抗生素具有敏感性、具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性以及具有高产孢百分比。现有技术也并未提供满足这三个标准的芽孢杆菌属菌株。

发明内容

[0018] 本发明所要解决的问题在于提供一种芽孢杆菌属菌株，所述芽孢杆菌属菌株的特征在于对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性；具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性；并且在第2天进行测量时具有至少80％的产孢百分比。

[0019] 所述解决方案是基于一种由本申请的发明人所研发的用于鉴定具有这些改良特性的经过改良的芽孢杆菌属菌株的选择方法。

[0020] 所述选择方法的第一个必要步骤是特异性地筛选对常用于人类的抗生素具有敏感性的芽孢杆菌属菌株。更确切地说，针对于对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素的敏感性来对所述菌株进行筛选。

[0021] 此外，针对于对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性和在第2天测量时具有至少80％的产孢百分比对所述菌株进行筛选。

[0022] 在本申请的发明人所研究的来自土壤和粪便以及食物来源的261种分离株当中，有161种分离株在实施例中所描述的预筛选测试中具有抗生素抗性。在对抗生素具有敏感性的100种分离株当中，有56种具有对抗产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且仅22种具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌这两者的作用。在这些当中，有12种分离株来自于菌种解淀粉芽孢杆菌。其它代表性菌株来自于菌种枯草芽孢杆菌和莫哈韦芽孢杆菌(B.mojavensis)。表2和3汇总了科汉森公司(Chr.Hansen)专有菌株(被选用于二次筛选的32种菌株中的22种)的结果。

[0023] 所述选择方法侧重于(i)安全性、(ii)作用以及(iii)在适用于生产的培养基中的高产孢能力。所述安全性方面主要是基于不存在抗生素抗性，由于在人类中抗性细菌的病例不断增多，因而这点是重要的。这些细菌会引起因病原性细菌已具有抗性而不再能够用抗生素治疗的公知疾病。

[0024] 众所周知的是，芽孢杆菌能够产生可能具有抗微生物活性的物质，如即细菌素(bacteriocin)、溶细菌酶(bacteriolytic enzyme)或表面活性素(surfactin)。所述第二个选择标准，即对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的作用是重要的，这是因为这两种病原体是猪和家禽腹泻的主要原因。测试对抗大肠杆菌的三种菌株和对抗A型产气荚膜梭菌的作用，但在此考虑了所述结果指示了对抗大肠杆菌的一般作用以及对抗诸如C型产气荚膜梭菌之类的另外其它类型梭状芽孢杆菌的作用。

[0025] 所述第三个选择标准对于生产益生菌来说是重要的。所述生产过程在培养所述芽孢杆菌的发酵罐中进行并且在所述过程结束时，高生产效益需要高产孢速率。芽孢杆菌的产孢过程多年来一直被研究，但仍存在许多问题。因此，从事芽孢杆菌的生产和工艺研发的本领域技术人员公知的是一些芽孢杆菌属菌株具有非常低的产孢速率。已表明，芽孢杆菌分化成特化细胞的亚群，如即形成芽孢的群落、产生用于降解复合营养物质的酶的群落以及死亡的群落(Lopez和Kolter,2010)。这种分化似乎是受细胞外信号调控的，这些信号中的大部分是由芽孢杆菌本身产生的。因此已假设的是，酶或抗微生物性物质的大量产生可能引起低产孢功效。因此，对于本领域普通技术人员来说不寻常的并且惊人的是，芽孢杆菌属菌株兼具抗微生物活性和高产孢百分比。附图说明

[0026] 图1示意性地示出了261种芽孢杆菌属菌株的抗微生物活性。惊人的是，许多解淀粉芽孢杆菌菌株具有抗微生物作用。

具体实施方式

[0027] 在2006年抗生素生长促进剂在欧盟(European Union)的逐步停用使得对具有高功效的有成本效益的饲料添加剂的需求不断增长，并且因此使得对新型益生菌的需求也不断增长。基于芽孢杆菌的益生菌饲料添加剂因其对猪和家禽的健康和生产的积极作用而被人们所知。这些产品适用于饲料行业，这是因为芽孢具有热稳定性并且能够在高达90℃-95℃的温度下进行的制粒过程中存活下来。

[0028] 用于猪的益生菌对于动物、人类以及环境来说必须是安全的，并且应当促进动物的生长和饲料利用率。本发明的目的在于以三个步骤对来自不同来源的广泛的需氧型内生芽孢形成细菌(AEB)针对它们在猪中的益生作用进行筛选。所述AEB是从发酵食物(Kantong(一种酱汁)和Gergoush(一种自然发酵的苏丹面包点心)初级起子)、猪粪便、土壤以及不同的培养物收藏物中分离出的。通过对16SrDNA基因进行测序鉴定出261种AEB分离株，并且通过测定多种相关抗生素的最低抑制浓度(MIC)来对所述AEB分离株的相关抗生素抗性进行研究。

[0029] 进一步的分析包括对胆汁和酸的耐受性、病原体抑制作用、在不同培养基中的生长、产孢能力以及与动物细胞系的相互作用以评估对肠道系统中的紧密连接产生积极作用的可能性。结果显示在菌种和菌株这两者之间存在很大的差异。分离的菌种主要属于芽孢杆菌属，包括来自食物来源的解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及沙福芽孢杆菌(B.safensis)；来自粪便的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)；以及来自土壤的地衣芽孢杆菌和简单芽孢杆菌(B.simplex)。

[0030] 这些分离株中有许多显示出不希望有的高于由欧洲食品安全局(EFSA)所界定的分界点的抗生素抗性并且由于安全性问题而被舍弃。当在小牛浸液肉汤中培养过夜时，对于大部分的菌株观测到良好的生长，而16％在适用于发酵的培养基中的生长不令人满意。在所述筛选方法的第2步骤中，通过对gyrB基因进行测序并且进行PFGE指纹图谱分析鉴定出32种所选择的不具有抗生素抗性的菌株。此外，对它们对所选择的病原体的抗微生物作用进行了测试并且在各分离株之间观测到相当大的差异。所述分离株中的多种显示出对产气荚膜梭菌的抑制作用，而仅有几种分离株抑制大肠杆菌。本发明的结果因此确认对产气荚膜梭菌和大肠杆菌这两者生长的抑制作用只在极少的情况下会同时存在。所述筛选方法的第3步骤涉及具有高病原体抑制作用的10种菌株并且包括测定芽孢的热稳定性、基因组测序以及证实它们对紧密连接的作用的进一步体外研究。

[0031] 本发明提供了特征在于以下的芽孢杆菌属菌株：(i)对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性。

[0032] 术语“对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性”意指被认为对特定抗生素敏感的菌株在表1中所概述的由EFSA(EFSA,2008)所给出的分界点水平一定不能生长。

[0033] 表1中所概述的MIC值是基于由EFSA所发布的准则(Technical guidance prepared by the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP)on the update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human and veterinary importance( 由用于动物饲料中的添加剂和产品或物质方面的专家组(FEEDAP)所制定的有关用于评估细菌对具有人类和兽医学重要性的抗生素的抗性的标准更新的技术指导)。The EFSA Journal(2008)732,1-15)提供了抗生素和针对芽孢杆菌属的可接受的分界值的列表。EFSA未给出针对芽孢杆菌的氨苄西林分界点，然而存在针对多种其它细菌(即乳酸杆菌属菌种)的分界点。因此，选择芽孢杆菌属菌株对氨苄西林的这种敏感性作为用于本发明的分界点。

[0034] 表1：常用于人类的多种抗生素的EFSA分界点

[0035]

[0036] 要在本发明的范围内，所述菌株必须对上述所有抗生素均具有敏感性。实际上，这意指在通过微量稀释法进行测试时在分界点水平未观测到菌株生长(最低抑制浓度(MIC))。

[0037] 根据本发明，通过如由CLSI的标准(临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)M07-A8和M45-A2)所概述的肉汤微量稀释法来测量MIC，所述肉汤微量稀释法如下进行：

[0038] 将所要测试的菌株过夜生长的悬浮液以105 cfu/ml(菌落形成单位/毫升)的近似浓度于ISO-SENSITEST肉汤(Oxoid CM0473)中接种到微量滴定板中所要测试的抗生素的两倍连续稀释液中(总体积100微升/孔)，并且在37℃、在有氧条件下孵育20至24小时。可以使用包含抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素的预制组VetMIC Lact-1和Lact-2。在24小时后记录作为抗生素抑制明显生长的最低浓度的结果。

[0039] 本发明的方面(ii)的第一部分涉及一种表现出对抗大肠杆菌的抗微生物活性的芽孢杆菌属菌株。根据本发明，这通过大肠杆菌琼脂斑点测试来测量，所述斑点测试如下进行：

[0040] 将9ml小牛浸液肉汤(VIB)用所要测试的芽孢杆菌培养物接种并且在37℃和175rpm孵育过夜。同时，将9ml脑心浸液(BHI)肉汤用选自大肠杆菌O149(O149:k91,k88a)、大肠杆菌O147(O147:K89 F4)以及大肠杆菌O101(O101 F5)的大肠杆菌菌株接种并且在
37℃孵育过夜。

[0041] 在50℃将大肠杆菌的过夜培养物各自以2ml的体积添加到200ml的液体VIB琼脂中，并且倒入到每一个生物测定培养皿中。将培养皿在无菌工作台中干燥。将过夜的所要测试的芽孢杆菌培养物点样到与大肠杆菌混合的VIB琼脂的表面上并且在37℃孵育2天。记录斑点周围抑制带的半径和斑点直径。

[0042] 如果抑制带是至少1.5mm，那么认为芽孢杆菌属菌株对大肠杆菌表现出抗微生物活性。优选地，该抑制带是至少2.0mm，如至少2.5mm，更优选地至少3mm，最优选地至少3.5mm并且甚至更优选地至少4mm。抑制带对于不同的大肠杆菌菌株来说可能是不同的。对于根据本发明被认为表现出对抗大肠杆菌的抗微生物活性的菌株，它应当针对所测试的所有大肠杆菌菌株均表现出至少1.5mm的抑制带。优选地，对所述大肠杆菌菌株中的两种的抑制带、或甚至更优选地对所有三种大肠杆菌菌株的抑制带是至少2mm。本发明的芽孢杆菌属菌株的特征在于对大肠杆菌生长的抑制作用，特别是对所测试的菌种生长的抑制作用。
如通过现有技术所证实并且由本申请的发明人所确认，对一种大肠杆菌菌种的生长无抑制作用的同时往往对另一种大肠杆菌菌种的生长也无抑制作用(表5，Barbosa等,2005)，反之亦然，即对一种大肠杆菌菌种具有抑制活性的同时往往对其它大肠杆菌菌种也具有抑制活性(表1，Guo等,2006)。

[0043] 本发明的方面(ii)的第二部分涉及一种表现出对抗产气荚膜梭菌的抗微生物活性的芽孢杆菌属菌株。根据本发明，这是通过产气荚膜梭菌琼脂斑点测试来测量，所述斑点测试如下进行：

[0044] 将9ml的VIB用所要测试的芽孢杆菌培养物接种并且在37℃和175rpm孵育过夜。同时，将9ml的BHI肉汤用A型产气荚膜梭菌DSM 756接种，并且在37℃在厌氧罐中孵育过夜。

[0045] 将芽孢杆菌培养物点样到皮氏培养皿(petri dish)中VIB琼脂的表面上并且在37℃孵育过夜。将2ml体积的产气荚膜梭菌过夜培养物与200ml的液体BHI琼脂混合，并且倒到已生长有芽孢杆菌斑点的VIB琼脂上。将培养皿在37℃在厌氧条件下孵育1天。测量斑点周围澄清了的抑制带的半径。

[0046] 如果抑制带是至少5mm，那么认为芽孢杆菌属菌株对产气荚膜梭菌表现出抗微生物活性。优选地，抑制带是至少6mm，更优选地至少7mm。本发明的芽孢杆菌属菌株的特征在于对产气荚膜梭菌生长的抑制作用，特别是对所测试的菌种生长的抑制作用。如本领域技术人员所知，对一种菌种的生长无抑制作用的同时往往对其它产气荚膜梭菌菌种的生长也无抑制作用，反之亦然，即对一种产气荚膜梭菌菌种的生长具有抑制作用的同时往往对其它产气荚膜梭菌菌种的生长也具有抑制作用。

[0047] 芽孢杆菌细胞以芽孢杆菌芽孢细胞和芽孢杆菌营养细胞的形式存在。当在本文提及芽孢杆菌细胞时，指的是这两者。

[0048] 与芽孢杆菌芽孢细胞有关的术语“芽孢杆菌芽孢”在本文指的是根据本领域可以被表征为由芽孢杆菌属细菌产生的处于休眠状态的坚硬的非繁殖结构的芽孢。芽孢的主要功能一般在于确保细菌能够在整个环境胁迫阶段存活下来。它们因此能够抵抗紫外线辐射和γ辐射、干燥、溶菌酶、温度、饥饿以及化学消毒剂。芽孢通常存在于土壤和水中，在土壤和水中，它们可以存活很长一段时间。芽孢外被对于许多毒性分子来说具有不可渗透性，并且还可能含有牵涉到萌发的酶。核心具有正常的细胞结构，如DNA和核糖体，但不具有代谢活性。当细菌检测到环境条件变得不利时，它可以开始产孢过程，所述产孢过程需时约八小时。

[0049] 术语“芽孢杆菌营养细胞”指的是功能性营养芽孢杆菌细胞，它们能够分裂产生更多的营养细胞。

[0050] 在方面(iii)中，本发明涉及一种在第2天进行测量时表现出至少80％的产孢百分比的芽孢杆菌属菌株。根据本发明，如下测定产孢百分比：

[0051] 将所要测试的芽孢杆菌属菌株以50μl的体积添加到深孔(DW)培养板中700μl的VIB中，并且在37℃和175rpm孵育过夜。将50μl体积的芽孢杆菌过夜培养物转移至DW培养板中700μl的产孢培养基中，所述产孢培养基包含(w/w)95％的水；1.5％的氮源(即酵母)；3％的蔗糖；0.06％的微量矿物质；0.1％的磷酸氢二钾。将培养板在37℃和175rpm孵育3天。在显微镜下密切观察产孢过程，并且在孵育1天(24小时)、2天(48小时)以及3天(72小时)后通过目测评价来确定芽孢百分比(芽孢数与芽孢杆菌细胞的总数相比)。

[0052] 术语“在第2天进行测量时具有至少80％的产孢百分比”意指在孵育2天后至少80％的细胞已形成芽孢。产孢百分比可以优选地更高，如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。本发明的一个重要目的在于选择具有具高产孢百分比的细胞的芽孢杆菌属菌株以使得所述菌株可用于动物饲料生产。如上文所述，还可以被称作高产孢速率的高产孢百分比是为高生产效益所需的。

[0053] 如上文所述，现有技术已描述了用于选择芽孢杆菌属菌株的方法，但现有技术的筛选方法并未侧重于产孢百分比。因此，现有技术所选的芽孢杆菌属菌株不可能以足以与如本文所述的产孢百分比相符的程度形成芽孢。

[0054] 已经选择并且保藏了具有高生长特性和产孢能力、无抗生素抗性以及高抗微生物活性的组合能力的三种菌株。然而其它菌株，特别是菌种解淀粉芽孢杆菌的菌株(参见表2和3中的菌株D-J)也满足权利要求书中所概述的标准并且因此也被包括在本发明的范围内。

[0055] 从图1中可以明显看出，特别是菌种解淀粉芽孢杆菌的许多菌株落入本发明的范围内。惊人的是，许多解淀粉芽孢杆菌菌株具有抗微生物作用，这是因为最近已经假定芽孢杆菌属的抗微生物作用具有菌株特异性并且与菌种无关。

[0056] 基于对测定法的详细描述，本领域普通技术人员能够重复这些测定以确定具体的芽孢杆菌属菌株是否符合本发明的多个方面中的第(i)项的敏感性、第(ii)项的抗微生物活性以及第(iii)项的产孢百分比。以这种方式，本领域普通技术人员将能够始终如一地制备具有所述特性的菌株。优选地，选择方法还将包括(iv)测定营养细胞在pH 4的敏感性，以及(v)测定胆汁抗性以确保所述菌株能够以足够的程度在胃肠道中存活。显然，可以按任何顺序来进行这些测定并且在此过程当中如果一些菌株不满足所述标准，那么可以将它们排除在外。

[0057] 从文献中得知，胆汁对芽孢杆菌芽孢细胞在动物的GIT中存活和萌发以及长成营养细胞具有一些负面影响。因此，益生性细菌一般应当能够通过能够耐受低pH值并且具有胆汁盐抗性而在动物的肠道中存活并且增殖，从而可用作益生性芽孢杆菌组合物而被添加到动物饲料中。实施例在这方面提供了有用的体外测试。针对于对低pH值(模拟胃内条件)的敏感性进行的测试侧重于营养细胞对pH 4的抗性。公知的是，芽孢在2至3的pH值具有抵抗性并且营养细胞将在pH 2死亡。然而，胃内的pH值可以具有高达4的pH值，特别是在饲喂条件下。这可能会引起芽孢萌发，因此，测试营养细胞在pH 4的敏感性是有意义的。所选的菌株应当优选地能抵抗pH 4。所选菌株的结果呈现于表2中。

[0058] 本发明的菌株属于芽孢杆菌属，优选地是菌种解淀粉芽孢杆菌(如解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)或解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum))、简单芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)或特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)中的一种。

[0059] 鉴定261种菌株的初始方法是基于16S。这种方法不能区分芽孢杆菌属的一些密切相关的菌种。因此，菌株可以被鉴定为与由菌种解淀粉芽孢杆菌/萎缩芽孢杆菌/甲基营养型芽孢杆菌/西姆芽孢杆菌/死谷芽孢杆菌组成的组或由菌种莫哈韦芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌/特基拉芽孢杆菌组成的组相关。这两组均含有满足本发明的标准的许多菌株，并且这些组因此代表本发明的重要实施方案。

[0060] 在认为适当的情况下，通过更为细致的方法(gyr B)对这些菌株进行进一步鉴定。表2和3中所示的数据主要是基于解淀粉芽孢杆菌(通过gyr B所鉴定)。通过RNA聚合酶β亚基(rpo B)基因序列分析对所选的解淀粉芽孢杆菌分离株进行进一步鉴定，并且所鉴定出的这些亚种呈现于表4、5以及6中。

[0061] 期望所述菌株表现出热稳定性。所选菌株的结果呈现于表4中。在99.5℃的热稳定性被测量为cfu在2分钟、5分钟以及10分钟后相对于时间零点的减少量(log/log)。在使用常见的可商购的芽孢杆菌芽孢制剂的情况下达到了低于2的减少量。对于落入本发明的范围内的菌株，在2分钟后的减少量应当优选地是0.5或更少，更优选地0.25或更少，最优选地0.05或更少。在优选的实施方案中，在5分钟后的减少量应当优选地是2.5或更少，更优选地1或更少，最优选地0.5或更少，并且在10分钟后的减少量也应当优选地是2.5或更少，更优选地1或更少，最优选地0.5或更少。该表中的所有菌株均表现出适当的热稳定性。从该表中可以看出，菌株B、D以及F甚至在10分钟后仍具有非常高的热稳定性。值得注意的是，B和F这两者都是解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种菌株，从而使得这个亚种成为本发明的一个优选的实施方案。

[0062] 已在实施例4中对酶产生进行了研究。本发明的研究结果显示所研究的所有菌株均具有50 mU/ml或更大的纤维素酶活性。在此考虑了这种活性将是本发明的芽孢杆菌属菌株的一个有益的特性。对于某个实施方案，可能优选的是，所述菌株具有甚至更高的纤维素酶活性，如100 mU/ml或更大，如对于解淀粉芽孢杆菌植物亚种菌株所观测到的那样，从而使得这个亚种成为本发明的一个优选的实施方案。对于落入本发明范围内的菌株，纤维素酶活性应当优选地是50 mU/ml或更大，更优选地100 mU/ml或更大，最优选地250 mU/ml或更大，甚至更优选地400 mU/ml或更大。

[0063] 一些菌株显示出70 mU/ml或更大的高木聚糖酶活性。表5示出了对于所研究的菌株来说，高纤维素酶活性未必与高木聚糖酶活性或如被定义为40000RFU/OD或更大的高蛋白酶活性同时存在。皆为解淀粉芽孢杆菌植物亚种的菌株G、I以及J是所有这三种酶的活性都高的菌株的实例。

[0064] 在一个优选的实施方案中，芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。最优选地，所述菌株选自由以下各项组成的组：(a)具有保藏号DSM25839的莫哈韦芽孢杆菌菌株；(b)具有保藏号DSM 25840、保藏号DSM 27032或保藏号DSM
27033的解淀粉芽孢杆菌菌株；以及(c)具有保藏号DSM 25841的枯草芽孢杆菌菌株；以及它们的突变株。

[0065] 本发明的另一个方面涉及一种用于获得以下菌株的突变株的方法：

[0066] (a)具有保藏号DSM 25839的莫哈韦芽孢杆菌菌株；

[0067] (b)具有保藏号DSM 25840、保藏号DSM 27032或保藏号DSM 27033的解淀粉芽孢杆菌菌株；或

[0068] (c)具有保藏号DSM 25841的枯草芽孢杆菌菌株；

[0069] 所述方法包括任选地对所述菌株进行诱变处理以及选择具有以下特性的突变株：

[0070] (i)对氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素具有敏感性；

[0071] (ii)具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抗微生物活性，

[0072] 以及

[0073] (iii)在第2天进行测量时具有至少80％的产孢百分比。

[0074] 可以对所述菌株进行如下文进一步详细描述的诱变处理以获得突变株并且之后进行选择过程。或者，对自发产生的突变株进行选择。

[0075] 所述用于获得突变株的方法还可以包括(iv)测定营养细胞在pH 4的敏感性，以及(v)测定胆汁抗性以确保所述菌株能够以足够的程度在胃肠道中存活。显然，可以按任何顺序来进行这些测定，并且在此过程当中如果一些菌株不满足所述标准，那么可以将它们排除在外。

[0076] 如本文所用的细菌“菌株”指的是在生长或繁殖时在遗传学上保持不变的细菌。包括多个相同细菌。

[0077] “野生型菌株”指的是如在自然界中所存在的非突变形式的细菌。

[0078] “突变型细菌”或“突变株”指的是在基因组(DNA)中包含一处或多处在野生型DNA中不存在的突变的天然(自发、天然存在)突变型细菌或诱导突变型细菌。“诱导突变株”是通过人为处理诱导产生突变的细菌，所述处理诸如使用任何常规使用的诱变处理进行的处理，包括使用化学诱变剂的处理，如选自以下的化学诱变剂：(i)与DNA结合或将会被掺入到DNA中的诱变剂，如碱基类似物(例如2-氨基嘌呤)或嵌入剂(如ICR-191)；(ii)与DNA反应的诱变剂，包括烷化剂，如亚硝基胍或羟胺，或甲磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)、UV或γ辐射等。相反，“自发突变株”或“天然存在的突变株”未经过人为诱变处理。

[0079] 可以对突变株进行多次诱变处理(单次处理应当被理解为先进行一个诱变步骤，之后进行筛选/选择步骤)，但本发明优选的是进行不超过20次，或不超过10次，或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在本发明优选的突变株中，与母本菌株相比，细菌基因组中少于1％、少于0.1％、少于0.01％、少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸已被另一核苷酸置换或缺失。

[0080] 如上文所述的突变型细菌是非转基因的(non-GMO)，即未通过重组DNA技术加以修饰。作为上述通过随机诱变提供突变株的优选方法的替代方案，还有可能通过定点诱变例如通过使用适当设计的PCR技术或通过使用可整合到细菌复制子中的转座元件来提供这样的突变株。

[0081] 当以自发产生的突变株的形式提供所述突变株时，对上述野生型菌株进行选择步骤，之前不进行任何的诱变处理。

[0082] 芽孢杆菌属的多种菌种已获得了GRAS认证，即它们被公认为是安全的。所有枯草芽孢杆菌菌株均获得了GRAS认证。本文所述的芽孢杆菌属菌株是需氧型和兼性产芽孢菌。芽孢杆菌属菌种是仅有的被认为获得了GRAS认证的产芽孢菌。向牲畜饲喂获得了GRAS认证的微生物是一种在生产商、兽医以及畜牧业的其他从业人员当中可接受的做法。

[0083] 因此，在另一个方面，本发明涉及一种芽孢杆菌组合物，所述芽孢杆菌组合物包含本发明的芽孢杆菌属菌株的细胞。该组合物可以包含选自本发明的菌株中的至少一种的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或甚至更多种芽孢杆菌属菌株的细胞。优选地，该芽孢杆菌组合物的细胞是芽孢细胞。

[0084] 该组合物的相关芽孢杆菌属菌株可以本领域技术人员已知的商业上相关的形式存在。因此，在一个实施方案中，该组合物的芽孢杆菌属菌株以干燥(例如喷雾干燥)的细胞或冷冻细胞的形式存在。该组合物可以任何合适的形式提供，如液体、浆料、粉末或丸粒的形式。

[0085] 在一个优选的实施方案中，该芽孢杆菌组合物包含105至1012 CFU/g，更优选地10612 7 12
至10 CFU/g并且最优选地10至10 CFU/g。

[0086] 术语“CFU/g”指的是包括组合物中存在的合适的相关添加剂在内的组合物本身的克重。如本领域技术人员所知，商业上相关的细菌组合物一般还包含其它相关的添加剂，例如像属于乳清、乳清渗透物、碳酸钙/石灰石以及诸如铝硅酸盐和硅藻土(kieselgur/diatomaceous earth)之类的防结块剂的组中的一种载体/成分。它不包括适用于包装芽孢杆菌组合物的容器的重量。一个实施方案涉及一种被包装到合适容器中的组合物。

[0087] 本发明的组合物可以包含包括突变株在内的本发明的芽孢杆菌属菌株，以及使得这些组合物适合于以饲料添加剂或用于饮用水的添加剂的形式向动物饲喂的载体。或者，包括突变株在内的本发明的芽孢杆菌属菌株可以与包括饲料蛋白和/或饲料碳水化合物在内的动物饲料成分一起配制。这些组合可以呈经由标准制粒工艺挤压而成的丸粒形式。

[0088] 如本文所述的芽孢杆菌组合物可以用作动物饲料的益生菌添加剂。本发明还提供了一种用于制备动物饲料或预混合料的方法，所述方法包括将本发明的芽孢杆菌组合物添加到动物饲料中。

[0089] 如本文所用的术语“预混合料”指的是将芽孢杆菌属菌株添加到载体中以产生预混合料，然后将该预混合料以所需的纳入率添加至饲料中并且向动物饲喂。

[0090] 本发明的另一个方面涉及一种用于饲喂动物的方法，所述方法包括向动物施用本发明的芽孢杆菌组合物或根据本发明制备的动物饲料或预混合料。

[0091] 实施例5描述了使用菌株B和C进行的饲喂试验，并且证实与阴性对照组相比，将这两种芽孢杆菌属菌株益生菌产品补充到保育期饮食当中，在数字上提高了生产性能。在试验期间可以观测到对生产参数的显著作用。在两个芽孢杆菌组中并且在两次试验中死亡百分比均降低。

[0092] 在一个试验点中，与饲喂芽孢杆菌的动物相比，在饲喂对照饮食的动物中，为了克服严重腹泻而接受恩氟沙星(Enrofluxacin)治疗的每圈动物数目显著更高(P>0.05)。

[0093] 这个实施例因此表明，本发明的芽孢杆菌组合物的施用可以用于例如通过抑制诸如大肠杆菌和梭状芽孢杆菌之类的病原体来治疗和预防动物的疾病。芽孢杆菌组合物可以作为直接饲喂的微生物或作为动物饲料的饲料添加剂来饲喂。以有效减少动物肠道中诸如梭状芽孢杆菌和大肠杆菌之类的病原性细菌生长的量向动物施用或饲喂本发明的组合物。

[0094] 该动物可以选自由家禽、反刍动物、小牛、猪、兔、马、鱼以及宠物组成的组。在一个优选的实施方案中，该动物是被饲养以供食用(如猪)或作为食品生产动物(food-producer)(如肉仔鸡和产蛋鸡)的养殖动物。

[0095] 还提供了向仔猪施用本发明的一种或多种芽孢杆菌属菌株的方法。这些方法可以包括向产仔母猪饲喂本发明的一种或多种芽孢杆菌属菌株。该一种或多种菌株可以在妊娠、哺乳或这两者期间饲喂。也可以向保育猪和生长肥育猪饲喂该一种或多种芽孢杆菌属菌株。

[0096] 除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求书的上下文中)，术语“a/an(一)”和“所述”以及类似的指代对象的使用应当被理解为包括单数和复数这两种形式。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”应当被理解为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指明，否则在本文中对值的范围的叙述仅意图用作单独地指示落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值被并入到本说明书中，如同其在本文中被单独叙述一般。除非在本文中另外指明或另外与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以按照任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地阐明本发明而不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言不应当被理解成将任何未要求保护的要素指示为实施本发明必要的要素。

[0097] 保藏的菌株

[0098] 莫哈韦芽孢杆菌菌株CHCC 15510已由丹麦的科汉森有限公司(Chr.Hansen A/S,Denmark)以保藏号DSM 25839保藏在DSMZ(布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物菌种保藏中心(邮编：D-38124)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig))，保藏日是2012年4月3日。已在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的条件下进行了保藏。

[0099] 解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15516已由丹麦的科汉森有限公司以保藏号DSM 25840保藏在DSMZ(布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物菌种保藏中心(邮编：D-38124))，保藏日是2012年4月3日。已在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行了保藏。

[0100] 解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15536已由丹麦的科汉森有限公司以保藏号DSM 27032保藏在DSMZ(布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物菌种保藏中心(邮编：D-38124))，保藏日是2013年3月21日。已在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行了保藏。

[0101] 解淀粉芽孢杆菌菌株CHCC 15539已由丹麦的科汉森有限公司以保藏号DSM 27033保藏在DSMZ(布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物菌种保藏中心(邮编：D-38124))，保藏日是2013年3月21日。已在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行了保藏。

[0102] 枯草芽孢杆菌菌株CHCC 15541已由丹麦的科汉森有限公司以保藏号DSM25841保藏在DSMZ(布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物菌种保藏中心(邮编：D-38124))，保藏日是2012年4月3日。已在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条件下进行了保藏。

[0103] 对于上文所鉴定的所有保藏的微生物，以下附加的说明均适用：

[0104] 对于对应指定国的对应专利局，本发明的申请人请求上述保藏的微生物的样品在专利授权日或本申请被驳回或撤回或者被视为撤回之日以前仅可供由请求人所指定的专门人员使用。

[0105] 本发明的实施方案以非限制性实施例的方式描述于下文中。

[0106] 实施例

[0107] 材料：

[0108] 小牛浸液肉汤(VIB)(Difco，234420)

[0109] 小牛浸液肉汤(VIB)琼脂(VIB+1.5％的细菌学琼脂(1号琼脂)，Oxoid LP0011)[0110] T3琼脂板(每升：3g胰蛋白胨、2g胰蛋白示(tryptose)、1.5g酵母提取物、0.05 M磷酸二氢钠以及0.005g的MnCl2[pH 6.8]和15g琼脂)

[0111] 劳拉-伯坦尼(Laura-Bertani，LB)肉汤(g/L：细菌用胰蛋白胨，10 g/L(Difco0123)；酵母提取物，5g/L(Oxoid L21)；NaCl，10g/L(Merck nr.106404))[0112] 脑心浸液(BHI)肉汤(Oxoid CM225)

[0113] 脑心浸液(BHI)琼脂(Oxoid CM375)

[0114] 胆汁盐(猪胆汁提取物；Sigma B8631)

[0115] 生物测定培养皿(Nunc 240845)

[0116] 皮氏培养皿(Procudan 140096，带筋条的皮氏培养皿)

[0117] 产孢培养基：％(w/w)95％的水；1.5％的氮源(即酵母)；3％的糖；0.06％的微量矿物质；0.1％的磷酸氢二钾

[0118] 含蛋白胨的生理盐水溶液(0.9％氯化钠、1％蛋白胨)FKP

[0119] VetMIC Lact-1和Lact-2(瑞典乌普萨拉的SVA公司(SVA,Uppsala,Sweden))[0120] ISO-SENSITEST肉汤(Oxoid CM0473)

[0121] 培养物：

[0122] 芽孢杆菌属菌株是从粪便、土壤、食物来源中分离以及从菌株库收藏物中采集而来并且在-80℃维持在MTP母板(master plate)中含20％甘油的VIB中。

[0123] 抗生素：

[0124] 氨苄西林(西格玛公司(Sigma)，A9518-5G)

[0125] 万古霉素(西格玛公司，V1764-250MG)

[0126] 庆大霉素(西格玛公司，G1264-50MG)

[0127] 卡那霉素(西格玛公司，K1377-1G)

[0128] 链霉素(西格玛公司，S6501-5G)

[0129] 红霉素(西格玛公司，E-5389)

[0130] 克林霉素(西格玛公司，C2569-10MG)

[0131] 四环素(西格玛公司，T-7660)

[0132] 氯霉素(西格玛公司，C0378-5G)

[0133] 病原体：

[0134] 大肠杆菌O101 F5(丹麦哥本哈根的国家血清研究所(State Serum Institute,Copenhagen,Denmark))

[0135] 大肠杆菌O147:K89 F4(丹麦哥本哈根的国家血清研究所)

[0136] 大肠杆菌O149:k91,k88a(NCTC 10650)英国国家典型培养物保藏中心(National Collection of Type Cultures)

[0137] 大肠杆菌菌株在-80℃维持在MTP母板中含20％甘油的LB中。

[0138] A型产气荚膜梭菌DSM 756在-80℃维持在含20％甘油的BHI中。

[0139] 实施例1：预筛选

[0140] 针对抗生素敏感性、病原体抑制作用、胆汁抗性以及对低pH值的敏感性对来自土壤和粪便以及食物来源的261种分离株进行预筛选。

[0141] 1.1抗生素敏感性

[0142] 将芽孢杆菌属菌株以50μl的体积从MTP母板中添加到DW培养板中700μl的VIB中并且在37℃和175rpm孵育过夜。将补充有2个浓度的表1中所列的抗生素的ISO测试样品和不含抗生素的ISO对照样品以180μl的体积添加到MTP培养板中。将过夜的芽孢杆菌培养物稀释100倍并且以20μl的等分部分转移到ISO测试样品和对照样品中。将MTP培养板在37℃孵育。在孵育24小时和48小时后，测量接种物和MTP测试板在620nm的光密度(OD)。细菌的抗生素敏感性被估算为ISO测试样品的OD/ISO对照样品的OD的百分比。

[0143] 1.2针对病原体抑制作用对芽孢杆菌属菌株进行筛选

[0144] 将芽孢杆菌属菌株以50μl的体积从MTP母板中添加到DW培养板中700μl的VIB中并且在37℃和175rpm孵育过夜。

[0145] 在测定之前，将大肠杆菌菌株在LB中在30℃培养过夜。将产气荚膜梭菌CHCC14372在厌氧罐中在37℃在BHI中培养过夜。

[0146] 1.2.1大肠杆菌抑制作用(通过琼脂斑点测试)

[0147] 在50℃将2ml的大肠杆菌过夜培养物与200ml液体VIB琼脂混合，并且倒入到每个生物测定培养皿中。将培养皿在无菌工作台中干燥。将各2μl的芽孢杆菌过夜培养物点样到与大肠杆菌混合的VIB琼脂的表面上并且在37℃孵育2天。测量斑点周围澄清了的抑制带的半径并且记录为：“高”，即半径大于2mm；“中”，即半径在0.5mm-2mm之间；以及“低”，即半径小于0.5mm。

[0148] 1.2.2产气荚膜梭菌抑制作用(通过琼脂斑点测试)

[0149] 将VIB琼脂倒入到生物测定培养皿(每个培养皿200ml)中，并且在无菌工作台中充分干燥。将各2μl的芽孢杆菌过夜培养物点样到VIB琼脂培养皿的表面上并且在37℃孵育过夜。将A型产气荚膜梭菌CHCC14372以2ml的体积添加到200ml液体BHI琼脂中，混合并且轻轻地铺入具有芽孢杆菌斑点的生物测定培养皿中。将培养皿在37℃在厌氧条件下孵育1天。测量斑点周围澄清了的抑制带的半径并且记录为：“高”，即大于2mm；“中”，即在1mm-2mm之间；“低”，即小于1mm。

[0150] 1.2.3产气荚膜梭菌抑制作用(通过孔扩散测试)

[0151] 将2ml的产气荚膜梭菌CHCC14372过夜培养物与200ml液体BHI琼脂混合，并且倒入到每个生物测定培养皿中。在凝固后，使用无菌钻孔器在BHI琼脂中制成10mm的孔并且将80μl的芽孢杆菌过夜培养物转移到每个孔中。将培养皿在37℃在厌氧条件下孵育1天。测量孔周围澄清了的抑制带的半径并且记录为：“高”，即大于2mm；“中”，即在0.5mm-2mm之间；以及“低”，即小于0.5mm。

[0152] 1.3胆汁抗性测定

[0153] 将芽孢杆菌属菌株以50μl的体积从MTP母板中添加到DW培养板中700μl的VIB中并且在37℃和175rpm孵育过夜。将50μl体积的芽孢杆菌过夜培养物转移至DW培养板中800μl的补充有0.3％胆汁盐的VIB(测试样品)和不含胆汁的VIB(对照样品)中。将培养板在37℃和175rpm孵育。在时间零点、第6小时以及第24小时测量含胆汁的VIB在620nm的光密度(OD620)并且用VIB对照样品相应的OD620值相减。根据OD620值的差值将培养物排在A组(OD<0.1)、B组(OD＝0.1-0.4)以及C组(OD>0.4)中。A组中的菌株被认为具有最大的胆汁盐抗性。所选择的菌株应当在A组或B组中。所选菌株的结果呈现于表
2中。

[0154] 1.4对低pH值(模拟胃内条件)的敏感性

[0155] 将已使用1.0M盐酸调节至pH 4的800μl的VIB等分样品和VIB对照样品(pH7)分配于DW培养板中。将芽孢杆菌属菌株以50μl的体积从MTP母板中添加到DW培养板中并且在37℃和175rpm孵育24小时。在时间零点和孵育24小时后测量200μl细胞悬浮液的光密度(OD620)。通过用孵育后的相应值减去孵育前的OD620值来确定细菌在pH 4的生长。显示出大于0.1的OD620增加值的培养物被认为能抵抗pH 4(在表2中用R指示)，而OD620值小于0.1(不生长或负值)的培养物被认为对pH 4具敏感性(在表2中用S指示)。

[0156] 1.5预筛选的结果：

[0157] 基于预筛选测试，选择32种菌株进行二次筛选。所选择的菌株应当对所述抗生素具有敏感性并且显示出对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌这两者的抗微生物作用并且在所进行的其它测试中表现良好。

[0158] 在来自土壤和粪便以及食物来源的261种分离株当中，161种分离株在预筛选测试中具有抗生素抗性。在对抗生素具有敏感性的100种分离株当中，56种具有对抗产气荚膜梭菌的抗微生物作用并且仅22种具有对抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌这两者的作用。在这些当中，有12种分离株来自于菌种解淀粉芽孢杆菌。其它代表性菌株来自于菌种枯草芽孢杆菌和莫哈韦芽孢杆菌。表2和3汇总了科汉森公司专有菌株(被选用于二次筛选的32种菌株中的22种)的结果。

[0159] 实施例2：二次筛选

[0160] 基于初步筛选的结果，通过重复琼脂斑点测试对40种所选择的分离株和参考菌株的病原体抑制作用和产孢能力进行了测试。还通过MIC测试对32种菌株的抗生素敏感性进行了测试。

[0161] 2.1针对病原体抑制作用对芽孢杆菌属菌株进行筛选

[0162] 在测定之前，将9ml的VIB用芽孢杆菌培养物接种并且在37℃和175rpm孵育过夜。同时，将9ml的BHI肉汤用大肠杆菌菌株接种，并且在37℃孵育过夜。将产气荚膜梭菌在相同条件下培养在厌氧罐中。

[0163] 2.1.1大肠杆菌抑制作用(通过琼脂斑点测试)

[0164] 在50℃将病原体的过夜培养物各自以2ml的体积添加到200ml的液体VIB琼脂中，并且倒入到每一个生物测定培养皿中。将培养皿在无菌工作台中干燥。将芽孢杆菌过夜培养物点样到与病原体混合的VIB琼脂的表面上并且在37℃孵育2天。记录斑点周围抑制带的半径和斑点直径。

[0165] 2.1.2产气荚膜梭菌抑制作用(通过琼脂斑点测试)

[0166] 将芽孢杆菌培养物点样到皮氏培养皿中VIB琼脂的表面上并且在37℃孵育过夜。将2ml体积的产气荚膜梭菌过夜培养物与200ml的液体BHI琼脂混合，并且倒入到已生长有芽孢杆菌斑点的VIB琼脂中。将培养皿在37℃在厌氧条件下孵育1天。测量斑点周围澄清了的抑制带的半径。

[0167] 2.2在VIB和产孢培养基中的生长

[0168] 将芽孢杆菌属菌株以50μl的体积从MTP母板中添加到DW培养板中700μl的VIB或产孢培养基中并且在37℃和175rpm孵育24小时。通过200μl悬浮液在620nm的光密度(OD620)来测定细菌生长。由于产孢培养基的浊度高并且它在各孔间存在差异，因此用孵育后相应孔的OD620值减去孵育前的OD620值。将显示出大于0.4的OD620的培养物排在A组(高生长组)中，并且将显示出小于0.4的OD620的培养物排在B组(低生长组)中。

[0169] 2.3在产孢培养基中的产孢作用

[0170] 将芽孢杆菌属菌株以50μl的体积从MTP母板中添加到DW培养板中700μl的VIB中并且在37℃和175rpm孵育过夜。将50μl体积的芽孢杆菌过夜培养物转移至DW培养板中700μl的产孢培养基(SM)中。将培养板在37℃和175rpm孵育3天。在显微镜下密切观察产孢作用，并且在孵育1天(24小时)、2天(48小时)以及3天(72小时)后通过目测评价来确定芽孢百分比(相对于总细胞的芽孢数)。

[0171] 2.4通过MIC所测量的抗生素敏感性

[0172] 通过测量多种抗生素的最低抑制浓度(MIC)来分析菌株的抗生素敏感性。所用的方法是如由CLSI的标准(临床和实验室标准协会M07-A8和M45-A2)所概述的肉汤微量稀释法。

[0173] 将所要测试的菌株过夜生长的悬浮液以105 cfu/ml(菌落形成单位/毫升)的近似浓度于ISO-SENSITEST肉汤(Oxoid CM0473)中接种到微量滴定板中所要测试的抗生素的两倍连续稀释液中(总体积100微升/孔)并且在37℃在有氧条件下孵育20至24小时。可以使用包含抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素以及氯霉素的预制组VetMIC Lact-1和Lact-2。在24小时后记录作为抗生素抑制明显生长的最低浓度的结果。该测试进行两次作为两个独立的生物学重复。

[0174] 2.5结果

[0175] 32种所选菌株的结果显示解淀粉芽孢杆菌具有抗生素敏感性、抗微生物作用以及产孢能力的最佳组合特性，参见表2。仅包括了与科汉森公司专有菌株(32种菌株中的22种)有关的数据。

[0176] 表2

[0177] 所选择的芽孢杆菌属菌株的基本数据

[0178] 来源、通过gyrB鉴定的菌种、在VIB和产孢培养基中的生长以及产孢百分比。

[0179] 菌株A＝15510；菌株B＝15516；菌株C＝15541；菌株H＝15536；菌株I＝15539[0180]

[0181]

[0182] 表3

[0183] 所选择的芽孢杆菌属菌株对大肠杆菌和产气荚膜梭菌的抑制作用(mm)以及对胆汁和酸的抗性

[0184] 菌株A＝CHCC15510；菌株B＝15516；菌株C＝15541；菌株H＝15536；菌株I＝15539

[0185] O149、O147以及O101是在病原体小节中所提及的三种大肠杆菌猪病原体。

[0186]

[0187]

[0188] 实施例3：热稳定性

[0189] 3.1用于热稳定性测试的方法

[0190] 将芽孢杆菌属菌株在37℃和220rpm在VIB中培养过夜。将过夜的培养物涂布接5 6
种到T3琼脂板上(100μl的10-10稀释液)并且在37℃孵育1至2天直到产孢完成为止。将芽孢从培养板中刮出，悬浮于FKP溶液中并且在80℃孵育15分钟以使营养细胞失活。在加热后立即将芽孢悬浮液放在冰上。将芽孢制剂在FKP中洗涤两次，重悬于含20％甘油的FKP中并且在使用前保持在80℃。通过将容纳500μl芽孢在FKP中的悬浮液(浓
6
度为约1×10 CFU/ml)的微量离心管在99.5℃保持2分钟、5分钟以及10分钟来评估细菌芽孢的耐热性。通过将经过加热的悬浮液的稀释液接种到VIB琼脂上在37℃孵育过夜后，来测定CFU计数。

[0191] 3.2热稳定性测试的结果

[0192] 热稳定性数据示于表4中。

[0193] 表4：所选择的芽孢杆菌属菌株在99.5℃的热稳定性；测量为cfu在2分钟、5分钟以及10分钟后相对于时间零点的减少量(log/log)

[0194] 菌株B＝15516；菌株C＝15541；菌株H＝15536

[0195]

[0196]

[0197] 一般来说，cfu在2分钟后相对于时间零点的减少量小于2(log/log)对于将被纳入到饲料中进行制粒的芽孢来说是合适的，并且在使用常见的可商购的芽孢杆菌芽孢制剂的情况下达到了低于2的结果。因此，所测试的并且示于表4中的所有菌株均具有良好的热稳定性。一些菌株在5分钟和10分钟后还显示出良好的热稳定性，即菌株B和菌株F，这两者均是解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种，未显示出cfu减少。

[0198] 实施例4：酶产生

[0199] 4.1用于纤维素酶测定的方法

[0200] 将芽孢杆菌属菌株在37℃和剧烈磁力搅拌下在羧甲基纤维素(CMC)培养基(Abou-Taleb等,2009)(每升：10.0g羧甲基纤维素(C9481)、2.0g细菌用胰蛋白胨(目录号211705，丹麦的碧迪有限公司(Becton Dickinson A/S,Denmark))、4g KH2PO4、4.0g Na2HPO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.001g CaCl2·2H2O、0.004gFeSO4·7H2O，pH 7)中培养24小时。使用EnzChek纤维素酶底物试剂盒(目录号：E33953，生命科技公司(Life Technologies))根据制造商的说明书测定纤维素酶的产生。简单地说，通过离心收集培养上清液并且将所述培养上清液在连续稀释中分配于MTP中(每孔200μl)。使用来自黑曲霉(Aspergillus -1
niger)的纤维素酶(C1184)从2 U ml 开始建构标准曲线。将EnzChek底物溶液添加至Nunc 96孔黑色FluoroNunc培养板(目录号：237105，赛默飞世尔科技-能肯公司(Thermo Fisher Scientific,NUNC Inc.))中的培养上清液中。在孵育30分钟后记录在激发波长
360nm/发射波长420nm的荧光(Enspire 2300多标记读数器(Enspire 2300Multilabel Reader)，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer Inc.))。在两次独立的实验中根据标准曲线计算-1
纤维素酶活性并且表示为平均值(U ml )。

[0201] 4.2用于木聚糖酶测定的方法

[0202] 将芽孢杆菌培养物在37℃和剧烈磁力搅拌下在含有榉木木聚糖的培养基(Cordeiro等,2002)(每升：5.0g木聚糖(X4252)、2.0g酵母提取物(目录号：288620，丹麦的碧迪有限公司)、5.0g细菌用蛋白胨(目录号：211677，丹麦的碧迪有限公司)、0.5g NaCl、0.5g MgSO4·7H2O、0.15g CaCl2·2H2O，pH 7.5)中培养24小时。通过使用EnzChek Ultra木聚糖酶测定试剂盒(目录号：E33650，生命科技公司)根据制造商的说明书进行木聚糖酶测定。简单地说，通过离心收集培养上清液，将所述培养上清液在连续稀释中分配于MTP中(每孔200μl)并且添加木聚糖酶底物工作溶液。在孵育30分钟后测量培养上清液在激发波长360nm/发射波长420nm的荧光(Enspire 2300多标记读数器，珀金埃尔默公司)。使用细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosis)(X2753)作为标准酶并且在从25mU -1ml 开始于连续稀释中加入到MTP中。根据标准曲线计算芽孢杆菌属菌株的木聚糖酶活性-1
并且表示为两次独立测定的平均值(mU ml )。

[0203] 4.3用于蛋白酶测定的方法

[0204] 将芽孢杆菌过夜培养物(在37℃培养在VIB中)转移至含有异硫氰酸荧光素-酪蛋白(FITC-C)作为底物(Sigma C3777)的反应混合物中并且在37℃孵育3小时。在沉淀后，通过在激发波长497nm、发射波长515nm的荧光来测量可溶性肽的量。这一测定对广泛的蛋白酶(丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶)进行检测。

[0205] 4.4用于生物膜产生的方法

[0206] 将芽孢杆菌属菌株添加到VIB中(约107 CFU ml-1)，分配到聚丙烯(PP)MTP(96孔无色锥底PP培养板(Conical Btm PP Plt Natural)；丹麦的能肯公司(NUNC Inc.,Denmark))中，并且在37℃、在不振荡的情况下孵育24小时。通过测量在620 nm的光密度(OD)来控制生长。通过如先前所述(Auger等,2009)的结晶紫染色法来评估生物-1膜的形成。简单地说，在使用蒸馏水对各孔进行洗涤后，将0.1％(w v )的结晶紫溶液添-1
加至PP-MTP中并且将培养板孵育30分钟。然后，重复洗涤程序并且将96％(v v )的乙醇添加至培养板中。在孵育15分钟后测量在570nm的吸光度(Wallac Victor2分光光度计，珀金埃尔默公司)。将芽孢杆菌属菌种菌株分类为高度(吸光度570nm>2.0)、中度(吸光度570nm＝1.0-2.0)或低度(吸光度 570nm<1.0)生物膜产生菌。将该测定按一式两份进行两次。

[0207] 4.5.酶测定的结果

[0208] 表5：酶产生和生物膜

[0209] (RFU＝相对荧光单位)

[0210] 菌株A＝15510；菌株B＝15516；菌株C＝15541；菌株H＝15536；菌株I＝15539[0211]

[0212] 上表显示皆为解淀粉芽孢杆菌植物亚种的菌株E、G、H、I以及J具有高纤维素酶活性，而为解淀粉芽孢杆菌解淀粉亚种的菌株B和F具有低纤维素酶活性。

[0213] 实施例5：仔猪试验

[0214] 将两种所选择的芽孢杆菌属菌株(菌株B或C)补充到保育期饮食中以评估它们对断奶后仔猪的生长性能和死亡率的影响。由于大肠杆菌是在保育期对生产参数和死亡率有很大影响的主要病原体中的一种，因此这些试验可以提供有关在动物体内在大肠杆菌抑制方面的作用的信息。在2个不同的试验点进行试验；试验点1是研究养殖场并且试验点2是大学。试验设置在这两个试验点是相似的。

[0215] 表6

[0216] 有关用于仔猪试验中的试验点的概述

[0217]

[0218] 5.1.1在试验点1的实验设置

[0219] 在断奶当天，将来源于实验养殖场的来自两个连续断奶批次(每批288头仔猪)的576头仔猪(28天大)用于实验中。仔猪是杂交繁育的仔猪(ACMC猪×皮特兰猪(Pietrain))。所选择的仔猪是总体方面良好的健康仔猪并且在保育期未接受过任何疫苗接种。该实验养殖场中猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)呈阳性，但受到控制，并且在断奶后的时期存在大肠杆菌病的一些问题。将这两个断奶批次中的仔猪根据体重进行分选，然后分配到48个猪圈中(总共96个猪圈)，从而使得在两种处理中，每一区各猪栏中容纳具有相似体重的6头仔猪，即3头未去势公猪和3头母猪。按区向容纳体重较轻的仔猪和体重较重的仔猪的猪圈分配所述处理，从而使得将每一种处理施用于每圈有6头仔猪的24个猪圈(每种处理每个房间6个猪圈；每种处理每个断奶批次12个猪圈)。将芽孢杆菌产品以每7
吨饲料400g或每克饲料1.28×10 CFU添加至饲料中。

[0220] 在28天大(第0天；断奶当天)、35天大、42天大以及63天大时单独地对猪进行称重以计算平均日增重(ADWG)。在相同阶段(28-35天大；35-42天大；42-63天大)中以及对于主要时期(教槽前(prestarter)：28-42天大；教槽期(starter)：42-63天大；以及整个保育期)按圈测量平均每日采食量(ADFI)和饲料转化率(FCR)。每天对死亡率和病变发病率进行管理，包括登记所施用的各抗生素治疗。

[0221] 表7

[0222] 在试验点1的生产参数

[0223] 与对照组相比得到的P值(A：P＝<0.1；a：P＝<0.05)

[0224] 菌株B＝15516；菌株C＝15541

[0225] SE＝标准误差

[0226]

[0227]

[0228] 5.1.2结果

[0229] 与阴性对照组相比，被补充到保育期饮食中的两种芽孢杆菌属菌株益生菌产品均在数字上提高了生产性能，它们之间没有显示出差异。在教槽前的时期(28天-42天大)可以观测到对ADG和FU这两者的显著作用。两个芽孢杆菌组的死亡百分比均降低(死亡％：对照组(3.47％)，菌株B组(1.39％)，菌株C组(2.08％))。

[0230] 5.2.1在试验点2的实验设置

[0231] 在断奶后立即将所选择的所有仔猪均圈养在有24个猪圈的断奶室中，其中每圈有三十只动物。该断奶室装备有集中供暖和使用冷却系统进行的强制通风以及完全漏缝地板。每个猪圈装备有可商购的双侧湿-干进料器以确保随意进食和自由饮水，所述进料器具有用于同时饲喂三只动物的容量。在整个实验阶段随意地分配饲料。

[0232] 使用总共七百二十头可商购的刚断奶的杂交仔猪[皮特兰猪×(长白猪(Landrace)×大白猪(Large White))]。这些动物是在断奶当天自同一个养殖场的母猪获得并且被移送到实验设施中(没有经过交通运输)。使用体重是7.0公斤(SD＝1.64公斤)的26天大的公仔猪和母仔猪。使用带有动物编号的塑料耳标标识。根据初始体重将这些动物分配到三个区中。在每个区内，将仔猪分配到猪栏中以使得体重分布均衡。因此，每个区由每圈有30只动物的8个猪圈组成，向这些猪圈中随机分配实验饮食。

[0233] 试验在28天大、断奶时开始。在试验中，在第0天和第7天单独地对动物进行称重并且在第21天和第35天对各组进行称重。在整个实验期间测量每个料斗中的饲料消耗量。从而根据总采食量计算平均每日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)以及采食量:增重比(FCR)。定期评估仔猪的健康状况并且记录任何异常体征或所给药物。还计算了死亡率和淘汰百分比。

[0234] 表8

[0235] 在试验点2的生产参数

[0236] 最小二乘法(least square means)，与对照组相比得到的P值(A：P＝<0.1)[0237] 菌株B＝15516；菌株C＝15541

[0238]

[0239] 5.2.2结果

[0240] 与阴性对照组相比，被补充到保育期饮食中的两种芽孢杆菌属菌株均在数字上提高了生产性能，它们之间没有显示出差异。在试验期间可以观测到对ADG和FU这两者的显著作用。

[0241] 在断奶后第一周期间，与饲喂芽孢杆菌的动物相比，在饲喂对照饮食的动物中，为了克服严重腹泻而接受恩氟沙星治疗的每圈动物数目显著更高(P>0.05)。在整个实验期间(断奶后0至35天)观测到相同的结果(P<0.05)。两个芽孢杆菌组的死亡百分比均降低(死亡％：对照组(4.17％)，菌株B组(0.04％)，菌株C组(2.65％))。

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