生物膜有机体的抑制
阅读：94发布：2023-12-31
专利汇可以提供生物膜有机体的抑制专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含至少两种抗 生物 膜 剂的产品，其中所述抗生物膜剂的中德至少一种是抗 微生物 肽。第二种抗生物膜剂一般是分散剂或防粘剂。还提供了所述产品在 治疗 微生物感染中的用途。，下面是生物膜有机体的抑制专利的具体信息内容。
1.一种包含至少两种抗生物膜剂的产品，其中，所述抗生物膜剂中的至少一种是抗微生物肽。
2.如权利要求1所述的产品，其中，另一种所述抗生物膜剂是分散剂或防粘剂。
3.如权利要求1或2所述的产品，其中，所述抗微生物肽是抗菌肽。
4.如前述任一项权利要求所述的产品，其中，所述抗微生物肽包含根据式I的氨基酸：
((X)1(Y)m)n (I)
其中l和m是1至10的整数，例如1至5；n是1至10的整数；X和Y可以相同或不同，独立地为疏水性氨基酸或阳离子氨基酸。
5.如权利要求4所述的产品，其中，所述抗微生物肽包含根据式(I)的氨基酸，式(I)中X和Y是阳离子氨基酸。
6.如前述任一项权利要求所述的产品，其中，所述抗微生物肽包含2至200个氨基酸。
7.如前述任一项权利要求所述的产品，其中，X和/或Y是阳离子氨基酸。
8.如权利要求7所述的产品，其中，X和/或Y选自组氨酸、精氨酸和赖氨酸。
9.如权利要求8所述的产品，其中，X和/或Y选自精氨酸和赖氨酸。
10.如权利要求2至9中任一项所述的产品，其中，所述分散剂是能够分散生物膜的颗粒的试剂。
11.如权利要求10所述的产品，其中，所述分散剂是粘液溶解剂。
12.如权利要求10至12中任一项所述的产品，其中，所述分散剂是酶。
13.如权利要求12所述的产品，其中，所述酶选自脱氧核糖核酸酶、褐藻酸酶、蛋白酶和糖酶。
14.如权利要求10至12中任一项所述的产品，其中，所述分散剂是胺。
15.如权利要求14所述的产品，其中，所述胺是氨基硫醇。
16.如权利要求15所述的产品，其中，所述胺选自乙酰半胱氨酸和半胱胺。
17.如权利要求10至12中任一项所述的产品，其中，所述分散剂是酸。
18.如权利要求17所述的产品，其中，所述酸是乙二胺四乙酸(EDTA)。
19.如权利要求2至9中任一项所述的产品，其中，所述防粘剂是能够抑制细胞、蛋白质和有机体之间粘着的试剂。
20.如权利要求19所述的产品，其中，所述防粘剂选自乙酰透明质酸、肝素和Carbopol
934。
21.如前述任一项权利要求所述的产品，所述产品包含协同有效量的(i)第一抗生物膜剂，和(ii)第二抗生物膜剂，其中，所述第二抗生物膜剂与所述第一抗生物膜剂不同并且为抗微生物肽。
22.如前述任一项权利要求所述的产品，所述产品用作消毒剂或杀虫剂。
23.如权利要求1至21中任一项所述的产品，所述产品用作药物。
24.一种基底，将如前述任一项权利要求所述的产品涂敷或者附着到该基底上。
25.如权利要求24所述的基底，其中，所述基底选自敷料、医疗装置和内置装置。
26.如权利要求25所述的基底，其中，所述内置装置选自支架、导管、腹膜透析管、引流装置、人工关节和牙植入物。
27.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至21中任一项所述的产品和一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。
28.如权利要求1至21中任一项所述的产品在治疗微生物感染或疾病或与疾病相关的病症中的用途。
29.包含根据式I的氨基酸的抗微生物肽在治疗微生物感染或疾病或与疾病相关的病症中的用途。
30.如权利要求28和29中任一项所述的应用，其中，所述感染或疾病或与疾病相关的病症选自皮肤和伤口感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、牙菌斑的形成、眼部感染、心内膜炎、囊性纤维化中的感染和内置医疗装置的感染。
31.一种预防在环境中形成生物膜的方法，所述方法包括向环境中给药如权利要求1至21中任一项所述的产品或者如权利要求24至26中任一项所述的基底的步骤。
32.一种预防在环境中形成生物膜的方法，所述方法包括向所述环境中给药抗微生物肽的步骤，所述抗微生物肽包含根据式I的氨基酸。
33.如权利要求31和32中任一项所述的方法，其中，所述环境包含选自细菌、真菌、酵母、病毒和原生动物的形成生物膜的微生物。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述微生物是细菌。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述细菌选自可以包括假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述细菌选自假单胞菌属(Pseudomonas spp.)和葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述细菌是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金 黄 色 葡 萄 球 菌(Staphylococcus aureus) 或 表 皮 葡 萄 球 菌(Staphylococcus epidermidis)。
38.如权利要求32至37中任一项所述的方法，其中，所述环境是口腔。
39.如权利要求38所述的方法，所述方法用于预防在人类牙齿或牙植入物上形成噬菌斑或龋齿。
40.一种通过预防或治疗法来治疗微生物感染的方法，所述方法包括顺序或者联合给药治疗有效量的：
●第一抗生物膜剂；和
●不同于所述第一抗生物膜剂的第二抗生物膜剂；其中，所述第一抗生物膜剂和第二抗生物膜剂中的至少一种是抗微生物肽。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述第一抗生物膜剂是抗微生物肽，而所述第二抗生物膜剂选自分散剂和防粘剂。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中，所述微生物感染是局部感染。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所述局部感染选自创伤、溃疡和损害。
44.如权利要求40或41所述的方法，其中，所述微生物感染是口腔感染。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述口腔感染选自牙龈炎、牙周炎和粘膜炎。
46.如权利要求40或41所述的方法，其中，所述微生物感染是全身感染。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述全身感染是粘膜感染。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述粘膜感染是胃肠感染、泌尿生殖感染或呼吸感染。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中，所述粘膜感染是囊性纤维化。
50.一种治疗或预防在环境中形成生物膜的方法，所述方法包括向所述环境中给药有效量的半胱胺。
51.半胱胺在治疗微生物感染，特别是微生物生物膜感染中的用途。
生物膜有机体的抑制
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 微生物生物膜是嵌入在聚合物质的细胞外基质中的微生物细胞的群落并且附着在生物或非生物表面。在这些生物膜中可以发现一系列的微生物(细菌、真菌和/或原生动物，以及相关的噬菌体和其他病毒)。生物膜在自然界中普遍存在，通常存在于大多数环境中。由于生物膜与许多感染相关，尤其是它们有助于感染治疗的顽抗性(recalcitrance)，因此日益受到科学界和医学界的认可。
[0004] 生物膜是许多哺乳动物疾病状态的病因(etiologic agents)并且与80％的人类感染有关。感染的实例包括皮肤和伤口感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、牙菌斑的形成、眼部感染(包括隐形眼镜污染)、心内膜炎、囊性纤维化中的感染，以及内置医疗装置的感染，所述内置医疗装置例如人工关节、牙植入物、导管和心脏植入物。
[0005] 如由美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(European Committee onAntimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)所描述的，浮游微生物(即悬浮在液体培养基中或者在液体培养基中生长的微生物)通常用作抗微生物敏感性研究的模型。生物膜中的微生物对抗微生物治疗的抗性显著大于它们的浮游生物相对物(counterparts)。然而，还没有用于研究生物膜微生物的抗生素敏感性的标准化方法。
[0006] 生物膜的形成不仅仅限于微生物附着在表面上的能力。在生物膜中生长的微生物与生物膜在其上最初发育的实际物质层(physical substratum)的相互作用相比，更加能够彼此之间相互作用。例如，这种现象有助于接合基因转移，所述接合基因转移在生物膜中的细胞之间的发生率大于在浮游生物细胞之间的发生率。该现象表示在细菌之间水平基因转移的机会增加，并且这是重要的，因为该现象可以促进从抗敏感性微生物转移为抗生素抗性或毒性决定基因。细菌可以通过称为群体感应的系统相互交流，通过该群体感应系统，将信号分子释放到环境中并且可以通过周围微生物检测其浓度。群体感应系统使细菌间相互作用成为可能，从而增强它们的生存能力。对群体感应的响应包括：对营养物的可用性的适应、防御可以竞争相同养分的其它微生物和避免对细菌具有潜在危险性的毒性化合物。在宿主(例如，人类、其它动物或植物)的感染过程中，对于致病菌来说非常重要的是，协调它们的毒性以逃避宿主的免疫应答从而能够建立成功的感染。
[0007] 生物膜的形成在许多感染性疾病例如囊性纤维化和牙周炎中，在血流和尿路感染中以及由内置医疗装置的存在而引起的结果中具有关键作用。生物膜相关的微生物在它们的宿主中通过建议的机制引起疾病，所述建议的机制包括以下：(i)抗微生物剂通过生物膜基质的延迟穿透；(ii)细胞或细胞团块与内置医疗装置生物膜的分离；(iii)内毒素的产生；(iv)对宿主免疫系统的抗性；(v)通过抗微生物抗性和/或毒性决定基因的水平基因转移提供用来产生抗性生物的小生境；和(vi)生长速率的改变(即代谢休眠)(Donlan和Costerton，Clin Microbiol Rev 15：167-193，2002；Parsek和Singh，Annu Rev Microbiol 57：677-701，2003；Costerton JW，Resistance of biofilms to stress.In’The biofilm primer’。(Springer Berlin Heidelberg)。第56-64页.2007)。
[0008] 最近的实验证据已经表明，在生物膜之内存在专门的非代谢持留细胞(persister cells)(休眠细胞)的小亚群。一般认为，这些细胞是生物膜对于抗微生物剂的高抗药性/耐药性的原因。耐多药(Multi-drug-tolerant)的持留细胞存在于浮游生物和生物膜群体中，并且似乎酵母和细菌已经演变成对该亚群分配生存功能的类似策略。由聚合物基质提供的保护使持留细胞能避开被除去并作为种群恢复的来源。有证据表明，持留细胞可以是微生物生物膜的多种耐药性的主要原因(LaFleur等人，Antimicrob Agents Chemother.50：3839-46，2006；Lewis，Nature Reviews Microbiology 5，48-562007)。
[0009] 当前需要用于预防生物膜形成并治疗与微生物生物膜相关的病症的更好疗法。
发明内容
[0010] 根据本发明的第一个方面，提供了包含至少两种抗生物膜剂的产品，其中所述抗生物膜剂的至少一种是抗微生物肽。其他抗生物膜剂可以是分散剂或防粘剂。
[0011] 本文使用的术语“抗生物膜剂”是用于描述能够破坏或者抑制微生物生物膜的生长的试剂。抗生物膜剂可能能够破坏生物膜的结构，例如细胞外粘液基质，或者可能能够破坏或者抑制微生物细胞在生物膜内的生长。
[0012] 本发明还提供了预防在环境中形成生物膜的方法，该方法包括向所述环境中给药抗微生物肽的步骤。有利地，该方法包括向所述环境中给药根据本发明的产品的步骤。
[0013] 本发明还提供了通过预防或治疗法来治疗微生物感染，特别是微生物生物膜的方法，该方法包括给药治疗有效量的抗微生物肽，例如阳离子肽。通常，该方法涉及顺序或者联合给药治疗有效量的：
[0014] ●第一抗生物膜剂；和
[0015] ●不同于第一抗生物膜剂的第二抗生物膜剂；其中，第一抗生物膜剂和第二抗生物膜剂的至少一种为抗微生物肽，例如阳离子肽。
[0016] 上述活性剂可以以自由组合或固定组合的形式来给药。自由组合可以以包含自由组合中所有活性剂的组合包装的形式来提供。固定组合常为片剂或胶囊剂。
[0017] 包括在本发明中的是，通过以上列出的抗微生物肽或者活性剂的组合的预防或治疗法，在制备用于治疗微生物感染特别是微生物生物膜感染的药物中的用途。
[0018] 所述产品具有优点，即该产品证明了尤其是存在于生物膜中的持留细胞的抗菌活性，这对生物膜去除是必需的步骤。
[0019] 本发明的试剂可以以药学上可接受的盐的形式来给药。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法，由包含碱性或酸性部分的母体化合物来合成。通常，此种盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中、或者在水和有机溶剂的混合物中反应而制备；一般地，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。适合的盐的名单参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，US，1985，第1418页，其公开内容以引用方式并入本文，另见Stahl等人，Eds，“Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use”，Verlag Helvetica Chimica Acta and Wiley-VCH，2002。本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内，适合用于与人类组织或者根据具体情况的动物组织接触，而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或者其他与合理的受益/风险比相适应的问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0020] 因此，本发明包括所公开的化合物的药学上可接受的盐，其中通过制备所公开化合物的酸盐或碱盐的方式来改性母体化合物，所述的盐例如诸如由无机酸或碱或者有机酸或碱形成的常规的无毒盐或季铵盐。此种酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐(digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、延胡索酸盐、葡萄糖庚酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(2-hydroxyethanesulfonate)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐(mathanesulfonate)、2-萘磺酸盐(2-naphthanlenesulfonate)、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。碱盐包括铵盐；碱金属盐，例如钠盐和钾盐；碱土金属盐，例如钙盐和镁盐；与有机碱形成的盐，例如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖胺；以及与氨基酸形成的盐，例如精氨酸、赖氨酸等。另外，可以采用此类试剂将含有碱性氮的基团季铵化为低级烷基卤，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烃基硫酸盐如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基的硫酸盐，长链卤化物例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基卤如苄基和苯乙基的溴化物以及其他。
[0021] 因此，本发明包括通常含有至少以下的药物产品：
[0022] ●第一抗生物膜剂；和
[0023] ●不同于第一抗生物膜剂的第二抗生物膜剂，其中第一和第二抗生物膜剂中的至少一种是抗微生物肽，例如阳离子肽。
[0024] 第一抗生物膜剂
[0025] 第一抗生物膜剂可以是抗微生物肽，例如抗菌肽。优选地，第一抗生物膜剂是抗微生物肽，以下称为“第一抗微生物剂”。第一抗微生物剂可以包含根据式I的氨基酸：
[0026] ((X)l(Y)m)n (I)
[0027] 其中，1和m是从1至10的整数，例如1至5；n是从1至10的整数；X和Y可以相同或不同，独立地为疏水性氨基酸或阳离子氨基酸。
[0028] 优选地，第一抗微生物剂包含根据式(I)的氨基酸，其中X和Y是阳离子氨基酸。
[0029] 抗微生物肽可以包含2至200个氨基酸，例如3、4、5、6或7至高达100个氨基酸，包括3、4、5、6或7至高达10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。根据一个实施方案，抗微生物肽包含3或4至50个氨基酸。作为另外一种选择，肽可以包含多于27个氨基酸，一般地为27至300个氨基酸，适当地27至200个氨基酸。
[0030] 肽可以包含100至200个氨基酸，20至100、20和45个氨基酸，例如20、25、30、35、40、42或45个氨基酸。肽可以包含3至15个氨基酸，例如5至15个氨基酸。
[0031] 如本文所使用的，术语“疏水性”是指具有侧链的氨基酸，所述氨基酸在生理pH下不带电荷、没有极性并且一般通过水溶液来排斥。
[0032] 如本文所使用的，术语“阳离子”是指静电荷大于或等于0的氨基酸。通常，术语“阳离子”是指静电荷大于0的氨基酸。
[0033] 通常，疏水性氨基酸残基的疏水性大于或等于-1.10而电荷大于或等于0。
[0034] 疏水性氨基酸可以包括，亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸。
[0035] 优选地，X和/或Y是例如选自组氨酸、精氨酸和赖氨酸的阳离子氨基酸。还优选地，X和/或Y是精氨酸或赖氨酸。X和/或Y可以选自非天然存在的氨基酸，例如阳离子氨基酸鸟氨酸。
[0036] X和/或Y可以是如本文所定义的阳离子氨基酸的任选异构体，例如D或L-氨基酸。此外，X和/或Y可以是替代的氨基酸。
[0037] 氨基酸可以是天然存在的或者合成的。本发明还包括上述氨基酸的已知的异构体(结构的、立体的、构象的和构型的)和结构类似物，以及那些天然修饰(例如，翻译后修饰)或化学修饰的氨基酸，所述的修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、磺酰化和/或羟基化。
[0038] 根据一个实施方案，所述的肽可以包括阳离子或疏水性氨基酸X和Y的一种或多种替代物。然而，肽将主要地包括阳离子或疏水性氨基酸X和Y。通常，肽可以包含1至5种替代物，适当地1至3种替代物，一般地1种替代物。所述替代物可以是末端替代物或非末端替代物。
[0039] 替代物可以由氨基酸或非氨基酸组成。替代物可以带电荷或不带电荷。通常，一种或多种替代物是不带电荷的氨基酸。替代地或另外，一种或多种替代物可以是非氨基酸，例如半胱胺。
[0040] 优选地，X和Y是相同的并且为赖氨酸或精氨酸。
[0041] 根据一个实施方案，所述的肽主要包含可以由一个或多个不是精氨酸的氨基酸替代的精氨酸氨基酸。
[0042] 一般地，所述的肽包含，任选地由1至5个非精氨酸的氨基酸替代的7至20个精氨酸氨基酸，通常为3至5个非精氨酸替代物。
[0043] 作为另外一种选择，所述的肽可以包含，任选地由1至5个非赖氨酸的氨基酸替代的7至20个赖氨酸氨基酸，通常为3至5个非赖氨酸替代物。
[0044] 根据再一个实施方案，所述的肽可以主要地包含可以由一个或多个不是精氨酸的氨基酸替代的精氨酸氨基酸。
[0045] 一般地，所述的肽包含，任选地由1至5个非精氨酸氨基酸替代的精氨酸氨基酸，通常为3至5个非精氨酸替代物。
[0046] 作为另外一种选择，所述的肽可以包含，任选地由1至5个非赖氨酸的氨基酸替代的7至20个赖氨酸氨基酸，通常为3至5个非赖氨酸替代物。
[0047] 根据又一个实施方案，所述的肽可以包含27至300个赖氨酸氨基酸，一般地27至200个赖氨酸氨基酸。通常，所述的肽不含带有非赖氨酸氨基酸的非末端替代物。
[0048] 在式(I)的肽中，l和m可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，而n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0049] 在式(I)的肽中，l可以是1，n可以是1，以及m可以是4至9，例如m可以是3、4、5、6、7、8或9。
[0050] 在式(I)的肽中，l、n和/或m可以是1至5，例如1、2、3、4或5。
[0051] 在式(I)的肽中，l和m可以是0至7的整数，而n可以是1至10的整数。
[0052] 在式(I)的肽中，l和m可以是0、1或2，而n可以是1至10的整数。
[0053] 在式(I)的肽中，X和Y可以是相同的，l可以是0，m可以是1，并且n可以是3、4、5、6、7、8、9或10。
[0054] 在式(I)的肽中，X和Y可以是相同的，l和m可以是1并且n可以是2、3、4或5。
[0055] 在式(I)的肽中，X和Y可以是相同的，l可以是1，m可以是2，并且n可以是1、2、3、或4。
[0056] 在式(I)的肽中，X和Y可以是相同的，l和m可以是2，并且n可以是1、2、3、或4。
[0057] 优选地，第一抗微生物剂包含选自聚赖氨酸和聚精氨酸的肽序列。
[0058] 在一个实施方案中，第一抗微生物剂包含聚赖氨酸。
[0059] 在替代实施方案中，第一抗微生物剂包含聚精氨酸。
[0060] 根据本发明的再一个方面，提供了第一抗微生物剂在生物膜的预防治疗中的用途。
[0061] 通常，第一抗微生物剂是如下所述的本发明的产品的形式。
[0062] 第二抗生物膜剂
[0063] 第二抗生物膜剂可以是抑制生物膜形成的任何试剂。举例来说，第二抗生物膜剂可以抑制细菌的粘附性、疏水性或粘液的产生。第二抗生物膜剂可以选自分散剂和防粘剂。
[0064] 根据本发明的一个实施方案，所述的第二抗生物膜剂不是肽。
[0065] 术语“分散剂”旨在包括能够分散生物膜的颗粒的任何试剂。特别地，分散剂可以促进由微生物例如细菌所产生的粘液、形成部分生物膜的粘膜以及生物膜微生物(例如，细菌)的分散，所述粘膜例如是通过生物膜微生物粘附至的细胞所形成的。
[0066] 分散剂可以是粘液溶解剂。粘液溶解剂可以是酶，例如脱氧核糖核酸酶、褐藻酸酶、蛋白酶和糖酶(carobohydrase)。作为另外一种选择，粘液溶解剂可以是小分子，例如诸如氨基硫醇之类的胺或者诸如乙二胺四乙酸(EDTA)之类的酸。胺可以选自乙酰半胱氨酸和半胱胺。
[0067] 术语“防粘剂”旨在包括能够抑制细胞、蛋白质和有机体(例如微生物)之间的粘附，从而预防生物膜的形成或者促进生物膜自体破坏的任何试剂。特别地，防粘剂可以预防粘附在微生物的生物膜特别是自由生活微生物(即浮游生物细胞)中遇到的所有细胞类型的表面或基底。防粘剂可以包括但不限于，乙酰透明质酸、肝素或Carbopol 934。
[0068] 第二抗生物膜剂可以是抗菌剂。抗菌剂可以是粘液溶解剂，例如具有粘液溶解性和抗菌活性的粘液溶解剂。优选地，抗菌剂是半胱胺。
[0069] 发明的产品
[0070] 本发明的产品可以包含抗微生物肽。
[0071] 优选的产品包含抗微生物肽和粘液溶解剂。
[0072] 在本发明的产品中，所述第一抗生物膜剂与所述第二抗生物膜剂的比例可以是1∶10至10∶1；一般地至少2∶1，例如至少3∶1或4∶1。根据一个实施方案，所述第一抗生物膜剂与所述第二抗生物膜剂的比例是大约1∶1。优选地，第一抗生物膜剂是阳离子肽而第二抗生物膜剂是粘液溶解剂，并且阳离子肽与粘液溶解剂的比例为2∶1至
4∶1。根据再一个实施方案，所述的比例可以是大约1∶1。
4∶1。根据再一个实施方案，所述的比例可以是大约1∶1。
[0073] 活性剂可以同时地、顺序地或者分别地来给药。活性剂可以以组合包装形式提供。组合包装可以包含本发明的产品，以及每种活性剂的同时、分别或顺序给药的说明书。对于顺序给药，可以以任何顺序给药活性剂。
[0074] 本发明产品的活性剂可以以另外包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的药物组合物来提供。该药物组合物施用于固定组合和自由组合。
[0075] 本发明的活性剂可以通过本领域技术人员已知的任何适合的途径，优选地以适用于这样的给药途径的药物组合物形式，并且采用对治疗目的有效的剂量的施用。活性化合物和组合物可以，例如经胃肠外、口服、鼻内、支气管内、肠内、皮肤、舌下、直肠、阴道、眼部或者局部给药。局部和全身给药均是预期的。
[0076] 出于胃肠外给药的目的(如本文所使用的“胃肠外”是指包括静脉、肌肉、肠、腹腔、胸骨内、皮下和关节内注射给药的形式，并且静脉输注(包括连续静脉给药)是最优选的)，可以使用丙二醇水溶液，以及相应的水溶性盐的无菌水溶液。如果必要，可以将此种水溶液进行适当缓冲，并首先使液体稀释液与足够的盐水或葡萄糖等渗。这些水溶液尤其适合于静脉、肌肉、皮下和腹腔注射的目的。在这一点上，使用的无菌水溶液通过本领域技术人员熟知的标准技术可以很容易地得到。
[0078] 作为另外一种选择，本发明的产品可以以栓剂或者阴道栓剂的形式给药，或者可以以凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏或粉末的形式局部施用。本发明的产品可以经表皮或者皮肤给药，例如通过使用皮肤贴剂、贮存或皮下注射给药。本发明的产品也可以通过肺或直肠途径给药。
[0079] 对于口服给药，药物组合物的形式可以为例如片剂、胶囊、悬液或液体的形式。药物组合物优选地以包含特定量的活性成分的计量单位的形式来制备。此种剂量单位的实例包括具有常规添加剂例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；粘合剂例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；具有崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；和润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁的胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或悬液。活性成分也可以通过注射给药，因为在组合物中，例如盐水、葡萄糖或水分可以用作适合的载体。
[0080] 本发明的产品也可以发现作为/以口服制剂应用，在口服制剂中，将所述的产品配制在载体中，所述载体例如选自膜、带、凝胶、微球、锭剂、口香糖、牙粉(dentrifices)和漱口水。
[0081] 给药的治疗活性化合物的量和采用本发明的化合物和/或组合物治疗疾病病症的剂量方案依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重、性别和身体状况、疾病的严重程度、给药的途径和频率及使用的特定化合物、以及治疗个体的药代动力学特性，因此可以有很大变化。如果通过局部给药化合物而非全身给药并且用于预防而非治疗，则化合物的剂量一般将较低。根据治疗医师的判断，必要时此种治疗可以尽可能经常给药并持续一段时间。本领域技术人员将理解，待给药的抑制剂的剂量方案或治疗有效量对于每个个体来说可能需要优化。药物组合物可以包含约0.1至2000mg，优选地为约0.5至500mg并且最优选地为约1至200mg的活性成分。约0.01至100mg/kg体重，优选地为约0.1至约500mg/kg体重并且最优选地为约1至20mg/kg体重的每日剂量是适当的。每日剂量可以以1至4次/日给药。
[0082] 优选地，将本发明的产品施用于呼吸道。因此，本发明也可以提供包含本发明的产品的气雾剂药物制剂。还提供了包含本发明的产品的雾化器或吸入器。
[0083] 此外，本发明的产品可以适合于作为缓释剂型等的制剂。所述的制剂可以如此构成以致其可能需要一段时间来将活性剂释放于例如肠道或呼吸道的特定部位。包衣、包膜和保护基质可以例如由聚合物质制备，所述聚合物质例如聚交酯-乙醇酸酯、脂质体、微乳剂、微粒、纳米颗粒或蜡。这些包衣、包膜和保护基质对于包被内置装置例如支架、导管、腹膜透析管、引流装置等是有用的。
[0084] 本发明的产品可以包括本文定义的协同有效量的各种活性剂。因此，本发明包括含有协同有效量的以下物质的产品：(i)第一抗生物膜剂；(ii)不同于第一抗生物膜剂并且通常为抗微生物肽的第二抗生物膜剂。所述的产品可以用于制备在治疗微生物感染例如生物膜感染中同时、分别或顺序给药所述试剂的药物。如本文所使用的“协同”可以描述本发明产品的两种或多种试剂一起使用以产生大于分别使用所述试剂的预期组合效果的作用。
[0085] 在本发明的又一个方面，提供了将本发明的产品应用于或者附着在其上的基底。优选地，所述基底适合施用在伤口或者递送至创伤部位。优选地，所述基底允许将本发明产品的活性剂从基底转移到创伤面以实现其抗生物膜的作用。所述基底可以是敷料，例如创伤敷料。敷料可以包含纤维材料或者其可以是胶原状材料。所述基底可以为用于涂覆伤口的任何适合的形式，通常所述基底为水凝胶、胶体、软膏、乳膏、凝胶、泡沫或喷雾剂的形式。
[0086] 本发明的产品也可以发现作为/以消毒剂或杀虫剂来使用。在这种情况下，可以将本发明的肽或药物组合物单独地或者与其他消毒剂组合涂覆于待处理的表面。如本文所使用的，“待处理的表面”可以作为本文所定义的基底并且可以包括医疗装置和内置装置，例如支架、导管、腹膜透析管、引流装置、人工关节、牙植入物等。
[0087] 方法和用途
[0088] 本发明提供了预防生物膜在环境中形成的方法，所述方法包括将根据本发明的产品给药于所述环境中的步骤。该方法可以在体内或体外。
[0089] 根据一个实施方案，所述方法包括给药抗微生物肽的步骤。
[0090] 有利地，所述方法包括给药以下药物的步骤
[0091] ●第一抗生物膜剂；和
[0092] ●不同于第一抗生物膜剂的第二抗生物膜剂；其中，第一和第二抗生
[0093] 物膜剂中的至少一种是抗微生物肽，例如阳离子肽。
[0094] 所述环境可以包含选自细菌、真菌、酵母、病毒和原生动物的任何生物膜形成微生物。
[0095] 通常，微生物是细菌，例如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。细菌性病原体可以得自选自以下的细菌种类：葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，例如金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄 球菌(Staphylococcusepidermidis)；肠球菌属(Enterococcus spp.)，例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)；李斯特菌属(Listeria spp.)；假单胞菌属(Pseudomonas spp.)；分支杆菌属(Mycobacterium spp.)，例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；肠杆菌属(Enterobacter spp.)；弯曲菌属(Campylobacter spp.)；
沙门氏菌属(Salmonella spp.)；链球菌属(Streptococcus spp.)，例如A型或B型链球菌(Streptococcus Group A or B)、肺炎链球菌(Streptoccocus pneumoniae)；
螺杆菌属(Helicobacter spp.)，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；奈瑟球菌属(Neisseria spp.)，例如淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhea)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)；伯氏疏螺旋体菌(Borrelia burgdorferi)；志贺菌属(Shigella spp.)，例如弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)；大肠杆菌(Escherichia coli)；
嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)，例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；衣原体属(Chlamydia spp.)，例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella fularensis)；芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；
梭菌属(Clostridia spp.)，例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；耶尔森菌属(Yersinia spp.)，例如鼠疫耶尔森氏杆菌(Yersinia pestis)；密螺旋体属(Treponema spp.)；伯克霍尔德菌属(Burkholderia spp.)；例如鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)和类鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei)。
沙门氏菌属(Salmonella spp.)；链球菌属(Streptococcus spp.)，例如A型或B型链球菌(Streptococcus Group A or B)、肺炎链球菌(Streptoccocus pneumoniae)；
螺杆菌属(Helicobacter spp.)，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；奈瑟球菌属(Neisseria spp.)，例如淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhea)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)；伯氏疏螺旋体菌(Borrelia burgdorferi)；志贺菌属(Shigella spp.)，例如弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)；大肠杆菌(Escherichia coli)；
嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)，例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；衣原体属(Chlamydia spp.)，例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella fularensis)；芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；
梭菌属(Clostridia spp.)，例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；耶尔森菌属(Yersinia spp.)，例如鼠疫耶尔森氏杆菌(Yersinia pestis)；密螺旋体属(Treponema spp.)；伯克霍尔德菌属(Burkholderia spp.)；例如鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)和类鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei)。
[0096] 特别地，所述细菌可以包括假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)，例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；伯克霍尔德菌属(Burkholderia spp.)，例如洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)；链球菌 属(Streptococcus spp.)；丙 酸杆菌 属(Propionibacterium spp.)，例如痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。优选地，所述细菌选自假单胞菌属
(Pseudomonas spp.)，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；和葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。
(Pseudomonas spp.)，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；和葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。
[0097] 病毒病原体可以得自选自以下的病毒：人免疫缺陷病毒(HTV 1&2)；人T细胞白血病病毒(HTLV 1&2)；埃博拉病毒；人乳头瘤病毒(例如，HPV-2、HPV-5、HPV-8、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-52、HPV-54和HPV-56)；乳多空病毒；鼻病毒；脊髓灰质炎病毒；疱疹病毒；腺病毒；EB病毒(Epstein Barr virus)；流感病毒；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒；天花病毒；轮状病毒或SARS冠状病毒。
[0098] 寄生病原体可以得自选自以下组的寄生病原体：锥虫属(Trypanosoma spp.)(克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)、布鲁斯锥虫(Trypansosoma brucei))，利氏曼原虫属(Leishmania spp.)，贾第虫属(Giardia spp.)，毛滴虫属(Trichomonas spp.)，内阿米巴属(Entamoeba spp.)，耐格里属(Naegleria spp.)，棘阿米巴属(Acanthamoeba spp.)，血吸虫属(Schistosoma spp.)，疟原虫属(Plasmodium spp.)，Crytosporidiwn spp.，等孢子球虫属(Isospora spp.)，纤毛虫属(Balantidium spp.)，罗阿丝虫(Loa Loa)，人蛔虫(Ascaris lumbricoides)，犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)，弓形虫属(Toxoplasma ssp.)例如鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)。真菌病原体可以得自具有以下属的真菌病原体：念珠菌属(Candida spp.)(例如白色念珠菌C.albicans)、表皮癣菌属(Epidermophyton spp.)、外瓶霉属(Exophiala spp.)、小孢子菌属(Microsporiim spp.)、毛癣菌属(Trichophyton spp.)(例如红色毛癣菌(T.rubrum)和指间毛癣菌(T.interdigitale))、癣属(Tinea spp.)、曲霉菌 属(Aspergillus spp.)、芽生菌属(Blastomyces spp.)、芽生裂殖菌属(Blastoschizomyces spp.)、球孢子菌属(Coccidioides spp.)、隐球菌属(Cryptococcus spp.)、组织胞浆菌属(Histoplasma spp.)、副球孢子菌属(Paracoccidiomyces spp.)、孢子丝菌属(Sporotrix spp.)、犁头霉菌属(Absidia spp.)、Cladophialophora spp.、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、瓶霉菌属(Phialophora spp.)、Lacazia spp.、节图霉属(Arthrographis spp.)、支顶孢属(Acremonium spp.)、马杜拉菌属(Actinomadura spp.)、鳞质霉属(Apophysomyces spp.)、枝虫霉属(Emmonsia spp.)、蛙粪霉菌属(Basidiobolus spp.)、白僵菌属(Beauveria spp.)、金小孢子属(Chrysosporium spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、地丝菌属(Geotrichum spp.)、粘束孢霉属(Graphium spp.)、小球腔菌属(Leptosphaeria spp.)、马拉色霉菌属(Malassezia spp.)、毛霉菌属(Mucor spp.)、新龟甲属(Neotestudina spp.)、奴卡菌属(Nocardia spp.)、诺卡土壤菌属(Nocardiopsis spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、茎点霉属(Phoma spp.)、毛结节菌属(Piedraia spp.)、肺囊虫属(Pneumocystis spp.)、假霉样真菌属(Pseudallescheria spp.)、棘壳孢属(Pyrenochaeta spp.)、根毛霉菌属(Rhizomucor spp.)、根霉菌属(Rhizopus spp.)、红酵母属(Rhodotorula spp.)、酵母菌属(Saccharomyces spp.)、丝孢菌属(Scedosporium spp.)、帚霉属(Scopulariopsis spp.)、掷孢酵母属(Sporobolomyces spp.)、共头霉属(Syncephalastrum spp.)、木霉属(Trichoderma spp.)、丝孢酵母属(Trichosporon spp.)、单格孢属(Ulocladium spp.、黑粉菌属(Ustilago spp.)、轮枝孢属(Verticillium spp.)、瓶霉属(Wangiella spp)。
[0099] 根据又一个实施方案，所述微生物是真菌，尤其是念珠菌属。
[0100] 本发明的方法可以用于将生物膜在多种环境中的形成最小化并且优选地，预防生物膜在多种环境中的形成，所述环境包括但不限于：家居、工作场所、实验室、工业环境、水生环境(例如，流水线系统)、医疗装置、动物体例如人体，所述医疗装置包括诸如本文所定义的内置装置、牙科装置或牙植入物。
[0101] 因此，本发明的方法可以用于口腔从而预防在人牙齿上或者牙植入物例如假牙上形成牙菌斑或龋齿。
[0102] 本发明的方法可以用于预防或限制在人体尤其是在微生物感染的治疗中生物膜的形成。与生物膜感染有关的状况可以包括局部感染、口腔感染和全身感染。局部感染可以包括，创伤、溃疡和损害，例如诸如切口或烧伤之类的皮肤创伤，以及与其有关的病症。
[0103] 口腔感染可以包括牙龈炎、牙周炎和粘膜炎。
[0104] 全身感染可以包括与粘膜感染有关的囊性纤维化和其他状况，例如胃肠道感染、泌尿生殖道感染或呼吸道感染。
[0105] 本发明的又一个方面在于通过向哺乳动物给药治疗有效量的本发明的产品，治疗、预防或推迟哺乳动物尤其是人类中与微生物生物膜感染的存在有关的疾病或病症的进展。
[0106] “有效”量或者“治疗有效量”意思是在正确医学判断的范围内，足以提供期待的效果，而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或者其他与合理的受益/风险比相当的问题或并发症的一种或多种活性物质的量。
[0107] 根据本发明的一个方面，所述方法包括给药抗微生物肽的步骤。
[0108] 有利地，所述方法包括给药以下药物的步骤：
[0109] ●第一抗生物膜剂；和
[0110] ●不同于第一抗生物膜剂的第二抗生物膜剂；其中，第一和第二抗生物膜剂中的至少一种是抗微生物肽，例如阳离子肽。
[0111] 本发明还提供了本发明的产品在制备用于通过以上列出的活性剂的组合的预防或治疗法来治疗微生物感染尤其是微生物生物膜感染中的药物中的用途。
[0112] 此外，本发明提供了以上所描述的抗微生物肽在制备用于通过预防或治疗法来治疗微生物感染尤其是微生物生物膜感染中的药物中的用途。
[0113] 因此，本发明的产品可以用于疾病或病症的预防、进展的推迟或治疗，所述的疾病或病症选自皮肤和伤口感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、牙菌斑的形成、眼部感染(包括隐形眼镜污染)、心内膜炎、囊性纤维化中的感染和如本文所述的内置医疗装置的感染。
[0114] 本发明还包括治疗方法，其中将本发明的产品和一种或多种其他抗菌剂例如抗生素一起给药哺乳动物。
[0115] 本发明人出人意料地发现，某些分散剂，特别是粘液溶解剂抑制生物膜持留细胞的生长。因此，本发明也包括治疗/预防生物膜在环境中形成的方法，该方法包括向所述环境中给药粘液溶解剂，例如半胱胺。所述粘液溶解剂可以单独地或者与另一种抗微生物剂例如抗微生物肽联合给药。
[0116] 本发明另外提供了通过预防或治疗法来治疗微生物感染尤其是微生物生物膜的方法，该方法包括给药治疗有效量的分散剂，尤其是粘液溶解剂例如半胱胺。
[0117] 本发明还提供了分散剂，尤其是粘液溶解剂例如半胱胺在制备用于治疗微生物感染尤其是微生物生物膜感染的药物中的用途。
[0118] 在本说明书中所述的活性剂可以以不同的形式存在，例如游离酸、游离碱、酯以及例如其他前体药物、盐和互变异构体，并且本发明包括所述试剂的所有不同形式。
[0120] 除非与其不匹配，与本发明的具体方面、实施方案或实例结合描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例。
[0121] 在本文的整个说明书和权利要求书中，单词“包含”和“含有”以及其变型，例如“包含(comprising)”和“包括(comprises)”是指“包括但不限于”，并且不是为了(也不是)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。
[0122] 一般来说，术语“大约”意欲涵盖应用于其上的10％或小于10％的任何数值范围。
[0123] 在以下的说明书和权利要求书中记载了本发明的再一个方面和实施方案。
[0125] 图1：NP108和NM001(半胱胺)抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCCBAA-47浮游生物细胞的抗菌活性
[0126] 图2：NP108和NM001(半胱胺)联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47浮游生物细胞的抗菌活性
[0127] 图3：NP108和NM001(半胱胺)抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM11729浮游生物细胞的抗菌活性
[0128] 图4：NP108和NM001(半胱胺)联合抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM 11729浮游生物细胞的抗菌活性
[0129] 图5：NP339抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生物膜细胞的活性
[0130] 图6：NP339抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的持留细胞的活性
[0131] 图7：NP341抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生物膜细胞的活性
[0132] 图8：NP341抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的持留细胞的活性
[0133] 图9：NM001(半胱胺)抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生物膜细胞的活性[0134] 图10：NM001(半胱胺)抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的持留细胞的活性[0135] 图11：NP108和NM001(半胱胺)联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47生物膜细胞的抗菌活性
[0136] 图12：NP108和NM001(半胱胺)抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47持留细胞的抗菌活性
[0137] 图13：NP108和NM001(半胱胺)联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47持留细胞的抗菌活性
[0138] 图14：NP339和NM001(半胱胺)联合抗(a)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)DSM1128、(b)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47、(c)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)DSM 1299、和(d)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC27853生物膜细胞的抗菌活性
[0139] 图15：NP339和NM001(半胱胺)联合抗(a)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)DSM1128和(b)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47持留细胞的抗菌活性
[0140] 图16：NP108和NM001(半胱胺)抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM11729生物膜细胞的抗菌活性
[0141] 图17：NP108和NM001(半胱胺)联合抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM 11729生物膜细胞的抗菌活性
[0142] 图18：NP108和NM001(半胱胺)抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM11729持留细胞的抗菌活性
[0143] 图19：NP108和NM001(半胱胺)联合抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM 11729持留细胞的抗菌活性
[0144] 图20和图21：粘液溶解剂N-乙酰半胱氨酸(图20(a)和图20(b))和NM001(半胱胺)(图21(a)和图21(b))单独地以及与NP341联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)27853浮游生物细胞的活性
[0145] 图22a：24小时后未治疗的对照金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0146] 图22b：采用NM001(半胱胺)以2mg/ml治疗后24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0147] 图22c：采用粘菌素以0.2mg/ml治疗后24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0148] 图22d：采用肽NP108以2mg/ml治疗后24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0149] 图23a：24小时后未治疗的对照金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0150] 图23b：采用NM001(半胱胺)以2mg/ml治疗后24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0151] 图23c：采用粘菌素以0.2mg/ml治疗后24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0152] 图23d：采用肽NP108以2mg/ml治疗后24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜
[0153] 图24a：24小时后未治疗的对照铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0154] 图24b：采用NM001(半胱胺)以2mg/ml治疗后24小时的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0155] 图24c：采用粘菌素以0.2mg/ml治疗后24小时的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0156] 图24d：采用肽NP108以2mg/ml治疗后24小时的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0157] 图25a：24小时后未治疗的对照铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0158] 图25b：采用NM001(半胱胺)以2mg/ml治疗后24小时的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0159] 图25c：采用粘菌素以0.2mg/ml治疗后24小时的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0160] 图25d：采用肽NPl08以2mg/ml治疗后24小时的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生物膜
[0161] 图26：NP432单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1生物膜的活性
[0162] 图27：NP445单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1生物膜的活性
[0163] 图28：NP458单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1生物膜的活性
[0164] 图29：NP462单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1生物膜的活性
[0165] 图30：NP432单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923生物膜的活性
[0166] 图31：NP445单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923生物膜的活性
[0167] 图32：NP458单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923生物膜的活性
[0168] 图33：NP462单独地和与NM001(半胱胺)联合或者与NP108联合抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923生物膜的活性
[0169] 表1：试验的抗微生物剂抗革兰氏阴性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株和革兰氏阳性葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)的活性的汇总
[0170] 表2：试验的抗微生物剂抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的活性的汇总
[0171]
[0172]
[0173]实施例
[0174] 抗微生物剂抗细菌生物膜的活性
[0175] 材料和方法
[0176] 1.1细菌菌株
[0177] 在本研究中使用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、铜绿假单胞菌BAA-47(PAO1)、铜绿假单胞菌DSM1128、铜绿假单胞菌DSM1299和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC35984、表皮葡萄球菌ATCC12228、金黄色葡萄球菌(S.aureus)25923以及甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌DSM 11729(MRSA)(DSMZ，Braunschweig，Germany)。得到四株铜绿假单胞菌临床分离株(NH57388A-D，Hoffmann等人，2005，2007)并将其用于抗微生物敏感性试验。
[0178] 1.2抗微生物化合物的制备
[0179] 本研究中试验的抗微生物剂是阳离子肽NP108，该阳离子肽NP108相当于10-20kDa聚-L-赖氨酸、氢溴化物和半胱胺(NM001)。两种试剂均得自
Sigma-Aldrich(Gillingham，UK)，而20mg/ml的储备溶液用14-18MΩ.cm纯水(Purite HP40water purification system，Oxon，UK)来制备。一旦溶解，使用0.22μm的过滤器(Millipore，Watford，England)来过滤消毒制剂并在-20℃下储存。
Sigma-Aldrich(Gillingham，UK)，而20mg/ml的储备溶液用14-18MΩ.cm纯水(Purite HP40water purification system，Oxon，UK)来制备。一旦溶解，使用0.22μm的过滤器(Millipore，Watford，England)来过滤消毒制剂并在-20℃下储存。
[0180] 还研究了以下的NovaBiotics抗微生物肽
[0181]
[0182]
[0183] NovaBiotics抗微生物肽采用Fmoc合成法通过NeoMPS(Strasbourg，France)合成并且纯度至少为95％。
[0184] 1.3细菌接种物的制备
[0185] 通过稀释法从Mueller-Hinton肉汤中活跃生长的培养物确立细菌接种物，所述的Mueller-Hinton肉汤利用如CLSI法M26-A中所描述的0.5McFarland浊度标准进行标准化。
[0186] 1.4最小抑菌浓度(MIC)的测定
[0187] 为了测定预防生物膜的形成，将细菌接种物和抗微生物剂同时加入到平板中。在37℃下培养平板24小时并在625nm下读出微滴定平板阅读器(microtitre plate reader)(BioTek Powerwave XS，Winooski，USA)上的光密度值。MIC作为显示细菌生长总体抑制的抗微生物剂的最低浓度来获得。
[0188] 1.5部分抑菌浓度(FIC)的测定
[0189] FIC相当于表示抗微生物剂的联合是否是协同、加和、拮抗或中和的相互作用系数(interaction coefficient)。通过比较试剂联合(试剂A和试剂B的MIC)的活性与单个试剂(试剂A或试剂B的MIC)的活性来测定FIC如下(Singh等人，2000)：
[0190] FIC＝MICA[联合]/MICA[单独]+MICB[联合]/MICB[单独]
[0191] FIC指数为1表明两种抗微生物剂的加和联合，而FIC指数＜1表明两种抗微生物剂的协同联合。中和联合将得到FIC在1至4，FIC指数大于4表明两种抗微生物剂之间的拮抗作用。
[0192] 可以计算FIC以评估两种抗微生物剂联合与细菌生物膜的相互作用。用MBEC代替MIC，适用相同的公式。
[0193] 1.6最小生物膜去除浓度(MBEC)的测定
[0194] 将总计100μl体积的Mueller-Hinton中细菌接种物加入到96孔板(测试平板challenge plates)的每个孔中并在37℃下，以24rpm，在gyrorotary震动平台(gyrorotary shaking platform)(Grant-bio PS-3D，Shepreth，England)上培养该平板24小时以便于生物膜形成。
[0195] 然后用无菌PBS(1x)冲洗测试平板一次，并将Mueller-Hinton中抗微生物剂的2倍系列稀释液加入到测试平板中。在37℃下，以24rpm，在gyrorotary震动平台(Grant-bio PS-3D，Shepreth，England)上培养测试平板24小时。
[0196] 将每个测试平板中的上清液转移至新的平板中并在625nm下测定微滴定平板阅读器(BioTek Powerwave XS，Winooski，USA)上的光密度值。通过不显示细菌生长的抗微生物的最小浓度来获得MBEC。
[0197] 1.7生物膜中持留细胞的估计
[0198] 在测试平板中的上清液转移之后，用无菌PBS(1x)冲洗生物膜一次，并将无菌PBS(1x)中含有4μM SYTO9和20μM碘化丙啶(PI)的100μlBacLight活/死的荧光染色溶液(Invitrogen，Paisley，UK)加入到测试平板的每个孔中。平板在室温下在黑暗中培养15分钟，并且分别在SYTO9和PI荧光分别为485(ex)/528(em)和485(ex)/645(em)下读出灵敏度设为50并选择底部光学位置的荧光微滴定平板阅读器(BioTek Synergy HT，Winooski，USA)上的荧光。用Axiovert 40荧光显微镜(Zeiss，Gottingen，Germany)直接观察生物膜从而鉴定活的和死的细菌的存在，并以100至400倍的放大倍数对生物膜拍照。
[0199] 持留细胞的相对生存力通过活/死荧光测量比测定，并使用显微观察以确认活细胞的存在与否。
[0200] 2结果
[0201] 2.1生物膜形成的预防
[0202] 为了评估通过革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌来预防生物膜形成，将细菌接种物和抗微生物剂同时加入到平板中。针对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌，抗微生物剂的浓度范围在0-500μg/ml NP108和0-320μg/ml半胱胺，而针对革兰氏阳性菌MRSA，抗微生物剂的浓度范围在0-1000μg/ml NP108和0-320μg/ml半胱胺。
[0203] 2.1.1抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47的活性
[0204] NP108的MIC是62.5μg/ml，而半胱胺的MIC是320μg/ml。NP108在250μg/ml具有杀菌性，而半胱胺在高达320μg/ml下无杀菌性(数据未显示)。
[0205] 在160μg/ml半胱胺的存在下，将NP108的MIC减小至31.25μg/ml。当使半胱胺的浓度加倍(即320μg/ml)，而不考虑NP108的浓度时，没有观察到生长。
[0206] 该联合的FIC的测定表明抗微生物剂具有加和作用(FIC＝1)。此外，在125μg/ml NP108和320μg/ml半胱胺的存在下获得杀菌活性(数据未显示)，其证实了这些试剂的加和作用。
[0207] 2.1.2抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM 11729的活性
[0208] NP108的FIC是125μg/ml，而半胱胺的FIC是大于320μg/ml。NP108在125μg/ml具有杀菌性，而半胱胺在高达320μg/ml下无杀菌性(数据未显示)。
[0209] 对于NP108的任何给定浓度而言，增加半胱胺的浓度显示较高的生长抑制。在40μg/ml半胱胺的存在下，将NP108的FIC降低至31.25μg/ml，而当加入320μg/ml半胱时，将NP108的FIC降低至15.625μg/ml。
[0210] 该联合的FIC的测定表明抗微生物剂至少具有加和作用(FIC＜1)。此外，在31.25μg/ml NP108和≥160μg/ml半胱胺以及62.5μg/ml NP108和≥80μg/ml半胱胺的存在下获得杀菌活性(数据未显示)，其证实了这些试剂的加和作用。
[0211] 附录1显示了短的线性精氨酸肽(NP339、NP340、NP341和NP352)抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM 11729浮游生物细胞的时间过程活性。
[0212] 附录2提供了NP108、半胱胺、NP108与半胱胺两种化合物的联合以及NP339和NP341抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM 11729和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)BAA-47浮游生物细胞的活性的汇总。
[0213] 2.2形成的生物膜的破坏
[0214] 使用24小时龄的生物膜，对NP108和半胱胺抗细菌生物膜的活性进行评估，而且还测定了两种化合物联合的活性。抗微生物剂抗细菌生物膜的活性通过其抗生物膜细胞和抗持留细胞的活性来测定。
[0215] 2.2.1NP339抗细菌生物膜的活性
[0216] 图5显示了NP339抗3种葡萄球菌属细菌的生物膜的高活性，产生156至625μg/ml的MBEC。由于微生物生物膜的复杂性和异质性，最高剂量下NP339抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)25923的光密度值的增加很可能是人为现象。相反，NP339减慢了铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)BAA-47(PAO1)的生长，但即使试验的最高剂量(即5mg/ml)也不足以抑制100％的生物膜细胞。
[0217] 图6提供了NP339具有抗持留细胞活性的证据。与NP339抗试验的4种菌株的生物膜细胞的活性不同，与抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)BAA-47(PAO1)的持留细胞相比，NP339对于抗葡萄球菌属细菌的持留细胞具有较低的活性。NP339在625μg/ml下能够抑制铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)BAA-47(PAO1)持留细胞的生存力。
[0218] 2.2.2NP341抗细菌生物膜的活性
[0219] 与NP339(图5)类似，NP341显示了生物膜细胞生存力的显著性降低。MRSA 11729和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)12228的MBEC为625μg/ml。NP341使MRSA 11729和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)BAA-47(PAO1)的生物膜细胞的生存力降低了2至3倍的因子。
[0220] 如采用NP339所观察到的，在625μg/ml NP341下铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)持留细胞的生存力被完全抑制。3种葡萄球菌属细菌的持留细胞的生存力减少了25％至50％。
[0221] 2.2.3半胱胺抗细菌生物膜的活性
[0222] 图9提供了以下的证据，即半胱胺具有抗试验的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生物膜细胞的抗微生物活性。
[0223] 图10显示了半胱胺具有抗试验的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的持留细胞的活性。
[0224] 这里提供的结果显示，线性短阳离子肽NP339和NP341抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生物膜的抗微生物活性。这些化合物显现出对于抗革兰氏阳性菌的生物膜细胞比对于抗革兰氏阴性菌的生物膜细胞更加有效，而其抗持留细胞则与此相反。半胱胺显示了在高浓度下抗生物膜细胞的活性，然而，在试验的最低浓度(即6.25mg/ml)下其抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性持留细胞的生存力。
[0225] 2.2.4NP108和半胱胺联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCCBAA-47的活性[0226] 这两种抗微生物剂的联合在250μg/ml NP108和62.5至500μg/ml半胱胺的情况下，显示了细菌生长的完全抑制作用。将31.25μg/ml半胱胺加入到500μg/ml NP108中具有类似效果，而31.25μg/ml半胱胺加250μg/mlNP108仅显示了细菌生长的部分抑制作用。
[0227] 用那些MBEC值(MBECNP108[单独]＞500μg/ml、MBECNP108[联合]＝250μg/ml、MBEC半胱胺[联合]＝62.5μg/ml、MBEC半胱胺[单独]＝＞100,00μg/ml)得到的FIC为～0.5，表明这两种抗微生物剂之间的协同作用。这与从NP108/半胱胺联合抗浮游生物细胞中得到的观察结果一致(图2)。
[0228] 利用荧光染色法对NP108和半胱胺抗持留细胞的活性进行了评估从而测定细胞的相对生存力。使用的核酸结合荧光分子是SYTO9和PI，SYTO9和PI分别穿透所有的细菌细胞(绿色荧光)和膜破坏细胞(红色荧光)。因此，发射的绿色(活的)/红色(死的)荧光比给出了细菌群体的相对生存力的指示并且用于评估生物膜内相应于持留细胞的剩余活细胞的存在。
[0229] 图12显示了用NP108或半胱胺治疗的生物膜的相对生存力依然显著，表明这些化合物缺乏抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47的持留细胞的活性。
[0230] 图13提供了以下的证据，即与单独的化合物(图12)相比，NP108和半胱胺的联合显示了较高的抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCCBAA-47的持留细胞的活性。抗这些细胞的最有效的联合是250-500μg/mlNP108和62.5-500μg/ml半胱胺。这些联合显示了在生物膜之内的最低的相对生存力。31.25μg/ml NP108和500μg/ml半胱胺得到类似的结果，而采用250μg/ml半胱胺仅观察到部分抑制作用。
[0231] 这些化合物抗持留细胞的活性显示了与抗生物膜细胞得到的最佳联合的曲线的相似性(图11)。此外，荧光染色的生物膜的直接显微镜观察结果证实了这些联合抗持留细胞的活性，因为在250-500μg/ml NP108和62.5-500μg/ml半胱胺的情况下没有观察到活细胞(数据未显示)。
[0232] 2.2.5NP339和半胱胺的联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的活性
[0233] 图14(a)-(d)显示了NP339的3个浓度：1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml与增加至高达10mg/ml浓度的半胱胺相联合的抗铜绿假单胞菌的4个菌株的活性。
[0234] 这些数据清楚地证实了NP339与半胱胺联合的抗铜绿假单胞菌生物膜细胞的抗微生物活性的增加。下面的图显示了这些联合抗这些菌株中的2个的持留细胞的活性的实例。
[0235] 图16显示了NP108和半胱胺抗金黄色葡萄球菌(S.epidermidis)DSM11729生物膜细胞的活性。半胱胺的MBEC是250μg/ml，而NP108在125μg/ml时抑制那些细胞的生长。
[0236] NP108和半胱胺的联合在31.25μg/ml NP108和62.5μg/ml半胱胺的情况下显示了细菌生长的完全抑制作用，而采用较低浓度的任一种化合物显示部分抑制作用(图17)。因此，用那些MBEC(MBECNP108[单独]125μg/ml、MBECNP108[联合]＝31.25μg/ml、MBEC半胱胺[单独]＝
250μg/ml、MBEC半胱胺[联合]＝62.5μg/ml)得到的FIC为0.5，从而表明这两种抗微生物剂之间抗这些革兰氏阳性菌的生物膜的协同作用。对于革兰氏阴性菌，观察到类似结果(图
11)。该结果还与从NP108/半胱胺联合抗金黄色葡萄球菌(S.epidermidis)DSM11729浮游生物细胞的活性中得到的观察结果相一致(图4)。
250μg/ml、MBEC半胱胺[联合]＝62.5μg/ml)得到的FIC为0.5，从而表明这两种抗微生物剂之间抗这些革兰氏阳性菌的生物膜的协同作用。对于革兰氏阴性菌，观察到类似结果(图
11)。该结果还与从NP108/半胱胺联合抗金黄色葡萄球菌(S.epidermidis)DSM11729浮游生物细胞的活性中得到的观察结果相一致(图4)。
[0237] 与观察到的缺乏抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC BAA-47持留细胞的活性类似(图12)，用NP108或半胱胺治疗的金黄色葡萄球菌(S.epidermidis)DSM 11729生物膜的相对生存力依然显著，表明这些化合物在低浓度下缺乏抗这些革兰氏阳性菌的持留细胞的活性(图18)。
[0238] 与单独的化合物(图19)相比，NP108和半胱胺的联合显示了较高的抗金黄色葡萄球菌DSM 11729的持留细胞的活性。抗这些细胞的最有效的联合是250-500μg/ml NP108和125-250μg/ml半胱胺。这些联合显示了在生物膜之内的最低的相对生存力。62.5μg/ml NP108和500μg/ml半胱胺得到类似的结果。与较低浓度的两种化合物中的任一种联合显示了在生物膜内的高的相对生存力。
[0239] 与革兰氏阴性持留细胞不同，荧光染色的金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM 11729生物膜的直接显微观察结果显示，在NP108和半胱胺的最高联合浓度下存在残留活细胞(数据未显示)。
[0240] 表1提供了短的精氨酸肽NP339、NP341、聚-L-赖氨酸NP108、半胱胺和NP108与半胱胺的联合抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性的汇总
[0241] 表1：试验的抗微生物剂抗革兰氏阴性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株和革兰氏阳性葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)的活性的汇总。括号内的数字表示试验菌株的最大数量。MIC：最小抑菌浓度；MBEC：最小生物膜去除浓度；FIC：部分抑菌浓度。
[0242]
[0243] 注释：
[0244] 1-附录1显示了经试验的短精氨酸抗微生物剂抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)DSM11729的MIC。
[0245] 2-附录2显示了粘液溶解剂半胱胺和N-乙酰半胱氨酸与NP341联合抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC27853的活性。
[0246] 附录1：数据(未显示)证实了短的线性精氨酸肽在48小时内抗甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)DSM 11729的浮游生物细胞的活性。如在图例中所显示的经试验的浓度范围是mg/ml。数据(未显示)证实了短的线性精氨酸肽在48小时内抗甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)DSM 11729的浮游生物细胞的活性。时间过程活性证实了细菌生长抑制与抗微生物剂的剂量以及暴露于细胞中的时间有关。NP339、NP340和NP352在上述的0.5mg/ml浓度下，在48小时观察到完全的杀菌活性；在0.125和0.25mg/ml浓度下，在至少24小时显示完全抑制，而在较低浓度例如0.06和0.03mg/ml下，分别在至少20小时和15小时显示完全抑制。采用NP341，除了0.25mg/ml下在48小时显示完全抑制外，得到相似结果。
[0247] 附录2：然而，与3-6mg/ml的N-乙酰半胱氨酸联用，仅需要205μg/ml的NP341便可达到MBEC(图20a)。观察到类似的这两种化合物的联合抗持留细胞的活性增加：1024μg/ml NP341+3128μg/ml N-乙酰半胱氨酸抑制大约75％的持留细胞，该数值远远大于两种化合物中任一种单独使用获得的抑制(图20b)。
[0248] 与单独使用每一种化合物相比，半胱胺或N-乙酰半胱氨酸与NP341的联合显示抗菌活性增加。单独使用NP341抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC27853的MBEC大于2mg/ml，而单独使用半胱胺则大于100mg/ml(图21a)。这表明，对于抗铜绿假单胞菌ATCC27853的生物膜细胞，两种化合物之间无协同作用。然而，对于抗持留细胞，观察到这样的协同作用：205μg/ml NP341+3mg/ml半胱胺抑制大约75％的持留细胞，其远大于两种化合物中任一种单独使用的抑制效果(图21b)。
[0249] 当与NP339联合使用时，我们观察到即使加入少量的半胱胺也有助于降低NP339的MBEC值(图14a-d)。更有趣的是，NP339和半胱胺的联合也显示抗铜绿假单胞菌DSM1128和铜绿假单胞菌BAA-47的持留细胞的活性增加(图15a-b)。
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