一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用
阅读：894发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2。本发明还公开了所述蛋白的核酸分子，以及所述核酸分子的重组载体、宿主细胞或重组菌。还公开了所述蛋白以及所述核酸分子及其重组载体、宿主细胞或重组菌等在调控 植物 抗虫性、杀虫或提高转基因植物抗虫性和制备 杀虫剂 或防虫害制剂中的应用。体外实验证明改造合成的Bt基因产毒蛋白对玉米螟有显著的杀虫效果。本发明利用组成型启动子构建了新的植物表达载体，抗虫基因mCry1Ia2能够在单子叶植物中稳定高效表达，进而用于生产抗虫转基因植物。，下面是一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2，是如下(a)-(d)中任一种蛋白质：
(a)其氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列；
(b)其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；
(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质；
(d)与(a)或(b)限定的蛋白质至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有
95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有抗虫功能的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下1)-4)中任一所述核酸分子：
1)编码区包括序列表中序列1所示的核酸分子；
2)编码区由序列表中序列1所示的核酸分子组成；
3)与1)或2)限定的核酸序列杂交且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子；
4)与1)或2)限定的核酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有
85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子。
4.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是通过将密码子优化后的Cry1Ab的第一、第二功能结构域1392bp和Cry1F的第三功能结构域453bp和Cry1Ie一个长
2157bp的三个功能结构域片段拼接在一起，形成六个结构域的新核苷酸序列并命名为mCry1Ia2。
5.含有权利要求2-4任意一项所述核酸分子的重组载体、宿主细胞或重组菌。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求2-4任意一项所述核酸分子或权利要求5所述重组载体、宿主细胞或重组菌在调控植物抗虫性中的应用；
或，权利要求1所述蛋白、权利要求2-4任意一项所述核酸分子或权利要求5所述重组载体、宿主细胞或重组菌在杀虫中的应用；
或，权利要求1所述蛋白、权利要求2-4任意一项所述核酸分子或权利要求5所述重组载体、宿主细胞或重组菌在提高转基因植物抗虫性中的应用；
或权利要求1所述蛋白、权利要求2-4任意一项所述核酸分子或权利要求5所述重组载体、宿主细胞或重组菌在制备杀虫剂或防虫害制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为农作物、果树或蔬菜。
8.一种杀虫剂或防虫害制剂，其活性成分为权利要求1所述蛋白、权利要求2-4任意一项所述核酸分子或权利要求5所述重组载体、宿主细胞或重组菌。
9.一种提高植物抗虫性的方法，其特征在于，包括如下步骤：提高植物中编码权利要求
1所述蛋白的DNA分子的表达量或活性，获得转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。
10.一种培育抗虫性提高转基因植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：提高植物中编码权利要求1所述蛋白的DNA分子的表达量或活性，获得转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。
一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其广泛存在于水、土壤、沙漠、树叶、昆虫尸体中，是现今产量最大、使用最广的生物杀虫剂。它在形成孢子时可以形成杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)，又称δ-内毒素，可以对鳞翅目和鞘翅目等农业害虫产生特异性的杀虫活性。其作用过程包括昆虫体吞食原毒素、原毒素酶解与活化、毒素穿过围食膜、毒素与特定受体结合、毒素分子嵌入表皮细胞膜、形成离子通道、中肠细胞的离子失衡后细胞裂解。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。
[0003] Whiteley和Schnepf于1985年发表了从苏云金芽孢杆菌中克隆得到的cry基因核苷酸序列。随着不断发现新的Bt菌株以及Bt基因的克隆，Bt家族的成员不断增多，根据数据库(www.lifesci.sussex.ac.uk)最新更新数据统计，目前在分离得到的Bt菌株中已经识别并且命名了975个杀虫蛋白基因，包括789个Cry基因，38个Cyt基因以及142个Vip基因。通过将Bt基因导入植物中来培育抗虫转基因作物，是Bt基因的主要应用方向。根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站的数据统计发现，通过安全评价Bt基因的转化事件共有345个，其中玉米转化体事件通过审批的有255个。
[0004] 孟山都和迪卡公司于1990年获得了结实正常的转Bt基因玉米。1993年，Koziel等研发出转cry1Ab基因玉米，Michael等通过改造cry1Ab基因获得的转基因玉米株系对玉米螟具有较高抗性。1996年，美国开始商业化种植转基因抗虫玉米。1997年，美国正式批准了4个转Bt基因玉米品种可进行销售，包括由孟山都公司推出mon810，Syngenta公司推出的bt176、bt11，以及迪卡公司的DBT418，其防治对象均为玉米螟，该年抗虫转基因玉米的种植面积达到320万hm2。地老虎、玉米根叶甲等地下害虫同样影响玉米产量，因此孟山都公司推广防治地下害虫“mon863”(cry3Bb)，并获得了可以同时对玉米螟和地下害虫有防治效果的抗虫玉米“mon863×mon810”。2007和2008年，先正达公司推出了防治鳞翅目害虫和地下害虫的mir604(cry3A)和mir162(Vip3Aa)。又分别在2011年和2012年推出了双基因的“bt11×GA21×mir162”和三基因的“bt11×mir162×mir604×GA21”抗虫玉米。
[0005] 我国对于抗虫转基因玉米的研究起步较晚，但近年来取得很大进展，获得了多个遗传稳定且抗虫性状比较好的转化体及转基因杂交组合。王国英等(1995年)采用基因枪法将pB48.415质粒转入玉米愈伤组织中并获得转基因植株，鉴定后发现其具有一定抗虫性。张莉萍等(2003年)将改造的Bt、SCK、SCK与Bt双价抗虫基因通过基因枪法转入玉米自交系R18中，获得了大量转基因植株。张艳贞等(2004年)采用农杆菌介导法将Bt基因导入玉米自交系4112和丹340中，通过分子检测方法，证明外源基因在玉米基因组上已稳定整合，平均转化率达到2.35％。李余良等(2005年)在玉米自交系S1中转入Bt和GNA基因，获得能够同时扩增出两个目的基因的株系，进行室内抗虫鉴定发现其表现较强的抗性。谢树章等(2015年)通过密码子优化的方法获得GmCry1F基因，并转入到玉米材料中，为抗虫品种培育提供了新材料。王阳等(2016年)将Cry1Ab的结构域与Cry1Ial结构域互换后进行密码子优化并转入玉米中，获得了遗传稳定的抗玉米螟新种质。中国农业大学利用自主产权的抗虫基因mCry1Ac培育出优良转化体Bt-799，田间心叶期接虫条件下转基因抗虫玉米Bt-799表现高抗亚洲玉米螟。2019年12月，北京大北农生物技术有限公司转Cry1Ab基因的DBN9936抗虫玉米，以及杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学转cry1Ab/cry2Aj的双抗12-5玉米分别获得安全证书审批。
[0006] 转基因作物中应用最多的是Cry1Ab，是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒杀作用的伴胞晶体，其在生物防治领域具有重要的应用前景。苏云金杆菌δ-内毒素基因Cry1Ab来源于微生物，但其转基因植物存在表达量低、表达产物不稳定、抗虫性效果差等问题。通过改造碱基序列提高GC含量能提高其在转基因植物中的表达量，达到杀虫目的(Koziel，1993)。一般认为Bt蛋白的结构域Ⅰ参与孔道的形成，结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合，结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。室内研究表明，亚洲玉米螟Cry1F抗性品系对Cry1Ab和Cry1Ac杀虫蛋白有中等的交互抗性，但与Cry1h或Cry1Ie没有交互抗性，将Cry1F与Cry1h或Cry1Ie进行叠加，可以作为延缓亚洲玉米螟对Bt蛋白产生抗性的策略(Wang et al.,2016)。进一步的研究表明，Cry1Ie与Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry1h没有交互抗性，可以与这些蛋白进行叠加，延缓Bt蛋白产生抗性(Wang et al.,2017)。
[0007] 玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，当前玉米虫害(以玉米螟为主)严重，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。由于缺乏合适的抗虫品种，目前解决虫害的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂；但是化学杀虫剂同时杀死害虫及其天敌，造成生态不平衡和环境污染。通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。单一的抗虫基因使用又往往会使玉米螟对Bt蛋白产生抗性。因此，应用新的抗虫基因组合、提高杀虫蛋白的表达量以及培育新型抗虫转基因玉米是解决上述问题的最有效途径之一。
发明内容
[0008] 为了培育新型抗虫作物，本发明的目的在于提供一种人工合成抗虫蛋白mCry1Ia2。
[0009] 本发明的另一个目的是提供编码上述蛋白的核酸分子。
[0010] 本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组载体、宿主细胞或重组菌。
[0011] 本发明的另一个目的是提供上述蛋白在调控植物抗虫性、杀虫或提高转基因植物抗虫性中的应用。
[0012] 本发明的进一步目的是提供上述蛋白在制备杀虫剂或防虫害制剂中的应用。
[0013] 本发明的进一步目的是提供一种提高植物抗虫性的方法。
[0014] 本发明的进一步目的是提供一种培育抗虫性提高转基因植物的方法。
[0015] 为了实现本发明目的，本发明提供方案如下：一种抗虫基因mCry1Ia2，通过三种对鳞翅目害虫具有高毒力的cry1Ab、cry1F和cry1Ie基因人工优化、改造并合成新的DNA序列，以利用植物偏好的密码子序列，提高抗虫基因在转基因过程中的转化成功率，同时提高在转基因植物中的表达量和稳定表达的特性，通过三基因、六个结构域的组合应用延缓亚洲玉米螟对Bt蛋白产生抗性并提高基因的杀虫活性
[0016] 首先，本发明提供的一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2，是如下(a)-(d)中任一种蛋白质：
[0018] (b)其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；
[0019] (c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗虫功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质；
[0020] (d)与(a)或(b)限定的蛋白质至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有抗虫功能的蛋白。
[0021] 序列2为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0022] 上述(b)中的mCry1Ia2蛋白可先合成其编码基因(序列1)，再进行生物表达得到。上述(b)中的mCry1Ia2蛋白的编码基因可通过将序列1的第1-4002位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
[0023] 本发明的还提供了编码上述蛋白的核酸分子，命名为基因mCry1Ia2。
[0024] 所述核酸分子为如下1)-4)中任一所述核酸分子：
[0025] 1)编码区包括序列表中序列1所示的核酸分子；
[0026] 2)编码区由序列表中序列1所示的核酸分子组成；
[0027] 3)与1)或2)限定的核酸序列杂交且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子；
[0028] 4)与1)或2)限定的核酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有抗虫功能蛋白质的核酸分子。
[0029] 序列1核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0030] 本发明提供的抗虫基因的核酸分子是通过将密码子优化后的Cry1Ab的第一、第二功能结构域1392bp和Cry1F的第三功能结构域453bp和Cry1Ie一个长2157bp的三个功能结构域片段拼接在一起，形成六个结构域的新核苷酸序列并命名为mCry1Ia2。
[0031] 本发明还提供了含有抗虫基因mCry1Ia2的载体，优选双价载体pTF101，该载体含有一个筛选基因bar基因，一方面，有利于转化体的筛选，减小后期检测工作量；另一方面，在转化体时，可以通过检测bar基因来进一步说明目的基因已转入受体植株。
[0032] 进一步地，本发明还提供了含有上述载体的宿主细胞，优选LBA4404。
[0033] 本发明还提供了含有抗虫基因mCry1Ia2的转化植物细胞或重组菌。
[0034] 更进一步地，本发明还提供了所述蛋白、所述核酸分子、重组载体、宿主细胞或重组菌在调控植物抗虫性中的应用；
[0035] 或，所述蛋白、所述核酸分子、重组载体、宿主细胞或重组菌在杀虫中的应用；
[0036] 或，所述蛋白、所述核酸分子、重组载体、宿主细胞或重组菌在提高转基因植物抗虫性中的应用；
[0037] 或所述蛋白、所述核酸分子、重组载体、宿主细胞或重组菌在制备杀虫剂或防虫害制剂中的应用。
[0039] 更进一步地，本发明提供一种杀虫剂或防虫害制剂。
[0040] 本发明提供的杀虫剂或防虫害制剂，其活性成分为上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、宿主细胞或重组菌。
[0041] 更进一步地，本发明提供一种培育抗虫性提高转基因植物的方法或提供一种提高植物抗虫性的方法。
[0042] 本发明提供的方法，包括如下步骤：提高植物中编码上述蛋白的DNA分子的表达量或活性，获得转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。
[0043] 上述方法中，所述提高编码上述蛋白的DNA分子的表达量或活性为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物。
[0044] 将本发明基因mCry1Ia2与原核表达载体可操作地连接，能够快速初步检测本发明合成的Bt基因表达产物对玉米螟的毒性。将本发明基因mCry1Ia2与植物表达载体可操作地连接，并将表达载体导入相应的农杆菌中，进而通过农杆菌介导法进行遗传转化，培育抗虫转基因玉米。也可以对其它农作物或者果树等进行遗传转化，使其具备抗虫活性。
[0046] 本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0047] 本发明人工合成的抗虫基因mCry1Ia2序列与原始Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ie序列相比，大大增强了其在植物中的表达，延缓了玉米螟对Bt蛋白抗性的产生。改造后的mCry1Ia2基因经NCBI数据库(https://ncbi.nlm.nih.gov)比对分析，与1-1605bp优先比中的CACL基因(基因序列号，KY421715.1)相似性为89.65％，1846-4002bp优先比中的Cry1Ie基因(基因序列号，KX650634.1)相似性为82.00％。编码的氨基酸序列的比对分析显示，改造后的mCry1Ia2编码蛋白与优先比中的蛋白Cry1AcCry1I(AGS47767.1)相似性为81.60％。本发明的抗虫基因mCry1Ia2可在植物细胞中高效稳定的表达。
[0048] 将抗虫基因mCry1Ia2导入玉米后，可以得到稳定遗传的mCry1Ia2转化体。此外，该基因也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
[0049] 体外实验证明改造合成的Bt基因产毒蛋白对玉米螟有显著的杀虫效果。本发明利用组成型启动子构建了新的植物表达载体，抗虫基因mCry1Ia2能够在单子叶植物中稳定高效表达，进而用于生产抗虫转基因植物。附图说明
[0050] 图1为T0代转化体目的蛋白mCry1Ia2的免疫学检测，其中CK为未转基因苗阴性对照；转基因阳性苗为1到5。上条带为质控线，下条带为检测线指示被检测蛋白。该结果表明，抗虫基因mCry1Ia2表达的目的蛋白在转基因玉米中高效表达。
[0051] 图2为T1代转化体花丝的玉米螟杀虫性检测，其中CK为未转基因苗花丝阴性对照；转基因阳性苗花丝为1到5。该结果表明，抗虫基因mCry1Ia2表达的目的蛋白在转基因玉米中高效杀虫。
具体实施方式
[0052] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0053] 实施例1 mCry1Ia2基因的合成
[0054] 通过密码子优化，合成Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ie(合成工作由金唯智(苏州)有限公司完成。)，再通过SOE法(1992，蔡宇旸)，将Cry1Ab的第一、第二功能结构域、Cry1F的第三功能结构域和Cry1Ie的三个结构域片段拼接在一起，形成新的拥有六个结构域的mCry1Ia2 DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一般认为：Bt蛋白由三个结构域构成，结构域Ⅰ包括活性杀虫蛋白N末端的250-300个氨基酸，由7个α-螺旋组成，其中一个α-螺旋疏水性较强，位于结构域Ⅰ的中心，其余6个α-螺旋围在周围。现已证明其与杀虫蛋白的毒性有关，疏水性的α-螺旋具有插入敏感昆虫的中肠道细胞膜，并形成孔道；结构域Ⅱ由三个反相平行的β折叠形成一个三棱形状的结构，每个折叠通过一个小环结构相连。其中有两个β折叠高度同源，各由四条反相平行的具有β构象的肽链构成。另一个β折叠有三条β构象的肽链及一个小的α-螺旋构成。这一结构域由中间的约200个氨基酸构成。结构域Ⅱ主要参于对目标昆虫消化道表皮靶细胞的识别与结合，是决定杀虫蛋白特异性的主要因素。结构域Ⅲ由两个反相平行的具有β构象的肽链高度缠绕而形成一个β-三夹板结构，其主要功能是维持蛋白结构稳定，使其不受昆虫蛋白酶的降解(Li et al.,1991；Grochulski et al.,1995)。此外，该结构域也可能起到保证毒蛋白与受体稳定结合的作用。改造后的mCry1Ia2基因经NCBI数据库(https://ncbi.nlm.nih.gov)比对分析，与1-1605bp优先比中的CACL基因(基因序列号，KY421715.1)相似性为89.65％，1846-4002bp优先比中的Cry1Ie基因(基因序列号，KX650634.1)相似性为82.00％。编码的氨基酸序列的比对分析显示，改造后的mCry1Ia2编码蛋白与优先比中的蛋白Cry1AcCry1I(AGS47767.1)相似性为81.60％。编码mCry1Ia2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0055] 实施例2 mCry1Ia2基因在原核系统中的表达和产物的毒性检测
[0056] 为了检测改造的mCry1Ia2基因体外表达及对玉米螟的毒性情况，我们构建了Bt原核表达载体。根据需要，在引物序列的5’端添加NdeI内切酶识别位点序列AAGGAGATATACATA，如SEQ ID NO.3所示；3’端添加XhoI内切酶识别位点序列GGTGGTGGTGCTCGAG，如SEQ ID NO.4所示。设计引物序列为：F：AAGGAGATATACATATGGACAACAACCCCAAC，如SEQ ID NO.5所示；R：GGTGGTGGTGCTCGAGCATGTCCCGCTGCTCGAT，如SEQ ID NO.6所示。以拼接好的DNA为模板，用添加了接头的引物，扩增mCry1Ia2基因，凝胶回收试剂盒回收纯化mCry1Ia2基因片段。用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切pET30a，回收纯化。两个片段进行连接反应，构建所得原核表达质粒命名为pET30a-mCry1Ia2。经PCR检测，测序，表明载体构建正确。用pET30a-mCry1Ia2转化BL21(DE3)感受态细胞。
[0057] 用含有pET30a-mCry1Ia2的大肠杆菌BL21菌液经IPTG诱导后，提取Bt蛋白，以清水和含空载体pET30a大肠杆菌BL21菌液为对照，用玉米螟进行虫试。具体步骤如下：
[0058] ①接种大肠杆菌BL21单菌落于5ml LB(含卡那霉素)液体培养基中，37℃过夜培养。
[0059] ②将菌液接种到500ml LB(含卡那霉素)液体培养基中，培养至OD≈0.5。
[0060] ③加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时。
[0061] ④4000rpm离心10min，收集菌体。
[0062] ⑤加入20ml裂解缓冲液(2mM Tris-HCl；0.2mM CaCl2；PH＝8.0)，重新悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,冰上放置30min。
[0064] ⑦将收集的上清加入到饲养玉米螟的饲料中。以含空载体pET30a大肠杆菌BL21菌液为阴性对照。
[0065] ⑧在24孔板上放入一条饲料，每个放有饲料的孔接1头2-3龄玉米螟，各接100个孔，重复三次。放入温度26～28度，相对湿度70％左右的环境中培养，7天后进行毒性鉴定：结果表明，分泌表达的mCry1Ia2基因编码的Bt蛋白有较好的杀虫效果，玉米螟的死亡率达到100％，而且对玉米螟的生长有明显的抑制作用(表1)。
[0066] 表1 mCry1Ia2基因原核表达产物的毒性检测结果
[0067]处理(重复三次) 试虫数(只) 平均死亡率(％)
H2O(阴性对照) 500 0
pET30a(阴性对照) 500 0
阳性对照 500 100
mCry1Ia2 500 100
H2O(阴性对照) 500 0
pET30a(阴性对照) 500 0
阳性对照 500 100
mCry1Ia2 500 100
[0068] 实施例3 mCry1Ia2基因在转基因植物中的表达和表达产物的毒性检测[0069] 在引物序列的5’和3’端，分别添加SmaI内切酶识别位点序列CTCTAGAGGATCCCC，如SEQ ID NO.7所示；和TCGAGCTCGGTACCC，如SEQ ID NO.8所示。设计引物为：F：5’CTCTAGAGGATCCCCATGGACAACAACCCCAAC3’，如SEQ ID NO.9所示；R:5’TCGAGCTCGGTACCCCTACTACTCGAGTGTGGCAGT 3’，如SEQ ID NO.10所示，以合成的mCry1Ia2核苷酸序列为模板，用带接头的引物扩增，并用凝胶回收纯化试剂盒回收目的片段。同时用SmaⅠ酶切植物表达载体pTF101，回收纯化酶切后的pTF101片段。两个片段进行连接反应(In-Fusion HD cloning kit，Clontech)，构建得到真核表达质粒pTF101-mCry1Ia2(启动子为CaMV35S，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar)。经PCR检测，测序，表明载体构建正确。
[0070] 其中，pTF101(pTF101-35S-MCS-Bar)质粒是在pCAMBIA1300质粒基础上构建的质粒，含有一个目的基因插入盒和一个来自吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。该载体可用于玉米受体材料的遗传转化。
[0071] 采用农杆菌介导转化方法(菌种LBA4404)将插入序列导入受体植株的茎尖组织，经除草剂双丙氨膦筛选后获得转基因植株。移栽成活的转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。
[0072] 目的蛋白mCry1Ia2的检测(Cry1Ab免疫学检测)：
[0073] 1、取约1cm2左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf管中。然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。
[0075] 3、取出检测试纸条(上海佑隆生物科技有限公司)，手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂直，将标记的末端插入至离心管或提取袋中。插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。
[0076] 4、3-5分钟内出现质控线，最长反应时间为30分钟，此时检测条可取出。质控线是用来确保试验结果的准确性。如果质控线没有出现，检测无效。由于样品的流动性不同，产生信号的时间也不同。如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现。如果想长期保存检测结果，可剪掉样品垫，用纸巾吸干，这将阻止残存的液体干扰结果。检测线的深浅反应了被检测蛋白的含量(图1)。其中CK为未转基因苗阴性对照；转基因阳性苗为1到5。上条带为质控线，下条带为检测线指示被检测蛋白。该结果表明，抗虫基因mCry1Ia2表达的目的蛋白在转基因玉米中高效表达。
[0077] 转mCry1Ia2基因抗虫玉米花丝室内杀虫检测：
[0078] 在培养皿放入玉米花丝并放入30头玉米螟幼虫，每个培养皿作为一次重复，每个处理设置5次重复。将其放置于人工气候箱内进行饲养，培养条件为：温度28℃，RH 80％，光照周期16L：8D，根据被玉米螟食取玉米花丝情况及时补充相同的组织样品。从接虫开始，每隔48小时统计1次玉米螟幼虫存活数量，共调查7天。根据各处理存活的幼虫数量，计算不同玉米花丝饲喂的玉米螟幼虫存活率(图2)。花丝室内生测结果表明，第3天时，玉米螟的存活率显著降低，均达到20％以下；7天后，转基因玉米花丝饲喂亚洲玉米螟的存活率为0％，而阴性对照饲喂亚洲玉米螟幼虫的存活率接近100％，说明转mCry1Ia2基因抗虫玉米花丝具有很好玉米螟抗性。
[0079] 表2转mCry1Ia2基因阳性苗花丝的毒性检测结果
[0080] 处理(重复三次) 试虫数(只) 7天平均死亡率(％)阴性对照 30 0
转基因阳性苗1 30 100
转基因阳性苗2 30 100
转基因阳性苗3 30 100
转基因阳性苗4 30 100
转基因阳性苗5 30 100
转基因阳性苗1 30 100
转基因阳性苗2 30 100
转基因阳性苗3 30 100
转基因阳性苗4 30 100
转基因阳性苗5 30 100
[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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