一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法
阅读：485发布：2021-07-16
专利汇可以提供一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种双抗性双功能性 水 稻的高效育种方法，属于杂交稻育种领域。本发明通过将两种单功能性和两种单抗病性水稻分别交叉杂交后进行花粉培养，筛选表型后再进行杂交，花培培养和筛选操作，获得具有双抗性和双功能表型的水稻新品种。该方法使新品种在具备保健功能的同时兼具抗病性，提高品种的 质量 ，降低生产过程中 农药 的使用。本发明与传统杂交水稻育种相比，无须繁琐的反复杂交纯化步骤，明显缩短育种周期，提高育种效率。，下面是一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法专利的具体信息内容。
1.一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法，其特征在于：所述育种方法具体步骤如下：
(1)选用功能性水稻品种A、抗病水稻品种B、功能性水稻品种C、抗病水稻品种D，A和B杂交，C和D杂交，得到杂交F1代，分别以F1-AB和F1-CD表示；
(2)种植杂交F1代，具体管理标准如下：
(2.1)合理密植，规范栽插：每亩9000窝，每窝三苗呈等边三角形，苗间距10厘米，施足底肥，浅薄水栽秧；
(2.2)栽插后浅水湿润灌溉返青分蘖，当分蘖总数达到成穗数的85％时自然断水落干晒田；
(2.3)施肥:每亩施用纯氮肥12～14kg，氮、磷、钾比例为2:1:2，氮肥中底肥、分蘖肥和穗肥比例为5:3:1；磷肥作底肥，钾肥则底肥、追肥各半；
(2.4)病虫害防治：主要采用物理或农业防治方法防治一代二化螟，二代二化螟等害虫，采用3％“井岗霉素”8g兑水30kg喷施一次防治纹枯病，采用破口前7天到破口期用“纹曲灵”250mL兑水30kg喷施一次；
(3)抽穗期取F1代幼穗进行花粉培养，分别采用病原体粗毒素处理，筛选具有抗病特性的F2-AB和F2-CD；
(4)大田移栽F2-AB和F2-CD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，成熟期单株收种F3-AB和F3-CD；
(5)依据品种A或C的功能性指标分别对F3-AB和F3-CD进行鉴定，筛选具有品种A或C功能性特征的F3-AB和F3-CD留种；
(6)对F3-AB和F3-CD进行杂交，得到F4-ABCD；
(7)种植F4-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，取幼穗进行花粉培养，同时采用品种B和D所对抗的病原体粗毒素处理，筛选具有抗病特性的F5-ABCD；
(8)大田移栽F5-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，成熟期单株收种F6-ABCD；
(9)筛选同时具有品种A和C功能性特征的F6-ABCD留种；
(10)验证F6-ABCD：种植F6-ABCD，生长期同时接种B和D所对抗的病原体，成熟期单株收种，同时考察品种A和C具有的功能性特征，符合双抗性双功能性的标准即育成新品种DADF1或DADF2。
2.根据权利要求1所述的一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法，其特征在于，功能性水稻品种A和C的功能性指标包括抗性淀粉含量、水溶性蛋白含量、γ-氨基丁酸含量、铁元素含量，抗病品种B和D的抗性包括抗稻瘟病、抗水稻胡麻叶斑病、抗条纹叶枯病、抗黑条矮缩病。
3.根据权利要求1所述的一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法，其特征在于，所述功能性水稻品种A为W025或宜糖1号、抗病水稻品种B为龙粳42或汴稻1号、功能性水稻品种C为IR164或W3660、抗病水稻品种D为关东194或IR24。
4.根据权利要求1所述的一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法，其特征在于，所述花粉培养的步骤如下：
(1)以稻苞大而不破、剑叶叶枕距为5～8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的1/3～1/2为标准取穗，取材后，用71％乙醇表面消毒，然后湿润的纱布包裹整个稻穗，保持稻穗湿润，在4℃下低温预处理4天；
(2)预处理后剪下稻苞，将稻苞浸泡于70％的酒精中处理3～5min，然后将该稻苞转移于超净工作台中剥离稻穗，用消毒过的纱布包裹稻穗后用浓度为0.1％的升汞灭菌10min并间或摇动，无菌水漂洗3次，打开纱布晾干；
(3)无菌台上剥除稻穗苞叶，选取合适的小穗剪下，用剪颖抖药法将花药接种至诱导培养基上，每个三角瓶越接种100个花药；
(4)当诱导培养后的花药愈伤组织长到3.5～7mm大小时，转到分化培养基上诱导绿苗，培养条件为恒温27℃，恒湿69％，避光12h/光照2250Lx 14h。
5.根据权利要求1所述的一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法，其特征在于，所述病原体粗毒素处理具体步骤如下：
挑选直径3.5～7mm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27～28℃、湿度69～70％、光12h/暗12h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长到2.5cm后转接与生根培养基进行继代培养，待长到9cm后移栽到周转箱壮苗，10～20天后移栽入大田。
一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法
技术领域
[0001] 本发明涉及水稻育种技术领域，特别涉及一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法。
背景技术
[0002] 由于我国地域经济发展的不平衡以及地域自然条件的差异，导致了生活在不同地区的人们在营养供给条件上产生了差异。近几年来，生活在富裕地区的一些人由于营养过剩和饮食结构不合理，导致高血糖、高血压、高血脂、心血管疾病、糖尿病、肾脏病、肥胖、动脉硬化、骨质疏松和生长发育不均衡等病症的发病率大大提高；而在相对贫困的地区，则由于营养缺乏.以致于某些地方性疾病如缺铁营养性贫血症、维生素A缺乏症等重新流行。这些由营养搭配不良而导致的疾病。可以通过改善营养结构，食用具有特定营养性和功能性的功能性食品实现医食同源，对食用者起到营养和保健的效果。
[0003] 世界上大约有50％以上的人口以大米为主食，而我国是世界上最大的稻谷生产和消费国.大米是我们的传统主食.它的营养价值在膳食中占举足轻重的地位.因此三大粮食作物之一的水稻被开发成为具有保健作用的功能性产品。功能性水稻是指能生产出具有调节人体生理功能、适宜特定人群食用，而又不以治疗为目的的功能性稻米。功能营养稻是指具有稳定遗传性状，富含一种或几种营养元素，食用后能改善人体生理功能的特种用途的新型水稻品种或组合。与普通水稻相比，功能性水稻具有抗性淀粉、膳食纤维、铁、钙、锌等微营养元素、γ-氨基丁酸、六磷酸肌醇、谷维素、维生素E、谷胱甘肽、功能性黄酮类化合物等多种功能性成分，是功能食品开发的理想加工原料。因此水稻育种既要以高产、优质和多抗为目标，以解决我国的粮食安全问题.也应该注重具有的功能性成分的新型稻育种，以满足特殊人群改善身体健康状况的消费需求。
[0004] 目前，水稻抗病育种中主要采用传统的抗病育种方法进行育种，如利用资源筛选、杂交、回交等常规育种途经选育出一批具有垂直抗性和水平抗性较好的优良品系，但是常规育种消耗时间非常长，一个品种的育成需要7、8年以上的努力，常规育种为获得性状稳定的品种，步骤较多，周期漫长，每年的筛选也很低效，工作量庞大。尤其是病原体的突变频率增加，一个新品种的育成速度已经跟不上病原体的突变速度，一个新品种往往推广3-5年即可产生新的耐药突变菌株，所以寻找更高效更快捷的育种方法是目前水稻抗病育种的迫切需求。
[0005] 花药培养通过对所获得的单倍体植株进行染色体加倍，便可获得纯合二倍体，可缩短育种所需年限。利用单倍体及其细胞进行诱变育种，无论是发生显性还是隐性突变，均可在当代表现出来，便于鉴定和选择，然后将发生有利突变的个体进行染色体加倍，即可获得遗传性稳定的纯合植株，从而加速育种进程。利用单倍体植株的组织、细胞或原生质体作为外源基因转化的受体，有利于外源基因的整合表达。
[0006] 中国专利CN2015106764511公开了一种双功能水稻品种的选育方法。以高抗性淀粉含量水稻品种为亲本，与低水溶性蛋白水稻品种杂交，杂交得F1代种子；F1自交；F2-F3代植株中，选择抗性淀粉含量10％以上、低水溶性蛋白含量4％以下的水稻植株；F4代株系中，选择高产株系；F5-F6，开展系统选育，选择抗性淀粉含量的优良株系；F7代，得到双功能水稻的定型品系。本发明聚合高抗性淀粉含量和低水溶性蛋白的两种优良特性，同时适宜糖尿病人和肾脏病人食用。
[0007] 中国专利CN201710170128公开了一种高效水稻育种方法。该方法采用盘锦二号/荃优822得到的F1为母本，以龙粳46/两优2161得到的F1’为父本，配制组合，达到改良现有品种综合性状的目的。充分利用品种的优势互补，选用优点突出且其它形状相近的材料作为亲本从而加快后代稳定速度。并且，采用分子标记辅助选择与温室加代繁殖相结合的先进育种技术，有效缩短了育种时间，提高选择效率。新品系具有高产、抗病性、抗倒性高，结实率高(结实率在92％以上)、抗旱的特点，适合大面积推广种植，能够达到节本增效，促进农民增收的目的。
[0008] 上述两个发明虽然选育出了新的功能性水稻品种和高产抗病水稻品种，但技术方案中步骤较多，消耗时间非常长，一个品种的育成需要7、8年以上的努力，常规育种为获得性状稳定的品种，步骤较多，周期漫长，每年的筛选也很低效，工作量庞大。中国专利CN2015106764511在筛选出双功能性水稻品种的同时没有兼顾水稻的抗病性，未考虑实际推广应用过程中的因病虫害而导致的减产和农药应用导致的品质衰减问题。尤其是病原体的突变频率增加，一个新品种的育成速度已经跟不上病原体的突变速度，一个新品种往往推广3-5年即可产生新的耐药突变菌株，所以寻找更高效更快捷的育种方法是目前水稻抗病育种的迫切需求。
[0009] 中国专利CN201710170128育成的新品种虽然高产抗病抗倒伏，但水稻品质并未有提升，不能满足特殊人群的需求，没有功能性水稻的各项优点。
发明内容
[0010] 本发明所要解决的技术问题：针对现有常规水稻育种技术步骤较多，周期漫长，效率低下，且无法兼顾功能性和抗病性的缺点，发明了一种兼顾抗病性和功能性的水稻育种方法，提高水稻育种效率。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
[0012] 本发明提供一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法，所述育种方法具体步[0013] 骤如下：
[0014] (1)选用功能性水稻品种A、抗病水稻品种B、功能性水稻品种C、抗病水稻品种D，A和B杂交，C和D杂交，得到杂交F1代，分别以F1-AB和F1-CD表示；
[0015] (2)种植杂交F1代，具体管理标准如下：
[0016] (2.1)合理密植，规范栽插：每亩9000窝，每窝三苗呈等边三角形，苗间距10厘米，施足底肥，浅薄水栽秧；
[0017] (2.2)栽插后浅水湿润灌溉返青分蘖，当分蘖总数达到成穗数的85％时自然断水落干晒田；
[0019] (2.4)病虫害防治：主要采用物理或农业防治方法防治一代二化螟，二代二化螟等害虫，采用3％“井岗霉素”8g兑水30kg喷施一次防治纹枯病，采用破口前7天到破口期用“纹曲灵”250mL兑水30kg喷施一次；
[0020] (3)抽穗期取F1代幼穗进行花粉培养，分别采用病原体粗毒素处理，筛选具有抗病特性的F2-AB和F2-CD；
[0021] (4)大田移栽F2-AB和F2-CD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，成熟期单株收种F3-AB和F3-CD；
[0022] (5)依据品种A或C的功能性指标分别对F3-AB和F3-CD进行鉴定，筛选具有品种A或C功能性特征的F3-AB和F3-CD留种；
[0023] (6)对F3-AB和F3-CD进行杂交，得到F4-ABCD；
[0024] (7)种植F4-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，取幼穗进行花粉培养，同时采用品种B和D所对抗的病原体粗毒素处理，筛选具有抗病特性的F5-ABCD；
[0025] (8)大田移栽F5-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，成熟期单株收种F6-ABCD；
[0026] (9)筛选同时具有品种A和C功能性特征的F6-ABCD留种；
[0027] (10)验证F6-ABCD：种植F6-ABCD，生长期同时接种B和D所对抗的病原体，成熟期单株收种，同时考察品种A和C具有的功能性特征，符合双抗性双功能性的标准即育成新品种DADF1或DADF2。
[0028] 所述的功能性水稻品种A和C的功能性指标包括抗性淀粉含量、水溶性蛋白含量、γ-氨基丁酸含量、铁元素含量，抗病品种B和D的抗性包括抗稻瘟病、抗水稻胡麻叶斑病、抗条纹叶枯病、抗黑条矮缩病。
[0029] 所述功能性水稻品种A为W025或宜糖1号、抗病水稻品种B为龙粳42或汴稻1号、功能性水稻品种C为IR164或W3660、抗病水稻品种D为关东194或IR24。
[0030] 所述花粉培养的步骤如下：
[0031] (1)以稻苞大而不破、剑叶叶枕距为5～8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的1/3～1/2为标准取穗，取材后，用71％乙醇表面消毒，然后湿润的纱布包裹整个稻穗，保持稻穗湿润，在4℃下低温预处理4天；
[0032] (2)预处理后剪下稻苞，将稻苞浸泡于70％的酒精中处理3～5min，然后将该稻苞转移于超净工作台中剥离稻穗，用消毒过的纱布包裹稻穗后用浓度为0.1％的升汞灭菌10min并间或摇动，无菌水漂洗3次，打开纱布晾干；
[0033] (3)无菌台上剥除稻穗苞叶，选取合适的小穗剪下，用剪颖抖药法将花药接种至诱导培养基上，每个三角瓶越接种100个花药；
[0034] (4)当诱导培养后的花药愈伤组织长到3～7mm大小时，转到分化培养基上诱导绿苗。
[0035] 所述病原体粗毒素处理筛选具体步骤如下：
[0036] 挑选直径3.5～7mm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，在温度27～28℃、湿度69～70％、光12h/暗12h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长到2.5cm后转接与生根培养基进行继代培养，待长到9cm后移栽到周转箱壮苗，10～20天后移栽入大田。
[0037] 本发明获得的有益效果：
[0038] 本发明以两种功能性的水稻品种和两种抗病性的水稻品种为材料，通过杂交和纯化育种后可获得同时集双功能性和双抗病性于一身的水稻新品种。优选方式获得水稻新品种DADF1具有抗性淀粉含量高和富含铁的功能特性，且有稻瘟病和黑条矮缩病的高抗性，新品种DADF2具有富含γ-氨基丁酸和水溶性蛋白含量低的功能特性，同时具有水稻胡麻叶斑病和条纹叶枯病的高抗性。本发明还可推广延伸至多种功能性特征和抗病性的富集。
[0039] 本发明对水稻抗性和功能性进行有目的的定向筛选，筛选过程仅需2-3年，大大缩短育种周期，提高育种效率，简化育种步骤，有效解决了现有常规水稻育种技术步骤较多，周期漫长，效率低下，且无法兼顾功能性和抗病性的缺点。生产中可减少农药使用和工作量，提升稻米品质。
具体实施方式
[0040] 下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0041] 实施例1：DADF1的选育
[0042] 按如下步骤进行选育：
[0043] (1)选用抗性淀粉含量高的功能性水稻品种“宜糖1号”(A)、抗稻瘟病水稻品种“龙粳42”(B)、富铁的功能性水稻品种“IR164”(C)、抗黑条矮缩病水稻品种“IR24”(D)，A和B杂交，C和D杂交，得到杂交F1代，分别以F1-AB和F1-CD表示。
[0044] (2)种植杂交F1代，具体管理标准如下：
[0045] (2.1)合理密植，规范栽插：每亩9000窝，每窝三苗呈等边三角形，苗间距10厘米，施足底肥，浅薄水栽秧；
[0046] (2.2)栽插后浅水湿润灌溉返青分蘖，当分蘖总数达到成穗数的85％时自然断水落干晒田；
[0047] (2.3)施肥:每亩施用纯氮肥12～14kg，氮、磷、钾比例为2:1:2，氮肥中底肥、分蘖肥和穗肥比例为5:3:1；磷肥作底肥，钾肥则底肥、追肥各半；
[0048] (2.4)病虫害防治：虫害主要采用物理或农业防治方法防治一代二化螟，二代二化螟等害虫，农业防治主要是消灭越冬虫源、灌水灭蛹，物理防治主要是安装频振式杀虫灯诱杀成虫、稻田养鸭和保护天敌。病害采用3％“井岗霉素”8g兑水30kg喷施一次，采用破口前7天到破口期用“纹曲灵”250mL兑水30kg喷施一次；
[0049] (3)抽穗期取F1-AB和F1-CD幼穗进行花粉培养，对F1-AB采用稻瘟病粗毒素处理，对F1-CD采用黑条矮缩病粗毒素处理筛选具有抗病特性的F2-AB和F2-CD，具体步骤如下：
[0050] (3.1)以稻苞大而不破、剑叶叶枕距为5～8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的1/3～1/2为标准取穗，取材后，用71％乙醇表面消毒，然后湿润的纱布包裹整个稻穗，保持稻穗湿润，在4℃下低温预处理4天；
[0051] (3.2)预处理后剪下稻苞，将稻苞浸泡于70％的酒精中处理3～5min，然后将该稻苞转移于超净工作台中剥离稻穗，用消毒过的纱布包裹稻穗后用浓度为0.1％的升汞灭菌10min并间或摇动，无菌水漂洗3次，打开纱布晾干；
[0052] (3.3)无菌台上剥除稻穗苞叶，选取合适的小穗剪下，用剪颖抖药法将花药接种至诱导培养基上，每个三角瓶越接种100个花药；
[0053] (3.4)当诱导培养后的花药愈伤组织长到3～5mm大小时，转到分化培养基上诱导绿苗。
[0054] (3.5)粗毒素的制备：挑取保存的稻瘟病菌或黑条矮缩病菌接种于PDA固体培养基上(配制方法为：将马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，放入锅中，加水1000mL，煮沸30min，稍冷后用双层纱布过滤，滤液内加16g琼脂，22g蔗糖，加水补足至1000mL)，26℃黑暗培养，待长出菌丝体并产生孢子后转接到PDA液体培养基中(配制方法为：将马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，放入锅中，加水1000mL，煮沸30min，稍冷后用双层纱布过滤，滤液内加20g蔗糖，加水补足至1000mL)，在25℃条件下振荡培养15d，用无菌纱布滤去菌，离心
15min(1500r/min)，在滤液中加入约滤液重量1/2的活性炭，4℃静置吸附8h，然后10000r/min离心10min，然后将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，65℃下旋转蒸发浓缩洗脱液，即获得水稻黑条矮缩病菌或稻瘟病菌粗毒素。
15min(1500r/min)，在滤液中加入约滤液重量1/2的活性炭，4℃静置吸附8h，然后10000r/min离心10min，然后将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，65℃下旋转蒸发浓缩洗脱液，即获得水稻黑条矮缩病菌或稻瘟病菌粗毒素。
[0055] (3.6)挑选直径3.5～5mm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，培养条件为恒温28℃，恒湿69％，光12h/暗12h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长到2.5cm后转接与生根培养基进行继代培养，待长到9cm后移栽到周转箱壮苗，10～20天后移栽入大田。
[0056] (4)大田移栽F2-AB和F2-CD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，群体共2000株，自交后成熟期单株留种F3-AB和F3-CD；
[0057] (5)依据抗性淀粉含量或铁元素含量的功能性评价指标分别对F3-AB和F3-CD进行筛选，筛选出抗性淀粉含量高的F3-AB和富铁的F3-CD种子各30份。
[0058] (6)以F3-AB为父本和F3-CD为母本进行杂交，收得种子F4-ABCD。
[0059] (7)播种F4-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，抽穗期按步骤(3)进行花粉培养，同时采用稻瘟病和黑条矮缩病粗毒素处理，筛选同时具有双抗特性的F5-ABCD。
[0060] (8)大田移栽F5-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，共筛选出2000株，自交后成熟期单株留种F6-ABCD。
[0061] (9)测定F6-ABCD的抗体淀粉含量和铁元素含量，筛选同时具有抗体淀粉含量高于30％和铁元素含量大于20mg/kg的功能性特征的6-ABCD留种，共30份。
[0062] (10)验证F6-ABCD：种植F6-ABCD，生长期同时接种稻瘟病和黑条矮缩病，成熟期单株收种，测定抗体淀粉含量和铁元素含量，符合双抗性双功能性的标准即育成新品种DADF1。
[0063] 实施例2：DADF2的选育
[0064] 按如下步骤进行选育：
[0065] (1)选用γ-氨基丁酸含量高的功能性水稻品种“W025”(A)、抗水稻胡麻叶斑病水稻品种“汴稻1号”(B)、低水溶性蛋白的功能性水稻品种“W3660”(C)、抗条纹叶枯病水稻品种“关东194”(D)，A和B杂交，C和D杂交，得到杂交F1代，分别以F1-AB和F1-CD表示。
[0066] (2)种植杂交F1代，具体管理标准如下：
[0067] (2.1)合理密植，规范栽插：每亩9000窝，每窝三苗呈等边三角形，苗间距10厘米，施足底肥，浅薄水栽秧；
[0068] (2.2)栽插后浅水湿润灌溉返青分蘖，当分蘖总数达到成穗数的85％时自然断水落干晒田；
[0069] (2.3)施肥:每亩施用纯氮肥12～14kg，氮、磷、钾比例为2:1:2，氮肥中底肥、分蘖肥和穗肥比例为5:3:1；磷肥作底肥，钾肥则底肥、追肥各半；
[0070] (2.4)病虫害防治：虫害主要采用物理或农业防治方法防治一代二化螟，二代二化螟等害虫，农业防治主要是消灭越冬虫源、灌水灭蛹，物理防治主要是安装频振式杀虫灯诱杀成虫、稻田养鸭和保护天敌。病害采用3％“井岗霉素”8g兑水30kg喷施一次，采用破口前7天到破口期用“纹曲灵”250mL兑水30kg喷施一次；
[0071] (3)抽穗期取F1-AB和F1-CD幼穗进行花粉培养，对F1-AB采用胡麻叶斑病粗毒素处理，对F1-CD采用条纹叶枯病粗毒素处理筛选具有抗病特性的F2-AB和F2-CD，具体步骤如下：
[0072] (3.1)以稻苞大而不破、剑叶叶枕距为5～8cm、稻穗中部花药位置占颖壳的1/3～1/2为标准取穗，取材后，用75％乙醇表面消毒，然后湿润的纱布包裹整个稻穗，保持稻穗湿润，在4℃下低温预处理4天；
[0073] (3.2)预处理后剪下稻苞，将稻苞浸泡于70％的酒精中处理3～5min，然后将该稻苞转移于超净工作台中剥离稻穗，用消毒过的纱布包裹稻穗后用浓度为0.1％的升汞灭菌10min并间或摇动，无菌水漂洗3次，打开纱布晾干；
[0074] (3.3)无菌台上剥除稻穗苞叶，选取合适的小穗剪下，用剪颖抖药法将花药接种至诱导培养基上，每个三角瓶越接种100个花药；
[0075] (3.4)当诱导培养后的花药愈伤组织长到3～5mm大小时，转到分化培养基上诱导绿苗。
[0076] (3.5)粗毒素的制备：挑取保存的胡麻叶斑病菌或条纹叶枯病菌接种于PDA固体培养基上(配制方法为：将马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，放入锅中，加水1000mL，煮沸30min，稍冷后用双层纱布过滤，滤液内加16g琼脂，22g蔗糖，加水补足至1000mL)，26℃黑暗培养，待长出菌丝体并产生孢子后转接到PDA液体培养基中(配制方法为：将马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，放入锅中，加水1000mL，煮沸30min，稍冷后用双层纱布过滤，滤液内加20g蔗糖，加水补足至1000mL)，在25℃条件下振荡培养15d，用无菌纱布滤去菌，离心
15min(1500r/min)，在滤液中加入约滤液重量1/2的活性炭，4℃静置吸附8h，然后10000r/min离心10min，然后将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，65℃下旋转蒸发浓缩洗脱液，即获得水稻胡麻叶斑病菌或条纹叶枯病菌粗毒素。
15min(1500r/min)，在滤液中加入约滤液重量1/2的活性炭，4℃静置吸附8h，然后10000r/min离心10min，然后将活性炭沉淀用等体积甲醇洗脱，65℃下旋转蒸发浓缩洗脱液，即获得水稻胡麻叶斑病菌或条纹叶枯病菌粗毒素。
[0077] (3.6)挑选直径5～7mm的花药愈伤组织接种于添加粗毒素选择压的分化培养基，培养条件为恒温27℃，恒湿70％，光12h/暗12h的条件下培养，获得花培幼苗，待花培苗长到2.5cm后转接与生根培养基进行继代培养，待长到9cm后移栽到周转箱壮苗，10～20天后移栽入大田。
[0078] (4)大田移栽F2-AB和F2-CD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，群体共2500株，自交后成熟期单株留种F3-AB和F3-CD；
[0079] (5)依据γ-氨基丁酸含量或水溶性蛋白含量的功能性评价指标分别对F3-AB和F3-CD进行筛选，筛选出含量高的γ-氨基丁酸F3-AB和低水溶性蛋白的F3-CD种子各50份。
[0080] (6)以F3-AB为父本和F3-CD为母本进行杂交，收得种子F4-ABCD。
[0081] (7)播种F4-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，抽穗期按步骤(3)进行花粉培养，同时采用胡麻叶斑病菌或条纹叶枯病菌粗毒素处理，筛选同时具有双抗特性F5-ABCD。
[0082] (8)大田移栽F5-ABCD，按步骤(2)的标准进行管理，开花期考察各株系并选择农艺性状、产量形状优异的单株，共筛选出2000株，自交后成熟期单株留种F6-ABCD。
[0083] (9)同时测定F6-ABCD的γ-氨基丁酸含量和水溶性蛋白含量，筛选同时具有γ-氨基丁酸含量高于80mg/kg和水溶性蛋白含量低于1％的功能性特征的F6-ABCD留种，共40份。
[0084] (10)验证F6-ABCD：种植F6-ABCD，生长期同时接种胡麻叶斑病和条纹叶枯病，成熟期单株收种，测定籽粒中γ-氨基丁酸含量和低水溶性蛋白含量，符合双抗性双功能性的标准即育成新品种DADF2。
[0085] 实施例1-2中育成的新品种功能性营养成分测定及抗病性检测结果如下：
[0086] 按照相同的加工步骤处理新品种及普通粳米水稻，测定新品种DADF1和DADF2米粒中的功能性指标包括抗性淀粉含量、水溶性蛋白含量、γ-氨基丁酸含量、铁元素含量，并对比普通粳米的营养成分，结果如下：
[0087] 表1新品种及普通粳米品种中功能性指标含量测定
[0088]
[0089] 选取正常生长的水稻植株作为实验验材料，将无抗性品种作为对照，同时接种胡麻叶斑病、黑条矮缩病、稻瘟病、条纹叶枯病病原体，步骤如下：
[0090] 选用正常生长的株高30～40cm的健壮水稻植株，采用随机分组的方式分组，每组100株，培养上述四种病原体，接种当天用无菌双蒸水冲洗收集各组病原体悬液，调整OD600至0.5，分别用灭菌后的手术剪蘸取病原体悬液，每株剪三个叶片，每片剪三个缺口，缺口长度2～3mm。
[0091] 接种后正常管理并观察21天，根据不同病害的发病特征测定各组发病率，具体接种方案见表2：
[0092] 表2各品种水稻病害接种方案表
[0093]
[0094] 注：“+”代表已接种；“﹣”代表未接种。
[0095] 按如下公式计算发病率：
[0096] 发病率＝(出现病斑的叶片数或植株数/总叶片数或总植株数)×100％[0097] 结果如下：
[0098] 表3各组水稻发病率
[0099]
[0100] 新品种DADF1植株生长过程中高抗稻瘟病和黑条矮缩病，可减少农药使用和生产工作量，提升稻米品质，稻米中富含铁和抗性淀粉，适合贫血症和糖尿病患者食用。
[0101] 新品种DADF2植株生长过程中高抗胡麻叶斑病和条纹叶枯病，可减少农药使用和生产工作量，提升稻米品质。稻米中富含γ-氨基丁酸且水溶性淀粉较普通稻米大幅降低，适合高血压、心脑血管疾病及肾脏疾病患者食用。
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