滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法
阅读：542发布：2020-05-08
专利汇可以提供滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种滤头式固相萃取结合GC‑QTOF/MS快速筛查和定量测定 烟草 中 农药 残留的方法，属于农药残留检测技术领域。采用本发明技术方案，可实现无需标准品对照的农药残留高通量的快速筛查，同时本发明方法有效简化了繁琐的农药标准溶液配制过程，大大提高了工作效率，而且本发明所述方法还可以根据实际工作的需要扩展农药的种类和数量，方便灵活，该方法操作简便，耗时短，准确性好，能够满足烟草中多农药残留的定性和定量检测的要求，为烟草中多种类农药残留的快速筛查和定量检测工作提供可靠途径，具有较好的实际应用之价值。，下面是滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法专利的具体信息内容。
1.一种滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1.样品前处理：向烟草样品中加入溶剂和内标得提取液，将提取液经NANO净化管净化处理得待检液；
S2.样品分析：待检液采用GC-QTOF/MS进行测定；
所述步骤S2中，
色谱分析条件为：
色谱柱：两根DB-5MS超高惰性毛细管色谱柱通过反吹系统串联，所述色谱柱配置为15m×250μm×0.25μm；
进样口温度：280℃；程序升温：初始温度60℃，保持1min后以40℃/min速率升温至120℃，然后以5℃/min速率升温至310℃，保持5min；不分流进样；载气：氦气，氦气纯度为
99.999％，恒流模式，灭蚁灵用于进行保留时间锁定，适时调节色谱柱1和柱2流速；反吹：开始时间40.5min，压力50psi；自动进样，进样量为1μL；
质谱分析条件为：
离子源：EI；电离能70eV；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟4min；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，扫描范围m/z 50～500，采集速率5spectrum/s，模式4Ghz；采集软件：安捷伦MassHunter工作站。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤S1中，
溶剂采用乙腈、乙酸乙酯或丙酮-正己烷，所述丙酮-正己烷中丙酮与正己烷的体积比
1:1。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述溶剂采用乙腈。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤S1中，内标为灭蚁灵。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤S1中，灭蚁灵的浓度为5.0mg/L。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤S1中，
样品与溶剂、待净化液的质量体积比为1g：5～25mL：0.4～1.8mL。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤S1中，样品与溶剂、待净化液的质量体积比为1g：15mL：1mL。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤S1样品前处理具体方法为：向粉粹后的烟草样品中加入乙腈和灭蚁灵，进行涡旋震荡处理、离心取上清液作为提取液；将NANO净化管与注射器针管串联，取1mL提取液作为待净化液置于注射器针管内，用推杆缓慢压下，重复净化多次，流出液经浓缩后加入丙酮-正己烷复溶，所述丙酮-正己烷中丙酮与正己烷的体积比为1:1，经滤膜过滤后即得待检液。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述步骤S1样品前处理具体方法为：将NANO净化管与注射器针管串联，取1mL提取液作为待净化液置于注射器针管内，用推杆缓慢压下，重复净化三次。
10.如权利要求8所述方法，其特征在于，样品前处理中，
涡旋震荡处理条件具体为：以2000r/min速率涡旋10min；
离心处理条件具体为：以4000r/min速率离心10min。
11.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述农药残留快速筛查具体方法为：
1)在色谱质谱条件下，对184种农药分别进行质谱全扫描，采集目标农药的高分辨质谱图，将其导入PCDL软件中，输入每种农药的名称、保留时间、分子式、精确质量数、CAS号以及结构式等信息，建立184种农药化合物的精确质量数据库；
2)选择所述184种农药化合物的精确质量数据库，在安捷伦Masshunter Qualitative Analysis Workflows定性筛查软件中进行自动检索，设定检索参数保留时间偏差为±
0.15min，精确质量偏差为±20ppm，最小合格碎片数量为1个，共流出匹配得分≥60分，按离子碎片信息进行自动检索，软件将依据保留时间、精确质量偏差、同位素峰分布和丰度比来计算每种化合物的实测值与谱库中理论值的偏差，并给出匹配得分。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于，
所述184种农药具体为：二溴氯丙烷、甲胺磷、敌敌畏、乙拌磷亚砜、速灭磷(E)、乙酰甲胺磷、速灭磷(Z)、克草猛、虫螨畏、异丙威、庚烯磷、氧化乐果、虫线磷、仲丁威、残杀威、内吸磷-O、甲基内吸磷、环草敌、灭线磷、二溴磷、杀虫脒、氟乐灵、乙丁氟灵、硫线磷、甲拌磷、α-六六六、六氯苯、氯硝胺、内吸磷-S、乐果、克百威、莠去津、β-六六六、异噁草酮、林丹、五氯硝基苯、特丁硫磷、地虫硫磷、磷胺(E)、二嗪磷、乙拌磷、δ-六六六、百菌清、兹克威、七氟菊酯、氯唑磷、3-羟基克百威、异稻瘟净、抗蚜威、磷胺(Z)、敌稗、乙草胺、甲基对硫磷、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲萘威、甲基立枯磷、七氯、甲草胺、扑草净、甲霜灵、皮蝇磷、砜吸磷、甲硫威、杀螟硫磷、甲基嘧啶磷、除草定、艾氏剂、马拉硫磷、甲拌磷砜、异丙甲草胺、倍硫磷、三氯杀螨醇I、三氯杀螨醇II、对硫磷、毒死蜱、三唑酮、氯酞酸甲酯、菌核净、水胺硫磷、噻虫嗪、溴硫磷、仲丁灵、双苯酰草胺、异丙乐灵、氧化氯丹、毒虫畏-E、环氧七氯-顺式、特丁硫磷砜、二甲戊灵、戊菌唑、环氧七氯-反式、克菌丹、毒虫畏-Z、异柳磷、喹硫磷、三唑醇、稻丰散、灭菌丹、烯虫酯、氯丹-反式、杀扑磷、o,p'-DDE、α-硫丹、乙拌磷砜、杀虫畏、氯丹-顺式、嘧菌胺、丁草胺、氟节胺、敌草胺、苯线磷、己唑醇、抑霉唑、丙硫磷、稻瘟灵、丙溴磷、狄氏剂、p,p'-DDE、烯效唑、丙草胺、脱叶磷、o,p'-DDD、腈菌唑、噻嗪酮、乙嘧酚磺酸酯、醚菌酯、噻呋酰胺、除草醚、异狄氏剂、噁唑啉、吡氟禾草灵、β-硫丹、乙酯杀螨醇、丰索磷、倍硫磷亚砜、苯草醚、p,p'-DDD、倍硫磷砜、o,p'-DDT、噁霜灵、乙硫磷、虫螨磷、三唑磷、三硫磷、苯霜灵、硫丹硫酸酯、丙环唑I、丙环唑II、p,p'-DDT、戊唑醇、三苯基磷酸酯、增效醚、异菌脲、苯线磷砜、溴螨酯、丁硫克百威、苯硫磷、氯虫苯甲酰胺、联苯菊酯、甲氧滴滴涕、咪唑菌酮、莎稗磷、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、溴苯磷、氰氟草酯、高效氯氟氰菊酯、氯苯嘧啶醇、吡菌磷、丙硫克百威、联苯三唑醇、氯菊酯-顺式、氯菊酯-反式、啶酰菌胺、精喹禾灵、喹禾灵、氟氰戊菊酯I、氟氰戊菊酯II、氰戊菊酯、溴氰菊酯、茚虫威、烯酰吗啉(Z)、烯酰吗啉(E)。
13.权利要求1-12任一项所述方法在快速筛查和定量测定烟草中农药残留中的应用。
滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中
农药残留的方法
技术领域
[0001] 本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种滤头式固相萃取结合 GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法。
背景技术
[0002] 近年来，由于生产中化学农药的滥用，农药残留问题已经成为影响农产品质量安全的一个重要因素。烟丝中的农药残留在卷烟抽吸过程中，会以一定的迁移率转移到烟气中或发生化学反应，产生新的有害物质，因此烟草农药残留问题一直是烟草行业乃至社会关注的焦点，也是国际国内贸易检验的重点。许多国家及国际组织均对烟草中农药残留制定了最大残留限量(MRL)法规，例如国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)在2016版“烟用农药指导性残留限量指南”中规定106种农药及其代谢物的指导限量标准，而中国烟草总公司也在2014年发布了我国的“烟叶农药最大残留限量标准”，规定了烟叶中123 种农药的最大残留限量。
[0003] 对于多残留分析，检测技术是影响其发展的主要制约因素，现有烟草农药多残留检测技术主要以气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱法为主，均以目标化合物数据采集为基础，在组分筛查鉴定前需要大量的方法设置和优化，仅支持靶标农药的检测，此外受仪器扫描速度及分辨率的限制，高通量的检测仍具有一定的局限性。而基于高分辨质谱技术的飞行时间质谱可采集更为全面的化合物信息，能够对设定的扫描质量范围内的所有物质进行测定，无需预先编辑质谱采集方法，扫描效率高，理论上同时扫描的目标物数量无上限，可在短时间内对大量目标化合物分析，同时实现未知化合物的定性筛查。近年来，色谱与高分辨质谱联用技术已成为化合物定性筛查的有效手段，在水果、蔬菜等的多农残筛查工作中已经取得了一定的进展。
[0004] 同时，烟草样品基质复杂，含有较多的色素、萜类、生物碱、黄酮和香豆素等干扰物质，因此对前处理过程提出了更高的要求。而据报道检测分析的误差近50％来源于样品的前处理过程，因此，选用合理高效的样品前处理技术是快速、准确检测农药多残留的基础和保障，也是浓缩痕量组分、去除干扰物质以及提高方法灵敏度的重要手段。现有多农药残留的净化方法主要基于 QuEChERS和SPE技术。SPE技术在处理基质较为复杂的样品方面表现出了明显的优势，净化效果较好，定量更为准确，但步骤比较繁琐费时。而QuEChERS 技术以其操作步骤简便、耗时短，消耗化学试剂少等特点，在处理大批量样品时具有明显的优势，然而QuEChERS虽然省时省力，但其去除基质干扰的能力有限，对仪器造成了一定的污染，缩短仪器的维护周期，增加维护成本。因此有必要开发一种针对烟草多农残的快速、高效、灵敏度高、选择性好的痕量检测技术。
发明内容
[0005] 针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法，本发明采用滤头式固相萃取方法，利用Box-Behnken响应面法对前处理方法进行优化，同时结合气相色谱-四级杆飞行时间质谱仪，建立了针对烟草中184种农药残留的快速筛查和定量测定方法，从而有效实现了无需标准品对照的农药残留高通量快速筛查，简化了繁琐的农药标准溶液配制过程，大大提高了工作效率，此外还可根据实际工作的需要扩展农药的种类和数量，为烟草中多种类农药残留的快速筛查工作提供了可靠途径。
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法。
[0007] 本发明的目的之二在于提供上述方法在快速筛查和定量测定烟草中农药残留中的应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
[0009] 本发明的第一个方面，提供一种滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法，所述方法包括：
[0010] S1.样品前处理：向烟草样品中加入溶剂和内标得提取液，将提取液经 NANO净化管净化处理得待检液；
[0011] S2.样品分析：待检液采用GC-QTOF/MS进行测定。
[0012] 优选的，所述步骤S1中，
[0013] 溶剂采用乙腈、乙酸乙酯或丙酮-正己烷(1:1，v/v)；进一步优选的，所述溶剂采用乙腈；
[0014] 内标为灭蚁灵，优选浓度为5.0mg/L；
[0015] 样品与溶剂、待净化液的质量体积比为1g：5～25mL：0.4～1.8mL，进一步优选为1g：15mL：1mL；
[0016] 样品前处理具体方法为：向粉粹后的烟草样品中加入乙腈和灭蚁灵，进行涡旋震荡处理、离心取上清液作为提取液；将NANO净化管与注射器针管串联，取1mL提取液(待净化液)置于注射器针管内，用推杆缓慢压下，重复净化多次(优选为三次)，流出液经浓缩后加入丙酮-正己烷(1:1，v/v)复溶，经滤膜过滤后即得待检液。
[0017] 优选的，所述步骤S2中，
[0018] 色谱分析条件为：
[0019] 色谱柱：两根DB-5MS超高惰性毛细管色谱柱(15m×250μm×0.25μm) 通过反吹系统串联；
[0020] 进样口温度：280℃；程序升温：初始温度60℃，保持1min后以40℃/min 速率升温至120℃，然后以5℃/min速率升温至310℃，保持5min；不分流进样；载气：氦气(纯度为99.999％)，恒流模式，灭蚁灵用于进行保留时间锁定，适时调节色谱柱1和柱2流速；反吹：
开始时间40.5min，压力50psi；自动进样，进样量为1μL；
开始时间40.5min，压力50psi；自动进样，进样量为1μL；
[0021] 质谱分析条件为：
[0022] 离子源：EI；电离能70eV；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟4min；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，扫描范围m/z 50～500，采集速率5spectrum/s，模式4Ghz；
采集软件：安捷伦MassHunter工作站；
采集软件：安捷伦MassHunter工作站；
[0023] 所述农药残留快速筛查具体方法为：
[0024] 1)在上述色谱质谱条件下，对184种农药分别进行质谱全扫描，采集目标农药的高分辨质谱图，将其导入PCDL(Personal Compound Database and Library)软件中，输入每种农药的名称、保留时间、分子式、精确质量数、CAS 号以及结构式等信息，建立184种农药化合物的精确质量数据库；
[0025] 2)选择上述184种农药化合物的精确质量数据库，在安捷伦Masshunter Qualitative Analysis Workflows定性筛查软件中进行自动检索，设定检索参数保留时间偏差为±0.15min，精确质量偏差为±20ppm，最小合格碎片数量为1个，共流出匹配得分≥60分，按离子碎片信息进行自动检索，软件将依据保留时间、精确质量偏差、同位素峰分布和丰度比来计算每种化合物的实测值与谱库中理论值的偏差，并给出匹配得分。
[0026] 上述方法中，所述184种农药列举如下：二溴氯丙烷、甲胺磷、敌敌畏、乙拌磷亚砜、速灭磷(E)、乙酰甲胺磷、速灭磷(Z)、克草猛、虫螨畏、异丙威、庚烯磷、氧化乐果、虫线磷、仲丁威、残杀威、内吸磷-O、甲基内吸磷、环草敌、灭线磷、二溴磷、杀虫脒、氟乐灵、乙丁氟灵、硫线磷、甲拌磷、α-六六六、六氯苯、氯硝胺、内吸磷-S、乐果、克百威、莠去津、β-六六六、异噁草酮、林丹、五氯硝基苯、特丁硫磷、地虫硫磷、磷胺(E)、二嗪磷、乙拌磷、δ- 六六六、百菌清、兹克威、七氟菊酯、氯唑磷、3-羟基克百威、异稻瘟净、抗蚜威、磷胺(Z)、敌稗、乙草胺、甲基对硫磷、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲萘威、甲基立枯磷、七氯、甲草胺、扑草净、甲霜灵、皮蝇磷、砜吸磷、甲硫威、杀螟硫磷、甲基嘧啶磷、除草定、艾氏剂、马拉硫磷、甲拌磷砜、异丙甲草胺、倍硫磷、三氯杀螨醇I、三氯杀螨醇II、对硫磷、毒死蜱、三唑酮、氯酞酸甲酯、菌核净、水胺硫磷、噻虫嗪、溴硫磷、仲丁灵、双苯酰草胺、异丙乐灵、氧化氯丹、毒虫畏-E、环氧七氯-顺式、特丁硫磷砜、二甲戊灵、戊菌唑、环氧七氯 -反式、克菌丹、毒虫畏-Z、异柳磷、喹硫磷、三唑醇、稻丰散、灭菌丹、烯虫酯、氯丹-反式、杀扑磷、o,p'-DDE、α-硫丹、乙拌磷砜、杀虫畏、氯丹-顺式、嘧菌胺、丁草胺、氟节胺、敌草胺、苯线磷、己唑醇、抑霉唑、丙硫磷、稻瘟灵、丙溴磷、狄氏剂、p,p'-DDE、烯效唑、丙草胺、脱叶磷、o,p'-DDD、腈菌唑、噻嗪酮、乙嘧酚磺酸酯、醚菌酯、噻呋酰胺、除草醚、异狄氏剂、噁唑啉、吡氟禾草灵、β-硫丹、乙酯杀螨醇、丰索磷、倍硫磷亚砜、苯草醚、p,p'-DDD、倍硫磷砜、o,p'-DDT、噁霜灵、乙硫磷、虫螨磷、三唑磷、三硫磷、苯霜灵、硫丹硫酸酯、丙环唑I、丙环唑II、p,p'-DDT、戊唑醇、三苯基磷酸酯、增效醚、异菌脲、苯线磷砜、溴螨酯、丁硫克百威、苯硫磷、氯虫苯甲酰胺、联苯菊酯、甲氧滴滴涕、咪唑菌酮、莎稗磷、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、溴苯磷、氰氟草酯、高效氯氟氰菊酯、氯苯嘧啶醇、吡菌磷、丙硫克百威、联苯三唑醇、氯菊酯- 顺式、氯菊酯-反式、啶酰菌胺、精喹禾灵、喹禾灵、氟氰戊菊酯I、氟氰戊菊酯II、氰戊菊酯、溴氰菊酯、茚虫威、烯酰吗啉(Z)、烯酰吗啉(E)。
[0027] 本发明的第二个方面，提供上述方法在快速筛查和定量测定烟草中农药残留中的应用。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 本发明采用滤头式固相萃取技术作为净化方法，并利用Box-Behnken响应面法对净化方法进行优化，结合气相色谱-四级杆飞行时间质谱检测，成功建立了烟草中184种农药残留的快速筛查和定量测定方法。从而有效实现了无需标准品对照的农药残留高通量快速筛查，简化了繁琐的农药标准溶液配制过程，大大提高了工作效率，同时，本发明所述方法还可以根据实际工作的需要扩展农药的种类和数量，方便灵活，该方法操作简便，耗时短，准确性好，能够满足烟草中多农药残留的定性和定量检测的要求，为烟草中多种类农药残留的快速筛查和定量检测工作提供可靠途径，具有较好的实际应用之价值。附图说明
[0030] 图1不同提取溶剂下目标农药回收率范围图；
[0031] 图2为加水量、溶剂用量和净化量对目标农药回收率的影响图；
[0032] 图3为净化量0.8mL时R＝f(A,B)的响应面和等高线图；
[0033] 图4为溶剂用量10mL时R＝f(A,C)的响应面和等高线图；
[0034] 图5为加水量2mL时R＝f(B,C)时的响应面和等高线图。
具体实施方式
[0035] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0036] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0037] 本发明的一种具体实施方式中，提供一种滤头式固相萃取结合GC-QTOF/MS快速筛查和定量测定烟草中农药残留的方法，所述方法包括：
[0038] S1.样品前处理：向烟草样品中加入溶剂和内标得提取液，将提取液经 NANO净化管净化处理得待检液；
[0039] S2.样品分析：待检液采用GC-QTOF/MS进行测定。
[0040] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，
[0041] 溶剂采用乙腈、乙酸乙酯或丙酮-正己烷(1:1，v/v)；进一步优选的，所述溶剂采用乙腈；
[0042] 内标为灭蚁灵，优选浓度为5.0mg/L；
[0043] 样品与溶剂、待净化液的质量体积比为1g：5～25mL：0.4～1.8mL，进一步优选为1g：15mL：1mL；
[0044] 样品前处理具体方法为：向粉粹后的烟草样品中加入乙腈和灭蚁灵，进行涡旋震荡处理(2000r/min速率涡旋10min)、离心(4000r/min速率离心10min) 取上清液作为提取液；将NANO净化管与注射器针管串联，取1mL提取液(待净化液)置于注射器针管内，用推杆缓慢压下，重复净化多次(优选为三次)，流出液经浓缩后加入丙酮-正己烷(1:1，v/v)复溶，经滤膜过滤后即得待检液。
[0045] 本发明中NANO净化管为市售产品，具体是一种滤头式固相萃取净化柱，该产品可以免去常规固相萃取净化方法的活化和淋洗步骤，直接上样吸附杂质成分，简化样品前处理程序，大大减少样品前处理时间。净化柱的主要填料 NANO是一种新型碳纳米管材料，其在碳纳米管材料的表面上键合特殊官能团，增加了对脂肪酸和色素等干扰物的选择性，同时由于层状中空结构的特征，使得材料的附载能力得以增加。
[0046] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，
[0047] 色谱分析条件为：
[0048] 色谱柱：两根DB-5MS超高惰性毛细管色谱柱(15m×250μm×0.25μm) 通过反吹系统串联；
[0049] 进样口温度：280℃；程序升温：初始温度60℃，保持1min后以40℃/min 速率升温至120℃，然后以5℃/min速率升温至310℃，保持5min；不分流进样；载气：氦气(纯度为99.999％)，恒流模式，灭蚁灵用于进行保留时间锁定，适时调节色谱柱1和柱2流速；反吹：
开始时间40.5min，压力50psi；自动进样，进样量为1μL；
开始时间40.5min，压力50psi；自动进样，进样量为1μL；
[0050] 质谱分析条件为：
[0051] 离子源：EI；电离能70eV；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟4min；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，扫描范围m/z 50～500，采集速率5spectrum/s，模式4Ghz；
采集软件：安捷伦MassHunter工作站；
采集软件：安捷伦MassHunter工作站；
[0052] 本发明的又一具体实施方式中，所述农药残留快速筛查具体方法为：
[0053] 1)在上述色谱质谱条件下，对184种农药分别进行质谱全扫描，采集目标农药的高分辨质谱图，将其导入PCDL(Personal Compound Database and Library)软件中，输入每种农药的名称、保留时间、分子式、精确质量数、CAS 号以及结构式等信息，建立184种农药化合物的精确质量数据库；
[0054] 2)选择上述184种农药化合物的精确质量数据库，在安捷伦Masshunter Qualitative Analysis Workflows定性筛查软件中进行自动检索，设定检索参数保留时间偏差为±0.15min，精确质量偏差为±20ppm，最小合格碎片数量为1个，共流出匹配得分≥60分，按离子碎片信息进行自动检索，软件将依据保留时间、精确质量偏差、同位素峰分布和丰度比来计算每种化合物的实测值与谱库中理论值的偏差，并给出匹配得分。
[0055] 本发明的又一具体实施方式中，所述184种农药列举如下：二溴氯丙烷、甲胺磷、敌敌畏、乙拌磷亚砜、速灭磷(E)、乙酰甲胺磷、速灭磷(Z)、克草猛、虫螨畏、异丙威、庚烯磷、氧化乐果、虫线磷、仲丁威、残杀威、内吸磷-O、甲基内吸磷、环草敌、灭线磷、二溴磷、杀虫脒、氟乐灵、乙丁氟灵、硫线磷、甲拌磷、α-六六六、六氯苯、氯硝胺、内吸磷-S、乐果、克百威、莠去津、β- 六六六、异噁草酮、林丹、五氯硝基苯、特丁硫磷、地虫硫磷、磷胺(E)、二嗪磷、乙拌磷、δ-六六六、百菌清、兹克威、七氟菊酯、氯唑磷、3-羟基克百威、异稻瘟净、抗蚜威、磷胺(Z)、敌稗、乙草胺、甲基对硫磷、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲萘威、甲基立枯磷、七氯、甲草胺、扑草净、甲霜灵、皮蝇磷、砜吸磷、甲硫威、杀螟硫磷、甲基嘧啶磷、除草定、艾氏剂、马拉硫磷、甲拌磷砜、异丙甲草胺、倍硫磷、三氯杀螨醇I、三氯杀螨醇II、对硫磷、毒死蜱、三唑酮、氯酞酸甲酯、菌核净、水胺硫磷、噻虫嗪、溴硫磷、仲丁灵、双苯酰草胺、异丙乐灵、氧化氯丹、毒虫畏-E、环氧七氯-顺式、特丁硫磷砜、二甲戊灵、戊菌唑、环氧七氯-反式、克菌丹、毒虫畏-Z、异柳磷、喹硫磷、三唑醇、稻丰散、灭菌丹、烯虫酯、氯丹-反式、杀扑磷、o,p'-DDE、α-硫丹、乙拌磷砜、杀虫畏、氯丹-顺式、嘧菌胺、丁草胺、氟节胺、敌草胺、苯线磷、己唑醇、抑霉唑、丙硫磷、稻瘟灵、丙溴磷、狄氏剂、p,p'-DDE、烯效唑、丙草胺、脱叶磷、 o,p'-DDD、腈菌唑、噻嗪酮、乙嘧酚磺酸酯、醚菌酯、噻呋酰胺、除草醚、异狄氏剂、噁唑啉、吡氟禾草灵、β-硫丹、乙酯杀螨醇、丰索磷、倍硫磷亚砜、苯草醚、p,p'-DDD、倍硫磷砜、o,p'-DDT、噁霜灵、乙硫磷、虫螨磷、三唑磷、三硫磷、苯霜灵、硫丹硫酸酯、丙环唑I、丙环唑II、p,p'-DDT、戊唑醇、三苯基磷酸酯、增效醚、异菌脲、苯线磷砜、溴螨酯、丁硫克百威、苯硫磷、氯虫苯甲酰胺、联苯菊酯、甲氧滴滴涕、咪唑菌酮、莎稗磷、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、溴苯磷、氰氟草酯、高效氯氟氰菊酯、氯苯嘧啶醇、吡菌磷、丙硫克百威、联苯三唑醇、氯菊酯-顺式、氯菊酯-反式、啶酰菌胺、精喹禾灵、喹禾灵、氟氰戊菊酯I、氟氰戊菊酯II、氰戊菊酯、溴氰菊酯、茚虫威、烯酰吗啉(Z)、烯酰吗啉(E)。
[0056] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在快速筛查和定量测定烟草中农药残留中的应用。
[0057] 结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。
[0058] 实施例
[0059] 1实验部分
[0060] 1.1仪器与试剂
[0062] 乙腈(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；丙酮、正己烷(色谱纯，上海安谱科技公司)；Cleanert NANO净化柱(博纳艾杰尔科技公司，天津)；50mL塑料离心管；固体农药标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于 95％；液体农药标准品及灭蚁灵标准品购自农业部环境保护所(天津)。
[0063] 1.2标准溶液的配制
[0064] 各农药单标储备液：准确称取10.0mg(精确到0.1mg)标准品，置于10mL 容量瓶中，用丙酮-正己烷(1:1，v/v)溶解定容，配制成质量浓度为1000.0mg/L 的单标储备液，贮存在-18℃冰箱中备用。
[0065] 混合标准储备液：为保证农药更好的分离效果，根据每种农药的化学性质和保留时间分为A、B、C三组。准确移取一定体积的农药单标溶液至10mL 容量瓶中，用丙酮-正己烷(1:1，v/v)溶解定容，使得混合标准储备液中各农药的质量浓度均为5.0mg/L，于4℃下避光保存。
[0066] 吸取一定体积的混合标准储备溶液、灭蚁灵内标溶液(5.0mg/L)加到一定体积的样品空白基质中，配成浓度为0.01～0.8μg/mL的基质混合标准工作溶液，在选定的色谱质谱条件下上机测定。以各组分与内标物峰面积的比值(y)与对应各组分与内标物的浓度比值(x)绘制标准曲线。184种农药的名称、保留时间及线性参数见表1。
[0067] 表1 184种农药的保留时间、相关系数、线性范围和线性方程
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074] 1.3前处理方法
[0075] 1.3.1样品前处理过程
[0076] 称取1.000g已粉碎的烟叶样品于50mL具盖离心管中，加入100μL内标 (5.0mg/L灭蚁灵)和一定量提取液，置于旋涡混合振荡仪上以2000r/min速率涡旋10min，然后以4000r/min离心10min，待净化。将NANO净化管与2 mL注射器针管串联，取一定体积上述上清液置于注射器针管内，用推杆缓慢压下，重复净化三次，流出液收集于2mL离心管中，于平行浓缩仪上以45℃减压浓缩，加入0.5mL丙酮-正己烷(1:1，v/v)复溶，经0.22μm有机系微孔滤膜过滤后，待GC-QTOF/MS测定。
[0077] 1.3.2单因素实验
[0078] 分别考察前处理过程中加水量(0、2、4、6、8mL)、溶剂用量(5、10、 15、20、25mL)和净化量(0.4、0.8、1.2、1.5、1.8mL)对目标农药回收率的影响。
[0079] 1.3.3 Box-Behnken试验设计
[0080] 在单因素实验的基础上，针对3个影响目标农药回收率的主要因素：加水量、溶剂用量和净化量，采用Design-Expert 9.0.6软件进行Box-Behnken试验设计，试验设计见表2。
[0081] 表2烟草前处理过程的响应面试验设计因素及编码
[0082]
[0083]
[0084] 1.4实验条件
[0085] 1.4.1色谱条件
[0086] 色谱柱：两根DB-5MS超高惰性毛细管色谱柱(15m×250μm×0.25μm) 通过反吹系统串联；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度60℃，保持1min 后以40℃/min速率升温至120℃，然后以5℃/min速率升温至310℃，保持5min；不分流进样；载气：氦气(纯度为
99.999％)，恒流模式，灭蚁灵用于进行保留时间锁定，适时调节色谱柱1和柱2流速；反吹：
开始时间40.5min，压力 50psi；自动进样，进样量为1μL。
99.999％)，恒流模式，灭蚁灵用于进行保留时间锁定，适时调节色谱柱1和柱2流速；反吹：
开始时间40.5min，压力 50psi；自动进样，进样量为1μL。
[0087] 1.4.2质谱条件
[0088] 离子源：EI；电离能70eV；离子源温度:280℃；传输线温度:280℃；溶剂延迟4min；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，扫描范围m/z 50～500，采集速率5spectrum/s，模式4Ghz；
采集软件：安捷伦MassHunter工作站。
采集软件：安捷伦MassHunter工作站。
[0089] 2结果与讨论
[0090] 2.1提取溶剂选择
[0091] 本发明考察的目标农药包含有机氯类、有机磷类和氨基甲酸酯类等多种类别，溶解性和极性差异较大的化合物，因此要求提取溶剂与目标农药间的溶解性好，渗透力强。由于烟草基质的复杂性，在保证提取效率的基础上，提取液中的共萃取杂质含量应尽可能少。目前农药多残留分析方法中，以乙腈，丙酮，乙酸乙酯以及丙酮-正己烷混合溶剂最为常用。
[0092] 以1.3.1节方法对烟草样品进行前处理，目标农药的加标回收率为指标，考察了乙腈，乙酸乙酯，以及丙酮-正己烷(1:1，v/v)作为提取溶剂的提取效果。不同溶剂得到的目标农药回收率范围见图1。结果表明，三种溶剂提取效果较好。但乙酸乙酯为提取溶剂时，部分极性较大的有机磷农药的提取不完全，提取液中共存较多的脂类、蛋白质，不利于净化；而采用丙酮-正己烷(1:1，v/v) 为提取溶剂，由于其非极性较强，导致提取的色素物质较多，同时共存有脂类等物质，影响定性和定量的稳定性，仪器维护成本相应提高。而乙腈提取的杂质较少，另外对一些拟除虫菊酯类农药和部分极性较强的农药的提取效率较高，因此，最终选择以乙腈为提取溶剂。
[0093] 2.2前处理方法优化
[0094] 2.2.1单因素试验
[0095] 在各农药添加浓度为0.5μg/g时，按1.3.2节设计各试验处理，并对各处理样品按1.3.1节方法进行前处理，计算各处理目标农药加标回收率在60～120％范围内的比例，结果见图2。从图2中可以看出，在固定其余两个因素的条件下，随着加水量的增加，范围内的农药比例呈现下降趋势；而溶剂用量与净化量对农药比例的影响均呈现先上升后下降的趋势。当加水量为2mL、溶剂用量 10mL和净化量0.8mL时，接近各单因素的最大响应值，以此为基础，采用响应面试验对各参数进一步优化。
[0096] 2.2.2响应面优化试验
[0097] 在单因素试验的基础上，选择加水量、溶剂用量和净化量为因素，每个因素设置3个水平，回收率在60～120％范围内的农药比例(Y)为响应值，采用 Box-Behnken试验设计建立数学模型，进行响应面分析。响应面优化试验设计方案及结果见表3，回归模型方差分析结果见表4。
[0098] 表3响应面优化试验结果
[0099]
[0100]
[0101] 表4回归模型方差分析结果
[0102]
[0103] 应用Design-expert 8.0.6软件对表3数据进行分析，得到农药比例(Y)对各因素的回收方程：
[0104] Y＝76.74-12.25A+17.43B+6.89C+4.20AB+4.14AC+2.80BC+1.44A2-7.71B2-9.78C2。由表4可知，该模型影响极显著(P<0.01)，且失拟项不显著(P＝0.2568>0.05)，说明回归方程与实际拟合中非正常误差所占比例较小，回归系数R2为0.9872，表明模型相关度好；变异系数为4.27％，说明实验稳定性良好。
[0105] 方差分析结果显示，在所选各因素水平范围内，A、B、C、AB、AC、B2、 C2的P值均小于0.05，说明以上因素对农药回收率有显著影响；其余因素的P 值大于0.05，说明影响不显著。本实验中各因素的主效应关系为溶剂用量>加水量>净化量。由回归方程绘制的响应面三维分析图见图3～5。
[0106] 结合回归模型的分析结果，烟草样品最优前处理过程参数为：加水量0mL，溶剂用量14.53mL，净化量0.91mL，在此条件下，60～120％范围内农药比例为94.8％。结合实际情况，确定前处理过程参数为：加水量0mL，溶剂用量15 mL，净化量1mL。在此条件下，农药比例为94.5％，说明该模型可靠，前处理过程参数可靠。
[0107] 2.3基质效应
[0108] 使用色谱法进行多种农药残留检测时，基质效应是普遍存在的现象，是影响检测结果准确性和重复性的重要因素。气相色谱系统中，大多数农药表现出不同程度的基质增强效应，一般认为是由于实际样品检测时，由于样品中的杂质分子与待测农药分子竞争进样口、柱头以及质谱系统的活性位点，从而使待测物与活性位点的反应机会减少，待测分子的损失减少，因此，相同含量的待测物在实际样品中要比在纯溶剂标样中的响应值高。基质效应与待测物的化学结构和性质密切相关，一般热不稳定、极性、具有氢键结合能力的农药在气相色谱系统中基质效应较强。本发明比较了相同浓度下目标农药在纯溶剂和基质溶液中的峰面积，得到基质效应相对强度，ME(基质效应)＝(基质标准样品的峰面积/试剂标准样品的峰面积)。结果表明绝大多数的农药表现为基质增强效应，因此本发明选择空白基质配置标准曲线来校正基质效应。
[0109] 2.4筛查方法建立与验证
[0110] 在优化的色谱、质谱条件下，对184种农药分别进行全扫描，采集目标农药的高分辨质谱图，将其导入PCDL(Personal Compound Database and Library) 软件中，输入每种农药的名称、保留时间、分子式、精确质量数、CAS号以及结构式等信息，建立184种农药化合物的精确质量数据库。在安捷伦Masshunter Qualitative Analysis Workflows定性筛查软件中，选择自建的184种农药精确质量数据库，设定检索保留时间偏差为±0.15min，精确质量偏差为±20ppm，最小合格碎片数量为1个，共流出匹配得分≥60分，按离子碎片信息进行自动检索，软件将依据保留时间、精确质量偏差、同位素峰分布和丰度比来计算每种化合物的实测值与谱库中理论值的偏差，并给出匹配得分。在筛查定性分析中，定性和定量离子比值是判断假阳性存在与否的重要参数，Workflow软件中默认两者比例高于75分时合格，当共流出匹配得分满足要求，但定性、定量离子比值得分小于75分时，软件给出的匹配结果会给予警示，表示存在假阳性可能，此时需手动进行验证。
[0111] 将0.05、0.1、0.5μg/g三个添加浓度的空白基质加标样品采用优化的前处理方法进行处理、检测后，按上述方法进行筛查验证，并统计筛查出的农药种类。以匹配得分≥60分的最低浓度为筛查限，结果表明：71.74％的农药的筛查限为0.05μg/g，20.6％的农药筛查限为0.1μg/g，6.5％的农药筛查限为0.5μg/g，另有1％左右的农药筛查限大于0.5μg/g。筛查限大于0.5μg/g的两种农药分别为乙草胺或甲基对硫磷、莠去津或β-六六六。筛查流程中，软件需首先对总离子流色谱图进行积分，然后根据精确质量数进行组分识别。乙草胺和甲基对硫磷、莠去津和β-六六六，这两对农药在色谱柱中未完全分离，积分时默认为一个组分，所以筛查过程中只识别了其中一种农药，导致出现假阴性结果，因此实际样品分析时，对于保留时间接近的农药，建议采用手动识别方法进一步进行确证。此外，实验中发现，仪器的状态对部分有机磷农药如乙酰甲胺磷、甲胺磷、氧化乐果等组分影响较大。如果进样系统不太清洁，组分会有降解和损失，导致色谱峰拖尾严重，影响定性、定量分析的准确性。
[0112] 2.5方法学验证
[0113] 2.5.1线性关系及检出限、定量限
[0114] 按照1.2节方法制作空白基质标准溶液，进行GC-QTOF/MS检测。以各农药与内标物峰面积的比值(y)与对应各农药与内标物的浓度比值(x)为参数，利用工作站软件绘制标准2
曲线。线性范围、线性方程与相关系数结果见表1。所有农药线性关系良好，相关系数(R)均大于0.995。以S/N＝3和S/N＝10分别计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，定量限结果见表5。表5中各农药的定量限均低于CORASTA烟草农残限量(GRLs)，方法适用于所述农药在烟草中的定量分析。
曲线。线性范围、线性方程与相关系数结果见表1。所有农药线性关系良好，相关系数(R)均大于0.995。以S/N＝3和S/N＝10分别计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，定量限结果见表5。表5中各农药的定量限均低于CORASTA烟草农残限量(GRLs)，方法适用于所述农药在烟草中的定量分析。
[0115] 2.5.2回收率与精密度
[0116] 选取空白烟草样品，添加一定量的混合标准储备液，分别制成添加量为 0.05、0.25、0.5μg/g加标样品，每个添加水平平行3次。以1.3节方法进行前处理，1.4节条件进行测定，计算各农药平均回收率和相对标准偏差(RSD)，结果如表5所示。从表5可以看出，在三个添加浓度水平下，除二溴氯丙烷、乙酰甲胺磷、速灭磷、二溴磷、乙拌磷、灭菌丹、六氯苯、百菌清和甲硫威回收率较低外，其他农药的平均回收率分别为62.05～122.19％、65.18～
120.21％和 68.55～119.41％，回收率的相对标准偏差(RSD)分别为0.16～14.04％、0.15～12.06％和0.03～14.92％(n＝3)。
120.21％和 68.55～119.41％，回收率的相对标准偏差(RSD)分别为0.16～14.04％、0.15～12.06％和0.03～14.92％(n＝3)。
[0117] 表5 184种农药回收率和定量限结果
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124] 2.6实际样品的分析
[0125] 采用建立的GC-QTOF/MS农药残留快速筛查确证技术对不同产地的9个烟草样品进行检测。每个样品均有农药残留检出，共检出筛查得分≥60分农药19 项次，涉及农药8种。分别为仲丁灵、二甲戊灵、三唑醇、甲霜灵、戊菌唑、联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯和氟节胺，分属于除草剂、杀菌剂、杀虫剂和植物生长调节剂。采用基质匹配校准曲线对检出的农药进行定量，结果表明8种农药均未超过CORASTA烟草农残限量。
[0126] 本发明采用滤头式固相萃取技术作为净化方法，并利用Box-Behnken响应面法对净化方法进行优化，结合气相色谱-四级杆飞行时间质谱检测，建立了烟草中184种农药残留的快速筛查和定量测定方法。与串联四极杆质谱检测技术相比，虽然定量限稍高，但凭借建立的高分辨质谱数据库，结合TOF全扫描模式，利用筛查软件的自动检索功能，可以实现不需标准品对照的农药残留高通量快速筛查，简化了繁琐的农药标准溶液配制过程，大大提高了工作效率。此外还可根据实际工作的需要，进一步扩展高分辨质谱数据库中农药的种类和数量。在实际应用中，可以先利用该方法对样品进行高通量筛查，在大量样品中排查出疑似农药，配置疑似农药标准溶液，然后利用该方法定量功能或气相色谱-三重四极杆质谱等手段对疑似农药进行定量分析，可大大缩短样品分析时间，减少人力物力消耗、提高检测效率。本方法为烟草中多种类农药残留的快速高通量筛查和检测工作提供了技术支持。
[0127] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 新的取代的异噻唑并吡啶酮、其制备方法及其用作除草剂和/或植物生长调节剂的用途 | 2020-05-08 | 328 |
| 一类具有杀虫活性的新型苦参碱衍生物及制备方法和应用 | 2020-05-08 | 82 |
| 一种含纳米硫组合物及其应用 | 2020-05-08 | 550 |
| 含甲氰菊酯和毒死蜱的复合杀虫杀螨纳米水剂及其制备方法和用途 | 2020-05-08 | 393 |
| 含甲氰菊酯和高效氯氟氰菊酯的复合杀虫杀螨纳米水剂及其用途 | 2020-05-11 | 293 |
| 一种含有藜芦碱的杀虫组合物 | 2020-05-11 | 830 |
| 一种松香源农药增效剂的制备方法及其应用 | 2020-05-11 | 167 |
| 水分散粒状组合物 | 2020-05-11 | 890 |
| 含哌啶的嘧啶类化合物及用途 | 2020-05-08 | 349 |
| 阿维菌素B2a肟醚类衍生物及其在农药上的应用 | 2020-05-11 | 837 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈