桔草菌酵素（ＳＵＢＴＩＬＡＳＥ）變異體 SUBTILASE VARIANTS

专利汇可以提供桔草菌酵素（ＳＵＢＴＩＬＡＳＥ）變異體 SUBTILASE VARIANTS专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本發明係關於新穎的枯草菌酵素變異體，其相較於親本枯草菌酵素具有一或更多性質的改變，包括：洗滌效果、熱穩定性、儲藏穩定性或催化活性。本發明的變異體適合用於例如清洗或清潔劑組成物中，諸如洗衣清潔劑組成物及洗碗組成物，包括自動洗碗組成物。 The present invention relates to novel subtilase variants exhibiting alterations relative to the parent subtilase in one or more properties including: Wash performance, thermal stability, storage stability or catalytic activity. The variants of the invention are suitable for use in e.g. cleaning or detergent compositions, such as laundry detergent compositions and dish wash compositions, including automatic dish wash compositions. 【創作特點】 發明簡述
所以，在本發明的第一方面係關於一枯草菌酵素變異體，其包括至少a)於一或更多個 位置 62、68、97、98、99、106、131、170、245、252插入、置換或缺失下列其中一個胺基酸殘基K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、T並且至少有下列之一的修飾 ＊ 0AQSVPWG；A1T,V；Q2L；S3T,A,L；V4L,A；I8V,T；S9G,D,R,K,L,V；R10H,K；V11A；Q12D；A13V；P14S,T,D,A,M,V,K,Q,L,H,R,I；A15M,T；A16P；H17R；N18S,H；R19W,K,L,F,G,I；G20 ＊ ,R,A；L21F,LP,LW,LA,LG；T22S,A,K,TV,TG,TL,TW,TV,G,L,TY；G23S；S24P；K27R,V28I；V30I；I35T,V；T38S；P40L；N43D；R45H,K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A,I,D；P52V,A；P55S,A；S57P；G61E,D,S,R,GP；N62D,ND,NE,DE,NG,E,S；V68A,S,L,I；T71A；I72V；L75I；N76S,D；N77S；S78T；V81A；A85T； S87C；A88V,T；E89G；K94N；V95C,T；L96LA,LG；G97E,D,W,A,GG,GA,GV,N,GS；A98S,D,E,T,AS,AD,AV,AE,AH,Q,N,M,L,G,R,V,S；S99D,L,A,AD,SD,SM,SG,DA,P,G,N,C,M,V,I；G100S,GE,C；S101SA,SK；G102D,S；S103D,E,Y,L,Q,H,T；V104T,S,R,I,N,M,L,D；S106D,E,T,M,G,A,L,F,I；I107T,V,M；A108V,T,S；L111I,V；A114V；N116S,D；G118D；M119L,I,V,A,S；H120N,D,Q,K,E,Y,S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N,I,G,C；P129PSN,T,E,D,S,N,A；S130P,T,C, ＊ ；P131M,F,W,L,A,H,T, ＊ ,PA,S,Q,R,E,G,D,C；S132G,T；A133ASA；T134A；Q137H,E,D；A138G,V；V139L,I；N140D,K；T143A；S144D,N,P；R145G；V150I；A151V,G；A152P；A158T,V,C,E,L,D,M；G160A,D；S163G,C,N,A；Y167K,A,I；A168G；A169G；R170C,S,H,L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L,I,V,A,S,T；N183D；N184D,S；N185S,D；R186L,C,H；S188G；S190A；Y192H；G195F,E；V203S,A,L,Q,M,F,I；N204T,D,S；Q206L；Y209C,H；G211D；S212N,L；T213A；Y214C,H；A215D,T；N218D,S；M222L,I,V,A,S；A223G；T224A,S；A228T；A230V；A232S,L,T,P；V234I；Q236A,L,D,T,C,M,F,S；K237R；N238D；P239T,S；S240F；S242T；V244I,M,A；Q245R,K,E,D,T,F,N,V,W,G,I,S,C,L,A,M；N248P,D,S；K251E,R；N252G,H,D,V,M,S,T,E,Y,S,Q,K,A,L；A254S； T255A,S；S256N,R,G；L257G；G258K,S259A,N,G；T260A,R；N261D；L262S,Q,V；Y263H,F；G264E；S265G,R,N；V268L,I；N269T；N296K；E271A；T274S,L,A,R或b)下列之一的組合變異體A108T+L111V；L124I+S125A；P129S+S130AT；L96LA+A151G+V203A；S49N+V203L+N218D；S3T+A16P+R45C+G100S+A230V；I8V+R19K+V139I；N76D+A174AL+A194P+A230V；N185R；N62NE；H120Q+Q137E,G61GE,G61GS,G100L,A133D,V68A,N123D,L111F+Y263H,V11A+G61GE+V227A+S240F,A133E+S144K+N218D,S128A+P129S+S130SP,S9R+A15T+T22TQ+S101P,S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S,G97E,Q245W,S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H,S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D,S9R+A15T+L111I+Q137E,S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E,S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E,S9R+A15T+T260M,S9R+A15T,Q245I,S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D,S9R+A15T+S130P,Q245F,S9R+A15T+N218D,G63E+N76D+A194P+A230V,S9R+A15T+T224A,G100S,S9R+A15T+D60DG,A138V+V139I+A194P+N218D+A230V, A108V+A169G+R170A+Y171H,I8V+P14L+R19L+V30I+I35V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N,A133D+T134S+Q137A,Q137D,A98AH,V51D,Q12E+P14L+A15T,G63E+N76D+A194P+A230V,Q12E+P14L+A15T,G97GS或c)在位置68有一或更多修飾，其中該修飾包括：缺失、插入及/或置換選自由K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S及T所組成之族群的胺基酸殘基。
在本發明的第二方面係關於一枯草菌酵素變異體，其包括a)一或更多下列修飾的組合X62D,XD,XE,XG,DE X68A,S,L,I X97E,D,W,A,N,XG,XA,XV,XS X98S,D,E,T,XS,XD,XV X99D,L,A,P,G,N,AD,XD,XM,XG,DA X106D,E,T,M,G,A,L,F,I X131M,F,W,L,A,H,T, ＊ ,S,Q,R,E,G,XA X170C,S,H X245R,K,E,D,T,F,N,V,W,G,I,S,C,L,A X252G,H,D,V,M,S,T,E,Y,S,Q,K具有至少下列之一的修飾 ＊ 0AQSVPWG；A1T,V；Q2L；S3T,A,L；V4L,A；I8V,T； S9G,D,R,K,L,V；R10H,K；V11A；Q12D；A13V；P14S,T,D,A,M,V,K,Q,L,H,R,I；A15M,T；A16P；H17R；N18S,H；R19W,K,L,F,G,I；G20 ＊ ,R,A；L21F,LP,LW,LA,LG；T22S,A,K,TV,TG,TL,TW,TV,G,L,TY；G23S；S24P；K27R,V28I；V30I；I35T,V；T38S；P40L；N43D；R45H,K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A,I,D；P52V,A；P55S,A；S57P；G61E,D,S,R,GP；N62D,ND,NE,DE,NG,E,S；V68A,S,L,I；T71A；I72V；L75I；N76S,D；N77S；S78T；V81A；A85T；S87C；A88V,T；E89G；K94N；V95C,T；L96LA,LG；G97E,D,W,A,GG,GA,GV,N,GS；A98S,D,E,T,AS,AD,AV,AE,AH,Q,N,M,L,G,R,V,S；S99D,L,A,AD,SD,SM,SG,DA,P,G,N,C,M,V,I；G100S,GE,C；S101SA,SK；G102D,S；S103D,E,Y,L,Q,H,T；V104T,S,R,I,N,M,L,D；S106D,E,T,M,G,A,L,F,I；I107T,V,M；A108V,T,S；L111I,V；A114V；N116S,D；G118D；M119L,I,V,A,S；H120N,D,Q,K,E,Y,S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N,I,G,C；P129PSN,T,E,D,S,N,A；S130P,T,C, ＊ ；P131M,F,W,L,A,H,T, ＊ ,PA,S,Q,R,E,G,D,C；S132G,T；A133ASA；T134A；Q137H,E,D；A138G,V；V139L,I；N140D,K；T143A；S144D,N,P；R145G；V150I；A151V,G；A152P；A158T,V,C,E,L,D,M；G160A,D；S163G,C,N,A；Y167K,A,I；A168G；A169G；R170C,S,H,L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L,I,V,A,S,T；N183D； N184D,S；N185S,D；R186L,C,H；S188G；S190A；Y192H；G195F,E；V203S,A,L,Q,M,F,I；N204T,D,S；Q206L；Y209C,H；G211D；S212N,L；T213A；Y214C,H；A215D,T；N218D,S；M222L,I,V,A,S；A223G；T224A,S；A228T；A230V；A232S,L,T,P；V234I；Q236A,L,D,T,C,M,F,S；K237R；N238D；P239T,S；S240F；S242T；V244I,M,A；Q245R,K,E,D,T,F,N,V,W,G,I,S,C,L,A,M；N248P,D,S；K251E,R；N252G,H,D,V,M,S,T,E,Y,S,Q,K,A,L；A254S；T255A,S；S256N,R,G；L257G；G258K,S259A,N,G；T260A,R；N261D；L262S,Q,V；Y263H,F；G264E；S265G,R,N；V268L,I；N269T；N296K；E271A；T274S,L,A,R.
在本發明的第三方面係關於一枯草菌酵素變異體，其包括至少下表I中所揭示的一個改變：
其中(a)表I的變異體顯現了蛋白酶活性，及(b)每一個位置係相當於枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)BPN’胺基酸序列的位置，顯示於圖1及序列辨識號碼：1。
在本發明第四方面係關於一經分離的多核苷酸，其編碼了本發明的枯草菌酵素變異體。
在本發明第五方面係關於一表現載體，其包括了本發明的經分離的多核苷酸。
在本發明第六方面係關於一 微 生物 寄主細胞，其係經本發明的表現載體所轉形。
在本發明第七方面係關於一製造根據本發明之枯草菌酵素變異體的方法，其中根據本發明的寄主係培養在可表現及分泌該變異體的環境中，且該變異體被回收。
在本發明第八方面係關於一清洗或清潔劑組成物，較佳的是洗衣或洗碗劑組成物，其包括本發明的變異體。
在本發明第九方面係關於一枯草菌酵素變異體，其包括至少一個揭示於下表II的改變：表II，本發明的枯草菌酵素變異體具有一或更多的改變：
其中(a)表II的變異體顯現了蛋白酶活性，及(b)每一個位置係相當於枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)BPN’胺基酸序列的位置，顯示於圖1及序列辨識號碼：1。
在本發明第十方面係關於一枯草菌酵素變異體，其包括N252D及N252M之一的改變。
在本發明第十一方面係關於一枯草菌酵素變異體，其包括一或更多改變：M119L,I,V,A,S；M175L,I,V,A,S及M222L,I,V,A,S合併有上表I及II所列之枯草菌酵素變異體。
關於排列及編號，參照圖1，其顯示了枯草桿菌蛋白酶BPN’(a)(BASBPN)及枯草桿菌蛋白酶309(b)(BLSAVI)之間的排列。此排列於本專利申請案中係作為殘基編號的參照。
定義
在進一步討論本發明的細節之前，先定義下列術語及常規。
我們參照WO 00/71691(始自第五頁，在此併入作為參考)作胺基酸及核酸命名的詳細描述。
命名變異體的命名法及常規
描述各種根據本發明所製造或思及的枯草菌酵素酵素變異體，使用下列命名法及常規以方便參照：參照的架構係藉由將經分離的或親本酵素與枯草桿菌蛋白酶BPN’(BASBPN)排列來先定義。
可以藉由GCG套組9.1版的GAP例行程序來編號變異體得到排列，使用下列參數：空隙(gap)產生違規=8及空隙延長違規=8及其他所有參數維持其內設值。
另一個方法是用已知的經識別的枯草菌酵素之間的排列，諸如WO 91/00345中所指的排列。在大多數的情況裡，差異並不重要。
因此，缺失及插入的編號的定義係關於BASBPN(序列辨識號碼：1)。在圖1中，相較於BASBPN，枯草桿菌蛋白酶309(序列辨識號碼：2)有六個缺失在位置36、58、158、162、163及164。這些缺失在圖1以星號( ＊ )表示。
關於修飾命名的詳細描述，我們參照WO 00/71691第7-12頁(在此併入作為參考)，該修飾係藉遺傳操作導入多肽中。
蛋白酶
切割蛋白質基質醯胺鍵的酵素係被分類為蛋白酶或(可交替的)胜肽酶(見沃許，1979，酵素反應機制，W.H.Freeman and Company，舊金山，第3章)。
胺基酸位置/殘基的編號
若無特別提及，在此所用的胺基酸編號係相當於枯草菌酵素BPN’(BASBPN)序列的編號。BPN’序列的進一步描述見圖1，序列辨識號碼：1或席森等人的蛋白質工程4(1991)719-737。
絲 氨 酸蛋白酶
絲氨酸蛋白酶是催化胜肽鍵 水 解 的酵素，且在活性區有一重要的絲氨酸殘基(懷特、韓德樂及史密斯在1973的生物化學原理第五版，McGraw-Hill Book Company，紐約，第271-272頁)。
細菌的絲氨酸蛋白酶具有分子量20,000至45,000道 耳 吞的範圍。其會被氟 磷酸 二異丙酯所抑制。其水解簡單的終端酯，且與真核細胞的胰凝 乳蛋白 酶及絲氨酸蛋白酶活性相似。更狹義的術語「鹼性蛋白酶」涵蓋一亞族，是具有高的最適pH的一些絲氨酸蛋白酶，從pH 9.0至11.0(回顧見普利斯特(1977)細菌生物學回顧41 711-753)。
枯草菌酵素
暫時稱為枯草菌酵素的絲氨酸蛋白酶亞群是由席森等人的蛋白質工程4(1991)719-737及席森等人的蛋白質科學6(1997)501-523所提出的。它們是藉由同源分析超過170個先前被認為是類-枯草桿菌蛋白酶蛋白酶的絲氨酸蛋白酶胺基酸序列而定義的。枯草桿菌蛋白酶先前通常被定義為絲氨酸蛋白酶，係由格蘭氏陽性菌或 真菌 所製造，且據席森等人現在是枯草菌酵素的亞群。有許多種類的枯草菌酵素已被鑑認出來，且一些枯草菌酵素的胺基酸序列也已被決定。關於此等枯草菌酵素及其胺基酸序列更詳細的描述請參見席森等人(1997)。
枯草菌酵素的其中一個亞群I-S1或「真」枯草桿菌蛋白酶包含「傳統的」枯草桿菌蛋白酶，諸如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168)、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE ® ，NOVOZYMES A/S)、及枯草桿菌蛋白酶DY(BSSDY)。
枯草菌酵素另外的亞群I-S2或高鹼性枯草桿菌蛋白酶係被席森等人(在前)所識別出。亞群I-S2蛋白酶係描述為高鹼性枯草桿菌蛋白酶，並包含諸如枯草桿菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL ® ，Genencor International Inc.)、枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE ® ，NOVOZYMES A/S)、枯草桿菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE ® ，NOVOZYMES A/S)、及鹼性彈 力 蛋白酵素YaB(BSEYAB)的酵素。
“SAVINASE®”
SAVINASE®是由NOVOZYMES A/S所市售。其是來自遲緩芽孢桿菌(B.Lentus)的枯草桿菌蛋白酶309，且與BAALKP只有在一個位置(N87S)不同。SAVINASE®具有圖1及序列辨識號碼：2中指為b)的胺基酸序列。
親本枯草菌酵素
術語「親本枯草菌酵素」係描述根據席森等人(1991及1997)所定義的枯草菌酵素。進一步詳述見上面「枯草菌酵素」的描述。親本枯草菌酵素也可以是從天然來源所分離的枯草菌酵素，其中接下來的修飾當維持枯草菌酵素的特徵。此外，親本枯草菌酵素可以是經由DNA重排(shuffling)技術所製造的枯草菌酵素，諸如J.E.耐斯等人在自然生物科技，17，893-896(1999)中所描述的。
或者，術語「親本枯草菌酵素」可以稱為「野生型枯草菌酵素」。
表列在此所述之各種枯草菌酵素的縮寫作為參照，進一步的縮寫參見席森等人的蛋白質工程4(1991)719-737及席森等人的蛋白質科學6(1997)501-523。
枯草菌酵素變異體的修飾
在此所用的術語「修飾」係定義為包括枯草菌酵素的化學修飾以及編碼了枯草菌酵素之DNA的基因操作。該修飾可以是胺基酸支鏈的置換、取代、缺失及/或插入感興趣的胺基酸。
枯草菌酵素變異體
在本發明的內文中，術語「枯草菌酵素變異體」或「突變的枯草菌酵素」係指由一有機體產生的枯草菌酵素者，該有機體可表現源自親本微生物的突變基因，該親本微生物含有原始或親本基因並產生相應親本酵素，親本基因的突變係為了產生突變基因，使得在合適的宿主中表現時可以產生突變的枯草菌酵素蛋白酶。
枯草菌酵素序列的同源性
兩段胺基酸序列之間的相似性在本文中係以「一致性」來描述。
為了決定兩段枯草菌酵素之間的一致性程度，可以使用(以下)GCG系統第9.1版的GAP例行程序，使用相同的設定，該例行程序所得的結果除了胺基酸排列還有兩段序列「一致性百分比」的計算。
根據這個描述，對於習於該項技術者來說可以容易的鑑認適合之能夠根據本發明作修飾的同源枯草菌酵素。
經分離的多核苷酸
當用在多核苷酸時，術語「經分離的」係指該多核苷酸被從其天然的基因環境中移出，並因而沒有其他外來的或不想要的編碼序列，且是以一適合用於經基因工程的蛋白質生成系統中的形式。此等經分離的分子係從其天然環境中分離出來的，並包括cDNA和基因選殖株。經分離的本發明DNA分子不含其他通常相關聯的基因，但可包括天然發生的5'和3'不轉譯區，諸如啟動子和終結子，相關區域的鑑認對習於該項技術者而言是顯而易知的(例如參見狄南和逖簡的自然316：774-78，1985)。術語「經分離的多核苷酸」可替換為術語「經選殖的多核苷酸」。
經分離的蛋白質
當用於蛋白質時，術語「經分離的」係指從其天生環境被移出的蛋白質，在較佳的形式下，該經分離的蛋白質實質上不含其他蛋白質，尤其是其他相似蛋白質(即「同源雜質」(見下面))。
經分離的蛋白質係超過10%的純度，較佳的係大於20%純度，更佳的是大於30%純度，其係以SDS-PAGE決定。進一步，較佳的為提供一高純度形式的蛋白質，即大於40%純度、大於60%純度、大於80%純度，更佳是大於95%純度，及最佳是大於99%純度，其係以SDS-PAGE決定。
術語「經分離的蛋白質」可替換為術語「經純化的蛋白質」。
同源雜質
術語「同源雜質」係指任何雜質(例如另一個除了本發明枯草菌酵素的多肽)，其源自本發明枯草菌酵素所得自的同源細胞。
得自
在此所用之術語「得自」特定微生物來源係指由特定來源或插入了來自來源之基因的細胞所生成的多核苷酸及/或枯草菌酵素。
基質
與蛋白酶基質連用的術語「基質」係應做最廣的解釋為包括含有至少一個可以被枯草桿菌蛋白酶蛋白酶水解的肽(醯胺)鍵的化合物。
產物
在本發明文中與源自一蛋白酶酵素反應之產物的術語「產物」應解釋為包括牽涉枯草菌酵素蛋白酶水解反應的產物，產物可以是後續水解反應的基質。
洗滌效果
本文中的術語「洗滌效果」係指在例如清洗或硬質表面清洗時，作為酵素移除位在欲清洗之目標上的蛋白質或有機染點的能力，亦可參見此處實施例3的洗滌效果測試。
發明詳述
本發明係關於新穎的枯草菌酵素變異體，其表現了相對於親本枯草菌酵素一或更多性質的改變，包括：洗滌效果、熱穩定性、儲藏穩定性或催化活性。
涵蓋於本發明的變異體係當與野生型枯草菌酵素相較時，有一或更多胺基酸殘基被取代、刪除或插入的變異體，該變異體至少包括a)在一或更多的位置62、68、97、98、99、106、131、170、245、252插入、置換或缺失下列胺基酸殘基之一：K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、T並且有至少下列之一的修飾 ＊ 0AQSVPWG；A1T,V；Q2L；S3T,A,L；V4L,A；I8V,T；S9G,D,R,K,L,V；R10H,K；V11A；Q12D；A13V；P14S,T,D,A,M,V,K,Q,L,H,R,I；A15M,T；A16P；H17R；N18S,H；R19W,K,L,F,G,I；G20 ＊ ,R,A；L21F,LP,LW,LA,LG；T22S,A,K,TV,TG,TL,TW,TV,G,L,TY；G23S；S24P；K27R,V28I；V30I；I35T,V；T38S；P40L；N43D；R45H,K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A,I,D；P52V,A；P55S,A；S57P；G61E,D,S,R,GP；N62D,ND,NE,DE,NG,E,S；V68A,S,L,I；T71A；I72V；L75I；N76S,D；N77S；S78T；V81A；A85T；S87C；A88V,T；E89G；K94N；V95C,T；L96LA,LG；G97E,D,W,A,GG,GA,GV,N,GS；A98S,D,E,T,AS,AD,AV,AE,AH,Q,N,M,L,G,R,V,S；S99D,L,A,AD,SD,SM,SG,DA,P,G,N,C,M,V,I；G100S,GE,C；S101SA,SK；G102D,S；S103D,E,Y,L,Q,H,T；V104T,S,R,I,N,M,L,D；S106D,E,T,M,G,A,L,F,I；I107T,V,M；A108V,T,S；L111I,V；A114V；N116S,D；G118D；M119L,I,V,A,S； H120N,D,Q,K,E,Y,S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N,I,G,C；P129PSN,T,E,D,S,N,A；S130P,T,C, ＊ ；P131M,F,W,L,A,H,T, ＊ ,PA,S,Q,R,E,G,D,C；S132G,T；A133ASA；T134A；Q137H,E,D；A138G,V；V139L,I；N140D,K；T143A；S144D,N,P；R145G；V150I；A151V,G；A152P；A158T,V,C,E,L,D,M；G160A,D；S163G,C,N,A；Y167K,A,I；A168G；A169G；R170C,S,H,L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L,I,V,A,S,T；N183D；N184D,S；N185S,D；R186L,C,H；S188G；S190A；Y192H；G195F,E；V203S,A,L,Q,M,F,I；N204T,D,S；Q206L；Y209C,H；G211D；S212N,L；T213A；Y214C,H；A215D,T；N218D,S；M222L,I,V,A,S；A223G；T224A,S；A228T；A230V；A232S,L,T,P；V234I；Q236A,L,D,T,C,M,F,S；K237R；N238D；P239T,S；S240F；S242T；V244I,M,A；Q245R,K,E,D,T,F,N,V,W,G,I,S,C,L,A,M；N248P,D,S；K251E,R；N252G,H,D,V,M,S,T,E,Y,S,Q,K,A,L；A254S；T255A,S；S256N,R,G；L257G；G258K,S259A,N,G；T260A,R；N261D；L262S,Q,V；Y263H,F；G264E；S265G,R,N；V268L,I；N269T；N296K；E271A；T274S,L,A,R或b)下列組合變異體之一A108T+L111V；L124I+S125A；P129S+S130AT；L96LA+A151G+V203A；S49N+V203L+N218D； S3T+A16P+R45C+G100S+A230V；I8V+R19K+V139I；N76D+A174AL+A194P+A230V；N185R；N62NE；H120Q+Q137E,G61GE,G61GS,G100L,A133D,V68A,N123D,L111F+Y263H,V11A+G61GE+V227A+S240F,A133E+S144K+N218D,S128A+P129S+S130SP,S9R+A15T+T22TQ+S101P,S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S,G97E,Q245W,S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H,S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D,S9R+A15T+L111I+Q137E,S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E,S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E,S9R+A15T+T260M,S9R+A15T,Q245I,S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D,S9R+A15T+S130P,Q245F,S9R+A15T+N218D,G63E+N76D+A194P+A230V,S9R+A15T+T224A,G100S,S9R+A15T+D60DG,A138V+V139I+A194P+N218D+A230V,A108V+A169G+R170A+Y171H,I8V+P14L+R19L+V30I+I35V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N,A133D+T134S+Q137A,Q137D,A98AH,V51D,Q12E+P14L+A15T,G63E+N76D+A194P+A230V,Q12E+P14L+A15T,G97GS或c)在位置68有一或更多修飾，其中該修飾包括：缺失、插入及/或置換選自由下列胺基酸殘基所組成的群組：K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S及T。
進一步，本發明變異體包括至少一或更多表I及II所示的改變，其中(a)表I及II的變異體具有蛋白酶活性，及(b)各位置係對應於枯草桿菌蛋白酶BPN’(序列辨識號碼：1)胺基酸序列的位置。
本發明枯草菌酵素變異體的第一方面可以是經鑑認及分離自天然的親本或野生型枯草菌酵素，此等親本野生型枯草菌酵素可用技藝中已知的標準技術專一性的篩選出。
進行此步驟的一較佳方式係藉由PCR從許多不同微生物(較佳的係從不同芽孢桿菌屬菌株)的枯草菌酵素中專一性放大有興趣的保守性DNA區域。
枯草菌酵素係一群保守性酵素，在其DNA及胺基酸序列為同源的，所以，能夠針對有興趣之多核苷酸序列兩側構築一相當專一性的引子。
使用此等PCR引子從一群不同的微生物(較佳的為不同的芽孢桿菌屬菌株)中放大DNA，接著對該經放大的PCR 片段 做DNA定序，能夠鑑認出可以產生本發明枯草菌酵素變異體的株。當鑑認出此等有興趣之枯草菌酵素的株及部分DNA序列後，完成此枯草菌酵素的選殖、表現及純化對習於該項技術者而言就是例行程序了，然而，此係設想本發明的枯草菌酵素變異體絕大多數是親本枯草菌酵素的變異體。
適合於此處所描述之用途的枯草菌酵素變異體可以用技藝中已知的標準技術來構築，諸如藉由定點/隨機突變或藉由不同枯草菌酵素序列的DNA重排(shuffling)，進一步細節參見本案「材料與方法」章節及實施例1(參見下面)。
如同習於該項技術者所了解的，此處所描述的變異體可包含一或更多進一步的修飾，特別是一或更多進一步的置換或插入。此外，此處所描述的變異體可涵蓋多於一處位置有突變，舉例來說，根據本發明的變異體可具有一個位置、兩個位置、三個位置或多於三個位置(諸如四到八個位置)的突變。
對來自天然或來自人工創造了變異的酵素，及對設計和生產來自親本枯草菌酵素的變異體來說，較佳的，該親本枯草菌酵素係屬於I-S1或I-S2亞群，尤其是I-S2亞群。
關於來自I-S1的變異體，親本枯草菌酵素較佳的係選自由下列所組成的群組BSS168(BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP)、BASBPN、BSSDY、BLSCAR(BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3)、BSSPRC及BSSPRD，或其保留住I-S1亞群特徵的功能性變異體。
關於來自I-S2的變異體，親本枯草菌酵素較佳的係選自由下列所組成的群組BSAPRQ、BLS147(BSAPRM、 BAH101)、BLSAVI(BSKSMK、BAALKP、BLSUBL)、BYSYAB、BAPB92、TVTHER及BSAPRS，或其保留住I-S2亞群特徵的功能性變異體。
尤其，該親本枯草菌酵素是BLSAVI(Savinase®、NOVOZYMES A/S)，且本發明較佳的枯草菌酵素變異體是Savinase®變異體。
本發明亦涵蓋任何上述枯草菌酵素變異體，並伴隨有對其胺基酸序列有任何其他修飾者，尤其是有技藝中已知的其他修飾以使酵素得到改善的性質。技藝中描述了一些具有改善之性質的枯草菌酵素變異體，而有一些已在本案「先前技術」那段中提及(參見前面)，此處所揭示的參考文獻係作為參考來鑑認枯草菌酵素變異體，其可有益於與此處所描述的枯草菌酵素變異體相結合。
此等結合包括位置：222(改善 氧 化穩定性)、218(改善熱穩定性)、在穩定酵素的Ca 2+ -結合區置換(例如位置76)，還有許多先前技藝中顯見的。
在另一具體實例，此處所描述的枯草菌酵素變異體可較佳的合併有一或更多下列位置的修飾：27,36,56,76,87,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,120,123,159,167,170,206,218,222,224,232,235,236,245,248,252及274。
特別的，下列BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK及BAALKP修飾被認為合適併有：K27R, ＊ 36D,S56P,N62D,V68A,N76D,S87N, G97N,S99SE,S101G,S103A,V104A,V104I,V104N,V104Y,S106A,H120D,H120N,N123S,G159D,Y167A,R170S,R170L,A194P,N204D,V205I,Q206E,L217D,N218S,N218D,M222S,M222A,T224S,A232V,K235L,Q236H,Q245R,N248D,N252K及T274A。
再者，含有任何下列修飾S101G+V104N,S87N+S101G+V104N,K27R+V104Y+N123S+T274A,N76D+S103A+V104I,S99D+S101R+S103A+V104I+G160S,S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D,S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D,S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I或N76D+V104A，或其他組合的修飾K27R, ＊ 36D,S56P,N62D,V68A,N76D,S87N,G97N,S99SE,S101G,S103A,V104A,V104I,V104N,V104Y,S106A,H120D,H120N,N123S,G159D,Y167A,R170S,R170L,A194P,N204D,V205I,Q206E,L217D,N218S,N218D,M222S,M222A,T224S,A232V,K235L,Q236H,Q245R,N248D,N252K及T274A合併有任何一或更多上述修飾的變異體具有改善的性質。
一個尤其有趣的變異體是：其除了有根據本發明的修飾之外，還具有下面的置換：S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245 R+N248D+N252K.
此外，本發明主要方面的枯草菌酵素變異體係較佳的在位置129、131及194伴有一或更多修飾，較佳的為129K、131H及194P修飾，最佳為P129K、P131H及A194P修飾。任何這些修飾係預期在生產時可提供較佳的枯草菌酵素變異體表現量。
本發明所選之變異體的洗滌效果可用本案實施例3所揭示的洗滌效果測試來試驗之，洗滌效果測試可用來測驗當變異體被放入標準或商業化清潔劑組成物時的能力，與參考的系統相比，從標準織物移除蛋白質染點，即親本枯草菌酵素或相似的枯草菌酵素具有更好的洗滌效果(放入相同的清潔劑系統中並於相同條件下進行測試)。本案的酵素變異體係用自動機械加壓分析(AMSA)測試，藉此AMSA測試，大量小體積之酵素-清潔劑溶液的洗滌效果能夠被很快的測試。使用此測試可以初步得知所選變異體的洗滌效果，若測試顯示所選的變異體並沒有比親本枯草菌酵素具有顯著改善，通常就不需要再進行進一步的測試實驗。
因此，特別有利於用於此處所述目的的變異體為：當在在相同的條件下於商業化清潔劑組成物中(諸如如同洗滌效果測試(實施例3)中所描述的US型式清潔劑、亞洲型式、歐洲型式或拉丁美洲型式清潔劑)測試時，與親本枯草菌酵素相較具有改善的洗滌效果
洗滌效果的改善可計算如同實施例3中所定義之所謂的強度值(Int)來定量。
在一個相當引人注意之本發明的具體實例中，當進行洗滌效果測試時，本發明的變異體功效表現分數(Performance Score)(S)至少為1，較佳的功效表現分數為2，其中：S(2)=變異體在三種酵素濃度下(5、10及30 nM)都比對照組表現更佳，S(1)=變異體在一或兩種濃度下比對照組表現更佳。
顯然的，本發明的變異體係較佳的符合上述標準，至少為所述的最低量，更佳的為所述的最高量。
製造枯草菌酵素變異體
許多選殖枯草菌酵素及造成基因(例如枯草菌酵素基因)置換、缺失或插入的方法是技藝中所熟知的。
通常，可以使用標準程序來選殖基因及導入突變(隨機及/或定點)入該基因中，以獲得本發明的枯草菌酵素變異體。合適技術的參考之進一步描述在實施例1中(參見後面)及(杉布魯克等人(1989)之分子選殖：實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；毆蘇柏,F.M.等人(編輯)的"分子生物學的現行規則"，John Wiley and Sons，1995；郝伍德,C.R.,及克汀,S.M.(編輯)的"芽孢桿菌屬的分子生物學方法"，John Wiley and Sons，1990)、及WO 96/34946。
此外，枯草菌酵素變異體可用標準技術來構築，以得到人工創造的變異，其可藉由諸如不同之枯草菌酵素基因的DNA重排(WO 95/22625；史堤默WPC，自然370：389-91(1994))。例如，編碼有Savinase®基因(其具有一或更多個枯草菌酵素本質所鑑認之部分序列)的DNA重排可在接下來篩選具改善之洗滌效果的變異體時，得到適合於此處所述之目的的枯草菌酵素變異體。
表現載體
含有編碼有本發明酵素之DNA構築體的重組表現載體可以是任何易於進行重組DNA程序的載體。
載體的選擇通常取決於其將被送入的寄主細胞，所以，載體可以是一獨立複製的載體，例如一個以 染色 體本身之外而存在的載體，例如質體，其複製是與染色體複製獨立的。
或者，載體可以是一個當進入寄主細胞時會部份或全部與寄主細胞基因組結合，並且與其所結合的染色體一起複製。
載體較佳的是一編碼有本發明酵素的DNA序列的表現載體，其可以與DNA轉錄所需之額外片段相連，通常，表現載體是來自質體或病毒DNA，或可包含兩者的片段。術語「可相連」係指片段被編排使其具有所欲目的的功能，例如轉錄在啟動子處開始並繼續於編碼有酵素的DNA序列進行。
啟動子可以是任何在所選之寄主細胞內具有轉錄活性的DNA序列，及可以是源自編碼有與寄主細胞同源或異源蛋白質的基因。
合適用於細菌寄主細胞之啟動子的實施例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的產麥芽糖澱粉分解酵素基因的啟動子、地衣芽孢桿菌的α-澱粉分解酵素基因的啟動子、解澱粉芽孢桿菌的α-澱粉分解酵素基因的啟動子、枯草桿菌的鹼性蛋白酶基因啟動子、或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的xylosidase基因啟動子、或噬菌體λ PR或PL啟動子、或大腸桿菌lac、trp或tac啟動子。
若必需的話，編碼有本發明酵素的DNA序列也可以與一合適的終結子相連結。
本發明的重組載體可以進一步包含一段能夠使載體在所考慮的寄主細胞內複製的DNA序列，載體亦可包含一可供選擇的標記，例如一其產物可以補足寄主細胞不足之處的基因，或一編碼有可抗例如抗生素(像康黴素、氯黴素、紅黴素、四環黴素、大觀黴素(Spectinomycine)、或類似物)或抗重金屬或除草劑的基因。
為了將本發明的酵素放入寄主細胞的分泌路徑中，可以把一分泌訊息序列(亦以領導序列、序列前身或前序列見知)放入重組載體中，該分泌訊息序列係併入於編碼有酵素之DNA序列的正確讀取架構中，分泌訊息序列通常位於編碼有酵素的DNA序列5'端，分泌訊息序列可以是正常下與酵素相連者，或可以來自編碼有另一個分泌蛋白的基因。
用於接合編碼有本酵素之DNA序列的方法、啟動子及視需要的終結子及/或分泌訊息序列、或用合適的PCR放大反應方案來組合這些序列、及將其插入於合適的載體中(其含有用於複製或集合的訊息)是習於該項技術者所熟知的(參見例如山布魯克等人在前面所列舉的書)。
寄主細胞
導入寄主細胞中之編碼有本酵素的DNA序列可以是與所考慮之寄主同源或異源的，若與寄主細胞同源，即是由寄主細胞天然產生的，則通常可連接到另一個啟動子序列或(若適合的話)另一個分泌訊息序列及/或終結子序列。術語「同源」係指包括一編碼有所考慮之寄主有機體原有酵素的DNA序列。術語「異源」係指包括一不會被寄主細胞自然表現的DNA序列。所以，DNA序列可以是來自另一個有機體或可以是一合成的序列。
本發明DNA構築體或重組載體所送入的寄主細胞可以是任何能夠生產本酵素的細胞，包括細菌、 酵母 菌、真菌及高等原核細胞，包括 植物 。
能夠在培養時生產本發明酵素之細菌寄主細胞的例子是格蘭氏陽性細菌，諸如芽孢桿菌屬菌株諸如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)、環狀芽孢桿菌(B.circulans)、B.lautus、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，或鏈黴菌屬菌株諸如變鉛青鏈黴菌(S.lividans)或鼠灰鏈黴菌(S.murinus)，或格蘭氏陰性細菌(諸如大腸桿菌)。
細菌轉形可用已知的原生質體轉形、電穿孔法、接合生殖，或利用勝任細胞(參見前述的山布魯克等人)。
當在細菌(諸如大腸桿菌)中表現酵素時，酵素可以留在細胞質中，典型的是一不溶性顆粒(以包涵體見知)，或可以藉由細菌分泌序列被送到膜間隙(periplasmic space)。在前者，細胞被溶解並收集顆粒及變性之，然後稀釋變性劑使酵素再摺疊。在後者，酵素可以藉由(例如)聲波振盪或滲透壓衝擊來瓦解細胞而從膜間隙中收集到，使其釋放出膜間隙中的物質並收集酵素。
當在格蘭氏陽性細菌(諸如芽孢桿菌屬或鏈黴菌屬菌株)中表現酵素時，酵素可以留在細胞質中，或可以藉由細菌分泌序列被送到細胞外基質。在後者，酵素可以從下面所描述的基質中取得。
生產枯草菌酵素變異體的方法
本發明提供一生產根據本發明經分離的酵素的方法，其中一合適的寄主細胞(其已被編碼有該酵素的DNA序列所轉形)係被培養在一能夠產生該酵素的條件下，及從培養基中取得酵素。
當一含有編碼有該酵素的DNA序列之表現載體被轉形入一異源的寄主細胞中時，可以產生本發明酵素的異源重組體，所以可以得到高純度的枯草菌酵素組成物，其特徵在於不含同源的不純物。
用於培養該轉形之寄主細胞的培養基可以是任何適合於生長所考慮之寄主細胞的習知培養基。表現的枯草菌酵素可以方便的分泌到培養基中，並可以藉由熟知得方法回收之，包括藉由離心或過濾從培養基中分離出該細胞，用鹽類(諸如 硫酸 銨)使培養基中的蛋白質成分沉澱下來，然後進行層析法，諸如離子交換層析、親和層析、或類似方法。
清洗及清潔劑組成物
本發明的酵素可以被加到清潔劑組成物中，並因此成為清潔劑組成物的成分，一般來說，清洗及清潔劑組成物係已於技藝中所詳述，可參見WO 96/34946、WO 97/07202、WO 95/30011得到合適的清洗及清潔劑組成物的進一步描述。
本發明的清潔劑組成物可以(舉例來說)調配成手洗或機器洗衣清潔劑組成物，包括適合染色織物的預處理的洗衣添加劑組成物，及添加了潤絲的織物柔軟精組成物，或被調製成用於一般家庭硬質表面清洗工作的清潔劑組成物，或被調製成用於手洗或機器的洗碗工作。
在一特定方面，本發明提供一包括本發明酵素的清潔劑添加物。該清潔劑添加物以及該清潔劑組成物可包含一或更多其他酵素，諸如蛋白酶、脂肪分解酵素、 角 質素分解酵素(cutinase)、澱粉分解酵素、 碳 水化合物酶、纖維酵素、果膠酵素、甘露聚醣酵素、阿拉伯糖酵素、半乳聚醣酵素、木聚醣酵素、 氧化酶 ，例如漆化酵素及/或過氧化酶。
一般說來，所選的酵素性質必須與所選的清潔劑相容(即pH-最適條件、與其他酵素及非酵素成分的相容性等等)，及該酵素必須以有效量存在。
蛋白酶：合適的蛋白酶包括那些動物、植物或微生物來源的，微生物來源是較佳的。化學修飾的或是經過蛋白質工程的突變株包括在內。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，較佳的是一鹼性微生物蛋白酶或類胰蛋白酶，鹼性蛋白酶的例子有枯草桿菌蛋白酶，尤其是那些來自芽孢桿菌屬者，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147及枯草桿菌蛋白酶168(描述於WO 89/06279中)。類胰蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如豬或 牛 來源的)及Fusarium蛋白酶，描述於WO 89/06270及WO 94/25583。
有用的蛋白酶的例子為描述於WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116及WO 98/34946中的變異體，尤其是在一或更多下列位置有置換的變異體：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235及274。
較佳的市面上可得到的蛋白酶酵素包括Durazym ® 、Relase ® 、Alcalase ® 、Savinase ® 、Primase ® 、Duralase ® 、Esperase ® 、Ovozyme ® 及Kannase ® (Novozymes A/S)、Maxatase TM 、Maxacal TM 、Maxapem TM 、Properase TM 、Purafect TM 、Purafect OxP TM 、FN2 TM 、FN3 TM 及FN4 TM (Genencor International,Inc.)。
脂肪分解酵素：合適的脂肪分解酵素包括那些細菌或真菌來源的，化學修飾的或經過蛋白質工程的突變株包括在內。有用的脂肪分解酵素的例子包括來自Humicola(Thermomyces同義詞)的脂肪分解酵素，例如來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)，如EP 258 068及EP 305 216中所描述，或來自H.insolens如WO 96/13580所描述，假單胞菌屬脂肪分解酵素，例如來自產鹼假單胞菌(P.alcaligenes)或類產鹼假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、螢光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌菌株SD 705(WO 95/06720及WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)，芽孢桿菌屬脂肪分解酵素，例如來自枯草桿菌(達托斯等人(1993)，Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422)。
其他例子的脂肪分解酵素變異體諸如那些描述於WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079及WO 97/07202中的。
較佳的市面上可獲得的脂肪分解酶酵素包括Lipex ® 、 Lipolase ® 及Lipolase Ultra ® (Novozymes A/S)。
澱粉分解酵素：合適的澱粉分解酵素(α及/或β)包括那些細菌或真菌來源的，化學修飾的或經蛋白質工程的突變株包括在內。澱粉分解酵素包括(舉例來說)來自芽孢桿菌屬的α-澱粉分解酵素，例如一特殊菌株地衣芽孢桿菌，細節描述於GB 1,296,839。
有用的澱粉分解酵素的例子係描述於WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873及WO 97/43424中的變異體，尤其是在一或更多下列位置具有置換的變異體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408及444。
市面上可得到的澱粉分解酵素為Duramyl ® 、Termamyl ® 、Fungamyl ® 及BAN ® (Novozymes A/S)、Rapidase TM 及Purastar TM (來自Genencor International Inc.)。
纖維酵素：合適的纖維酵素包括那些細菌或真菌來源的，化學修飾的或經蛋白質工程的突變株包括在內。合適的纖維酵素包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、Humicola、Fusarium、Thielavia、Acremonium屬的纖維酵素，例如產自Humicola insolens、Myceliophthora thermophila及Fusarium oxysporum的真菌纖維酵素，揭示於US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757及WO 89/09259。
尤其合適的纖維酵素是具有保色優點的鹼性或中性纖維酵素，此等纖維酵素的例子是描述於EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940的纖維酵素，其他例子是纖維酵素變異體，諸如那些描述於WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307及PCT/DK98/00299中的。
市面上可獲得的纖維酵素包括Celluzyme ® 及Carezyme ® (Novozymes A/S)、Clazinase TM 及Puradax HA TM (Genencor International Inc.)及KAC-500(B) TM (Kao Corporation)。
過氧化酵素/氧化酵素：合適的過氧化酵素/氧化酵素包括那些植物、細菌或真菌來源的，化學修飾的或經蛋白質工程的突變株包括在內。有用的過氧化酵素例子包括來自Coprinus的過氧化酵素，例如來自C.cinereus及其變異體，如WO 93/24618、WO 95/10602及WO 98/15257中所描述，市面上可獲得的過氧化酵素包括Guardzyme ® (Novozymes A/S)。
清潔劑酵素可以包括在清潔劑組成物中，其係藉由添加含有一或更多酵素的獨立添加劑，或藉由添加含有所有這些酵素的混合添加劑。本發明的清潔劑添加劑(即獨立添加劑或混合添加劑)可以製備成(例如)粒狀、液狀、泥狀等等，較佳的清潔劑添加物調配物是粒狀的，尤其是非粉末狀顆粒，液狀，尤其是經安定化的液體，或泥狀。
非粉末狀顆粒可以(例如)以US 4,106,991及4,661,452所揭示者來製造，並且可視需要的用技藝中已知的方法塗覆，蠟性塗覆物質的例子是聚氧化乙烯產物(聚乙二醇，PEG)，平均莫耳重為1000到20000；具有從16到50氧化乙烯單位的乙氧壬基 苯酚 ；乙氧基脂肪醇，其中該醇具有從12到20個碳 原子 及具有15到80個氧化乙烯單位；脂肪醇； 脂肪酸 ；及脂肪酸單-及二-及三甘油酯。適合應用在流床技術形成 薄膜 之塗覆物質的例子在GB 1483591。液狀酵素製劑可以(舉例來說)根據已建立的方法加以安定化，其係藉由添加聚醇(諸如丙 乙醇 )、醣類或醣醇、乳酸或 硼 酸，受保護的酵素可以根據EP 238,216所揭示的方法製備。
本發明的清潔劑組成物可以是任何方便的形式，例如棒狀、錠狀、粉狀、粒狀、膏狀或液狀，液狀清潔劑可以是水性的，典型的含有至多70%水及0-30%有機溶劑，或非水性。
清潔劑組成物包括一或更多表面活性劑，其可以是非離子性的，包括半極性及/或陰離子及/或陽離子及/或兩性離子。表面活性劑典型的濃度為從0.1%到60%重量比。
當包含在裡面時，清潔劑通常包含從約1%到約40%的陰離子表面活性劑，諸如線狀烷基苯磺酸鹽、α-磺酸烯烴酯、硫酸烷基酯(脂肪硫酸醇)、乙醇乙氧基硫酸酯、第二 烷基磺酸 酯、α-磺基 脂肪酸甲酯 、 琥珀酸 烷基-或烯基酯或皂。
當包含在裡面時，清潔劑通常包含從約0.2%至約40%的非離子表面活性劑諸如乙醇乙氧基化物、壬酚乙醇酯、烷基聚配醣體、烷基二甲基胺基氧化物、乙氧基脂肪酸單乙醇醯胺、脂肪酸單乙醇醯胺、聚羥基烷基脂肪酸醯胺、或 葡萄糖 胺的N-醯基N-烷基衍生物(“glucamides”).
清潔劑可包含0-65%的清潔劑助洗劑(builder)或錯合劑諸如沸石、二磷酸、三磷酸、磷酸鹽、碳酸、檸檬酸、三乙酸基氨、乙二胺四 醋酸 、二乙三胺五乙酸、烷基-或烯基-琥珀酸、可溶性矽酸鹽或層狀矽酸鹽類(例如Hoechst的SKS-6)。
清潔劑可以包含一或更多 聚合物 ，例子有羧基甲基-纖維素、聚(乙烯吡咯 酮 )、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基-吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚 羧酸 鹽，諸如聚 丙烯酸 鹽、順丁烯二酸/丙烯酸共聚物及月桂酸基甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物。
清潔劑可以含有包含H2O2來源的漂白系統，諸如過硼酸鹽或過碳酸鹽，可以與形成過酸的漂白活化劑混合，諸如四乙醯乙二胺或壬醯苯酚磺酸。或者，該漂白系統可以含有例如醯胺、醯亞胺或碸型式的過氧酸。
清潔劑亦可以包含其他習知的清潔劑成分，諸如(例如)織物柔軟精，包括泥、 泡沫 增效劑、肥皂泡抑制劑、抗腐蝕劑、塵粒懸浮劑、抗塵粒再沉澱劑、染劑、殺菌劑、光鮮劑、親水劑、變色抑制劑或香料。
因地方或區域情況的不同，諸如水的硬度及洗滌溫度，因而需要地方性清潔劑組成物。清潔劑實施例1及2分別提供典型拉丁美洲清潔劑及典型歐洲粉狀清潔劑組成物的範圍。
清潔劑實施例1.典型拉丁美洲清潔劑組成物
清潔劑實施例2.典型歐洲粉狀清潔劑組成物
本發明清潔劑組成物的酵素可以用習知的安定劑加以安定，例如聚醇諸如丙二醇或甘油、醣類或醣醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯或苯基硼酸衍生物，諸如4-甲醯基苯基硼酸，且組成物可以如例如WO 92/19709及WO 92/19708中所描述來調配。
目前涵蓋的是，在清潔劑組成物中，可以加入任何個別酵素(尤其是本發明的酵素)，其含量為相當於每公升清洗液含0.01-200毫克的酵素蛋白質，較佳為每公升清洗液含0.05-50毫克酵素蛋白質，尤其是每公升清洗液含0.1-10毫克酵素蛋白質。
本發明的酵素可以額外地混入WO 97/07202(在此併入做為參考)所揭示的清潔劑調配物中。
材料及方法
織料：
標準織料片段係得自EMPA St.Gallen,Lerchfeldstrasse 5,CH-9014 St.Gallen，瑞士。尤其是型EMPA116(被血液、牛奶及墨汁沾染的 棉 質織物)及EMPA117(被血液、牛奶及墨汁沾染的聚酯/棉質織物)。
菌株及質體：
豆形桿菌菌株309係存於NCIB，編號NCIB 10309，描述於美國專利第3,723,250號中(併入本文做為參考)，親本枯草菌酵素309或Savinase®可得自菌株309，表現用的寄主有機體是枯草桿菌。
使用質體pSX222做為大腸桿菌-枯草桿菌的載運載體及枯草桿菌的表現載體(如WO 96/34946所描述)。
一般分子生物學方法：
除非有特別提到，否則DNA操作及轉形係使用標準分子生物學方法進行(山布魯克等人，1989，分子選殖：實驗室操作手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；歐蘇柏,F.M.等人編"現今分子生物學的操作"，John Wiley and Sons，1995；郝伍德,C.R.,及克汀,S.M.編"芽孢桿菌屬的分子生物學方法"，John Wiley and Sons，1990)。
用於DNA操作的酵素
除非有特別提到，否則所有用於DNA操作的酵素諸如例如內切限制酶、接合酶等等係得自新英格蘭生物實驗室公司，用於DNA操作的酵素的使用係根據供應商的說明書。
發酵：
生產枯草菌酵素的發酵作用係在pH 7.3及37℃下進行，於旋轉式震盪台上225 rpm，在含有15毫升雙重TY培養基的50毫升試管中二至三天。
TY培養基的描述請參見"現今分子生物學的操作"第1.1.3頁的培養基的製備及細菌生物學工具，John Wiley and Sons，1995；郝伍德,C.R.,及克汀,S.M.編。
純化
從寄主細胞分泌出來的枯草菌酵素變異體可以藉由熟知的方法容易的從培養基中回收，包括藉由離心或過濾從培養基中分離出該細胞，用鹽類(諸如硫酸銨)使培養基中的蛋白質成分沉澱下來，然後進行層析法，諸如離子交換層析、親和層析、或類似方法。
洗滌效果測試
為了分析清潔劑組成物中所選之枯草菌酵素變異體的洗滌效果，進行了清洗實驗。本案的酵素變異體係用自動機械壓力分析法(AMSA)測試，AMSA測試可以分析大量小體積的酵素-清潔劑溶液的洗滌效果，AMSA盤具有許多孔可以用來測試溶液，且蓋子可穩固的擠壓織物樣本使其受到清洗，在清洗時，盤、測試溶液、織物及蓋子被充分的震盪，以使測試溶液能與織物接觸並提供機械壓力，進一步的描述可以參見WO 02/42740，尤其是第23-24頁"特定方法的具體實例"那一段。
清潔劑
用於本發明枯草菌酵素洗滌效果測試的清潔劑可以自市面上購得完全配製好的商業化清潔劑，然後接著用熱處理(於85℃水溶液中五分鐘)來去活化酵素成分，此外，不含酵素的商業化清潔劑基料可以直接購自製造商，又，合適的模式清潔劑可以根據此處第19-24頁所提供的方法配製以用於洗滌效果測試。，下面是桔草菌酵素（ＳＵＢＴＩＬＡＳＥ）變異體 SUBTILASE VARIANTS专利的具体信息内容。