许多活性物质，例如药物和营养补充性活性物质以及食物成分，暴露在空 气中或溶解氧中容易被氧化，例如在潮湿或水相环境下。对许多物质而言，暴 露在例如来自于自然光的紫外线辐射中会诱导(即引发或加速)氧化过程。脂 质例如油特别容易被氧化。
此感受性降低活性物质和任何包含活性物质的成分的稳定性。这会导致功 效降低和/或产生不希望产生的副产品。这些副产品可能例如破坏食品的味道 (例如脂肪或油变酸败时)，增加药物制剂的毒性，损害化妆品外观，引起发 动机内燃料的运行问题，或者简单地说在使用中损害其性能。
通过把活性物质封装到适当的输送载体中可保护其免受例如氧气和紫外 线的环境因素的影响。然而制备这样装载有活性物质的输送全身经常是复杂、 费时而且昂贵的。为确保所得制剂符合质量控制和监管标准并且提供均匀的活 性物质浓度，需要将封装的物体制作得大小和形状十分一致，这一过程可能出 现问题。如果不把该些物体的尺寸制作得较大继而损害到整个制剂的物理性 质，则很难在封装的物体内得到足够高的活性物质装载量。
此外需要确保任何已封装的物质能在预期使用点可适度地释放。要在使用 前把封装做得够好以保护该物质也不容易。
本发明目的是提供可增强活性物质对氧化的稳定性从而克服或至少缓和 上述问题的制备方法。

按照本发明的第一方面提供了天然孢子外壳或其碎片作为抗氧化剂的用 途。
“天然”是指孢子产自活的有机体，其可以是原核生物或真核生物，也可 以是植物或动物。孢子(此术语包括花粉粒，也包括有机体例如细菌的孢子内 壁)例如可来自于植物，或者有时来自于菌类、藻类、或者细菌或其它微生物。
孢子外壳是天然(自然状态的)孢子周围的外部薄膜。孢子外壳可以从孢 子分离，为移除可能附着在孢子外壳上或包含在孢子外壳内的孢子的其它成分 例如纤维质内膜层和脂质、蛋白质和核酸成分，可用有机溶剂、碱和酸进行连 续处理把孢子外膜从孢子分离出来。也可使用酶处理法把孢子外膜从孢子分离 出来。
所得孢子外壳形状为一基本中空的胶囊，胶囊典型地包含孢粉质。孢粉质 是一种已知在化学上和在物理上极其稳定的物质(G.Shaw，见《孢粉质》中“孢 粉质的化学性质”，J.Brooks，M.Muir，P.Van Gijzel和G.Shaw(编)，学术 出版社，伦敦和纽约，1971，305-348)，但孢粉质还是惰性并且无毒的。
孢子外壳可通过一些已知方法从孢子获得，例如结合有机溶液和强酸强碱 对孢子进行粗处理(如回流)。方法合适的做法如WO-2005/000280号专利(见 第10页)和以下例子所述。也可采用其它不太剧烈的方法，例如酶处理的方 法(见S.Gubatz，M.Rittscher，A.Meuter，A.Nagler，R.Wiermann，Grana，Suppl. 1(1993)12-17；K.Schultze Osthoff，R.Wiermann，J.PlantPhysiol.，131(1987) 5-15；F.Ahlers，J.Lambert，R.Wiermann，Z.Naturforsch.，54c(1999)492-495； C.Jungfermann，F.Ahlers，M.Grote，S.Gubatz，S.Steuemagel，I.Thom，G. Wetzels和R.Wiermann，J.Plant Physiol，151(1997)513-519)。
或者，可使用高压把孢子内容物从其孢子外壁层中的天然孔中挤出来。这 些方法可用来移除蛋白质或碳水化合物以得到大致保持原孢子完整形态的孢 子外壳。
例如对于伸筋草(Lycopodium clavatum)而言，所得孢子外壳可完全或基 本由孢粉质组成，视情况可带有小部分其它物质如几丁质，葡聚糖和/或甘露聚 糖。来自原孢子的大部分蛋白质将被移除。
从WO-2005/000280号专利得知来自于孢子的孢子外壳可用作药物和营养 物质的输送载体。活性物质可在物理上或化学上结合于或封装于孢子外壳内。 该文件提到孢子外壳能在已封装的活性物质和例如大气氧气之间提供物理障 碍或者使活性物质免受光解。
然而人们现在吃惊地发现天然孢子外壳本身可作为抗氧化剂以保护物质， 特别是使脂质和类脂质物质免受氧化。例如当往油里吹进氧气气泡时，油就由 于氧化作用而快速酸败。但当把油封装在来自于孢子的孢子外壳中时，其氧化 就慢得多，这如以下例子所示。
这种抗氧化效果不仅是由于孢子外壳提供了物理障碍而防止氧气进入，因 为即使物质在孢子外壳的外面——尽管理想状态是两者仍然接触或与孢子外 壳混和——仍可观察到这一效果。此外，如WO-2005/000280号专利所述，已 经知道来自于孢子的孢子外壳至少局部能渗透的。通过孢子外壳的微孔，可在 分离孢子外壁层时移除脂质、蛋白质、核酸和碳水化合物。活性物质浸渗孢子 外壳时也可从孔通过。这些孔预期中亦可让周围的氧接触到任何封装于孢子外 壳内的物质，而事实上已经发现，即使氧能够通过这些孔，仍可阻止封装物质 氧化。
因此看来孢子外壳本身或至少其表面能够作为抗氧化剂。所以在本发明 中，其作为抗氧化剂是指增强物质或成分对氧化的内在阻力的用途。虽然这种 保护可和本发明提供的抗氧化效应一起发生，但本发明并不仅包括免于与氧气 接触的物理保护。
按照本发明，孢子外壳可来自于任何合适的天然孢子，源于植物或动物。 在这里，术语“植物”解释成其广义含义，包括例如苔藓、真菌、藻类、裸子 植物、被子植物和种子蕨类植物。此外，术语“孢子”不仅用来包括如蕨类植 物、苔藓和真菌等生产的真正的孢子，还包括产自带有种子的植物(种子植物) 的花粉粒以及有机体例如细菌的孢子内壁。
从以下合适物种可得到这些孢子，第二栏所示为其孢子的直径：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)            1.2μm
勿忘我属植物(勿忘草)[Myosotis              2.4-5μm
(″forget-me-not″)]
黑曲霉(Aspergillus niger)                  4μm
青霉菌(Penicillium)                        3-5μm
小鸡油菌(Cantharellus minor)               4-6μm
灵芝(Ganomerma)                            5-6.5μm
田头菇(Agrocybe)                           10-14μm
异株荨蔴(Urtica dioica)                    10-12μm
黑蒽花霉(Periconia)          16-18μm
附球菌(Epicoccum)            20μm
伸筋草(Lycopodium clavatum)  25μm
伸筋草(Lycopodium clavatum)  40μm
冷杉(Abies)                  125μm
矮南瓜(Cucurbitapapo)        200μm
南瓜(Cuburbita)              250μm
本发明使用的孢子外壳可为在WO2005/000280号专利中，特别是第4、8 和9页以及例1中所述类型。其它可提取孢子外壳的孢子在WO-2005/000280 号专利的第8页引用的出版物上有公开。
按照本发明，孢子外壳可用于增强加入了孢子外壳的物质或使用了孢子外 壳的成分(该成分包括制剂)的氧化稳定性，因此可用来减缓物质或成分的氧 化速度。
孢子外壳可用来保护物质或成分免受紫外线引起的氧化。再次提醒，这不 只是指物理保护(即屏蔽)免受紫外线辐射。相反地，尽管发现这些孢子外壳 对阳光的屏蔽能力相对较弱，但已经发现天然孢子外壳能够减少物质在紫外线 辐射中氧化的倾向。(例如，来自伸筋草(Lycopodium clavatum)和三裂叶豚 草(Ambrosia trifida)的孢子外壳的孢粉质在波长范围为190-900nm时有近似 平谱，消光系数的绝对值为1-2x 105im-1，而且对这两类孢子外壳来说没有 多大不同。单个的孢子外壳在波长为450nm时传播大约45％的光。190nm和 900nm之间波长在传播上相似(Stephenn L.Atkin，Sylvain Barrier，Zhengang Cui， Paul D.I.Fletcher，Grahame Mackenzie and Vincent Panel，未出版作品)。)
依照本发明，孢子外壳适合在包含活性物质的制剂中用作抗氧化剂。活性 物质可封装于孢子外壳内或者在物理上或化学上与孢子外壳结合。因此孢子外 壳可用作物质的输送载体。或者活性物质和孢子外壳以简单的物理混和物存在 于试剂中。
因为其本身固有的无毒性，来自于孢子的孢子外壳特别适合在各种可能接 触人体或动物体或者和被人体或动物体进食的试剂中用作输送载体。在分离孢 子外壁成分的过程中移除可引起过敏反应的蛋白质物质为优选。
孢粉质是多数孢子外壳的主要成分，是人类已知的最具有抵抗力的天然有 机物质。它能够在压力、温度和pH值非常严酷的环境下生存，并且能不溶于 大多数有机溶剂。这也使得孢粉质非常适合用做输送载体。
来自于孢子的孢子外壳用作输送载体除了其抗氧化活性外还有另外的潜 在优势，包括：
·孢子外壳在保护封装物质免受大气作用上非常有效，特别是免受光 和/或氧气的作用，因此能防止过早降解。
·孢子外壳提供的物理保护能帮助减少物质由于例如蒸发、扩散或者 浸滤而引起的损失。
·从任何有机体制备的孢子外壳不论其大小、形状和表面性质都非常 统一，不同于典型的合成封装体。
·然而不同物种之间孢子的大小和形状变化很大，可视活性物质的性 质和需要的浓度、预期应用的地点和方式、需要的活性释放速度、使用前可 能的贮存环境等等而定以得到适合的制剂。
·即使是很小的孢子外壳也可把相对大量的活性物质封装。使用其它 已知的封装技术很难做到把高活性物质装载量、尺寸小的封装材料和充分的 封装保护结合起来。
·孢子外壳方便得到、价格通常便宜、有供应，并且来源于自然，这 些特征也使之很适合用作物质输送载体。
更多关于来自于孢子的孢子外壁用途的优势如WO-2005/000280例如第3 和4页以及横跨第5和6页的段落所述。
孢子外壳用在包含活性物质的制剂中时，制剂可适合和/或适用于和/或预 期以任何方式输送。例如，活性物质用作全身使用(例如药物或营养补充性活 性物质，食料或任何其它预期服进活体动物或植物的活性物质)时，制剂可适 合和/或适用于和/或预期为经由口部、静脉、肺部、鼻腔、皮肤、皮下、口腔、 腹膜或者任何其它合适的输送形式。
制剂可适合和/或适用于和/或预期把活性物质从局部输送到表层，这种情 况下表层可为有生命的表层(还是不论植物或动物)或者无生命的表层。孢子 外壳不仅作为保护封装活性物质的物理障碍，其作为抗氧化剂的能力在这种情 况下特别显著，这是因为活性物质释放到表层上后，将会暴露在孢子外壳外， 而仍能继续获得一定程度的氧化保护的益处。
在本发明中，“局部”制剂可适合和/或适用于和/或预期为局部应用于活 体部分例如皮肤或其它上皮细胞、毛发、指甲或牙齿，特别是皮肤。活体表层 可为植物或动物，特别是动物。动物表层可为人的或非人的，特别是人的。
使用孢子外壳的制剂可为任何适合的物理形式。孢子外壳可在适合的液体 中悬浮(术语“悬浮”包括乳状液和其它多相分散状态)，或者以固体如粉末 或片剂存在。适合局部输送的制剂其形式可为洗液、乳脂、软膏、糊状、凝胶、 泡沫或其它任何已知的局部施用的物理形式，例如包括用在如海绵、药签、刷 子、薄纸、皮肤贴布、敷料或牙齿纤维制品等媒介物上以方便局部用药的制剂。 其形式可为鼻腔喷雾剂或者滴眼液或滴耳液。
局部制剂形式或可选择为粉末，例如当活性物质为化妆用品如腮红、眼影 或粉底时，或者预期用于扑粉时。如以下第十一实施例所示，把液体全部封装 在孢子外壳内，孢子外壳可极其高效地吸收液体特别是脂质而得到实际上干爽 的产品。其它活性物质例如食品补充剂或食品成分或者药物或活性物质也可制 成粉末状。
其它适合的药物和营养制剂形式在WO2005/000280号专利中公开，例如在 第3页和第6-9页。
活性物质可为任何能够在应用位置产生效果的物质。例如可选自药物或营 养补充性活性物质、食品和食品成分、食品补充剂、除草剂、杀虫剂和害虫控 制剂、植物治疗剂如生长调节剂、抗菌活性物质、化妆用品(包括香氛)、盥 洗用品、消毒剂、清洁剂和其它清洗剂、粘合剂、诊断试剂、染料和墨水、燃 料、炸药、推进剂和感光材料。一般而言，本发明可用于稳定任何活性物质， 包括例如低聚物或聚合物的活性物质。
在本发明的一个实施例中，活性物质为化妆物质。化妆物质例如可选自化 妆产品(例如粉底、粉、腮红、眼影、眼线笔和唇线笔、唇膏、其它皮肤着色 剂和皮肤颜料)、皮肤护理产品(例如清洁剂、保湿剂、润肤剂、皮肤滋补剂 和清新剂、去死皮膏和磨砂膏)、香氛、香水产品、防晒剂和其它防紫外线剂、 自晒黑剂、晒后修复剂、抗老化剂和抗皱剂、皮肤增白剂、局部用驱虫剂、脱 毛剂、生发剂和指甲护理产品如指甲油或甲油卸妆液。香水产品可包括不止一 种香味。
在本发明的另一实施例中，活性物质可用于盥洗用品。因此可选自肥皂、 清洁剂和其它表面活性剂；除臭剂和止汗剂；润滑剂；香氛；香水产品；扑粉 和爽身粉；头发护理产品例如洗发水、护发素和染发剂；以及口腔和牙齿护理 产品如牙膏、漱口水和口气清新剂。
而在本发明的另一实施例中，活性物质用于家庭用品。例如可选自消毒剂 和其它抗菌剂、香氛、香水产品、空气清新剂、昆虫或其它害虫驱除剂、杀虫 剂、洗衣用品(如洗涤剂和保养剂)、织物处理剂(包括染色剂)、清洗剂、 紫外线防护剂、油漆和清漆。
在本发明的另一实施例中，活性物质为药物或营养补充性活性物质，包括 兽用物质。适合局部输送的药物活性物质例如可选自用于处理皮肤或皮肤组织 不适(如痤疮、牛皮癣或湿疹)、伤口或烧伤治疗剂、抗炎药、抗刺激剂、抗 微生物剂(包括抗真菌剂和抗细菌剂)、维生素、血管扩张剂、局部有效的抗 生素和消毒剂的物质。
药物或营养补充性活性物质可适合和/或预期用于治疗或预防。
而在本发明的另一实施例中，活性物质为食品，包括食品材料。食品材料 可包括例如食品补充剂(如维生素和矿物质、叶酸、欧米加-3油或纤维)、调 味料、香氛剂、上色剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂或者改变食品质地或持续性 的介质。
活性物质特别可选自药物和营养补充性活性物质、食品以及化妆物质和盥 洗物质。
在本发明的一个实施例中，活性物质可预期和/或适用于和/或适合局部输 送，这种情况下最好不是预期和/或能够全身使用(特别是通过皮肤输送)的物 质。此物质适合非预期和/或不适用于和/或不适合摄入，特别是人类的摄入。
在某些情况下活性物质适合为除香精油之外的物质，或者至少不为预期和 /或不适合在活体内全身使用的香精油。
在某些情况下活性物质可适合为除药物(至少为预期和/或适合全身用药的 药物)或营养物质以外的物质。
在某些情况下活性物质可适合为除维生素、矿物质、香精油、食物调味料 和/或营养食品以外的物质。
活性物质可包含挥发性物质，特别是香氛。因为孢子外壳有助于抑制任何 易挥发成分在使用前释放，所以本发明特别适合包含这种挥发性物质的制剂。 这一点也非必然可预料，谨记天然孢子外壳已知是有孔的。但是有些时候孢子 外壳能够封装挥发性活性物并减少其挥发至空气中，如以下例10所示。
活性物质可为脂质或者类似于脂质的物质(例如油、脂肪或蜡)和/或可为 亲脂质物质。它可存在于如液体载体的二级流体载体中，特别是非水性(或基 本上或至少部分非水性)的载体，更特别是非水性的载体，尤其是如油的脂质 载体。因此活性物质可以溶液或悬浮液的形式存在，术语“悬浮液”包括乳液 和其它的多相分散状态。二级载体例如可为油包水型乳液或油包水包油型乳 液。
活性物质本身可为天然物质或来自于天然原料，特别是植物原料。
在某些情况下活性物质可以是非极性的。
活性物质可对一个或多个外部影响因素例如热、光、氧气或水敏感。特别 是活性物质可易受氧化，尤其是被大气中的氧气或溶解氧氧化。更特别在外界 条件下，它易受紫外线导致的氧化(即光化学氧化)。
包含活性物质的制剂可适合和/或适用于和/或预期用于储存和/或使用在包 含氧气的流体环境中，例如在空气中或在如包含溶解氧的水等液体中。它可适 合和/或适用于和/或预期储存和/或使用于暴露在特别是来自日光的紫外线辐射 下的环境中。在这些情况下本发明可特别有效地保护该活性物质免受氧化并因 此增强制剂总体的稳定性。
本发明中使用的制剂可包含多于一种的活性物质。例如两或多个活性物质 可同时封装在同一孢子外壳内。作为替代或另外，根据本发明制备的制剂可包 括两种或更多种包含活性物质的孢子外壳，每个孢子外壳都在物理上或化学上 与不同的活性物质结合或封装不同的活性物质。
因此，例如根据本发明制备的化妆品制剂可包含遮光剂和驱虫剂，或者遮 光剂和保湿剂，或者粉底或其它皮肤着色剂和遮光剂。两个或多个活性物质因 此可从孢子外壳提供的抗氧化保护中得益。
这也可使两个或多个活性物质在使用前能分开保存，然后在预期使用时一 起原位释放。这尤其有价值，例如如果它们互不相容或者产生不良的互相作用。
根据本发明制备的制剂可包含在产品中，例如可选自化妆品；盥洗用品(如 沐浴用品、肥皂和个人护理产品)；头发护理产品；指甲护理产品；牙科用品 如牙膏，漱口剂和牙线；家用产品(内用或外用)如表面清洁剂、消毒剂、空 气清新剂、驱虫剂及洗衣和织物处理用品；油漆、墨水、染料和其它上色产品； 粘合产品；药物和营养补充性产品；食品，包括食品添加剂和食品材料；农业 和园艺产品；燃料；炸药；推进剂和感光材料。
这种产品可适合和/或适用和/或预期以任何适合方法输送，包括例如局部 应用。
特别是此商品可选自化妆品(包括皮肤护理产品)、盥洗用品、头发和指 甲护理用品和牙科用品。
在本发明的另一个实施例中，产品为药物或营养补充性产品，两种产品都 包括兽用产品。
而在另一实施例中，产品为食品。
根据本发明制备的制剂，活性物质可在化学上或物理上与孢子外壳结合或 封装于孢子外壳中。活性物质适合在物理上与孢子外壳结合或者封装于孢子外 壳中。更适合的是活性物质至少部分封装于孢子外壳中。
物质在化学上与孢子外壳结合的适合方法如WO-2005/000280号专利所 述，例如在横跨第4和5页的段落中、第14-22页和第24-32页。方法可包括 为所述孢子外壳的化学衍生，以促进其与所涉物质化学结合。化学结合可包含 共价键或其它形式的化学键，例如氢键、巯键、范德华键或配位键。
活性物质和孢子外壳的物理结合可包括例如把物质吸附(如包括憎水相互 作用或亲水相互作用)在孢子外壳的表面(不管内表面或外表面)上。
活性物质的封装是指把该物质保留在腔室内，腔室本来存在于孢子外壳壁 中和/或孢子外壳限定的中央腔室内。
活性物质可用超过一种上述方式附着于孢子外壳；例如可封装于孢子外壳 中，也可和其在化学上结合，或者可将活性物质的一部分吸附在孢子外壳外表 面上而另一部分包含在孢子外壳里。
根据本发明制备的制剂中，孢子外壳的直径(可通过扫描电子显微术确定) 可为1-300μm，适合地为1-250μm或3-50μm或15-40μm。来自于草花粉的孢 子外壁和其它直径约为20μm的孢子外壁也可认为是适合的。
优选的孢子微粒大小取决于相关活性物质或制剂的预期施用方式。例如对 于肺部输送比较小的微粒(例如直径为10μm或更小或者于鼻腔输送8或5μm 或更小或者于输送至肺部时为小于5μm)为优选。适合口服的微粒尺寸为小于 25μm。然而，如果预期把活性物质输送到肠道(例如某些营养物质如益生菌)， 适合的微粒大小为40μm或更大。一般而言，对于预期全身使用的活性物质， 微粒尺寸为25μm或更小为优选，因为活性物质可方便地经过而进入血流。
在某些情况下，较大的孢子外壳例如直径为30或40μm或更大，由于不大 可能被预先吸收到血流中，特别适合作为局部输送介质。然而如果局部输送的 活性物质需要穿透发囊，较小的孢子外壳-如7μm或更小，或者5或3μm或更 小，或者理想地为2μm或更小如1-2μm-可能是适当的。
较大孢子外壳的优势是其可能有较高的活性物质装载量，但也可能损害制 剂整体的质地和/或外观，而这些对口服和局部输送很重要。因此，在这种情况 下，特别是对于例如口服药物或者营养补充性物质或食物，孢子外壳的直径适 合为10μm或更小。此外，当使用较大的孢子外壳时，相较于相关的大量较小 的孢子外壳，相关的活性物质可能会较不均匀地分布在整个制剂中。一般而言， 为求达到合理的活性物质装载量，4μm的最小直径是优选。然而可能有些情况 下最小直径是60μm或更大才合适。
在本发明的一个实施例中，孢子外壳可另外包含来自天然孢子的全部或部 分纤维素内膜层。孢子若只用有机溶剂和碱一起处理就可达到上述结果，而用 有机溶剂和酸一起处理就达不到上述的结果。这种碱性水解例如使用氢氧化钾 可确保孢子的蛋白质成分移除，而让至少一部分原纤维素内壁继续存在。
在本发明的一个实施例中，孢子外壳可是完整的或大体上完好的。换言之， 除了自然存在于这些孢子外壳的表层上的微孔或纳米孔之外，孢子外壳还提供 了连续的外壁以限定活性物质装载的内部腔室。然而孢子外壳可能有些部分断 开或被损坏；因此本发明包括使用来自于孢子的孢子外壳的碎片，特别是活性 物质在化学上或在物理上结合于孢子外壳的情况。然而，孢子外壳表面积的连 续性以占当其在相关物种如完整时的孢子外壳的至少50％以上为合适，至少 75％或80％或90％更合适。因此在多数情况下，本发明涉及天然孢子外壳的用 途而不是其碎片的用途。
孢子外壳可以化学方法改变，可以是改变其属性(例如溶解性)或是因应 其预期施用地点而作的改变(例如使之更具表面活性)，或者方便其附着在活 性物质上。这些适合的化学改变以及可大致上述改变的方法如WO-2005/000280 号专利所述，特别在横跨第4页和第5页的段落中和第14-22页和第24-32页。 孢子外壳的外面可通过例如使功能团附着(典型地为化学上的)而被改性，如 阳离子和阴离子基团(参见WO-2005/000280号专利和G.Shaw，M.Sykes， R.W.Humble，G.Mackenzie，D.Marsdan & E.Phelivan，反应聚合物，1988，2， 211-217)，和/或令孢子外壳对其预期应用的表面的吸引力增强的功能团。
使用适当的如WO-2005/000280号专利所述的已知技术，活性物质可附着 或封装于孢子外壳中。特别是可通过把孢子外壳浸入活性物质中或者其溶液或 悬浮液中使孢子外壳充满活性物质。可如WO-2005/000280号专利所述使用一 个或多个增强渗透介质帮助活性物质充满孢子外壳。可代替或另外使用减少或 增加压力(空气压力方面)以促进渗入。
孢子外壳可装载任何合适数量的活性物质，视预期使用情况而定。根据本 发明制备的制剂例如可包含活性物质和孢子外壳重量比为0.01∶1到35∶1或 者33∶1，例如从0.01到20∶1或者从0.1∶1到12∶1或8∶1或5∶1，或者 从0.5∶1到5∶1或1∶1到5∶1或8∶1等等。要是活性物质预期为至少部分 封装，能得到的装载量依孢子外壳的大小而定。
依照本发明，制剂可包含一部分未封装在孢子外壳内部腔室中的活性物 质，这是因为即使活性物质在孢子外壳外面，孢子外壳仍然能提供抗氧化效果。 因此可在此制剂中使用相对较高的活性物质浓度，例如活性物质和孢子外壳重 量比超过5∶1或10∶1，甚至20∶1或30∶1。如上所述，最大的适合装载量 可依孢子外壳的大小而定。
在一些情况下，活性物质和在制剂中的孢子外壳重量比为孢子外壳充满着 活性物质(或充满着包含活性物质的溶液或悬浮液)时的重量和另外包围在孢 子外壳的外表面上的厚达10μm或以下的活性物质/溶液/悬浮液的膜的重量的 比值。这一情况可代表活性物质和孢子外壳重量比适合的最大值，让孢子外壳 的抗氧化效果达到合理水平。
孢子外壳可涂有阻挡层以进一步保护相关活性物质免受大气影响。这对于 挥发性活性物质的输送和/或对氧气敏感的物质特别有用。适合的涂层在制剂正 常储存情况下(典型地在室温下)为固体或半固体，但可在预期局部应用的较 高温度(如皮肤温度)下溶解。脂质涂层适合在这些情况下使用，例如包括黄 油或其它固体脂肪(如可可油或硬化棕榈仁油)、油(如鳕鱼肝油)和蜡(如 巴西棕榈蜡或蜂蜡)。特别是如果活性物质预期为局部输送，涂层可为在温度 为皮肤温度时或皮肤温度左右时溶解的物质(例如可可油)，这样活性物质就 能以局部应用的方式释放给皮肤。其它可能的涂层可为应用时以手工施压能够 破裂的材料，例如易碎的固体如虫漆，或在施用(如局部地)时产生溶解、破 裂或其它方面的变化以释放活性物质的其他材料。例如明胶可为适合的涂层材 料。
其它已知的涂层赋形剂可依所需的输送方法和预期的作用地点(例如涂层 可用于延缓、瞄准或者控制活性物质的释放)选择。多种天然或合成的涂层赋 形剂，包括低聚物和聚合物，可用来保护根据本发明制备的制剂中的活性物质。 来自于蔬菜的涂层物质可为优选。
涂层可以已知方式应用于孢子外壳，如喷洒、滚动、筛选或浸渍。涂层不 必一定连续地包围在孢子外壳的全部外表面上。
本发明的第二方面提供了天然孢子外壳或其碎片的用途，目的是从物质或 成分移除之前形成的氧化物。换言之，天然孢子外壳或其碎片已被发现有可能 “清除”在某种程度上已经氧化的物质或成分，并移除此氧化物的至少一部分， 从而增强该物质或成分的有效稳定性。例如，物质为脂质如油，并至少一部分 已酸败时，可在此物质中加入孢子或以孢子外壳装载该物质以减少酸败。
因此本发明的第二方面包括减轻物质或成分酸败或其它氧化降解的方法， 该方法包括把物质或成分封装于天然孢子外壳或其碎片中，或者在化学上或物 理上将之与天然孢子外壳或其碎片结合，或某些情况下与天然孢子外壳或其碎 片混合。
因此可以下列方法进行本发明的第二方面：例如把至少部分已氧化的活性 物质或成分封装于天然孢子外壳，或者在化学上或物理上与天然孢子外壳或其 碎片结合。随后该物质或成分从孢子外壳分离时，例如输送到预期的作用地点 时，可发现其氧化程度比与孢子外壳结合前减少。这些情况下的氧化程度可以 任何适合的方式测量出来，例如通过评估活性物质或成分中氧化反应副产品 (例如过氧化物和/或酸)的水平。对于脂质活性物质，其氧化程度典型地和酸 败水平相同。
在本发明的第二方面的一个实施例中，孢子外壳或其碎片包含来自天然孢 子的全部或部分纤维素内膜层为优选。如上所述，如孢子只经有机溶剂和碱而 非酸的处理就可以获得。
依照本发明的第二方面，孢子外壳适合的微粒直径为20-60μm或20-50μm 或30-50μm，如40μm左右。孢子外壳可来自伸筋草(Lycopodium clavatum) 的孢子。
本发明的第三方面提供了保护活性物质免受氧化的方法，和/或增强活性物 质或包含活性物质的成分的稳定性，此方法包括以天然孢子外壳或其碎片制备 活性物质。适合的是该活性物质封装于孢子外壳或其碎片内，或者在化学或物 理上与孢子外壳或其碎片结合。
本发明的第四方面提供了制备活性物质的方法，该方法包括(a)准备或提 供天然孢子外壳或其碎片；和(b)把活性物质封装于外壳内，或化学上和物 理上将活性物质和孢子外壳或碎片结合，目的是为所得制剂提供抗氧化效果。
本发明的第五方面提供了天然孢子外壳或其碎片作为药物活性抗氧化剂 的用途。
第六方面提供了天然孢子外壳或其碎片生产输送给人或动物体作为抗氧 化剂的药物的用途。
第七方面提供了治疗需要抗氧化剂的人或动物病患者的治疗方法，此方法 包括给病患者施用有效治疗(包括预防)份量的天然孢子外壳或其碎片。
依据本发明的第五到第七方面，孢子外壳或其碎片可与另一药物活性物质 一起施用，例如斯达汀(statin)等降脂剂。它可用于治疗任何因为氧化压力而 引起或加剧的不适，例如心血管病。又可用于治疗任何由于在体内生成自由基 和/或其它氧化剂例如来自于摄入的物质而引起或加剧的不适；因此可用于例如 减少炎症和/或治疗癌症如肠癌。
因为来自于孢子的孢子外壳可抵抗高强度的潮湿、酸、碱和热，所以典型 地不会在口中溶解或分解。它还是无味的，因此可用于掩盖活性物质例如药物 或营养补充物、食物或食品补充剂的味道。
因此，本发明的第八方面提供了天然孢子外壳或其碎片作为味道掩盖剂的 用途。再次，该孢子外壳或碎片适合用作包含活性物质的制剂的一部分以掩盖， 至少部分地掩盖活性物质的味道。该制剂可适合和/或适用于和/或预期为口服， 或任何令接受施用制剂病患者可感知味道的输送方法。
本说明书的整个说明书和权利要求中，单词“包括(comprise)”和“包 含(contain)”及其词形变化如“包括(comprising)”和“包括(comprises)” 是指“包括但不限于”，而且不排除其它部分、添加物、成分、整体或步骤。
本说明书的整个说明书和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数包 括复数。特别是使用不定冠词的地方，除非上下文另有要求，否则本说明书应 理解为可能为单数也可能为复数。
本发明的每一方面的优选特征可与任一其它方面一起叙述。
本发明的其它特征通过以下例子变得清晰。一般而言，本发明可扩展到此 说明书公开的特征(包括任何随之的权利要求和附图)的任何新特征或任何新 结合。因此除非与之不相容，结合本发明的某特定方面、实施例或例子所述的 特征、整体、特性、化合物、化学部分或基团将被理解为可应用于在此所述的 任何其它方面，实施例或例子。
此外，除非另有陈述，任何在此公开的特征可以为起到同一或相似目的的 可选择特征代替。
本发明将通过以下非限制性的例子说明。
实施例
以下实验说明来自于孢子的孢子外壳作为天然抗氧化剂的能力；特别是降 低油的氧化速度的能力。而这表明它们适合用作对氧敏感的活性物质特别是脂 质的输送载体，以及在施用前，施用时和施用后增强上述物质的稳定性。
使用的孢子外壳从伸筋草(Lycopodium clavatum L)(普通伸筋草)的孢 子中萃取，可购自例如Unikem、Post Apple Scientific、Fluka和Tibrewala International。25μm和40μm的孢子都经过试验，40μm的孢子来自于伸筋草的 亚种或遗传性变种。前者有网状的外表面而后者看来更光滑更圆。相信两者的 孢子外壳厚度都约是1.5μm。
把孢子外壳从孢子中其它成分(特别是蛋白质成分)分离的萃取程序如下 所述：标明“AHS”的样本先和氢氧化钾一起碱性水解，后和磷酸一起加酸水 解，而标明“BHS”的样本仅和氢氧化钾一起碱性水解。BHS样本因此不仅包 括孢子外壳也包括一部分纤维质内膜层。
首先，将未经处理的孢子悬浮在丙酮中并在搅拌下回流四小时。为此，将 250克孢子溶解在750毫升丙酮中，并在安装有两个双表面李比希冷凝器(20 厘米-4厘米)的2升圆底烧瓶中回流4小时。然后过滤(孔隙率为3级)所得 的脱脂孢子(DFS)并在空气中干燥过夜。
要产生碱性水解(BHS)的孢子外壁，就要将脱脂孢子(DHS)悬浮在6％w/v 的水性氢氧化钾中并在搅拌下回流(条件如上所述)6小时。经过过滤(孔隙 率为3级)后，再以新鲜的氢氧化钾溶液重复此操作。再次过滤(3级)悬浮 液，并以热水(3次)和热乙醇(2次)冲洗所得固体。然后在乙醇中回流(条 件如上所述)2小时，并过滤(3级)，在空气中干燥过夜。随后在60℃的烘 箱内彻底干燥。
要产生酸性水解(AHS)的孢子外壁，就要将去脂孢子悬浮在85％v/v的 正磷酸(750ml)中，在搅拌下回流(条件如上所述)7天。然后过滤(孔隙 率为3)固体，用水(5次，250ml)，丙酮(5次，250ml)，乙醇(1次，250ml)， 2M氢氧化纳(1次，250ml)，水(5次，250ml)，丙酮(1次，300ml)和乙 醇(1次，300ml)冲洗。然后在60℃的烘箱内干燥。
BHS和AHS产品都基本不含氮元素(经燃烧元素分析法和红外光谱测定)， 这表明移除了蛋白质和核酸，因此原始孢子潜在的过敏成分也已移除。通过扫 描电子显微镜和共焦电子显微镜术可观察到BHS和AHS产品为基本中空的胶 囊，没有了原来的内部孢原质。
除非另有陈述，以下步骤为将油装载到孢子外壳中。先把油加热到40℃至 60℃之间并混合几滴乙醇。然后把相应的孢子外壳加到所得悬浮液中形成均相 混合物。置于真空(30hPa)中1-2小时。
例1-相对于紫外线的稳定性(1)
此例使用装载了太阳花油、油菜籽油或豆油的25μm AHS孢子外壁，油和 孢子外壁重量比为1∶1。
上述步骤可用来将相应的油装载到孢子外壳中。然后把每个样本在纸上展 开经紫外线照射两小时，紫外线照射的条件为：使用每个设有30个灯泡的四 个PhilipsTM CLEO型15W紫外线灯而所使用的灯具为PhilipsTM Original Home Solaria型，其参数为：HB 171/A，220-230伏，50赫兹，75瓦
作为对照标准，未经装载的孢子外壁样本经过相同处理。
经照射后，用滴定法确定各个样本的过氧化值(PV)。为此，在氯仿(10ml) 中搅拌样本使之溶解，并加入乙酸(15ml)和饱和的碘化钾水溶液(1ml)。 塞着烧瓶晃动此混合物一分钟，再在室温下避光放置正好五分钟。以75ml的 蒸馏水稀释后，以硫代硫酸钠水溶液(0.01N)滴定，并用淀粉溶液作指示剂。 测出的过氧化值是测量样本中所含活性氧数量的量度法，其原理为氧气分解脂 肪而产生了过氧化物，当以上述方式处理后就产生碘分子，因其与淀粉反应而 产生无色的碘化钠而可被察觉。因此可使用标准程序(IUPAC方法2.500)确 定过氧化值(PV)。
脂质样本的过氧化值显示脂质降解到过氧化物的程度，因此显示其酸败程 度。过氧化值越高，脂质越酸败，其被氧化的程度也就越高。
结果如下表1中所示。
表1

表1中的结果表明把油类封装在孢子外壳中显著减少了其暴露于紫外线时 的氧化速率。这使得孢子外壳非常适合用于对氧气和/或紫外线敏感的物质，特 别是脂质的载体，于是可在使用前的储存期间保护这些物质免受氧化。
例2-相对于紫外线的稳定性(2)
准备两个完全相同的样本，把蓝蓟油(echium oil)(0.5g)加到25μm AHS 孢子外壳(0.125g)形成油和孢子外壁重量比为4∶1的均相混合物。和例1不 同，为了不使孢子外壳浸满油，混合物没有置入真空中；因此油和孢子外壳作 为简单的物理混合物，大部分油在孢子外壳外。
样本受紫外线照射，其照射前和照射后的过氧化值都被确定，如例1所述。 此外，纯蓝蓟油用作对照标准。
结果如表2中所示。
表2
  油∶孢子外壁重量比   暴露于紫外线中   (小时)   过氧化值   (meq/kg)   1∶0   0   9.0   1∶0   0   8.5   1∶0   2   110.1   1∶0   2   130.3   4∶1   2   10.1   4∶1   2   12.5
在实验误差内，这些数据表明孢子外壳很大程度上保护蓝蓟油免受紫外线 影响。因为在这种情况下大部分油类可能包围在孢子外壳外而不是被封装在其 内，所以这说明了孢子外壳具有天然抗氧化性质。
例3-对抗空气氧化的稳定性(1)
此实验评估了孢子外壳免受空气氧化的保护性质。作为周围的氧气对油酸 败作用的标准，氧化诱导时间(OITs)用MetrohmTM 743Rancimat仪来测定， 仪器版本为1.0SRI，空气流动率为20升/小时，操作温度为50℃。根据AOCS 空气氧化方法(A.OM-AOCS Cd 12b-92)，Rancimat仪用于测定特别是食用油 和脂肪的氧化稳定性。
所有物质-包括油、脂肪、脂肪酸氨基化合物和其它脂肪酸衍生物-都对氧 化有一定程度的固有抵抗力。这种天然抗氧化的程度是由物质本身和其所含的 任何添加剂，以及其预先的处理所决定。当物质内在的抵抗力被克服之前，它 的氧化是进行得很慢的，之后速度迅速加快。氧化诱导时间(OIT)是这一加 速开始之前的时间长度。经过这一时间限制后通常认为试验物质已经酸败。
在使用Rancimat仪时，经过滤并干燥的空气气流会通过样本，样本保存在 预先设定了温度的加热模块中。离开样本而排出的空气排进去离子水起泡，再 通过测量传导器不断测量去离子水的导电率。样本当被空气氧化时产生挥发性 有机化合物，这些有机物包括羧酸，主要是蚁酸；这些物质存在于排出的空气 中引致最初已去离子的水的传导率产生相应变化。产生的图表显示了传导率随 时间而发生的变化，通过Rancimat仪参照相对于时间的传导率的二阶导数最大 值能从此变化自动得出氧化诱导时间(其定义为氧化速度的最大变化点)。
准备三个样本，每个样本两份：新鲜的蓝蓟油混合入玻璃纤维；孢子外壳 (如以上描述获得)混合入玻璃纤维；装载入40μm AHS孢子外壳的蓝蓟油。 后种情况下油和孢子外壁重量比为0.5∶1。共焦电子显微镜方法显示第三个样 本中油被封装在孢子外壳中。
为确保较大的接触表面，在各个样本疏松分布之下对其吹气。然后如上所 述使用Rancimat仪评估样本。结果如表3所示。
表3

表3的数据表明封装有孢子外壁的油对空气的氧化作用的抵抗力显著的较 高，因此稳定性也显著的较高。这意味保护效果来自于孢子外壳。这种保护很 可能不只是孢子外壳作为氧气进入的物理障碍，因为已知来自于孢子的孢子外 壳至少部分为有孔的。
例4-对抗空气氧化的稳定性(2)
重复例3，但使用25μm的AHS孢子外壳并且用蓝蓟油和孢子外壳的物理 混合物代替封装的油的样本。物理混合物包含的油和孢子外壁的重量比为5∶1 (0.5g油比0.1g孢子外壳)。
结果如下图4所示。
表4

再次发现当过剩的蓝蓟油(5∶1)和孢子外壳混合时，蓝蓟油可防止被空 气氧化的时间达至少190小时。因为这种情况下大量的蓝蓟油必然在孢子外壳 外面，这表示孢子外壳本身就可作为抗氧化剂而不是对氧气提供单纯的物理上 的障碍。
例1和例3说明油封装在孢子外壳中(即保存在孢子外壁微囊体的内腔室 中且外表面带有最少量油或者没有油-这通过共焦显微术观察而得)时，可观察 到油在免受紫外线诱导的氧化和空气氧化方面受到很好保护。然而过量的油存 在时，也发现孢子外壳本身可抑制油的氧化，如在此例和例2中，孢子外壳外 油量很大，油因此直接暴露于空气和周围的紫外光中。
例5-对于紫外线的稳定性(3)
使用以上所述程序以蓝蓟油或鳕鱼肝(cod liver)油装载孢子外壳。这两 种情况中，油和孢子外壳的重量比均为1∶1。实验中既试验25μm的孢子外壁， 又试验40μm的孢子外壁，并且对AHS(只有孢子外壁)和BHS(孢子外壁+ 内壁)都进行试验。
如例1所述把各个样本展开在表面皿上以紫外线照射。作为对照标准，未 封装油的样本受到相同处理。
再如例1所述，测定在照射前和照射后各个样本的过氧化值。
不同种类孢子外壳的测试结果如下表5至表8所示。
表5-25μm AHS

表6-40μm AHS

表7-25μm BHS

表8-40μm BHS

这些数据证实油封装于孢子外壳中可大大减少其在紫外线中的氧化速度。
对40μm BHS来说此结果特别显著，似乎可完全保护两种油完全免受氧化。 此外，这种情况下孢子外壳似乎可“清理”油类，甚至在紫外线照射前就减少 了其过氧化值：这显出此BHS不管其阻挡油免受紫外线照射的能力如何，还是 具有相当强的抗氧化效果，在某些情况下甚至能消除任何之前产生的酸败。
例6-“清理”酸败油(1)
重复例5，但使用鳕鱼肝油，40μm孢子外壳(既包括AHS又包括BHS) 并且以孢子外壳和油重量比为0.5∶1，即用较高的多的油装载量。结果如下表 9所示。
表9
  样本   照射前过氧化值   (meq/kg)   照射后过氧化值   (meq/kg)   纯鳕鱼肝油   4.5   18   40μm AHS+油   10   13   40μm BHS+油   0   0
这再次证明BHS(孢子外壁+内壁)孢子外壳“清理”酸败的能力，(孢 子外壁+油)样本的过氧化值甚至比原来的油的样本的过氧化值还低。
例7-“清理”酸败油(2)
重复例6，但使用过氧化值为20.5meq/kg，即已经变得酸败的蓝蓟油。 照射前的结果如表10所示。
表10
  样本   孢子外壁∶油重量比   照射前PV(meq/kg)   纯蓝蓟油   0∶1   20.5   40μm AHS+油   1∶1   25.5   40μm AHS+油   0.5∶1   26.5   40μm BHS+油   1∶1   3   40μm BHS+油   0.5∶1   8.5
这些数据再次证明40μm BHS(即孢子外壁/内壁组合)“清理”已酸败油 的惊人能力。原来的油的样本经封装于孢子外壳中后其过氧化值大大减少。孢 子外壳比例越高，其效果越好。
例8-对抗空气氧化的稳定性(3)
重复例3，但使用鳕鱼肝油。
这些试验中使用了40μm孢子外壁(既包括AHS又包括BHS)，以油和 孢子外壳重量比为1∶1、3∶1和5∶1装载鳕鱼肝油。各个样本插入在两个玻 璃纤维填料之间的样本试管中。将毛细管从相应的塞子穿过以确保油不会从试 管底部流下来。然后把这些试管插入Rancimat仪的加热模块之间，空气开始流 动。
结果如下表11所示。
表11
  样本   油∶孢子外壁比   (w/w)   氧化诱导时间   (小时)   鳕鱼肝油   1∶0   56   油∶BHS   5∶1   59   油∶BHS   3∶1   ＞120   油∶BHS   1∶1   ＞120   油∶AHS   5∶1   73   油∶AHS   3∶1   ＞120   油∶AHS   1∶1   ＞120
表11的数据再次说明封装于孢子外壁中的油对于空气氧化的抵抗力显著 地较强，因此也稳定得多。
油的装载量越高，其保护效果越差。这可能是由于更多的油在孢子外壳的 外面和/或只是松散地与孢子外壁联系着(封装油得益于孢子外壳的天然抗氧化 性质，也可能得益于其对于空气的某种物理保护)。
例9-孢子外壳作为味道掩盖剂
如上所述制备孢子外壳。以油和孢子外壳重量比2∶1的比率用鳕鱼肝油 (来自于博资有限公司(The Boots Company PLC))装载孢子外壳，把两者的 均相混合物置入真空中1.5小时。
所得物质经三人品尝。三人都发现其质地软滑，尝起来没有油的味道和质 地。
这证明孢子外壳可在例如药物和营养补充性产品、食品和食品补充剂中用 作味道掩盖剂。很多人认为例如欧米加-3油的食品补充剂有不好的味道；因此 用来自于植物的孢子外壳制备食品补充剂不仅能保护其免受氧化，更能掩盖其 味道和/或气味，将其添加到预期的食物或营养性补充产品中时特别有用途。
例10-保护挥发性活性物质
此实验评估从来自于孢子的孢子外壳里的挥发性活性物质的挥发速度。
如上所述制备孢子外壳(AHS，直径为40μm)，装载有丁醇。醇类不仅 是挥发性物质，通常也用在局部外用制剂如化妆产品中作稀释剂。通过“被动 接触”，即把醇和孢子外壳在室温和室压下混合并让流体渗透进孢子外壳里以 使之浸透孢子外壳。
样本A包含2ml的纯丁醇作为对照标准；样本B包含封装于1g的孢子外 壳中的2ml丁醇。
把各个样本铺在培养皿中，每隔五分钟称一下重量以测量封装醇类完全挥 发所花费的时间。全部实验均一式三份地进行。
试验结果如下表12所示。各个情况下提出的半衰期为理论上的、计算出 的时间，期间一半量的封装醇类挥发掉。
表12
  样本   挥发时间(分钟)   半衰期(分钟)   A   200   61   B   300   115
表12说明把挥发性的醇类封装于孢子外壳中能相当程度地抑制其通过挥 发释放。为进一步减缓挥发损失从而保护根据本发明制备的制剂中的挥发性活 性物质，可把保护性的涂层例如脂质涂层涂在孢子外壳上。
例11-高活性物质装载量
把油和25μm AHS孢子外壳搅拌形成均相混合物，置入真空(30kPa)中2 小时，让孢子外壳浸满油。使用的油为大豆油、向日葵油、蓝蓟油和油菜籽油， 比例为每克孢子外壳3g油，鳕鱼肝油为每克孢子外壳3.5g油。
结果发现即使在这些相对较高的装载量中，装载了油的孢子外壳还是表现 为粉末，证实这些油的封装有效。通过共焦显微术可进一步对此确定。这证明 了来自于孢子的孢子外壳用作活性物质的输送载体的一个优势。也说明孢子外 壳适合用于粉末制剂中作载体，例如局部输送化妆物质、清洁产品或洗衣产品， 或者用于药物或营养补充性活性物质、食品补充剂等等的输送。
装载量为每克孢子外壳5g油或多于5g油时，样本表现更如糊状，表示很 大部分油在孢子外壳外面。这种制剂适合用作乳脂或软膏，例如，或者可应用 于某类食品上。装载量为每克孢子外壳2g油或少于2g油时，粉末很幼细而自 由流动，且摸起来适当干燥。