降低多聚唾液酸中的内毒素

本发明涉及通过以下方法减少多聚唾液酸(PSA)及其缀合物中的内毒 素，所述方法即对多聚唾液酸进行强碱孵育，然后回收PSA，所述回收通常 是通过阴离子交换柱进行吸收和洗脱实现的。内毒素含量降低的经纯化的 PSA可用于衍生化药物送递系统、包括蛋白和肽药物的生物分子，这改善了 药物的药物代谢动力学和药效学。

多聚唾液酸(PSA)是天然的无支链的唾液酸聚合物，由某些菌株以及哺 乳动物的某些细胞产生[Roth et.al.，1993]。通过有限酸水解或通过神经氨酸 苷酶消化或通过将所述聚合物的天然、细菌衍生形式分段(fractionation) 可以产生这样的多聚唾液酸，即所述多聚唾液酸的聚合程度可以从n＝约80 或更多个唾液酸残基到低至n＝2个唾液酸残基。不同多聚唾液酸的组合物也 是变化的使得存在均聚形式，即大肠杆菌(E.coli)K1菌株和B群脑膜炎球 菌的荚膜多糖中的α-2，8连接的多聚唾液酸，其也存在于胚胎形式的神经细 胞粘附分子(N-CAM)上。也存在杂聚形式，如大肠杆菌K92菌株和C群脑 膜炎奈瑟氏菌的多糖中的α-2，8 α-2，9交互多聚唾液酸。唾液酸也以与非唾 液酸的单体的交互共聚体的形式存在，如W135群或Y群脑膜炎奈瑟氏菌 中。多聚唾液酸具有重要的生物学功能，包括免疫和补体系统对病原菌的回 避和胎儿发育中对不成熟神经元神经胶质粘附的调控(其中所述聚合物具有 抗粘附功能)[Muhlenhoff et al.，1998]，尽管在哺乳动物中没有已知的多聚 唾液酸受体。大肠杆菌K1菌株的α-2，8-连接的多聚唾液酸也称为“多聚乙 酰神经氨糖酸(CA)”，并(以不同长度)用于举例说明本发明。

所述细菌多糖中的多聚唾液酸的α-2，8连接形式，是非免疫原性的(即 使当缀合于免疫原性载体蛋白时也不引起哺乳动物受试者体内的T细胞或 抗体反应)，这可反映其作为哺乳动物(以及细菌)聚合物的状态。在细胞 表面神经节苷脂上发现了较短形式(n最大＝4)的所述聚合物，所述细胞表 面神经节苷脂广泛地分布在体内，并被认为有效地给予和保持了对多聚唾液 酸的免疫耐受性。近年来，多聚唾液酸特别是那些α-2，8连接的均聚唾液酸 的生物学性质已被利用来改善蛋白和低分子量药物分子的药物代谢动力学 性质[Gregoriadis，2006；Jain et.al.，2003；US-A-5846,951；WO-A-0187922]。 多聚唾液酸的衍生作用使得包括过氧化氢酶和天冬酰胺酶在内的若干治疗 性蛋白的循环半衰期有了显著的提高，并使得这些蛋白可在原有抗体的存在 下应用，所述抗体是因为之前暴露于所述治疗性蛋白而产生的不想要(并且 有时是不可避免)的后果。在许多方面，多聚唾液酸化的蛋白的改良性质可 与用聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白相比。例如，在每种情况下，半衰期都增加， 且蛋白和肽都对蛋白水解消化较不敏感，但用PSA的生物活性保留似乎大 于用PEG[Hreczuk-Hirst et.al.，2002]。另外，将PEG用于必须慢性给药的 治疗性试剂还存在问题，因为PEG的生物降解是非常缓慢的[Beranova et.al.， 2000]，并且其高分量形式倾向于积聚在组织中[Bendele et.al.，1998；Convers et.al.，1997]。已发现聚乙二醇修饰的蛋白可生成抗PEG抗体，所述抗体也 可影响所述缀合物在血液循环中的残留时间[Cheng et.al.，1999]。尽管PEG 在传统上就用作缀合于治疗剂的非经肠给药聚合物，然而仍需更好地理解其 免疫毒理学、药理学和新陈代谢[Hunter and Moghimi，2002]。同样，还需考 虑PEG在可能大剂量使用的治疗剂中的应用性，因为PEG的积聚可能导致 毒性。因此，所述α-2，8连接的多聚唾液酸提供了一种很好的PEG替代物， 其是一种人体中天然存在的免疫上不可查的生物降解聚合物，并且其通过组 织神经氨糖酸苷酶降解为唾液酸--一种无毒的糖。然而，所述粗PSA被 高水平的内毒素污染，这限制了其治疗应用。

本发明人的科研组在以前的科学论文和已授权专利中已经描述了PSA 的纯化和分级分离，以及其在提高蛋白治疗剂的药物代谢动力学性质上的应 用[Gregoriadis，2006，Jain et.al.，2004；US-A-05846,951；WO-A-0187922]。 现在，本发明人描述了内毒素含量降低的纯化PSA的制备，所述PSA可用 于生产PSA衍生的蛋白和其他治疗剂。这些新材料和方法特别适于生产用 于人类和动物的PSA衍生治疗剂，其中由于医学伦理学以及管理机构如 FDA和EMEA的安全要求，药物实体的化学和分子定义是非常重要的。

内毒素(一种脂多糖)被Richard Pfeiffer在1982年首先定义为一种在 微生物膜破裂时释放的热稳定的毒性物质。被感染宿主中的炎症反应导致毒 性的产生，这似乎对清除大部分局部感染是最佳的。然而，当存在系统性分 布的严重感染时，也可发生导致感染性休克和死亡的炎症反应。

这种脂多糖(LPS)在将内毒素呈递给免疫系统骨髓细胞和产生炎性细胞 因子的过程中发生的大多数步骤中起作用。LPS最有效的组分是脂质A并 与内毒素有协同效应。细菌炎症介质如肽聚糖、细菌脂蛋白的二酰甘油基半 胱氨酸部分和细菌核酸指纹，也称为内毒素。最近，已发现钟样受体(TLR4) 是脂质A炎性信号传感器。而且，已经鉴定出不同炎症介质的信号传感器。 弄清内毒素的结构很重要，这有助于了解如何除去该物质。

LPS由三部分组成：位于近端的将LPS锚定在OM外层小叶上的疏水 脂质A部分，位于远端的延伸到水介质中的亲水O-抗原重复单元和连接两 端的核心寡糖。尽管对存活不是必须的，但是所述O抗原和核心糖提供了 对包括洗涤剂的多种抗菌剂和血清补体的膜攻击复合体的抗性。

产生O抗原的野生型细胞由于它们光滑的菌落被被称为“光滑型”，而 不含有O抗原的细胞被称为“粗糙型”。含有O抗原多糖的分子通常被称为 LPS，而如在奈瑟氏菌属中的不含O抗原的分子被称为脂寡糖或LOS。由 于脂质A对于存活是必须的并且也是一种有效的炎症介质，因此其现在是 用于开发抗生素和抗炎药的靶标。

除LPS之外，许多炎症介质可降解为内毒素，包括肽聚糖、细菌脂蛋 白的二酰甘油基半胱氨酸部分、细菌核酸指纹和失活内毒素(由内毒素突变 菌株产生)。

经修饰的脂质A结构已被用于开发新内毒素拮抗剂和免疫助剂[Christ et al.，1995]。脂质A结构和功能的生物化学细节的确定可帮助理解其在细菌 发病机理中的作用并且有助于开发新的感染疗法[Bishop 2005]。

已经开发了降低体液中内毒素含量的方法。例如，WO87/07531描述了 用固定在固相载体上的多粘菌素B从含内毒素的体液如血液中除去内毒素。

US 6,942,802 B2描述了从蛋白溶液中除去细菌内毒素以回收蛋白的方 法。在该专利中，使用固定化金属亲和色谱。

US 6,713,611 B2涉及一种从含有碱性蛋白的溶液中除去内毒素的方法。 所述方法包括在所述溶液中加入表面活性剂并将得到的溶液上样到阳离子 交换柱上，然后从所述柱上回收所述碱性蛋白。

US 6,617,443描述了一种从要回收其中核酸的材料中除去内毒素的方 法。所述内毒素通过在无盐洗涤剂溶液中预孵育所述核酸，然后在触角阴离 子交换剂上进行阴离子交换色谱而除去。

US 5,169,535描述了一种从含蛋白和内毒素的溶液中除去内毒素的方 法，其中所述溶液的pH被调至9或更低(所述蛋白的等电点)并使所述溶 液通过充满交联的颗粒状壳聚糖的柱子。所述内毒素被吸附而所述蛋白通 过。

US 5,917,022描述了一种从生物产品如治疗用蛋白、血液血浆成分和白 蛋白溶液中除去内毒素的方法。此方法包括将所述生物学产品中存在的内毒 素与由丙烯基葡聚糖和N，N-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物构成的交联亲水基 质结合，所述内毒素以某种程度的亲和性与其结合。此方法属于亲和色谱方 法。

US 7,109,322公开了一种从含有治疗活性物质的组合物中降低或除去内 毒素的方法，所述活性物质通常为通过遗传工程和或生物技术从天然来源提 取的核酸。为此，例如，用色谱材料处理从发酵液回收的组合物。将天然来 源的成分如所获得的大肠杆菌发酵液离心，用200mM NaOH、1％的十二 烷基硫酸钠裂解，过滤，然后通过优先(与内毒素相比)吸附所述核酸的阴 离子交换柱。用洗脱缓冲液洗脱所述核酸并回收。在另一个实例中，先使用 内毒素的金属亲和吸收剂，然后再使用所述阴离子交换柱。

发明US 6,699,386 B2提供了一种具有选择性吸附内毒素的较强能力的 吸附剂和一种从蛋白溶液中吸附内毒素的方法。所述吸附剂由一种通过交联 剂结合于碱性材料的碱性物质构成。

发明US 6,774,102描述了具有通过体外吸附从血液或血浆中选择性除 去内毒素和细胞因子诱导物质的能力的血液处理材料，用于感染性休克的治 疗。他们还提供了用于从人类或动物受试者的血液中除去内毒素的方法和设 备，其中使用一种固定在固态载体介质上的含有本发明多分散寡肽的吸附 剂。

已描述了这些用于从多糖样品中除去内毒素的方法。

US 5,589,591公开了使用优选超滤的粒析技术生产基本不含内毒素的多 糖组合物的方法。此方法适于从取自植物来源的甘露聚糖、阿拉伯树胶和阿 拉伯半乳聚糖中除去内毒素。

US 5,039,610描述了从革兰氏阴性的多糖如磷酸多核糖核醇中除去内毒 素的方法。将来自革兰氏阴性细菌发酵液的含有多糖的粉末溶解以提供内毒 素的二价反离子。连续加入乙醇以诱导脂多糖沉淀，并将得到的材料与非离 子型树脂、洗涤剂和螯合剂混合。

然而，时至今日，将多聚唾液酸样品中的内毒素含量降低到可药用的水 平仍然是一种挑战。来自发酵液的多糖带有阴离子且分子量与内毒素非常 接近。该天然化合物也是一种脂多糖。由于这些原因，大部分纯化技术得到 的是某种PSA和内毒素的共纯化。本发明克服了这些问题。

本发明的第一方面提供了一种用于降低含有多聚唾液酸和内毒素的样 品中内毒素含量的方法，步骤如下：

(i)在样品中加入pKa至少12的碱以形成pH至少12的碱性溶液，将此 溶液在预定温度下孵育预定时间；然后

(ii)从所述溶液中回收内毒素含量降低的多聚唾液酸。

在一个实施方案中，从所述溶液中回收PSA的步骤包括：

(iii)将所述碱处理的溶液通过阴离子交换柱，其中多聚唾液酸被吸附到 离子交换树脂上；

(iv)用洗涤缓冲液洗涤所述交换柱，其中多聚唾液酸仍然被吸附在离子 交换树脂上；而

(v)用洗脱缓冲液将多聚唾液酸从所述柱上洗脱下来，从而提供内毒素含 量降低的多聚唾液酸的产物溶液。一般认为至少部分碱处理的内毒素产物在 空隙体积中通过了所述离子交换柱。

在另一个实施方案中，回收步骤(ii)包括一个脱盐处理步骤，即基于分子 筛色谱，回收不含盐的高分子量材料如多糖。本发明特别适用于对微生物发 酵液的处理。

用本发明的碱处理方法处理的含有多聚唾液酸和内毒素的溶液优选为 发酵液，通常为离心后的上清液或者除去诸如营养物质、脂质、蛋白和核酸 的不想要污染物的预处理步骤的产物。然而，样品可能会含有不想在最后产 物中存在的蛋白，因为预计其会被所述碱降解且降解产物很容易在所述PSA 回收步骤中被除去。

此方法可得到内毒素含量降低并适用于制药的PSA样品。令本领域技 术人员惊讶的是，强碱的应用不会导致所述PSA(分子量)的降解或脱乙酰。 本领域技术人员应当会避免PSA与强碱如NaOH的接触从而避免脱乙酰作 用，参见Moe et al.。然而，我们已经展示了用碱孵育，然后例如通过在阴 离子交换柱上洗脱而回收PSA的方法，是一种降低PSA内毒素含量而不会 导致化学修饰(例如脱乙酰)和分子量降低的特别有效的方法。

本发明的第二方面提供了一种通过上述方法获得的内毒素含量降低的 PSA材料样品。

所述内毒素含量应被降低到一个可药用水平。优选地，通过本发明的方 法获得的样品中内毒素含量少于25EU/mg PSA材料。因此，本发明的第三 方面提供一种通过LAL试验测量的、内毒素含量为25EU/mg PLA材料或 更少的样品。优选地，内毒素的含量在0.05-25EU/mg PSA材料的范围内。 本发明提供具有低毒素含量的PSA样品本身和PSA缀合物(如生物分子或 药物转运系统缀合物)(以下统称为PSA材料)。

本发明的方法在可提供可用的PSA产率的条件下进行。可通过以下方 式避免PSA被亲和配体如多粘菌素B或聚阳离子如多聚赖氨酸污染，所述 配体常用在被设计用于除去内毒素的亲和吸附剂中，即通过完全不这些材料 或者在基质不发生降解的条件下使用(在此条件下内毒素的除去可能达不到 最佳)。这种“纯化的”PSA可用于衍生治疗剂如蛋白，以及用于人体而没 有内毒素毒性的危险。

用欧洲药典附录XIVC(European Pharmacopoeia 5.0，Appendix XIVC) 中所述的LAL试验测量所述内毒素水平。

在本发明方法的步骤(i)中，将所述样品加入到pKa至少12的碱中。不 受理论制约的，一般认为所述碱能够断开键，很可能是内毒素中的酯键，使 其失活，和/或允许除去所述反应产物。要在本发明方法中起作用，所述碱 必须足够强以与内毒素反应并将其水解。令人惊讶的是，例如通过N-乙酰 基的脱乙酰或多唾液酸的断裂使所述内毒素浓度的降低基本不会对所述多 聚唾液酸造成破坏。

优选地，所述碱的pKa至少13，更优选地至少14。所述碱优选地形成 pH至少13的碱溶液，更优选地形成pH至少14的碱溶液。所述样品通常 在合适碱性缓冲液中孵育，例如HEPES缓冲液，或者水。

本发明适用的碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2和LiOH。特别优选的是 NaOH。NaOH适用的浓度为2N。

进行步骤(i)的预定时间通常在5分钟到24小时之间，优选为30分钟到 6小时。预定温度通常为0℃至60℃，优选为2℃-40℃。更高的温度和/或 更长的时间可导致PSA本身发生不想要的降解。

在本发明的一个实施方案中，步骤(i)中的孵育为在20℃下2小时，同时 匀速搅拌。步骤(i)可紧随一个中和所述样品的附加步骤。中和可用例如HCl 进行，使溶液的终pH达到约7.4。

发明人的早期专利公开文本WO2006/016161中描述了一种利用步骤(iv) 和(v)中所用的离子交换色谱的合适方法。此方法可用于本发明，其中在此 阶段不必将所述PSA分离成具有不同平均分子量的级分。在现有技术的方 法中，PSA被分离成具有不同平均分子量的级分。使PSA的水溶液与柱中 的阴离子交换树脂接触，由此PSA被吸附。然后用洗脱缓冲水溶液对所述 PSA进行选择性洗脱，并将所述PSA从洗脱级分中回收。所述选择性洗脱 包括用至少一种洗脱缓冲液洗涤柱中的树脂。如果使用一种以上的洗脱缓冲 液，每一种均可具有不同的离子强度和/或pH，其中第二种和后续缓冲液具 有比前一步骤所用的缓冲液更高的离子强度和/或pH。使用离子交换的分级 分离方法会导致内毒素含量的微小降低。

在本发明方法的优选实施方案中，所述样品在被所述碱处理后通过阴离 子交换柱。可能需要在上样到所述柱前对所述样品进行制备，例如，可能需 要稀释。至少部分内毒素会通过所述柱，优选地选择可使PSA被完全吸附 且至少部分内毒素不被吸附的上样缓冲液。上样缓冲液的实例描述如下。

本方法的步骤(iv)是洗涤步骤，其中用低离子浓度的洗脱缓冲液冲洗通 过所述柱。例如，可用一种盐浓度为100mM或更低的缓冲液进行这种初始 洗涤步骤。通常，所述洗涤缓冲含有三乙醇胺且pH为约7.4。此初始步骤 可洗涤出低分子量的污染物。所述洗涤步骤所用的缓冲液为所述离子交换树 脂柱体积的至少1倍，优选地为至少1.5倍。在此步骤中，基本上全部多聚 唾液酸都保持在所述离子交换树脂上。可进行一次以上的洗涤步骤。第二种 洗涤缓冲液可与第一种相同，或者含有乙醇和/或表面活性剂。表面活性剂 的合适实例为非离子表面活性剂如PEG、Tween 20和80以及Triton。所述 洗涤步骤可从柱中进一步除去内毒素。

应注意，阴离子交换树脂柱的横截面的直径可大于其高度，而传统柱的 高度大于其横截面的直径。柱体积可为1-5000ml。所述柱的高度可为1-5000 cm。所述横截面积可为1-5000cm2。所述横截面可为任何形状，但优选圆形。

阴离子交换树脂洗涤步骤之后，用洗脱缓冲液洗脱所述PSA。步骤(v) 所用的洗脱缓冲液的离子强度通常比所述洗涤缓冲液高，以从所述柱上除去 所述PSA。通常，所述洗脱缓冲液包含浓度至少为0.4M的NaCl。

发明人已发现对于所述优选实施方案中的洗脱步骤来说，优选地使用至 少1.0，优选至少1.25，最优选至少1.5倍柱体积的对应洗脱缓冲液。优选地 使用不超过3倍柱体积的洗脱缓冲液。优选地，75ml基质的流速是7ml/min。

本发明方法的优选实施方案可包括一个以上，例如至少5个，例如多至 20个，通常范围为6-12个的连续洗脱步骤，其中所用的洗脱缓冲液可连续 地提高离子强度。这些必要步骤的第一步中的离子强度通常为1mM到1M。 以这种方式，洗脱的PSA被分级分离成具有不同平均分子量的样品。

优选地，洗脱缓冲液的离子强度是通过改变强无机酸和强无机碱的盐— —优选氯化钠——的水平而改变的。

进行步骤(v)并获得产物溶液后，可重复步骤(i)和步骤(iii)-(v)。优选地， 重复步骤(iii)-(v)。

所述PSA可被进一步处理。后续步骤可包括进一步纯化和/或浓缩步骤。 这些另外的步骤通常包括其中将所述多糖从任意盐中分离的步骤，例如使用 膜，如超滤膜。这种步骤还使得可以浓缩PSA以形成更加高度浓缩的溶液。 可对这种溶液进行额外的膜处理步骤，例如连续超滤或其他过滤步骤。

所述阴离子交换洗脱缓冲液可包括挥发性酸或碱，在这种情况下所述其 他步骤可包括所述挥发性碱从所述洗脱级分中的挥发。尽管可能通过沉淀技 术，例如引入PSA的非溶剂，从水溶液中回收PSA，然而优选地不使用这 种溶剂，因为这可能会使最后从相应溶剂中的分离更加困难。因此，最后的 回收步骤优选地包括水的蒸发，并且优选地，任何从所述洗脱步骤中剩下的 剩余挥发性缓冲液成分的蒸发。在一种其中存在三乙醇胺的优选情况中，三 乙醇胺阳离子和乙酸阴离子都是挥发性的并可容易地在真空条件下被除去。

可通过干燥(优选地在低压条件下)将PSA从溶液中最终分离。这优 选地是通过冷冻干燥进行。

可作为一个预备步骤进行沉淀(优选地使用一种非溶剂)以分级分离全 部成分的一部分并降低其中较高分子量级分的多分散性。优选地，使用分级 乙醇沉淀。

本发明的方法可在步骤(i)之前、步骤(i)和(ii)之间或步骤(ii)之后包括另 一步骤。这可包括疏水相互作用色谱(HIC)、亲和色谱如固定化金属亲和色 谱(IMAC)或分子筛色谱(SEC)。

合适的HIC柱能够吸附内毒素但不吸附PSA，如Phenyl FF。其上样缓 冲液通常为溶于去离子水或pH调节到7.4的去离子水的硫酸铵、氯化钠等 的溶液。

HIC优选地在步骤(i)之前进行。事实上，发明人相信这是首次公开HIC 用于从PSA样品中除去内毒素的用途。令人惊讶的是，HIC可用于除去内 毒素(即以脂多糖形式)而不会一起除去多聚唾液酸，例如从发酵液中回收 时，或者反之，例如当PSA的缀合使其比内毒素更加疏水时。通过选择合 适的柱和条件，内毒素将吸附到柱上而PSA通过，或者相反(随上样缓冲 液)进入空柱或通过用合适的洗脱缓冲液洗脱。因此，本发明的另一方面提 供一种用于降低含有多聚唾液酸和内毒素的样品中内毒素含量的新方法，包 括：使所述样品通过可吸附内毒素的疏水相互作用柱，其中PSA穿过所述 柱并被收集以得到内毒素含量降低的多聚唾液酸产物溶液。因此，本发明的 另一方面提供一种用于降低含有多聚唾液酸和内毒素的样品中内毒素含量 的新方法，包括：使所述样品通过可吸附PSA的疏水相互作用柱，其中内 毒素穿过所述柱而PSA被吸附，然后PSA被洗脱和收集以得到内毒素含量 降低的多聚唾液酸产物溶液。优选地使用苯柱，因为其可结合内毒素而允许 PSA通过。在第一个实施方案中，在含有内毒素的柱空体积通过后，可用洗 涤缓冲液洗涤所述柱并收集洗下的成分，其也可包含PSA。第二个实施方案 特别适用于纯化PSA与蛋白的缀合物，例如相对疏水的蛋白。

亲和过滤基质通常可在本发明方法的步骤(ii)之后使用。应选择与内毒素 特异性结合的亲和基质。选择条件以使得上样所述溶液时PSA不被吸附。 通常优选地避免使用内毒素特异的亲和色谱，以避免被所述基质的降解产物 污染。优选地，当包括任何这种方法步骤时，要选择条件以避免这种降解。 尽管选择这些条件可能会损害内毒素移除的最优化，但当在多步过程中组合 使用本发明方法的必要步骤时，内毒素水平会降低到可接受的水平。

在本发明的一个实施方案中，含有固定化内毒素结合试剂的亲和基质被 用于纯化所述PSA样品。一种合适的试剂是多粘菌素B凝胶，特别是 Detoxi-GelTM。

所述Detoxi-GelTM内毒素去除凝胶使用固定化多粘菌素B以结合和除去 溶液中的热原。多粘菌素是一个含有带脂肪酸链的阳离子环肽的抗生素家 族。多粘菌素B通过结合至细菌脂多糖的脂质A部分而中和内毒素的生物 活性。Kluger等人进行的研究(1985)表明所述固定化多粘菌素B可使部分但 非全部内毒素失活。

所述固定化多粘菌素B凝胶是一种稳定的亲和基质，所述基质防止配体 滤出到珍贵的制剂中。使用亲和基质铰得可容易地清除缓冲液、细胞培养基、 含大分子如蛋白质的溶液以及药理学重要成分。Detoxi-GelTM内毒素去除凝胶 也已经被用于从核酸(DNA)样品中除去内毒素(Wicks et.al.，1995)。

通常，多粘菌素B在使用之前必须先被脱气。凝胶可通过以下方法再生， 即通常用洗涤剂如去氧胆酸钠洗涤，然后再冲洗以除去所述洗涤剂。一种洗 涤所述凝胶的合适试剂为无热原的水。凝胶一旦生成，即被加入到所述柱中， 并加入无热原的缓冲液或水。柱的孵育时间通常为一小时。一旦样品已经被 收集，则其通常要被冻干以防止细菌污染。

CellufineTM柱是另一种可用于降低PSA样品中内毒素含量的亲和色谱 柱。这种柱通常用2-8倍，例如5倍柱体积的无内毒素缓冲液如HEPES缓 冲液(pH 7.4)平衡。HEPES也可用作上样缓冲液。Cellufine是一种特别适用 的材料，因为其中PSA非特异性结合剂很少。

其他商业可获得的内毒素选择性亲和色谱柱为EndoTrap柱。EndoTrap RedTM也可用于降低PSA样品中的内毒素含量。这种柱通常用5-10倍，例 如5倍柱体积的无内毒素缓冲液如Regeneration Buffer RedTM和20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)或者用去离子水(pH 7.4)平衡。HEPES或去离子水 (pH 7.4)也可用作上样缓冲液。

EndoTrap RedTM柱也可用于降低PSA样品中的内毒素含量。这种柱通 常用5-10倍，例如5倍柱体积的加有50-100μM Ca+2的去离子水(pH 7.4) 平衡。

根据本发明的第一方面，还可对所述样品进行其他纯化方法处理。例如， 可在步骤(i)和(ii)之间或步骤(ii)之后对所述样品进行一个或多个用表面活性 剂、螯合剂、碱、有机溶剂、氧化剂或过氧化物酶孵育的预备步骤。

优选地，所述表面活性剂是一种阴离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸 钠(SDS)。或者，所述表明活性剂可以是0.5％Triton X 114或者1％的Triton X 100或114。也可使用阳离子表面活性剂，例如可有效杀菌的表面活性化 合物，如溴化十六烷三甲基铵。合适的孵育时间为一小时。合适的温度为 0-50℃，但优选35-37℃。

当使用非离子表面活性剂时，所述溶液被上样到阴离子交换柱上以除去 非离子表面活性剂。这里可使用20mM TEA缓冲液。

在本发明的一个实施方案中，将PSA样品用含有1％SDS/2N NaOH的 HEPES缓冲液孵育1小时，然后将此溶液上样到柱(如GPC柱)上以除去 盐和阴离子表面活性剂，再用一种合适的缓冲液(通常为HEPES缓冲液) 分级分离。可使用pd10，Sephadex 25柱。

或者，也可使用其他具有不同Triton浊点的非离子表面活性剂，如 Tween 20和Tween 80，以降低PSA样品中内毒素的含量。将PSA样品在 室温下在0.1％Tween 80中孵育30分钟。然后用合适的缓冲液或去离子水 (pH 7.4)将该溶液上样到阴离子交换柱中以除去表面活性剂。用水和缓冲液 (pH 7.4)充分地洗涤所述柱以除去表面活性剂。

在实施方案中，所述方法包括一个氧化步骤。此步骤旨在氧化唾液酸的 末端单元以使其可与例如蛋白或肽反应。其可同时导致降低内毒素含量的降 低并因此成为一个可用于完成降低内毒素的总体目标的步骤。合适的氧化剂 是高碘酸钠、超氧化物、次氯酸盐和过氧化物酶。

本发明方法可包括在步骤(i)之前或步骤(ii)之后使用相萃取、渗滤沉淀和 /或干热。当使用干热时，通常在一个小瓶中将PSA样品加热到100-200℃， 最优选地约150℃，并且持续1-6小时，通常约4小时。这些条件不使PSA 失活或降解。

渗滤可在用表面活性剂孵育所述PSA样品后使用，或者也可独立于表 面活性剂处理而使用。所述过滤器应足够小以留存至少较高分子量的PSA 并同时允许内毒素通过。一个临界值为5kDa球蛋白的典型超滤设备具有足 够大的孔以允许内毒素(10,000Da)通过并同时留存20,000Da及更大的 PSA。渗滤步骤优选地在所述碱处理后使用，如作为回收步骤(ii)的一部分。

本发明的方法提供内毒素含量降低到可药用水平的PSA，用于人类或动 物。理想地，所述PSA产物的内毒素含量小于25EU/mg PSA。优选地，所 述PSA的内毒素含量为0.05-25EU/mg。

本发明可用于产生低内毒素含量的PSA缀合物。在一个PSA缀合物中， 所述缀合部分优选地为一个生物分子，更优选地为一个蛋白。PSA蛋白缀合 物可通过若干方法产生，具体参见发明人的在先专利申请WO-A-0187922 和WO92/22331。根据本发明第一方法的方法通常不适用于PSA-生物分子 缀合物，因为所述碱通常会破坏所述生物分子部分，即在步骤(i)之前不进行 任何缀合。本发明的第四方面提供一个包括以下后续步骤的方法：

(v)将PSA缀合物和内毒素的混合物与一种非离子表面活性剂在预定温 度下接触预定时间；

(vi)将所述表明活性剂处理的样品通过阴离子交换柱，从而使所述PSA 缀合物被吸附到所述柱上；

(vii)用洗脱缓冲液将所述PSA缀合物从所述柱上洗脱下来以产生内毒 素含量降低的PSA缀合物溶液。

这一方面中所用的非离子表面活性剂的实例为PEG化合物、去水山梨 糖醇单油酸酯、Tween 20/80或Triton系列的膜。再次，不希望受理论制约 的，一般认为所述表面活性剂通过破坏内毒素的胶束形成或通过溶解内毒素 而使内毒素水平降低。

本发明第四或第一方面的产物可为一种药用组合物，其中所述内毒素含 量应足够低以在将所述组合物给药于人类或动物时避免毒副作用。所述组合 物可以是人类或动物的药用组合物。

通常，纯化前的PSA样品——即第一方面的步骤(i)和第四方面的步骤(v) 的起始材料——中的内毒素含量为1000-200,000EU/mg。为了成为可药用 的，所述样品中最后的内毒素含量不能超过25EU/mg。所允许的内毒素含 量与所述PSA的目的用途有关。如果所述PSA用于衍生一种用作药物的蛋 白，则所允许的内毒素含量随着用作药物的蛋白的剂量而变化——较高的剂 量通常要求更严格地除去内毒素。

对于用在人类(动物)剂量为10-500mg的药物组合物中的PSA-蛋白 缀合物，内毒素含量不应超过0.5EU/mg，优选地为0.05-0.5EU/mg。对于 人类剂量为1-10mg的PSA-蛋白缀合物，内毒素含量不应超过5EU/mg， 优选地为0.5-5EU/mg。对于人类剂量最多为1000μg的PSA-蛋白缀合物， 内毒素含量不应超过25EU/mg，优选地为5-25EU/mg。

本发明中含有内毒素和PSA的样品方便地为发酵液。所述发酵液可以 是重组产生的，或者是天然的产PSA的微生物液体、其水解产物或这些物 质之一的分解衍生物。所述微生物可为大肠杆菌K1、脑膜炎奈瑟氏菌或液 化性摩拉克氏菌。通常，根据本发明第一方面的方法包括一个预备步骤，其 中所述微生物被发酵以产生发酵液。所述PSA可为聚(2，8-连接的唾液酸)、 聚(2，9-连接的唾液酸)或2，8-2，9-交互连接的PSA。优选地，所述PSA是 多聚乙酰神经氨糖酸(CA)或者其氧化的、还原的、胺化的和/或酰肼衍生物。

所述PSA通常具有至少2个，优选地至少5个，更优选地至少10个， 例如至少50个糖单元。通常，具有大多数作用的PSA的平均分子量为多至 100kDa。

所述PSA可来自任何来源，优选天然来源如细菌来源(例如大肠杆菌 K1或K92、B群脑膜炎球菌)，或者甚至牛奶或N-CAM。所述唾液酸多聚 物可为杂聚多聚物如135群或V群奈瑟氏脑膜炎双球菌，或可为合成的如 酶法合成的。所述PSA可为嵌段共聚物，如均聚(唾液酸)与另一种天然 多聚物或合成多聚物的结构单元形成的缀合物。所述PSA可以为盐或游离 酸的形式。其可以为水解形式，从而使得在从细菌来源回收后分子量降低。 本发明方法的起始材料中的PSA可以为具有广泛分子量的材料，例如具有 超过1.3(如高至2或更高)的多分散性。优选地，分子量的多分散性小于 1.2，更优选地小于1.1，例如低至1.01。

使用纯化PSA对蛋白和药物转运系统的衍生化可造成半衰期增加、稳 定性提高、免疫原性降低和/或对溶解性的控制，并因此改善了生物药效和 药物代谢动力学性质，或者可加强溶解性或含有所述衍生活性物质的溶液的 粘度。

优选地，本发明各方法方面的最后产物和新产品中的PSA具有2-1000 个唾液酸单元，例如10-500个，更优选地为10-50个唾液酸单元。优选地， 所述PSA的多分散性小于2，理想地小于1.2，理想地为1.01-1.10。

本发明所用的纯化方法除了降低内毒素含量以外，还优选地降低所述 PSA的多分散性。

PSA样品的内毒素含量通过本发明方法被降低至少5倍，优选地至少 10倍，最优选地至少100、200、500倍，并且在某些实施方案中最多至1000、 10000、100000或甚至1000000倍。优选地，所述碱处理和回收降低内毒素 含量至少5倍。预备步骤和多个PSA回收步骤可导致总共降低至少105倍。 通常会选择若干回收步骤的组合从而通过被称为内毒素成分移除的互补步 骤使内毒素降低最大化同时使PSA回收最大化。

实施例的“内毒素试验”(LAL测验)部分描述了如何测量内毒素的含量。

实施例

内毒素的对照测定

为进行内毒素测定，使用了Charles River Laboratories的 Endosafe-PTS(便携测试系统)。这基于所述LAL(鲎变形细胞溶解物) 测定。

仪器操作

将所有需要的信息输入读数器。当全部测试信息均已输入后，所述读数 器显示“加样；按回车”。除非另外指出，所述PSA样品被制备成溶于20mM TEA缓冲液中1mg/ml的溶液，pH 7.4。将25μL样品加入全部四个样品 池中并按下所述读数器上的回车键。泵将样品小份抽入测试通道中，结果在 15-20分钟内产生。当试验完成后，所述仪器在屏幕上显示内毒素测量结果 和测定验收标准。所述仪器给出以下技术指标：样品EU/mL、样品％CV、 尖峰(spike)EU/mL、尖峰％CV和％尖峰回收。

实施例1-用氢氧化钠降低内毒素

在0.5M NaOH Hepes缓冲液中制备有内毒素(31kDa，未氧化的)污染 的6mg/ml的多聚乙酰神经氨糖酸溶液，然后置入室温下孵育10分钟。然 后将0.5ml溶液上样至分子筛色谱脱盐柱中并弃去所收集的级分。然后用 2.5ml HEPES缓冲液洗涤所述柱并收集级分，然后再用HEPES缓冲液收集 另外2ml级分。然后通过间苯二酚测定分析所收集的洗出级分的多聚乙酰神 经氨糖酸含量。然后将含有多聚乙酰神经氨糖酸的级分合并到一起并分析内 毒素含量。测试所述样品中PSA的去乙酰化程度。图1显示在0.5M NaOH 和1％SDS HEPES缓冲液中的多聚乙酰神经氨糖酸的非变性凝胶电泳。

用NaOH可使内毒素含量降低53倍且未检测到去乙酰化。也未在用 NaOH和SDS的PAGE中观察到CA的任何降解。

实施例2-在碱处理后通过阴离子交换降低内毒素

在20mM TEA缓冲液(pH 7.4)中测量直接取自大肠杆菌K1的发酵器的 样品(1mg/ml)，发现内毒素含量大于105EU/mg。然后将NaOH加入所述 PSA溶液中以使PSA样品溶液最终含有2N NaOH，然后在室温下轻轻搅拌， 孵育2小时。记录所述溶液的pH。用10倍柱体积的去离子水(pH 7.4)洗涤 HiTrap QFF(1ml)柱，然后用10倍柱体积的20mM TEA平衡该柱。测量 所述样品溶液的电导率，并用20mM TEA缓冲液适当地稀释以与缓冲溶液 的电导率匹配。然后将所述样品缓冲液以1ml/min的流量上样到QFF(1 ml柱)上并单独收集柱空体积(约1/3柱体积)。收集了1ml级分。然后用 20mM TEA洗涤所述柱，并每次收集1ml洗出级分。然后用含1M NaCl 的20mM TEA洗脱所述样品并收集洗脱级分。对所述洗脱样品进行间苯二 酚测定以计算所述样品中多聚乙酰神经氨糖酸的量，并且测量含多聚乙酰神 经氨糖酸的合并洗脱样品中的内毒素含量。发现所述产物的内毒素水平降低 至1407EU/mg，即降低了超过71倍。PSA的回收率为91％。

重复对上述产物进行碱处理和通过阴离子交换的回收，观察到内毒素含 量进一步降低至小于300，即又降低了5倍。

实施例3-在非离子表面活性剂(Triton X-100)处理后通过阴离子交换降 低内毒素

测量溶于20mM TEA缓冲液(pH 7.4)中的初始样品(1mg/ml)的内毒素 含量。在1％Triton X 100中制备多聚乙酰神经氨糖酸溶液(35mg/ml，有 内毒素污染)，在室温下孵育2小时。测量所述溶液的pH。按照实施例2 制备HiTrap QFF柱，并按照实施例2制备样品和上样。然后用20mM TEA 洗涤所述柱，并每次收集1ml洗出级分。然后用含1M NaCl的20mM TEA 洗脱所述样品并收集洗脱级分。对所述洗脱样品进行间苯二酚测定以计算所 述样品中多聚乙酰神经氨糖酸的量，并且测定含多聚乙酰神经氨糖酸的合并 洗脱样品中的内毒素含量。当上样7.28mg多聚乙酰神经氨糖酸时，所述起 始材料的内毒素含量从4023降低至1511EU/mg，即降低了约3倍。回收率 为97％。

实施例4-通过非离子表面活性剂(Triton X114)处理和阴离子交换降低内 毒素

制备1％Triton X 114溶液并且加入到合适量的通过标准离心、裂解、 渗滤和超滤从发酵液得到的PSA溶液中，使Triton X 114的终浓度为0.5％， 在室温下孵育2小时。测量所述溶液的pH。按照实施例3制备、上样、洗 涤和洗脱HiTrap QFF柱，并测定含有多聚乙酰神经氨糖酸的合并洗脱样品 中的内毒素含量。超过105EU/mg的起始内毒素水平降低至约2.3×104 EU/mg，即降低约4倍。

实施例5-通过在碱处理/阴离子交换后进行非离子表面活性剂处理和阴 离子交换来降低内毒素

按照实施例2的方法用碱处理不同发酵液的多聚乙酰神经氨糖酸溶液 产物，然后用Triton X 114做如下处理，然后进行阴离子交换。

制备1％Triton X 114溶液并加入到合适量的PSA溶液中使Triton X 114的终浓度为0.5％。所述溶液在室温(25℃)下变浑浊。为使所述溶液澄 清，将其置于冰上10-15分钟。再将所述溶液置于室温下20分钟以使其浑 浊。所述浑浊溶液被离心并分为两层：含PSA的上层和含内毒素的Triton X 114下层。保留上层并上样到所述QFF柱上。按照实施例4制备、上样、 洗涤和洗脱HiTrap QFF柱。

在此例中，内毒素水平在第一个碱处理步骤中从105EU/mg以上降低至 约4.4×103EU/mg，又在第二个表面活性剂步骤和阴离子交换后降低至8.2× 102EU/mg。

实施例6-通过非离子表面活性剂(Tween 80)处理和阴离子交换降低内毒 素

在0.1％Triton X 80中制备多聚乙酰神经氨糖酸溶液(100mg/ml，有 内毒素污染的；共2.5g)，将pH调节到7.4。在室温下将所述溶液孵育30 分钟，再用pH 7.4的水稀释至500ml。用10倍柱体积的去离子水(pH 7.4) 洗涤所述HiTrap QFF(75ml)柱，然后用10倍柱体积的pH 7.4的水平衡该 柱。然后在室温下以7ml/min的流量上样所述样品溶液。将上样级分收集 到用50ml falcon管的级分中或视情况而定。单独收集最先流出的25ml上 样样品，这部分对应所述柱的柱空体积。然后用pH 7.4的含0.01％Tween 80 的水洗涤柱(7ml/min，4CV)，并每次收集75ml洗出级分。然后用pH 7.4的 水洗涤柱(7ml/min，4CV)，并收集75ml或酌量的洗出级分。然后用pH 7.4 的150mM NaCl水溶液洗涤柱(7ml/min，8CV)，并收集75ml或酌量的洗出 级分。然后用pH 7.4的500mM NaCl水溶液洗脱柱，并收集75ml或酌量 的洗脱级分。在常温下收集所述样品。对所述洗脱样品进行间苯二酚测定以 计算所述样品中多聚乙酰神经氨糖酸的量，并且测定含多聚乙酰神经氨糖酸 的合并洗脱样品中的内毒素含量。

实施例7-通过疏水相互作用色谱除去内毒素

将含2M硫酸铵的去离子水/去离子水用作上样缓冲液。将500μg多 聚乙酰神经氨糖酸(7kDa，按照比较例1制备)溶解于500μl上样缓冲液 中，并将溶液上样到下表注明的HIC柱中。然后将柱孵育一小时。收集洗 脱样品并进行间苯二酚测定以评估所述洗脱样品中多聚乙酰神经氨糖酸的 量。然后将含有多聚乙酰神经氨糖酸的洗脱样品合并到一起并分析内毒素含 量。

结果

  所用柱   上样缓冲液   多聚乙酰神经   氨糖酸(μg)   初始内毒素含   量(EU/mg)   最终内毒素   含量(EU/mg)   Butyl FF   2M(NH4)2SO4   336.95   3070   211   Phenyl FF   2M(NH4)2SO4   353.80   3070   148   Octyl FF   去离子水   379.49   3070   214

内毒素含量降低最多至14.5倍。通过不同柱降低内毒素的顺序为： Phenyl＞Butyl≥Octyl。

实施例8-用阴离子表明活性剂(十二烷基硫酸钠)除去内毒素。

在1％SDS HEPES缓冲液中制备6mg/ml多聚乙酰神经氨糖酸溶液并 在37℃孵育1小时。然后将0.5ml溶液上样到Pd10柱中并丢弃所收集的级 分。然后用2.5ml HEPES缓冲液洗涤所述柱，并收集洗出级分。再用2ml HEPES缓冲液洗脱所述柱。然后通过间苯二酚测定分析所收集的洗出级分 的多聚乙酰神经氨糖酸含量。然后将含有多聚乙酰神经氨糖酸的级分合并到 一起并分析内毒素含量。

内毒素含量从＞10exp6EU/mg降低到741.6EU/mg。PSA的回收率为 84％。

比较实施例1.使用阴离子交换分级分离

制备一个新的预装柱(1000ml；Q Sepharose FF，GE Healthcare)并用3 倍柱体积的去离子水和3倍柱体积的洗涤缓冲液以50ml/min的流量洗涤防 腐剂。将蠕动泵管用起始缓冲液(三乙醇胺，pH 7.4；20mM)注满，所述 柱与所述泵连接，将数滴起始缓冲液加到所述柱的顶端以避免将空气引入所 述柱中。在三乙醇胺缓冲液中制备从有内毒素污染的大肠杆菌发酵液中获得 的多聚乙酰神经氨糖酸溶液，并将所述溶液的pH调节到7.4。然后将所述 样品(从Marukin，Japan获得的多聚乙酰神经氨糖酸(CA))以50ml/min 的流量加到柱中，再用另外750ml洗涤缓冲液洗涤所述柱。然后用1500ml 洗涤缓冲液洗涤所述柱。用1500ml浓度为100-475mM NaCl的不同洗脱缓 冲液洗脱所结合的CA，收集每轮的洗液并分别将它们转移到不同的容器中。 用1500ml 1M NaCl除去全部残留的CA和其他残留物并收集洗液。然后用 3倍柱体积的洗涤缓冲液使所述柱再生。然后将所述柱在室温下储存于20％ 的乙醇中。然后在4℃和4bar压力下将链长较长的样品(通过高盐洗脱剂 洗出)在250ml浓缩管(Vivacell，Vivascience)中浓缩到最小体积。用蒸馏水 (用NaOH将pH调节到7.4)洗涤所述浓缩物4次。同样在4℃和加压下 将链长较短的样品在50ml浓缩管(Vivaflow，Vivascience)中浓缩。用蒸馏水 洗涤所述浓缩物4次。通过三乙醇胺测定测量多聚乙酰神经氨糖酸的含量。 然后分析所述样品的内毒素含量。

结果显示所述内毒素水平的值从1.6×10exp5EU/mg降低至3070 EU/mg。所述内毒素含量降低几乎5倍。

比较实施例2-亲和色谱-Detoxi凝胶柱纯化

用无热原溶液再生所述Detoxi凝胶柱以防止在所述样品中引入任何内 毒素。全部溶液在加入柱之前都被除气以防止气泡堵塞所述柱和降低流量。 Detoxi内毒素去除凝胶可使用至少10次而不丧失活性。全部溶液和凝胶在 使用前都被平衡到室温。

通过将浆体置于带有磁力搅拌器的抽滤瓶底部将所述凝胶脱气。在搅拌 所述浆体的同时，用抽气器在所述瓶内制造真空。所述凝胶被脱气约15分 钟。用脱气的浆体装填合适尺寸的柱，并使所述凝胶沉降30分钟。所述凝 胶是通过以下方法再生的，即用5倍柱体积的1％脱氧胆酸钠洗涤，然后用 3-5倍柱体积的无热原水洗涤以除去过量的脱氧胆酸钠。所述凝胶在每次使 用前都用相同方法再生。然后将所述样品加入所述柱中。加入小份的无热原 缓冲液或水并收集流过的液体。所述样品在柱空体积(94％的柱床体积)收 集完成之后从所述柱中脱出。为使效率更高，在样品进入所述凝胶床后重新 盖上底盖和顶盖。将所述柱孵育至少一小时，然后取下底盖和顶盖。然后加 入无热原缓冲液或水以收集所述样品。在全部这些实验中，注意防止在除去 内毒素之后样品被灰尘或脏玻璃器皿所污染。然后将样品冷冻和储存。所述 柱根据如上相同方法再生而除去任何结合的内毒素，并在2-8℃下储存在 25％乙醇中。

在第一个实施例中，样品是WO2008/012525的实施例3所公开方法的 产物，其是根据WO2006/016161所述技术分级分离的多聚乙酰神经氨糖酸 与GCSF缀合的产物。所述缀合物在亲和凝胶处理前的内毒素水平为438 EU/mg，处理后其水平降低至10.5EU/mg。使用这种亲和色谱材料。PSA- 蛋白缀合物的内毒素含量降低了最多至35倍。

在第二个实施例中，样品是在以下条件下使用的纯多聚乙酰神经氨糖 酸：

  制剂   PSA(mg/ml)   (三乙醇胺测定)   PSA量(mg)   体积   pH   PSA 19.3Kda   (Marukin)   0.1749   0.1574   在Hepes缓冲液中(20mM   Hepes，150mM Nacl；pH 7.4)   0.9ml   7.4

内毒素含量的值从初始的16,000EU/mg降低至4.2EU/mg。回收率大 于90％。

在第三个实施例中，起始材料是根据比较实施例在以下条件下制备的溶 液。结果如下：

  制剂   PSA(mg/ml)   (三乙醇胺试验)  PSA量(mg)   体积   内毒素含量(EU/mg)   CA7kDa   0.374  1.87   5ml   66.04   CA7kDa   0.160  0.8   5ml   178.75

所述样品中初始内毒素含量为3070EU/mg。内毒素含量降低了最多至 47倍。

结论

内毒素特异的亲和色谱可用于从多聚唾液酸中及其缀合物中除去内毒 素，即，发明人已经证明了可以选择这样的条件，即在所述条件下内毒素与 所述柱结合，而PSA不结合但能以方便的形式被回收并且含有低水平内毒 素。因此此步骤可用于处理碱(或表面活性剂)处理的PSA产物。

比较实施例3-用亲和柱(Cellufine)除去内毒素

此实施例与比较实施例2类似，但使用一种不同的内毒素去除亲和柱。 Cellufine ET净化柱(S珠)是通过用5倍柱体积的0.2M NaOH、2M NaCl 和无内毒素的水洗涤而再生。然后用5倍柱体积的合适的无内毒素缓冲液 (HEPES缓冲液)平衡所述柱。然后将在比较实施例1中用HEPES缓冲 液(1mg/ml)制备的多聚乙酰神经氨糖酸溶液在21℃下以0.1-0.2ml/min的流 量加入所述柱中。上样总量为218μg。然后将所述柱孵育1小时，再用 HEPES缓冲液洗脱并收集洗脱液。对所述洗脱样品进行三乙醇胺测定以计 算所述样品中的多聚乙酰神经氨糖酸含量，并测定含多聚乙酰神经氨糖酸的 合并洗脱样品中的内毒素含量。

所述内毒素水平从3070EU/mg降低至75EU/mg，即降低了40倍。

用比较实施例2部分1所用的起始材料GCSF-PSA缀合物重复该方法， 内毒素水平从438EU/mg降低至12.4EU/mg。

我们的结论是Cellufine柱适于从PSA中除去内毒素。

比较实施例4：用亲和柱(EndoTrap Red)除去内毒素

此实施例使用另一种亲和柱用于吸附内毒素。Endotrap Red柱是用pH 7.4的去离子水再生和平衡。制备有内毒素污染的10ml 50mg/ml的多聚乙 酰神经氨糖酸溶液。串联两个柱。将所述样品溶液上样到所述柱并收集其柱 空体积(约1/3柱体积)。然后收集剩余的上样溶液。然后用6倍柱体积的 pH 7.4的去离子水洗涤所述柱并每次收集1ml洗出级分。对所有级分进行 三乙醇胺测定以计算多聚乙酰神经氨糖酸含量并测定含多聚乙酰神经氨糖 酸的样品中的内毒素含量。

16kDa多聚乙酰神经氨糖酸的结果显示内毒素水平从564EU/mg降低 至6EU/mg，降低了约90倍。

所述方法也用于由WO2008/012528所述方法制备的有内毒素污染的胰 岛素-PSA缀合物。所述内毒素含量从111EU/mg降低至12.5EU/mg，即降 低了9倍。

这些实施例显示另一种柱也可用于从PSA及其缀合物中除去内毒素。

比较实施例5-用HEPES缓冲液通过亲和柱除去内毒素

Endotrap Red(1ml柱体积)是用随柱提供的Red再生缓冲液再生。 然后用5倍柱体积的合适的无内毒素的20mM HEPES缓冲液平衡所述柱。 然后将用HEPES缓冲液(750μg/ml)制备的有内毒素污染的多聚乙酰神经氨 糖酸溶液在21℃下以0.1-0.2ml/min的流量加入所述柱中。然后用0.3ml 20 mM的HEPES缓冲液洗脱所述柱。对所述洗脱样品进行三乙醇胺/蛋白测定 以计算所述样品中的多聚乙酰神经氨糖酸含量，并测定含多聚乙酰神经氨糖 酸的合并洗脱样品中的内毒素含量。结果显示所述内毒素水平可降低约2-7 倍，且在PSA回收率达到100％的上样水平上这受所用PSA上样量的影响 (对所述柱较低的上样量可获得较大的降低)。

比较实施例-用30％的IPA通过阴离子交换柱除去内毒素、蛋白、DNA 和细胞碎片

通过离心、上清液恢复、渗滤和超滤回收发酵液，制备浓度为35mg/ml 的多聚乙酰神经氨糖酸并测量其pH。用10倍柱体积的去离子水(pH 7.4)洗 涤HiTrap QFF柱，并用10倍柱体积的20mM TEA平衡。测量所述样品 溶液的导电性并用20mM TEA缓冲液适当稀释以与缓冲液溶液的导电性匹 配。然后以1ml/min的流量上样所述样品溶液并分别收集流出级分。然后 收集1ml的流出级分。然后用30％IPA洗涤柱，并每次收集1ml的洗出级 分。然后用含1M NaCI的20mM TEA洗脱所述样品并收集洗脱级分。对 所述洗脱样品进行三乙醇胺测定以计算所述样品中的多聚乙酰神经氨糖酸 含量，并测定含多聚乙酰神经氨糖酸的合并洗脱样品中的内毒素含量。所述 发酵液提取物的初始内毒素含量为3.2×104EU/mg，最后含量为1.8×103 EU/mg，即所述内毒素含量降低了18倍。

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