啤酒花(Humulus lupulus)是大麻科(Cannabaceae)的多年生植物，啤 酒花球果(成熟的未受精成熟雌花)通常称作啤酒花。啤酒花除球果之外 包括叶子、茎、根等。存在于啤酒花球果的啤酒花苦味素部分(在啤酒 花球果的内苞片的根中形成的黄色颗粒)是苦味和香味的来源，它同酵 母和麦芽一起都是啤酒酿造中的重要啤酒原料。啤酒花在民间治疗中 可用作镇静药和制欲药(anti-aphrodisiac)。通过从啤酒花球果中除 去啤酒花苦味素部分形成啤酒花苞片，这些苞片是没用的。如果情形 需要，这些苞片在啤酒酿造中被除去以成为副产品。在这种情况下， 啤酒花苞片用作肥料或家畜草料。但是，由于没有发现有效用途，因 此希望开发一种具有高附加值的使用苞片的方法。
在下面的由申请人中请的日本专利公开出版物1～6中，认识到啤 酒花、特别是来源于啤酒花的多酚具有抗氧化作用、发泡麦芽饮品的 发泡稳定作用、防龋作用、除臭作用、癌细胞的抗转移作用和拓扑异 构酶抑制作用。
1、日本专利公开出版物No.09-2917，
2、日本专利公开出版物No.09-163969，
3、日本专利公开出版物No.09-295944，
4、日本专利公开出版物No.10-25232，
5、日本专利公开出版物No.2000-327582，
6、日本专利公开出版物No.2001-39886，
如上所述啤酒花苞片多酚的各种用途已被报道。但是，啤酒花苞 片多酚没有被在工业上积极地使用。作为此原因，因为来源于啤酒花 苞片的如蜡和纤维杂质产生大量的沉淀物，从而啤酒花苞片多酚制备 中的加工和处理调控是很困难的。

本发明的发明人认真地研究并发现了一种包括以下步骤的方法， 该方法包括使用乙醇水溶液抽提啤酒花苞片、浓缩提取液以使残余乙 醇浓度为2v/v％或更少、通过离心过滤或过滤纯化浓缩物、容易地得 到高纯度的啤酒花苞片多酚。
至今，一些制备啤酒花苞片多酚的方法已在上述专利参考文献1～ 6中公开。但是，这些参考文献没有公开使用乙醇水溶液抽提啤酒花苞 片、提取液被浓缩到2v/v％或更少的残余乙醇浓度、通过离心过滤和/ 或过滤纯化浓缩物的提纯方法。发明人通过将得到的物质用于饮食、 美容助剂、药物等而已完成了本发明。作为药物，可提供消炎药、抗 过敏药、抑制牙斑形成的药剂、抗癌药和癌细胞的抗转移药。
附图说明
图1为说明在由本发明制备的啤酒花苞片多酚(实施例1)和由常规 方法制备的啤酒花苞片多酚(对比实施例1)之间不溶性葡聚糖合成酶 (glucanproducing enzyme)的抑制活性差异的图。在图中，与对照组(无 添加)相比，较低的柱形表示不溶性葡聚糖合成酶被抑制而且不溶性葡 聚糖的产生量较少。

本发明的原料的啤酒花苞片通过从啤酒花球果中除去啤酒花苦味 素部分而获得。一般地，啤酒花苞片通过碾碎啤酒花球果并过滤啤酒 花苞片以除去啤酒花苦味素部分而获得。在除去啤酒花苦味素部分后， 这样的啤酒花苞片可用作原料，或在将啤酒花苞片加工成用于输送的 小球形状之后可被使用。另一方面，含有啤酒花苞片的原料如啤酒花 球果本身或超临界流体萃取(supercritical fluid extraction)的残 余物可毫无问题地用作原料。
制备啤酒花苞片多酚的方法包括使用浓度为50v/v％或更少的乙 醇水溶液抽提原料的啤酒花苞片或啤酒花苞片粒。作为优选的实施例， 乙醇水溶液为50v/v％或更少的乙醇水溶液。原料和提取溶剂的比例优 选为约1∶10～20(重量比)，在30～60℃温度下搅拌60～180分钟进行 抽提。提取液通过过滤获得，如果需要，通过使用压带机(belting press) 等的浓缩进行过滤以增加提取液的回收。另外，再次向浓缩的啤酒花 苞片中加入水，然后混合物再次被浓缩以增加提取液的回收。
所得到的啤酒花苞片提取液为绿色至发白绿色的液体。然后，液 体被浓缩到残余乙醇浓度为2v/v％或更少，并被纯化。如果浓缩物不 被纯化，而在下一步中进行处理，则由于大量的来源于蜡和纤维的沉 淀物被产生，在操作中引起了严重的问题。
当啤酒花苞片提取液浓缩到2v/v％或更少的残余乙醇浓度时，提 取液使用如热浓缩或真空浓缩的常规方法浓缩是没有任何问题的。在 该方法中，乙醇可被回收并被再次使用。
通过离心或过滤被浓缩成2v/v％或更少的残余乙醇浓度的啤酒花 苞片提取液进行纯化过程。在离心过滤过程中，连续型或离心管型的 普通离心分离机是没有任何问题的。可优选使用在约50～100000G具 有离心作用的连续型离心分离机。
如果有必要，啤酒花苞片提取液可在10℃或更低的温度下维持几 天至约一个月。沉淀物被充分地产生并被除去。
由上述纯化过程获得的原料溶液通过啤酒花苞片多酚被吸附到凝 胶型的合成吸附剂中的吸附过程、用水或乙醇水溶液、优选用水或 10v/v％或更少的乙醇水溶液洗涤合成吸附剂的洗涤过程、和使用高于 30v/v％的乙醇水溶液或乙醇从合成吸附剂中洗脱吸附部分从而获得啤 酒花苞片多酚的洗脱过程而被处理。
在吸附过程中，提取液被冷却至15～30℃的室温，然后穿过被合 成吸附剂填充的柱子以将啤酒花苞片多酚吸附到吸附剂中。凝胶型的 合成吸附剂是亲水性的乙烯基聚合物、羟基丙氧化葡聚糖、苯乙烯-二 乙烯基苯聚合物等。液体通过时间优选为0.5～10的SV值。SV值由 下式定义：
SV值＝(液体-通过体积(L))/[(树脂体积(L))×(液体-通过时间(h))]。
在洗涤过程中，为了增加啤酒花苞片多酚的纯度洗涤凝胶型的合 成吸附剂以除去杂质成分。洗涤溶剂优选水或1～10v/v％的乙醇水溶 液，并且其体积为树脂体积的1～5倍。
在洗脱过程中，啤酒花苞片多酚从保存啤酒花苞片多酚的凝胶型 合成吸附剂中被除去和被洗脱。用于洗脱的溶剂可以是含水的乙醇、 含水的丙酮、含水的乙腈等，特别是多于30v/v％乙醇的水溶液或乙醇。 洗脱溶剂的液体通过体积优选为树脂体积的1～6倍。
得到的洗脱液在减压下被浓缩。溶剂使用如冷冻干燥或喷雾干燥 的常规方法被除去，并可获得粉末状的啤酒花苞片多酚。在减压下浓 缩中，如乙醇、丙酮、乙腈等的溶剂可被回收以重复使用。如此获得 的啤酒花苞片多酚是皮肤色、棕色或浅黄色的微苦的无规则粉末。
以减少重量的啤酒花苞片重量的产率为1～10w/w％。使用乙醇水 溶液、约0.05N的氢氧化钠溶液等洗涤所用的凝胶型的合成吸附剂， 吸附剂可被重复使用。
所得到的多酚可以以各种用途所需的量被混合，例如用于饮食、 美容助剂、准药品、药物等。例如，当啤酒花苞片多酚用作抑制牙斑 形成的药剂时，它被用在如糖果、饮食、特别是蜜饯、巧克力、焦糖、 口香糖等能在口中保留相对较长时间的饮食中。它可加入到用于口腔 的药物中，如漱口剂、牙膏、嗽口水等。当啤酒花苞片多酚加入到这 些用于口腔的饮食及药物中时，啤酒花多酚可直接被加入。优选地，1～ 2v/v％的啤酒花苞片多酚的水溶液、乙醇水溶液或乙醇溶液以10～ 5000ppm、优选100～1000ppm的终浓度可被加入到用于口腔的饮食或 药物中。
啤酒花苞片多酚可与口服或肠道外药物产品的常规使用的载体、 敷料或添加剂一起以常规方法被制剂。作为药物，可提供消炎药、抗 过敏药、抑制牙斑形成的药剂、抗癌药和癌细胞的抗转移药。
口腔药物用品为片剂、胶囊、颗粒、糖浆等，肠道外药物用品为 外用药物如软膏、乳膏和溶液、及如无菌溶液和悬浮液的注射剂。当 这些药品被给药于人体时，给药量为每天一次或几次2mg～500mg、每 天2mg～1000mg以提供足够作用。
含有本发明的啤酒花苞片多酚的药物用品可由所需的单位体积形 式与药物学可接受的赋形剂、载体、填充剂、粘合剂、稳定剂、调味 剂等被制剂。可与片剂或胶囊混合的辅剂如下：粘合剂如黄芪胶、阿 拉伯胶、玉米淀粉和明胶(geratin)，填充剂如微纤维素，溶胀剂如玉 米淀粉、所有明胶化淀粉(geratinization starch)、海藻酸，润滑 剂如硬脂酸镁，甜味剂如蔗糖和糖精，以及调味剂如薄荷、冬青油 (akamono oil)和樱桃。胶囊除上述原料外可含有液体载体如脂肪和 脂肪油。其它原料为涂层剂。此外，制剂的外形可通过其它方法改变。 例如，片剂可使用虫胶(shellac)或蔗糖包被。糖浆或酏剂可含有作为 甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)或 对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)、颜料和调味剂如樱桃或橙子香 料。
用于注射的无菌组成可通过将赋形剂如用于注射的水、天然植物 油如芝麻油、椰子油、花生油和棉籽油，或合成脂肪赋形剂如油酸乙 酯中的活性物质溶解或悬浮的创规方法制成。而且，如果有必要，缓 冲剂、抗菌剂、抗氧化剂等可被配方。如软膏或乳剂的外部用物可以 通过使用凡士林、石蜡、脂肪和脂肪油、羊毛脂、聚乙二醇等的常规 方法而获得。
本发明的啤酒花苞片多酚可加入到饮食中。含有啤酒花苞片多酚 的饮食品可由上述配方形成。另外，可通过加入必需品到面筋、日本饼 干、曲奇或饮品的食物原料中以常规方法加工饮食品。啤酒花苞片多 酚被处理，并且为了疾病预防和健康保养作为健康食品或功能性食品 每天通过分成几次被被口服服用5mg～500mg于。
当啤酒花苞片多酚加入到这些饮食中时，多酚可以粉末加入，其 在1～2％水溶液或乙醇水溶液或乙醇溶液中的最终浓度为10～ 500ppm、优选10～100ppm是期望的。
实施例
虽然下面的实施例是对本发明实施方案的详细描述，但是本发明 并不限于这些实施例。
实施例1(通过纯化方法制备啤酒花苞片多酚)
50g啤酒花苞片使用1升40v/v％乙醇溶液在40℃下搅拌60分钟 被抽提。在使用纱布压缩过滤后，进一步加入水并再压缩和过滤以获 得1升的提取液。该提取液使用旋转式蒸发器浓缩至500ml。残余乙醇 的浓度为约1％。浓缩液使用离心机以4000G离心15分钟，并使用滤 纸过滤。提取液以SV＝1通过30g的苯乙烯-二乙烯苯树脂(由Mitsubishi Kagaku公司制造，SP850)柱子，然后使用100ml水洗涤该柱子。120ml 的65％乙醇水溶液穿过该柱子，并且120ml洗出液被回收。使用旋转 式蒸发器浓缩该洗出液至30ml。在冷冻干燥后，获得1.7g有微苦口味 的无气味的棕色粉末的啤酒花苞片多酚。
对比实施例1(通过常规方法制备啤酒花苞片多酚)
50g啤酒花苞片使用1升40v/v％乙醇溶液在40℃下通过搅拌60 分钟被抽提。在使用纱布压缩过滤后，进一步加入水并在压缩和过滤 以获得1升的提取液。该提取液使用旋转式蒸发器浓缩至500ml。残余 乙醇的浓度为约1％。浓缩液以SV＝1通过30g的苯乙烯-二乙烯苯树 脂(由Mitsubishi Kagaku公司制造，SP850)柱子，然后使用100ml水洗 涤该柱子。120ml的65％乙醇水溶液通过该柱子，120ml洗出液被回收。 使用旋转式蒸发器浓缩该洗出液至30ml。在冷冻干燥后，获得1.8g有 微苦口味无气味的棕色粉末的啤酒花苞片多酚。
实施例2(牙膏)
磷酸氢钙                         42.0
甘油                             18.0
角叉菜聚糖(Carrageenan)          0.7
硫酸月桂酯钠                     1.2
糖精钠                           0.09
对羟基苯甲酸丁酯                 0.005
实施例1获得的啤酒花苞片多酚           0.005
调味剂                                1.0
水                                    37.0
总计                                  100.0
使用具有上述量的各组分通过常规方法制备牙膏。
实施例3(漱口剂)
甘油                                  7.0
山梨糖醇                              5.0
乙醇                                  15.0
硫酸月桂酯钠                          0.8
糖精钠                                0.09
1-薄荷醇                              0.05
调味剂                                0.045
实施例1获得的啤酒花苞片多酚           0.005
水                                    72.0
总计                                  100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备漱口剂。
实施例4(锭剂)
阿拉伯树胶                                  6.0
硬脂酸镁                                    3.0
葡萄糖                                  73.0
乳糖                                    17.6
磷酸氢二钾                              0.2
磷酸钾                                  0.1
调味剂                                  0.095
实施例1获得的啤酒花苞片多酚             0.005
总计                                   100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备锭剂。
实施例5(面筋)
蔗糖                                  20.0
浓的麦芽糖浆(75％固体)                70.0
水                                    9.5
着色剂                                0.45
调味剂                                0.045
实施例1获得的啤酒花苞片多酚           0.005
总计                                  100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备面筋。
实施例6(口香糖)
胶质(gum base)                          20.0
碳酸钙                                  2.0
乳糖                           77.0
甜菊苷(Stevioside)             0.095
实施例1获得的啤酒花苞片多酚    0.005
调味剂                         0.9
总计                           100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备口香糖。
实施例7(果汁)
浓缩的桔子汁                   15.0
果糖                           5.0
柠檬酸                         0.2
调味剂                         0.1
着色剂                         0.15
抗坏血酸钠                     0.048
实施例1获得的啤酒花苞片多酚    0.005
水                             79.5
总计                           100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备果汁。
实施例8(曲奇)
软质面粉                       32.0
整只鸡蛋                       16.0
黄油                          16.0
糖                            25.0
水                            10.8
发酵粉                        0.198
实施例1获得的啤酒花苞片多酚   0.005
总计                          100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备曲奇。
实施例9(焦糖)
砂糖                          31.0
浓的麦芽糖浆(75％固体)        20.0
奶粉                          40.0
硬化油                        5.0
氯化钠                        0.6
调味剂                        0.025
在实施例1获得的啤酒花苞片多酚 0.005
水                            3.37
总计                          100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备焦糖。
实施例10(片剂，胶囊)
实施例1获得的啤酒花苞片多酚            10.0
乳糖                                  75.0
硬脂酸镁                              15.0
总计                                  100.0
使用具有上述量的各组分，由常规方法制备片剂和胶囊。
实施例11(粉状药品，颗粒)
实施例1获得的啤酒花苞片多酚           20.0
淀粉                                  30.0
乳糖                                  50.0
总计                                  100.0
使用具有上述量的各种组分的混合物，由常规方法制备粉状药品 和颗粒。
实施例12(注射剂)
实施例1获得的啤酒花苞片多酚           1.0
表面活性剂                            9.0
生理盐水                              90.0
总计                                  100.0
使用具有上述量的各组分，注射剂通过加热混合和杀菌被获得。
实施例13(啤酒花苞片多酚中多酚重量的测定)
对于由实施例1和对比实施例1获得的啤酒花苞片多酚，参考Folin 等的方法(O.Folin and W.Denis，J.Biol.Chem.22，305-308(1915))，测定多 酚的含量。具体地，0.2ml的样品溶液(20％甲醇水溶液)、0.8ml的蒸馏 水、1.0ml的酚试剂(由Kanto Kagaku公司.制造)和5.0ml 0.4M的碳酸 钠水溶液被混合。该混合物在室温下放置30分钟，使用分光光度计 (Hitachi U-2000)测定在760nm的吸光度。作为标准试样，使用普通天 然多酚的绿原酸(chlorogenic acid)，显示出绿原酸的每重量的含量。 表1表示实施例1和对比实施例1的多酚量的测定结果。从结果可知 实施例1的多酚量高于对比实施例1的多酚量。说明实施例1的多酚 纯度高于对比实施例1的多酚纯度。
表1
样品                          多酚含量(％)
实施例1                       83.7％
对比实施例1                   77.2％      
实施例14(对龋齿细菌的不溶性葡聚糖合成酶的抑制作用)
对于由实施例1和对比实施例1获得的啤酒花苞片多酚，参考 Nakahara等的方法(K.Nakahara，S.Kawabata，H.Ono，K.Ogura，T.Tanaka， T.Oshima和S.Hamada，Appl.Environ.Microbiol.，59，968-973(1993))，研 究了对龋齿细菌的不溶性葡聚糖合成酶的抑制作用。典型的龋齿菌株， S.sobrinus(ATCC保藏菌株33478)被培养并通过离心分离菌体和培养物 上清液。该培养物上清液使用50％硫酸铵溶液盐析，并渗析沉淀物以 获得不溶性葡聚糖合成酶的粗提液。将酶粗提液、试样(最终浓度200 μg/ml)和蔗糖(最终浓度50mM)混合以获得总体积750μl的100mM 的磷酸钾缓冲液(pH6.5)，该溶液在30℃下孵育16小时。孵育之后， 混合溶液以15000rpm离心10分钟。在除去上清液之后，沉淀物使用 100mM 1∶1的磷酸钾缓冲液(pH6.5)和乙醇的混合物洗涤3次。沉淀物 溶解于1N氢氧化钠水溶液中，葡萄糖生成通过苯酚硫酸盐方法测定。
图1表示实施例1和对比实施例1中的抑制率。从结果发现实施 例中对不溶性葡聚糖合成酶的抑制活性高于对比实施例1。这表明具有 高功能性的有用的啤酒花苞片多酚可通过本发明的方法获得。
工业实用性
啤酒花苞片作为起始材料，具有比常规啤酒花苞片多酚更高纯度 的啤酒花苞片多酚可通过本发明获得。所得到的啤酒花苞片多酚可容 易地用作食物、饮品、化妆品和药品。