使用全细胞催化剂(在别处也称作全细胞生物催化剂)的生物转 化已经被证明是用于精细化学品合成的很有吸引力的生产技术(概况 参见例如：S.Buchholz，H.Grger，″Ganzzellbiokatalyse″在 Angewandte Mikrobiologie，第8章，Springer-Verlag，Berlin， 2006，161f页)。与分离酶相比，尤其是净化的酶，重组体全细胞催 化剂通常代表更有成本效益型的催化剂，因为通过直接使用在发酵中 获得的生物质，在全细胞催化剂的生产中处理和纯化步骤被省略(相 比于通过利用分离酶)。另外，在氧化还原反应中使用全细胞催化剂 允许反应在不添加外部的昂贵辅助因素的情况下进行(参见 W0/2005/121350)，然而辅助因素的添加在使用分离酶的反应中是必 要的。
目前包含全细胞催化剂的生物转化反应溶液的各种处理方法已 众所周知。普遍的问题是在萃取操作中乳状液的形成，以及漫长、不 经济的处理时间，尤其是萃取和/或过滤时间，例如即使在实验室规 模也要好几个小时或甚至不能分离这些混合物，特别是结果形成稳定 乳状液时。G.Jrg，K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Chem. Ing.Techn.2004，76，1739-1742G.Jrg，K.Leppchen，T. Daussmann，M.Bertau，Chem.Ing.Techn.2004，76，1739-1742 的研究可以引用为典型实例，其中在具有高细胞密度的全细胞生物转 化的萃取过程中，主要的问题在于与有机溶剂接触时稳定凝胶和粘液 的形成。其相应的结果是需要将该产品随后通过蒸馏来纯化，在后续 处理中产生较大的损失，从而整个处理的经济性降低、成本高昂。
另外，在从2004年起对生物转化溶液的后续处理的综述， Yazbeck等人(D.R.Yazbeck，C.A.Martinez，S.Hu，J.Tao， Tetrahedron：Asymmetry 2004，15，2757-2763)详细地谈及因形 成乳状液而带来的通常复杂产品分离。需要指出为避免该问题并非有 很多使用方便的技术可利用，因此在该体系中更需要能更好提高后续 处理的方法。
因此，对通常能避免上述限制的处理方法存在相当大的兴趣。迄 今为止，已有下列方法公开：
在2-苯乙醇的全细胞催化合成中，为了避免甚至在＜10g/L的低 的底物或产物的浓度时乳状液形成的发生，Serp等人使用合成树脂 的固定物(immobilizate)来萃取，其中有机溶剂(癸二酸二丁酯)是 包封的(enclosed)(D.Serp，U.von Stockar，I.W.Marison， Biotechnol.Bioeng.2003，82，103-110)。通过在合成树脂的固定 物被吸收，2-苯乙醇产物从反应介质中原位去除。然而，这种使用包 封在固定物中的方法是昂贵和高成本的。此外，用于溶液的产物浓度 较低(＜10g/L)。
另一种处理乳状液的方法使用若干串联设置的旋液分离器(L.-Q. Yu，T.A.Meyer，B.R.Folsom，EP 900 113，1999)，所述乳状液 包含有机相、水相和全细胞催化剂。来自一个旋液分离器的溢出输送 到下一个旋液分离器，以便水相可以与有机相和生物催化剂分离。然 而，该方法需要高的成本支出，是相对昂贵的。
近来，Bertau等人公开了通过使用适合的酶作为破乳化剂可以 避免与有机溶剂接触时稳定的凝胶和粘液(G.Jrg，K.Leppchen，T. Daussmann，M.Bertau，Chem.Ing.Techn.2004，76，1739-1742和 G.Jrg，K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Biotechnol. Bioeng.2004，87，525-536)。在这种情况下，通过由全细胞催化剂 得到的通过微生物释放进入该介质的生物乳化剂，凝胶形成的问题可 以被抑制。然而，缺点是需要另外添加酶组分，特别是仅在较大费用 下得到时。另一个问题是发生副反应，由添加的蛋白酶所引起(G. Jrg，K.Leppchen，T.Daussmann，M.Bertau，Chem.Ing.Techn. 2004，76，1739-1742)。优选存在例如酯基，以及酰胺基的裂解。
作为替代方案，Hanson等人公开了在生物转化之后使用助滤剂 来实现(R.L.Hanson，S.Goldberg，A.Goswami，T.P.Tully，R. N.Patel，Adv.Synth.Catal.2005，347，1073-1080)。根据该方 法，减少有机酮底物是在中性pH值(pH 7)下用全细胞催化剂和约 20g/L反应量的底物并使用相对于有机底物使用量10倍的高价格的 助滤剂Amberlite XAD-16来实现的。虽然使用Amberlite XAD-16经 证明是适合的，然而在没有这些助滤剂的情况下使用乙基乙酸乙酯或 MTBE直接萃取经证明是不可行的，这会导致乳状液问题。然而， Hanson等人的方法的缺陷是具有局限性，例如高价格的Amberlite XAD-16作为助滤剂相对于有机组分10倍用量的高消耗量，甚至对于 仅约为20g/L的低比例的有机酮底物时。

因此本发明的技术问题是提供快速、简单、廉价和有效的处理由 全细胞生物转化产生的反应溶液的方法，所述方法基于合理价格的溶 剂或添加剂，需要很少的成本支出。本发明特别提供一种方法，用于 处理包含全细胞催化剂、含水组分和相对于总量比例＞50g/L的有机 组分的反应溶液，避免目前工艺水平的上述缺点。具体来说，该方法 适合于处理由使用全细胞催化剂氧化还原反应产生的反应溶液，其中 有机组分包含＞90％(w/w)的光学活性醇。
本发明的技术问题是通过一种处理反应溶液的方法来解决的，所 述反应溶液包含全细胞催化剂、含水组分和有机组分，其中有机组分 包含待富集的产物，使用以下步骤处理反应溶液：
a)将pH值调节到小于4；
b)在有助滤剂的情况下过滤反应溶液，优选所述助滤剂在所述反 应溶液中；
c)任选地：进一步富集和/或纯化包含在所述有机组分中的产物。
令人惊讶地发现通过将反应溶液pH值降低到小于4，在有助滤 剂的情况下进行过滤，极大的提高了反应溶液的过滤速度。特别地， 惊奇也是因为只降低pH值(实施例4＝比较例)，和在有助滤剂存在 但没有降低pH值的情况下(实施例2、3＝比较例)过滤，从在全细 胞催化反应中形成的乳状液开始，两者都存在不令人满意的产品分离 /成品处理。在这种情况下助滤剂优选存在于反应溶液中。因此优选 在过滤(在将pH值调节至小于4之前或之后)之前将助滤剂添加到 反应混合物中，如根据本发明的实施例6所示。然而另一选择为-在 将该反应混合物pH值调节到低于4之后-该反应混合物可以使用装 有助滤剂的过滤器来过滤(参见例如实施例5)。
因此，基于合理价格的溶剂或添加剂，本发明提供一种快速、简 单、廉价和有效的处理由全细胞生物转化产生的反应溶液的方法，仅 需要低成本支出。根据本发明的方法尤其适合于处理反应溶液，该溶 液包含全细胞催化剂、含水组分和具有相对于总量比例＞50g/L的有 机组分，并且特别用于由用全细胞催化剂的氧化还原反应产生的反应 溶液的处理，其中有机组分包含超过90％(w/w)的光学活性醇。
另外，优选方法具有以下步骤：
b1)使用有机溶剂或有机溶剂的混合物洗涤在过滤期间获得的滤 饼；
b2)任选地：使用步骤b1)中获得的滤液或新添加的有机溶剂或 有机溶剂的混合物萃取步骤a)中获得的滤液的含水组分；和
b3)从有机组分中除去有机溶剂。
在反应溶液中被处理的有机组分应理解为反应所需要的最终产 物，其可以与相应的起始产品和/或任何形成的副产物混合，最终产 物是例如光学活性醇，所述醇由相应的酮在由全细胞催化剂的催化反 应之后获得。通常，在反应之后需要的最终产物存在于作为与起始产 品例如以95％∶5％(w/w)的比例、97％∶3％(w/w)或更高比例混和的 混合物的有机组分中。
另外，所述方法优选其中有机组分包含超过90％(w/w)，特别优 选超过95％(w/w)的光学活性醇。
具体来说，根据本发明的方法克服现有技术中将产物从被处理的 反应溶液中分离的问题，其中所述反应溶液包括包含全细胞催化剂、 含水组分和包含待富集产物的有机组分的乳状液。
进一步优选在反应溶液中全细胞催化剂的比例不高于75g/L，优 选不高于50g/L，特别优选不高于30g/和更加特别是优选不高于 25g/L(g相对于生物质的湿重)。在该情况下全细胞催化剂在反应溶 液中的比例至少为10g/L，特别地至少为20g/L(克相对于生物质的 湿重)是特别优选的。
所有已知的助滤剂可以作为助滤剂使用。在另一个优选方法中， 助滤剂选自纤维素、硅胶、硅藻土、珍珠岩、方晶石、过滤用石英砾、 活性碳、炭、木粉、基于合成树脂的助滤剂和它们的混合物。使用硅 藻土、方晶石、过滤用石英砾和这些组分的混合物作为助滤剂是特别 优选的。相当特别优选的，产品名为Celite Hyflo Supercel的产品 作为助滤剂使用。
在根据本发明方法的一个优选实施方案中，调节反应溶液pH值 小于3，优选pH值为2-3，特别优选pH值为2.5-3。
在本方法的进一步变化中，MTBE(甲基叔丁基醚)和/或ETBE(乙 基叔丁基醚)和/或乙酸乙酯用作洗涤滤饼和/或萃取含水组分的有机 溶剂。
在一种优选方法中，有机组分的比例相对于反应溶液总量大于 50g/L，优选大于100g/L。

本发明使用以下实施例解释，然而并非限定保护的范围。
实验实施例的普遍解释
为解决现有技术的问题进行以下测试：
以下测试代表比较例：按照Hanson等人的方法(Adv.Synth. Catal.2005，347，1073-1080)，助滤剂在进行生物转化之后使用。 代替Hanson等人使用的Amberlite XAD-16，使用价格更有吸引力的 助滤剂Celite Hyflo Supercel(＝商品名)。然而，该方法被证明是 不适合于有机组分比例大于50g/L的生物转化(实施例2＝比较例)。 在中性pH值-范围(pH值6.5-7.0)进行生物转化之后，形成稳定乳 状液，其不能以可实行的方式使用助滤剂(以在过滤器上硅藻土层的 形式)处理，导致非常缓慢的过滤，过滤时间为6.5小时，此外在萃 取操作中的随后相分离也是非常缓慢的，超过5小时。另外，获得 20.1％的低分离收率。
如果将助滤剂Celite Hyflo Supercel搅拌进入pH值为6.5-7 的反应溶液然后过滤混合物，观察到同样地不令人满意的长达7小时 的过滤时间(实施例3＝比较例)。获得的分离收率是再次不令人满 意的，为55.4％。
另外，没有使用助滤剂的相应的测试即使将pH值降低到4也不 会提供显著的过滤，以致于在这种情况下过滤不得不中断(实施例4 比较例)。
相比之下，通过根据本发明的方法进行处理，实现了较短的过滤 时间和高的分离收率(实施例5和6)。例如，如果将pH值在生物转 化完成之后首先调节到pH值2.4，生成的反应混合物通过装有大约 层厚为0.5cm的硅藻土(Celite Hyflo Supercel)的过滤器过滤， 然后用有机溶剂洗涤，水相另外经受萃取处理，则获得79.2％的分离 收率(实施例5)。此外，在该方法中获得小于5分钟的短的过滤时 间。
如果将生物转化之后的pH值调节到pH值2.6，将Celite Hyflo Supercel添加到反应混合物然后过滤，滤饼用有机溶剂洗涤，水相 经受萃取处理，也获得高分离收率(78.4％)(实施例6)。在实例6 中，再次获得小于5分钟的短的过滤时间。
实验实施例：
实施例1(制备处理测试用的反应混合物的普遍测试规格；500mM 的底物浓度)：
在一个Titrino反应容器中(制造商：Metrohm)，将在 WO/2005/121350中公开的全细胞催化剂E.coli DSM14459(pNO5c， pNO8c)以对应于大约50g/L生物质浓度(实施例2和3)或大约25g/L (实施例4-6)、右旋葡萄糖(相对于所用的对氯乙酰苯的量为1.05-6 当量)和3.87g对氯乙酰苯(相对于所用的磷酸盐缓冲液的量，相应 使用0.5M的底物浓度)在室温下添加到50ml的磷酸盐缓冲液中， 其中所述全细胞催化剂E.coli DSM14459包含从Lactobacillus kefir中得到的(R)-乙醇脱氢酶和从Thermoplasma acidophilum (嗜酸细胞)得到葡糖脱氢酶。反应混合物在室温下搅拌22h，通过 添加氢氧化钠溶液(2M NaOH)将pH值保持恒定在6.5-7.0的范围内。 样品以定期的间隔取样，通过高压液相色谱法测定转化率。在22h的 反应时间之后，产物(R)-(4-氯苯基)乙基-1-醇的转化率大于99％。 然后反应混合物用于处理测试。
实施例2(比较例)
由实施例1描述的方法制备的反应溶液(乳状液)(双倍批量) 在真空下通过一个孔径大小为40-200μm、装有大约0.5cm厚层的硅 藻土(Celite Hyflo Supercel)的Schott玻璃滤器过滤。需要6.5 小时的过滤时间。非常浑浊的滤液用3×50mL MTBE萃取，形成一个 混合相，导致超过5小时的非常缓慢的分离。用硫酸镁干燥组合的有 机相、过滤然后在真空中除去有机溶剂(50℃，真空喷水)，以20.1％ 的分离收率获得需要的产物。
实施例3(比较例)
将100ml MTBE和1.5g硅藻土(Celite Hyflo Supercel)添加 到通过实施例1描述的方法制备的反应溶液(乳状液)中。在搅拌5 分钟之后，在真空下过滤。需要7小时的过滤时间。然后滤饼用50ml MTBE洗涤。将洗液添加到非常浑浊的滤液中，生成物混合物用2× 50ml MTBE萃取。用硫酸镁干燥组合的有机相之后过滤，然后在真空 中除去有机溶剂(50℃，真空喷水)，以55.4％的分离收率获得需要 的产物。
实施例4(比较例)
当生物质发生絮凝时，将浓盐酸添加到由实施例1描述的方法制 备的反应溶液(乳状液)(0.6倍批量)中直到将pH值调节到4.0。 然后在真空下过滤，但是由于凝胶形成而没有发生显著的过滤，并且 因此过滤被中断。
实施例5(根据本发明的实施例)：
当生物质发生絮凝时，将浓盐酸添加到由实施例1描述的方法制 备的反应溶液(乳状液)(0.6倍批量)中直到将pH值调节到2.4。 然后在真空下通过过滤器过滤，该过滤器装有大约层厚0.5cm的硅藻 土(Celite Hyflo Supercel)，观察到取得小于5分钟的非常快速的 过滤。然后滤饼用30ml MTBE洗涤，并进一步添加45ml到浑浊的滤 液中。存在良好的相分离。在进一步用75ml MTBE萃取之后，组合的 有机相用硫酸镁干燥、过滤，然后在真空下除去有机溶剂(50℃，真 空喷水)，以79.2％的分离收率获得所需的产物。
实施例6(根据本发明的实施例)
当生物质发生絮凝时，将浓盐酸添加到由实施例1描述的方法制 备的反应溶液(乳状液)(0.6倍批量)中直到将pH值调节到2.6， 添加2g硅藻土(Celite Hyflo Supercel)。然后在真空下过滤，观 察得到良好的小于5分钟的过滤。然后滤饼用2×80mL MTBE洗涤， (最初的含水)滤液用两种有机洗涤相(2×80mL)洗涤，在各种情 况下观察到良好的相分离。组合的有机相用硫酸镁干燥、过滤，然后 在真空下除去有机溶剂(50℃，真空喷水)，以78.4％的分离收率获 得需要的产物。形成的产物的对映体过量值大于99.8％ee。