5‑氨基‑2‑氧代噻唑并[4，5‑D]嘧啶‑3(2H)‑基‑5‑羟甲基四氢呋喃‑3‑基乙酸酯的共结晶及其制备和使用方法 |
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| 申请号 | CN201580070936.4 | 申请日 | 2015-12-22 | 公开(公告)号 | CN107108655A | 公开(公告)日 | 2017-08-29 |
| 申请人 | 豪夫迈·罗氏有限公司; | 发明人 | U·施威特; F·布利斯; M·卡默勒; F·蒂克萨伦特; | ||||
| 摘要 | 式I化合物的共结晶及其药物组合物是用于 治疗 疾病 ，如人免疫 缺陷 病毒(HIV)感染、乙肝病毒(HBV)感染、丙肝病毒(HCV)感染和癌症的新治疗剂。与相应的式I化合物的 甲苯 磺酸盐形式相比，该共结晶对于 氧 化和 水 性降解更稳定，具有更好的药代动 力 学和更优的 生物 活性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种共结晶，包含至少两种组分： |
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| 说明书全文 | 5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-D]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯的共结晶及其制备和使用方法 发明领域 [0001] 本发明涉及5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯和有机酸的共结晶，该共结晶的合成，及其用于治疗病理性疾病，尤其是乙型肝炎(HBV)感染的用途。 [0002] 发明背景 [0003] 核苷类似物是类似或模拟DNA合成中的天然核苷发挥作用的分子。“核苷类似物”类别内的化合物是治疗癌症、病毒感染和免疫抑制疾病的重要治疗剂。核苷类似物通过抑制DNA合成发挥其治疗效果。在进入细胞之后，核苷类似物被磷酸化成相应的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。三磷酸酯核苷类似物通过终止DNA转录抑制细胞分裂。 [0005] 乙肝病毒(HBV)是仅次于烟草的人类癌症的第二大病因。HBV诱导癌症的机制未知。假定HBV感染可直接触发肿瘤发展，或通过慢性炎症、肝硬化和与感染相关的细胞再生间接触发肿瘤发展。感染HBV的人受急性肝炎和肝损伤之苦，导致腹痛、黄疸和某些肝酶的升高血液水平。虽然患者一般会从急性HBV感染恢复，病毒可持续无限复制，导致慢性持续性肝炎，其是肝细胞癌，一种原发性肝癌的主要病因之一。 [0006] 3TC(拉米夫定)、干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2a、贺维力(阿德福韦二匹伏酯)、博路定(恩替卡韦)、和替泽卡(替比夫定)是最近FDA-批准的用于治疗HBV感染的药物。然而，这些药物中的许多有严重副作用并且在用这些药物治疗的患者中会迅速出现病毒耐药性。市售的核苷类似物的其他缺陷包括但不限于，与其采用需要耗时且高成本的纯化的多步骤合成方案制备相关的困难，以及与其储存期间的稳定性和抑制病毒复制而不破坏宿主细胞相关的挑战。 发明内容[0007] 本发明提供了共结晶作为治疗剂用于治疗疾病和病症，如癌症、病毒感染和与不良的免疫功能相关的病症。 [0008] 在一个实施方式中，本发明提供了包含至少2种组分的共结晶：(A)式I的化合物或其药学上可接受的立体异构体或互变异构体；和 [0009] [0010] (B)共结晶成形剂。 [0011] 共结晶成形剂(former)是有机酸。可用作共结晶成形剂的有机酸的示例是富马酸、马来酸、戊二酸、己二酸、α-酮戊二酸和邻氨基苯甲酸。根据一个实施方式，共结晶成形剂是戊二酸，而对于其他实施方式，共结晶前体可以是选自马来酸、己二酸或富马酸的有机酸。 [0012] 本发明的共结晶可包括式I的化合物和马来酸、式I的化合物和富马酸、式I的化合物和戊二酸、式I的化合物和己二酸、式I的化合物和邻氨基苯甲酸、或式I的化合物和α-酮戊二酸。本发明的共结晶的式I的化合物与共结晶成形剂之比可以是1∶1、1∶2或2∶1。 [0014] 在一个实施方式中，本发明提供了包含药学上可接受的运载体或稀释剂和包含以下至少两种组分的共接近的药物组合物：(A)式I的化合物或其药学上可接受的立体异构体或互变异构体和(B)共结晶成形剂。根据一个实施方式，本发明的药物组合物的共结晶包含式I的化合物和戊二酸作为共结晶成形剂。 [0015] 根据另一个实施方式，本发明提供了一种通过向有此需要的对象给予治疗有效量的权利要求1的共结晶治疗疾病或病症的方法。使用本发明的共结晶治疗的疾病或病症的示例是选自癌症、炎症或乙型肝炎感染的那些。 [0016] 根据该方法的一个实施方式，与治疗有效量的选自下组的第二治疗剂组合给予共结晶：抗生素、止吐剂、抗炎药、抗病毒剂、抗癌剂、免疫调节剂、α-干扰素、β-干扰素、PEG化α-干扰素、PEG化β-干扰素、利巴韦林、烷基化剂、激素、细胞因子、聚合酶抑制剂、和toll受体-样调节剂。 [0017] 通过将共结晶成形剂的悬液或溶液与式I的化合物或其药学上可接受的立体异构体或互变异构体的悬液或溶液混合以得到共结晶溶液，之后使该共结晶溶液过饱和来开始形成共结晶来合成本发明的共结晶。 [0018] 用于溶解式I的化合物的共结晶成形剂的溶剂包括有机溶剂、水、或水和有机溶剂的混合物。适于溶解共结晶成形剂的经典有机溶剂的示例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙酸异丙酯、己烷、庚烷、甲苯、丙酮、乙腈、二噁烷、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、或其组合。附图说明 [0019] 图1-本发明的示例性戊二酸共结晶的体内药代动力学。该图显示了在口服给予10mg/Kg剂量的式I的化合物的戊二酸共结晶或甲苯磺酸盐之后猕猴中的平均血浆浓度。 [0020] 图2-合成式I的化合物和示例性的共结晶的示例性方案。 [0021] 图3A-生物活性物质(R06871765)对HBV复制的影响。通过分别使用实时PCR和CLIA测定测量分泌的HBV DNA(■)和HBsAg(●)的水平监测的HBV复制。由CellTiter-Glo(▲)测定的细胞活力。 [0022] 图3B-PEG化的干扰素-α-2a 对HBV复制的影响。通过分别使用CLIA和实时PCR测定测量分泌的HBsAg(白色柱)和HBV DNA(灰色柱)的水平监测的HBV复制。由CellTiter-Glo(黑色柱)测定的细胞活力。 [0023] 图4-DMSO或R06871765刺激的PBMC调节的介质对HBV复制的影响。DMSO调节的介质-图(A)、(C)和(E)。R06871765(100μM)刺激的PBMC调节的介质-图(B)、(D)和(F)。通过分别使用实时PCR和CLIA测定测量分泌的HBV DNA(■)和HBsAg(●)的水平监测的HBV复制。由CellTiter-Glo(▲)测定的细胞活力。 [0024] 图5-IFN-α2a(Roferon-A)，图5A；IL-6，图5B；TNF-α，图5C；和IP-10，图5D；对HBV复制的影响。通过分别使用实时PCR和CLIA测定测量分泌的HBV DNA(■)和HBsAg(●)的水平监测的HBV复制。由CellTiter-Glo(▲)测定的细胞活力。 [0025] 详述 [0026] 本发明提供了包含式I的化合物和作为共结晶成形剂的有机酸的共结晶。本发明的共结晶及其药物组合物可用于治疗或预防病毒感染、癌症和与不良免疫功能相关的疾病或病症。 [0027] 应注意到使用术语“包括”(及其语法变体)包括“具有”和“包含”的包含性涵义，而不是“仅由……组成”的排他性涵义。本文所用的术语“一个”、“一种”和“该”理解为包括复数和单数。 [0028] 术语“活性药物成分”或“API”是指一种物质，例如，引发生物活性的药物组合物中的化合物或生物试剂。 [0029] 在本发明的内容中，术语“共结晶”是指包含2种或更多种化合物的晶体分子复合物。药物共结晶含有药物物质和在相同晶体中存在的一种或多种其他分子。在室温下，共结晶的2种或更多种化合物可以是固体形式。各种化合物具有其自身的不同物理特性，如结构、熔点和熔解热。术语“共结晶”也指包含2种或更多种化合物的晶体物质，该化合物在室温下各自可能是液体形式但是在促进共结晶的条件下结合时形成结晶材料。本发明的共结晶还包括通过将在室温下为固体的化合物与在室温下为液体的化合物在适于促进共结晶的条件下合并获得的晶体材料。在本发明的一些方面中，通过在适于促进共结晶的条件下合并式I的化合物与共结晶成形剂或通过合并式I的化合物与共结晶成形剂的溶剂合物来获得本发明的共结晶。 [0030] 术语“共结晶成形剂”是指在共结晶的相同晶体分子复合物内与药物一起存在的其他化合物或客体化合物。可参与与药物的供体-受体相互作用的任何分子可用作共结晶成形剂。“共结晶成形剂”类别的示例性化合物包括但不限于有机酸、有机碱、醇、苯酚酯和环糊精。例如，共结晶成形剂可以是糖、烟酰胺4-羟基苯甲酸、苯甲酸、戊二酸、富马酸、马来酸、己二酸、α-酮戊二酸、邻氨基苯甲酸或羟苯甲酸甲酯。 [0031] 在本发明的内容中，术语“免疫调节剂”是指能够通过刺激或抑制来修饰正常或异常免疫系统的天然或合成产物。 [0032] 术语“预防”指本发明化合物或组合物预防被诊断患有本文所述疾病的患者或有患上该疾病风险的患者内的所述疾病的能力。该术语也包括在已经患有这类疾病或具有这类病症症状的患者中预防疾病的进一步发展。 [0034] 术语“治疗有效量”指本发明化合物在治疗或预防疾病中足以提供益处的量，所述量延迟或最小化与所预防的疾病相关的症状，或者治愈或使所述疾病或感染或其病因好转。具体地，治疗有效量指足以提供体内治疗益处的量。在联系本发明化合物的量使用时，所述术语优选涵盖非毒性量，所述非毒性量改善全体治疗，降低或避免疾病症状或病因，或者增强其它治疗剂疗效或增强与其它治疗剂的协同作用。 [0035] 术语“治疗”、“处理”和“疗法”指：减轻或根除疾病或与疾病相关的症状。在某些实施方式中，此类术语指：通过给予一种或多种预防或治疗剂至患有疾病的患者，使该疾病的扩散或恶化最小化。 [0036] 本文所述的一些化合物可具有不对称中心，并因此可以对映异构体和非对映异构体存在。本发明的化合物可以是单一对映异构体(光学异构体)、非对映异构体、或对映异构体的混合物，包括外消旋混合物的形式。本发明化合物的光学异构体可通过已知技术获得，例如不对称合成、手性色谱法，或通过利用光学活性拆分剂对立体异构体进行化学分离。 [0037] 除非另有指示，“立体异构体”指，化合物的一种立体异构体，其基本不含该化合物的另一种立体异构体。因此，具有手性中心的立体异构纯化合物基本不含该化合物的相反对映异构体。具有两个手性中心的立体异构纯的化合物基本不含该化合物的其他非对映异构体。典型的立体异构纯的化合物包含大于约80重量％的该化合物的一种立体异构体和小于约20重量％的该化合物的另一种立体异构体，例如，大于约90重量％的该化合物的一种立体异构体和小于约10重量％的该化合物的另一种立体异构体，或大于约95重量％的该化合物的一种立体异构体和小于约5重量％的该化合物的另一种立体异构体，或大于约97重量％的该化合物的一种立体异构体和小于约3重量％的该化合物的另一种立体异构体。 [0038] 如果在描述的结构和对该结构给定的名称之间存在差异，则以描述的结构为准。此外，若结构或结构的部分的立体化学未用例如粗或虚线指示，则该结构或结构的部分应被理解为涵盖其全部立体异构体。有机合成领域的技术人员应知晓用制备所述化合物的单一对映异构体的方法制备它们的情况。 [0039] 共结晶 [0040] 下面式I中显示的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯是以游离碱形式的无定形粉末存在的3’-脱氧腺苷类似物。 [0041] [0042] 然而，游离碱具有弱化学稳定性并且没有合适的制备工艺来一致地合成药物级物质，游离碱不适合作为药剂。为了解决这些缺陷，如美国专利号7，928，085所述合成游离碱的对甲苯磺酸(甲苯磺酸)盐。如本专利中公开的那样，甲苯磺酸盐的晶体形式相比游离碱具有某些优势。例如，甲苯磺酸盐具有比游离碱更大的稳定性和水溶性。因此，甲苯磺酸盐被认为是比游离碱更合适的配制具有低残留溶剂含量的药物组合物的试剂。 [0043] 虽然5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯的甲苯磺酸盐形式相比游离碱有某些有利性质，但甲苯磺酸盐的合成是挑战性的。例如，合成需要使用对甲苯磺酸(TsOH)，一种已知的致癌剂。商业规模的甲苯磺酸合成被以下观察结果进一步复杂化，其伴随着形成遗传毒性剂-4-甲基苯磺酸乙酯(甲苯磺酸乙酯)和4-甲基苯磺酸异丙酯(甲苯磺酸异丙酯)作为副产物。 [0044] 由于甲苯磺酸乙酯和甲苯磺酸异丙酯的生物学毒性，在甲苯磺酸盐的商业规模制备过程中必须采用耗时且昂贵的纯化方法。即，需要能够去除或降低遗传毒性副产物的浓度至药物制剂所要求的个位数部分/百万分率(ppm)的纯化方案来获得适合用作治疗剂的甲苯磺酸盐。除了合成挑战以外，含5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯的甲苯磺酸盐的药物组合物的制备是挑战性的。 [0045] 使用下述方案合成的本发明的共结晶解决了与用于治疗HBV和HCV感染的治疗剂的甲苯磺酸盐的合成和药物开发相关的几个缺陷和挑战。如下文进一步所述，通过使5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯(式I的化合物)与至少一种共结晶成形剂接触来合成本发明的共结晶。 [0046] 当与共结晶成形剂结合时，式I的化合物的溶剂合物和盐也可形成共结晶。为此，已经评价了作为共结晶成形剂的几种有机酸。示例性的共结晶成形剂包括但不限于草酸、L-天冬氨酸、马来酸、糖精、2-氨基苯甲酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、4-氨基苯甲酸、α-酮戊二酸、1-羟基-2-萘甲酸、丙二酸、龙胆酸、水杨酸、L-(+)-酒石酸、富马酸、乳糖酸、柠檬酸、D-葡萄糖醛酸、β-环糊精，羟丙基-β-环糊精、4-氨基水杨酸、烟酰胺、L(-)-苹果酸、马尿酸、乙醇酸、L(-)焦谷氨酸、γ-环糊精、苯甲酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、4-羟基苯甲酸、(+)樟脑酸、山梨酸、烟酸、乳清酸、尿素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、L(-)-乳酰胺、L-抗坏血酸、肉桂酸、D，L-扁桃酸、香草酸和4-羟基苯甲酸甲酯。 [0047] 除了上述的有机酸以外，本发明还提供了共结晶，其中共结晶成形剂是第二药物或第二活性药物成分(API)。“第二药物”或“第二API”类别的示例是包含抗生素、止吐剂、抗抑郁药、和抗真菌剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗癌剂、免疫调节剂、α-干扰素、β-干扰素、利巴韦林、烷化剂、激素、细胞因子、或toll受体样调节剂的治疗剂。 [0048] 表1显示了按照本发明包含式I的化合物和有机酸共结晶成形剂的示例性共结晶的物理特性。如表1和下文中进一步显示，示例性的共结晶中的许多具有优良的溶解性，使得它们基于生物制药法规系统(BCS)分类系统命名为I类药物。 [0049] 表1 [0050] [0051] 使用X射线粉末衍射(XRPD)光谱、核磁共振(NMR)光谱、光学显微镜和红外(IR)光谱进一步表征本发明的共结晶。因此，在石蜡油中的戊二酸共结晶的悬浮液的偏振光显微镜显示结晶固体。固态NMR研究证实了式I戊二酸共结晶，而溶液相NMR研究证实了根据本发明技术的共结晶的2∶1的式I化合物比戊二酸(共结晶成形剂)的化学计量。对示例性戊二酸共结晶(0.27mg/mL)的乙醇溶液进行紫外分光光度学研究，显示在222nm、248nm和316nm处的三个吸收峰。此外，进行X射线粉末衍射研究以进一步表征本发明的共结晶。来自根据本发明的几个共结晶的X射线粉末衍射研究的2θ值列于表2中。 [0052] 表2 [0053] [0054] [0055] 令人惊奇的是，本发明的共结晶与式I化合物的甲苯磺酸盐相比具有几个优点。例如，使用下述合成方案进行的共结晶的合成耗时较少。本发明的合成方法很容易实现规模扩大化，允许共结晶的商业合成和分离。本发明共晶体的纯化是经济有效且快速的。简单的过滤和洗涤足以获得适合用作药剂的共结晶。此外，根据本发明的共结晶的合成消除了伴随着甲苯磺酸盐的制备的遗传毒性副产物的产生。 [0056] 除了上述优点之外，本发明的共结晶具有增强的化学稳定性，并且对无定形游离碱或5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯的甲苯磺酸盐的水解较不敏感。因此，本发明的共结晶可以在室温下长时间储存，但相应的对甲苯磺酸盐是吸湿性的，并且需要在低温下储存以防止降解。 [0057] 另一个优点是本发明的共结晶具有非常少量的残留溶剂。这允许本发明制备的共结晶的药物组合物含非常低量的残留溶剂(如果有的话)。此外，溶解性研究表明本发明的共结晶高度可溶于水，这对于制备药物组合物而言是希望的。由于它们的高水溶性，根据生物制药法规系统(BCS)指南，该共结晶被归类为I类药物。 [0058] 盐分因素(S)是指以盐或酯形式影响药代动力学和生物分布的给予的药物剂量的分数。例如，盐分因素@@(S)影响药物血浆浓度、达到血浆中API稳态浓度所需的剂量，API的生物利用度和药物的生物分布的其他因素。令人惊奇的是，式I化合物的共结晶具有相对于式I化合物的相应甲苯磺酸盐较低的“S”(药物盐分因素)值。例如，示例性的戊二酸共结晶的盐分因素(S)是1.2。式I化合物(5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯)的甲苯磺酸盐的盐分因素(S)更大，约1.53。因此，与1克相应的甲苯磺酸盐相比，每克戊二酸共结晶含有较大量的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-33(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯游离碱。 [0059] 换句话说，包含戊二酸共结晶的药物组合物每单位剂量中将含有更大量的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯游离碱。因此，每天需要向患者给予较少剂量的共结晶药物组合物，这可有利于增加患者在治疗期间的依从性。 [0060] 仅为了说明的目的，5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯游离碱的日剂量为约1600mg/天。如果制造口服制剂(片剂)，使得每片的最大重量不能超过1000mg，并且可存在于每个片剂中的5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯游离碱的最大量不能超过片剂的70重量％，那么需要给予患者以达到1600mg游离碱的目标日剂量的片剂的总数取决于(A)制备片剂中使用的式I化合物的具体形式和(B)与式I化合物的具体形式相关的盐分因素(S)。 [0061] 如表3所示，式I化合物的具体形式的盐分因素(S)能影响实现1600mg游离碱的目标日剂量所需的片剂数。当口服制剂包含式I化合物的游离碱或戊二酸酯共结晶时，达到目标日剂量所需的片剂更少。如果包含式I化合物的游离碱的片剂的总重量为770mg(游离碱的盐分因素(S)为1.0)，则各片剂将含有539mg游离碱(0.7×770mg)。由于游离碱难以以商业规模合成和纯化，如上所述，包含游离碱的片剂的稳定性差，保质期短，游离碱的片剂配制不适于商业化。 [0062] 相比之下，需要四片甲苯磺酸盐来达到1600mg的式I化合物的游离碱的目标日剂量。例如，如果每单位剂量的重量(mg)，即含有式I化合物的甲苯磺酸盐的片剂的重量为875mg，并且盐分因素(S)为1.53，则每个875mg片剂将含有612.5mg(片剂的总重量的70％)的甲苯磺酸盐，其对应于400mg的相应游离碱/片剂(612.5/1.53)。因此，需要将四片甲苯磺酸盐片剂给予患者以达到1600mg游离碱的目标日剂量。因此，如果使用甲苯磺酸盐作为药物，患者不仅需要口服摄取更多的片剂，而且这样的患者将需要吞下可能对需要治疗的儿童和老年患者具有挑战性的大得多的片剂。 [0063] 与甲苯磺酸盐相比，本发明共晶体的盐分因素的较低值减少了每天需要的含有共结晶的片剂的数量。例如，如果含戊二酸共结晶的片剂重量为930mg，则这种片剂将含有612.5mg(930mg的70％)(重量)的戊二酸共结晶。因此，每个片剂中游离碱的量为533.7mg(612.5/1.22)。从上述讨论可以看出，含有戊二酸共结晶的片剂与含有相应的甲苯磺酸盐的片剂相比，含有更大量的游离碱(即以/mg/单位剂量计的游离碱的重量)。因此，如表3所示，达到1600mg的目标日剂量所需的共结晶片剂较少。 [0064] 表3 [0065] [0066] 药物组合物和剂量 [0067] 本发明还涉及本发明的共结晶的药物制剂以及这种药物制剂治疗疾病症如癌症、病毒感染或与不良的免疫功能相关的疾病的用途。因此，一方面，本发明涉及包含式I化合物或其药学上可接受的立体异构体、互变异构体或溶剂合物和至少一种共结晶成形剂以及药学上可接受的赋形剂的共结晶的药物制剂。 [0068] 本发明的组合物还可以根据药物配制的普遍认可的实践而含有一种或多种其他治疗剂、药学上可接受的稀释剂、佐剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、缓冲剂或调味剂。合适的赋形剂是药学领域技术人员熟知的，并且本文提供合适赋形剂的非限制性示例。特定赋形剂是否适于掺入药物组合物或剂型中取决于本领域众所周知的各种因素，包括但不限于将剂型给予患者的方式。例如，经口剂型(例如片剂)可包含不适合用在肠胃外剂型中的赋形剂。特定赋形剂的适用性也可取决于剂型中的具体活性成分。 [0069] 适用于包含本发明的共结晶和药学上可接受的运载体的单一单位剂量的药物组合物也包括在本公开的范围内。根据本发明的药物制剂以及单一单位剂型可适用于口服、粘膜(包括舌下、口腔、直肠、鼻或阴道)、胃肠外(包括皮下、肌内、推注、动脉内或静脉内)、透皮或局部给药。本发明共结晶的无菌制剂也是可以想到的。 [0070] 药物制剂以及单一单位剂型可以含有不同量的共结晶，其药学上可接受的盐或互变异构体。例如，药物制剂以及单一单位剂型中共结晶的量可以在约0.1mg至约1000mg的范围内。对于一些制剂和单一剂型，共结晶的量为约50mg至约750mg、约50mg至约500mg、约100mg至约250mg、约10mg至约100mg、或约1mg至约10mg。 [0071] 包含本发明的共结晶的无水药物组合物也包括在本公开的范围内。由于在制造、储存、处理、包装、运输和使用药物制剂期间常规遇到湿气和/或水气，所以使用制剂领域技术人员已知的无水或低含水成分和低水分或低湿度条件制备本公开的无水药物组合物的方法和剂型在本公开的范围内。 [0072] 为了保持共结晶的药物组合物的无水性质，本发明的药物制剂应在保持其无水性质的条件下包装并储存。因此，优选使用已知防止暴露于水的材料包装无水组合物。合适的包装的示例包括但不限于，气密性密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装和条状包装。 [0073] 根据本发明的共结晶是用于治疗与不良的细胞分裂，不良的免疫功能或治疗病毒感染相关的疾病或病症的治疗剂。可以通过向需要治疗的患者或对象给予一种或多种治疗有效剂量的本发明共结晶来实现治疗。 [0074] 口服剂型 [0075] 适于口服使用的本发明的组合物可按照药物组合物生产领域的任何已知方法制备。一般参见Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第18版，宾西马尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing)，(1990)。这类口服剂型含有与至少一种赋形剂密切混合的预定量的活性成分。液体制剂可以进一步含有甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供本发明的共结晶的药学上极佳且可口的制剂。 [0076] 本发明的合适的口服组合物包括但不限于片剂、含片、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊剂、糖浆剂或酏剂。因为片剂和胶囊易于给予、储存和包装，所以它们代表了最有利的经口单位剂型，在这种情况下使用固体赋形剂。如果需要，片剂可以通过标准的水性或非水性技术进行包衣。一般而言，药物组合物和剂型通过如下方式制备：将活性成分(即共结晶)和液体运载体、精细研磨的固体运载体或两者均匀且密切混合，然后，必要时，使产物成型为所需形式。 [0077] 对于片剂组合物，与无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性成分用于制备片剂。这些赋形剂的示例包括但不限于，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠； 成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉，明胶，树胶如阿拉伯胶，和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。用于本发明的药物组合物的粘合剂或填料通常以药物组合物或剂型的约50至约99重量％存在。 [0078] 片剂可以通过压缩或模塑制备，并且可以是未包衣的或包衣的，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在期望的时间段内提供持续的治疗作用。示例性的延迟材料包括但不限于单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。 [0080] 除了片剂和胶囊之外，本发明的共结晶可以配制成适合于口服给药的糖浆、悬浮液、可分散粉末和颗粒剂。当配制成口服悬浮液时，药物组合物可以含有分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸，长链脂族醇或部分脂肪酸酯的缩合产物。这些产品的例子是聚氧乙烯硬脂酸酯、十七碳乙烯氧基鲸蜡醇、己糖醇如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、或聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。口服混悬剂也可含有一种或多种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或者对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。糖浆剂和酏剂中可配有甜味剂，如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。这类制剂也可含有缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。 [0081] 缓释剂型 [0082] 也可通过本领域普通技术人员熟知的受控的缓释方式或通过递送装置给予本发明的共结晶。示例包括但不限于美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、和4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、和5,733,566中所述的那些，其各自通过引用纳入本文。这样的剂型可用于使用例如羟丙基甲基纤维素，其它聚合物基质，凝胶，渗透膜，渗透系统，多层涂层，微粒，脂质体，微球或其组合中的一种或多种活性成分以不同比例提供所需释放曲线的缓释或控释。合适的控释制剂是制剂领域的普通技术人员已知的。因此，本公开包括适于口服给予的单一单位剂型，诸如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊和适于控释的囊片。 [0083] 所有控释药物产品的共同目标是改善药物治疗，使其优于所述药物的非控制对应物所获得的治疗。理想情况下，在药物治疗中使用控释制剂的特征在于以预定的时间间隔施用已知量的活性剂，例如2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、或2-12个月、3-12个月、4-12个月、5-12个月、6-12个月、7-12个月、8-12个月、9-12个月、10-12个月、11-12个月、或1年。控制释放制剂的优点包括药物延长的活性，降低的给药频率和提高的患者依从性。此外，可使用控释制剂来影响药物作用的启动时间或其它特性(例如药物在血液中的水平)，因而能影响副作用(例如，反作用)的出现。 [0084] 大多数控释制剂被设计成在开始时释放迅速产生所需疗效的药物(活性成分)量，然后逐渐并持续地释放相同或其它药物量以在更长的时间内维持相同治疗或预防效果的水平。为了保持体内恒定的药物水平，所述药物必须以替代该药物经代谢并排出身体的量的速度从所述剂型释放。可以通过各种条件刺激活性成分的控释，包括但不限于pH、温度、酶、水或其它生理条件或化合物。 [0085] 肠胃外剂型 [0086] 肠胃外剂型可通过多种途径给予患者，所述途径包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌肉内和动脉内注射。因为肠胃外剂型的给予通常绕过患者针对污染物的天然防御，所以肠胃外剂型优选是无菌的，或者能够在给予患者前消毒。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮在药学上可接受的注射用载剂中的干燥和/或冻干产品(可重建粉末)、准备注射的悬浮液，和乳液。 [0087] 可用于提供本公开的肠胃外剂型的合适载剂是本领域技术人员公知的。示例包括但不限于：用于注射USP的水；水性载剂如但不限于氯化钠注射液、林格注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液，以及乳酸林格注射液；水混溶性载剂如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载剂如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯酸苄酯。肠胃外制剂可以包括增加根据本发明的一种或多种活性药物成分或本发明的共结晶的溶解度的化合物。 [0088] 药盒 [0089] 本公开提供了包含含有本发明的共结晶的一个或多个容器的药物包装或药盒，并且可任选地包括含有药学上可接受的运载体的一个或多个容器。在其它实施方案中，本公开提供包含含有本发明的共结晶的一个或多个容器的药物包装或药盒，包含其他治疗剂的一个或多个容器和含有药学上可接受的运载体的一个或多个容器。 [0090] 根据本发明的药盒或包装可以包含含有将本发明的共结晶配制成适于给药的药物组合物所需的一种或多种药物成分的一个或多个容器或药物包装，，以及装置，如用于给予本发明的共结晶的药物组合物的一种或多种注射器。 [0091] 药盒或包装可以包括缓冲液，调节药物运载体的张力的化合物和改变亲水亲油平衡(HLB)的化合物，以改善递送和生物分布。药盒或包装中存在的容器可任选附有管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的告知书，该告知书反映出生产、使用或销售管理机构批准其用于人体。 [0092] 联合治疗 [0093] 在一个方面，本发明的共结晶的治疗有效剂量可以与治疗有效剂量的组合药物(其他治疗剂)一起给予需要治疗的患者或对象。本领域技术人员将认识到，可以分开地，例如在给予组合药物之前或之后的几秒钟、几分钟或几小时内，给予一定剂量的共结晶，或者可将两个剂量一起给予。其他治疗剂包括但不限于抗生素、止吐剂、抗抑郁药、和抗真菌剂、抗炎剂、抗病毒剂、抗癌剂、免疫调节剂、α-干扰素、β-干扰素、PEG化α-干扰素、PEG化β-干扰素、利巴韦林、烷化剂、激素、细胞因子、或toll受体样调节剂。 [0094] 除了上述治疗剂之外，本发明还包括联合治疗方案，其包括与治疗有效量的聚合酶抑制剂，例如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定组合的共结晶。包含三种药物组合的治疗方案也包括在本发明的范围内。例如，这种方案可以包括给予治疗有效剂量的共结晶、聚合酶抑制剂和干扰素或PEG化干扰素。 [0095] 存在于组合物中的每种化合物或其药学上可接受的盐或互变异构体的百分比也可以变化。例如，在一些实施方式中，所述组合物可包括的共结晶或其药学上可接受的盐或互变异构体的量为约1％到约98％的范围(重量/重量)。组合物可以含有本发明的共结晶或其药学上可接受的盐或互变异构体，其范围为约5％至约80％，约10％至约70％，约15％至约60％，约20％至约50％和约30％至约40％(重量/重量)。 [0096] 当使用抗生素作为第二种治疗剂时，示例性化合物包括但不限于大环内酯类(例如，妥布霉素 )、头孢菌素(例如，头孢氨苄 头孢拉定 头孢呋辛 头孢克肟 头孢克洛 头孢克肟 或 头孢羟氨苄 )、克拉霉素(例如，克拉霉素 )、红霉素(例如，红霉素 )、青霉素(例如，青霉素V(V-Cillin 或Pen Vee ))或喹诺酮(例如，氧氟 沙星 环丙沙星 或诺氟沙星 )、氨基糖苷类抗生素(例 如，安普霉素、阿贝卡星、班贝霉素、丁酰苷菌毒素、地贝卡星、新霉素、新霉素、十一烯酸、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、西苏霉素和壮观霉素)、苯丙醇抗生素(如叠氮霉酚、氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素)、安莎霉素抗生素(例如，利福酰胺和利福平)、碳头孢烯类(例如，劳拉卡贝)、碳青霉烯类(例如，比阿培南和亚胺培南)、头孢菌素类(例如，头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲嗪、头孢西酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺、和头孢匹罗)、头孢霉素类(例如，头孢拉宗、头孢美唑、和头孢米诺)、单菌霉素类(例如，氨曲南、卡芦莫南、和替吉莫南)、氧头孢烯类(例如，氟氧头孢和拉氧头孢)、青霉素(例如，阿姆地诺西林、阿姆地诺西林双酯、阿莫西林、巴卡西林、苄青霉素酸、苄青霉素钠、表柔比星、芬贝西林、氟氯青霉素、盘纳目西林、吡啶甲酸氢碘酸盐、青霉素邻苯三胺、青霉素0、青霉素V、青霉素V苄星青霉素、青霉素V哈胺、青哌环素、和芬丝西林钾)、林可酰胺类(例如，克林霉素和林可霉素)、双霉素、杆菌肽、卷曲霉素、多粘菌素、持久杀菌素、结核放射菌素、四环素类(例如，阿哌环素、金霉素、羟甲金霉素和去甲金霉素)、2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃类(例如，呋喃唑酮和呋唑氯铵)、喹诺酮类及其类似物(例如，西诺沙星、克林沙星、氟甲喹、和古来沙星)、磺胺类(例如，乙酰磺胺甲氧基吡嗪、苄磺胺、诺丙磺胺、酞磺醋胺、磺胺柯衣酸、和磺胺西汀)、砜类(例如，地百里砜、葡糖砜钠、和苯丙砜)、环丝氨酸、莫匹罗星、和马铃薯球蛋白。 [0097] 本发明的共结晶还可以与其它抗病毒剂组合给予或配制。有用的抗病毒剂包括但不限于蛋白酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和核苷类似物。抗病毒剂包括但不限于齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、可比韦、阿巴卡韦、阿德福韦、西多福韦、利托那韦、利巴韦林及其类似物、左旋利巴韦林、韦拉米啶、艾沙托立宾、吡非尼酮或其类似物、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、曲氟尿苷以及膦甲酸、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、安格那韦、洛匹那韦、利托那韦、α-干扰素、β干扰素、克立夫定、恩替卡韦、普来可那利。 [0098] 另外的治疗剂可包括肿瘤坏死因子拮抗剂，如依那西普、英夫利昔单抗和阿达木单抗)，胸腺素-α、(Zadaxin.TM)、干扰素受体激动剂、α-葡糖苷酶抑制剂、TNF-α拮抗剂、NS3解旋酶抑制剂、NS5B聚合酶抑制剂(如GS-9190、MK-3281、VCH-759(VX-759)、VCH-916、ABT-333、BMS-791325、PF-00868554、IDX-184、R1626、PSI-7851、VCH-222(VX-222)、ABT-072和BI207127)和NS5A蛋白的抑制剂(如BMS-790052、A-831和AZD2836)。 [0099] 本发明的共结晶可以联合以下试剂给予或配制：抑制病毒NS3蛋白酶的试剂，例如VX-950和SCH 503034，toll样受体(TLR)调节剂如IMO-2125和PF-04878691；细胞色素P450单加氧酶抑制剂；核酶如HeptazymeTM和硫代磷酸酯寡核苷酸，其与HBV蛋白质序列互补并且抑制病毒核心蛋白的表达。 [0100] 或者，本发明的共结晶可以与免疫调节剂组合给予或配制。免疫调节剂包括但不限于甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环孢霉素A，霉酚酸酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、丙二腈氨化物(例如来氟米特)、T细胞受体调节剂、和细胞因子受体调节剂、肽模拟物、和抗体(例如人、人源化、嵌合、单克隆、多克隆、Fvs、ScFv、Fab或F(ab)2片段或表位结合片段)、核酸分子(例如反义核酸分子和三股螺旋)、小分子、有机化合物和无机化合物。T细胞受体调节剂的例子包括但不限于：抗-T细胞受体抗体(例如，抗-CD4抗体(如cM-T412(勃林格公司(Boeringer))、IDEC-CE9.1(IDEC和SKB)、mAB 4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(扬森齐拉格公司(Janssen-Cilag)))、抗-CD3抗体(如Nuvion(产物设计实验室(Product Design Labs))、OKT3(强生公司)、或利妥昔(IDEC))、抗-CD5抗体(如抗-CD5蓖麻毒蛋白连接的免疫偶联物)、抗-CD7抗体(如CHH-380(诺华公司(Novartis)))、抗-CD8抗体、抗CD40配体单克隆抗体(如IDEC-131(IDEC))、抗-CD52抗体(如CAMPATH 1H(Ilex))、抗-CD2抗体、抗-CD11a抗体(如Xanelim(基因泰克公司(Genentech))、抗-B7抗体(如IDEC-114(IDEC))、CTLA4-免疫球蛋白、和toll受体样(TLR)调节剂。细胞因子受体调节剂的例子包括但不限于：可溶性细胞因子受体(如TNFα受体胞外结构域或其片段、IL-1β受体胞外结构域或其片段和IL-6受体胞外结构域或其片段)、细胞因子或其片段(如白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和GM-CSF)、抗-细胞因子受体抗体(如抗-IFN受体抗体、抗-IL-2受体抗体(如Zenapax(蛋白质设计实验室(Protein Design Labs))、抗-IL-4受体抗体、抗-IL-6受体抗体、抗-IL-10受体抗体和抗-IL-12受体抗体)、抗-细胞因子抗体(如抗-IFN受体抗体、抗-TNF-α抗体、抗-IL-1β抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-8抗体(如ABX-IL-8(阿布吉尼公司(Abgenix))，和抗-IL-12抗体)。 [0101] 当与另外的治疗剂组合给予时，共结晶和其它治疗剂可以叠加地或更优选协同地起作用。在一个实施方式中，包含本公开的共晶的组合物与另一种治疗剂同时给予，所述另一种治疗剂可以是与包含本公开的化合物的组合物相同组成或不同组成的一部分。在另一个实施方式中，可以在给予另一种治疗剂之前或之后给予共结晶。在另一个实施方式中，对之前未经受过或目前未经受其它治疗剂，尤其是抗病毒剂治疗的患者给予本发明的共结晶。实施例 [0102] I.相容性研究 [0103] 通过典型的相容性测定法(COMPASS)测定本发明共结晶与药学上可接受的赋形剂的相容性。根据该方法，赋形剂相容性的研究通过如下方式进行：通过将本发明的戊二酸共结晶与单一药物赋形剂物理混合，从而形成二元混合物，或通过将本发明的戊二酸共结晶与含有两种或更多种赋形剂的混合物物理混合(三元混合物)。每个二元混合物含有5重量％的式I化合物，而三元混合物中式I化合物的重量百分比为50％。将测试混合物在50℃下储存4周或在40℃的温度和75％的相对湿度下储存4周。 [0104] 本发明的共结晶与通常用于制备药物组合物的填料和/或赋形剂相容。表4说明了使用本发明式I化合物的戊二酸共结晶的三元混合物的相容性研究的结果。表5说明了使用式I化合物的甲苯磺酸盐的三元混合物的类似研究的结果。 [0105] 表4 [0106] [0107] 表5 [0108] [0109] [0110] 包含本发明的戊二酸共结晶或式I的化合物的甲苯磺酸盐的三元混合物含有下表6中所示比例的以下赋形剂。 [0111] 表6 [0112] [0113] 相容性研究的结果，表4和表5清楚地显示了本发明的戊二酸共结晶与药学上可接受的制剂制造过程中通常使用的药物赋形剂和填料更相容。然而，发现相应的甲苯磺酸盐与常用的赋形剂和/或填料不稳定。 [0114] 例如，将包含戊二酸共结晶的三元混合物和药物填料或赋形剂在50℃下储存4周或在40℃/75％相对湿度下储存4周显示式I化合物几乎不降解。在50℃时降解百分比的一般范围为约0.02％至0.098％。湿度的存在不会不利地影响本发明共结晶的三元混合物的相容性和/或稳定性，在40℃和75％相对湿度的存在下，式I化合物的降解百分比没有增加。 [0115] 相比之下，在包含式I化合物的甲苯磺酸盐和两种或更多种药物填料或赋形剂的三元混合物中，式I化合物的降解百分比较大。很明显，水分的存在损害了含有甲苯磺酸盐的三元混合物的相容性。如表5所示，湿度的存在增加了三元混合物的降解。对于甲苯磺酸盐，三元混合物2在湿度存在的情况下显示出约10％的降解，相比之下，本发明的戊二酸共结晶的类似的三元混合物的降解为0.02％。 [0116] 这些数据清楚地表明，本发明的戊二酸共结晶比甲磺酸盐与药物制剂制造中通常使用的赋形剂和填料更相容。 [0117] II.稳定性研究 [0118] 通过在不同温度和不同相对湿度的条件下将共结晶的测试样品储存一至三个月的时间来进行固态稳定性研究。通过超高效液相色谱(UPLC)分析测试共结晶来判断稳定性。共结晶的试样中API的降解百分比计算如下： [0119] 降解％＝100*(参照样品的API的AUC％-测试样品的API的AUC％)/参照样品的API的AUC％ [0120] 根据本发明的共结晶在研究中使用的温度范围内是相当稳定的。在湿度(75％相对湿度(R.H.))存在下的储存没有增加本发明共晶体的降解百分比。不归因于特定理论，结晶度可能有助于本发明共结晶的稳定性。表7显示了在40℃下和75％相对湿度的存在下在一定范围的温度内，根据本发明的式I戊二酸共结晶的稳定性的数据。 [0121] 表7 [0122] [0123] *用作1个月稳定性的参照；**用作2个月稳定性的参照。 [0124] 如表7所示，式I化合物的戊二酸酯共结晶在宽储存温度范围和湿度存在下显示出优异的稳定性。通过将式I化合物的游离碱的无定形形式与式I化合物的结晶形式进行比较，进一步支持结晶度有助于提高稳定性的假设，如表8所示。 [0125] 表8 [0126] [0127] 上述结果表明，结晶度确实对稳定性具有重要影响，因为结晶形式比相应的无定形形式更稳定，特别是在水分存在下。因此，结晶度也可能有助于提高本发明共结晶的稳定性。 [0128] 本发明共结晶的改进的稳定性具有某些优点。更大的稳定性可以允许更好地处理和易于使用共结晶，特别是在商业规模制备共结晶和商业规模制备共结晶药物制剂期间。增强的稳定性还可有助于增加固体药物组合物如含有共结晶的片剂的保质期。 [0129] 由于结晶形式不在溶液中保留，即当共结晶溶于溶剂时，只有式I化合物和溶剂之间的相互作用才能影响溶液的稳定性。因此，在相同的实验条件下，预计共结晶、甲苯磺酸盐或游离碱的结晶形式的溶液显示相当的溶液稳定性。 [0130] III.用于对共结晶的药代动力学和毒性研究的制剂的开发 [0131] 研究表明，共结晶可溶于水和缓冲溶剂。这些研究表明溶剂的pH影响共结晶的溶解度。在低pH下溶解度最高，例如在pH为1.0或pH为2.0的缓冲液中，并且溶解度随缓冲液pH增加而降低。戊二酸共结晶的pH 1.0缓冲溶液的UPLC分析表明，每毫升缓冲溶液中存在超过60mg的游离碱形式的式I化合物。然而，基于UPLC分析，每毫升pH 7.0缓冲溶液中存在约22mg的游离碱形式的式I化合物。有趣的是，pH 4.0缓冲液中的溶解度最低，每毫升缓冲液中存在大约8毫克的游离碱形式，最有可能是由于形成式I化合物的两性离子形式。 [0132] 在室温下孵育24小时后对缓冲的共结晶溶液的分析显示没有降解。与甲苯磺酸盐不同，本发明共结晶的溶液中不会形成遗传毒性副产物。多形体筛选进一步显示了表征为固体形式A的示例性戊二酸共结晶的单一多晶型物。 [0133] 药代动力学 [0134] 进行研究以比较戊二酸共结晶的药代动力学(PK)与式I化合物的甲苯磺酸盐的PK。使用不含防腐剂的Blanose 7LF PM的3％溶液配制戊二酸共结晶和甲苯磺酸盐。食蟹猴药代动力学研究结果表明，口服各化合物后，戊二酸共结晶的血浆浓度大于相应的甲苯磺酸盐。 [0135] 在本研究中，每种化合物以10mg/kg的剂量口服给予食蟹猴。给药后，在0分钟、60分钟、120分钟和180分钟从每个测试对象中获得血液。在将血浆从全血中分离后，通过加入70％乙醇使各血浆样品的等分试样变性。通过离心使变性蛋白质沉淀，收集上清液并用干燥氮气流干燥。将由此获得的沉淀在含有0.1％甲酸的水中重建，并通过使用HSS-T3(高强度二氧化硅)柱或YMC TriartC-18柱的UPLC分析重建的混合物。使用含有0.1％HCOOH(流动相A)的水和含有0.1％HCOOH(流动相-B)的乙腈的混合物进行梯度洗脱，用于药代动力学(PK)样品的分析。 [0136] 如图1所示，口服给予戊二酸共结晶提供了循环血浆中较高浓度的共结晶。事实上，口服给予戊二酸共结晶后检测到的式I化合物的脱乙酰化形式的血浆浓度比经口服给予甲苯磺酸盐后检测到的式I的脱乙酰化形式的血浆浓度高约两倍。 [0137] 口服给予共结晶后，式I化合物的脱乙酰化形式的较高浓度也导致较高水平的活性药物物质，即式I化合物的脱乙酰化氧化形式。参见方案1。式I化合物是双前药，其经酶促转化为生物活性药物的5-氨基-3-((2R，3R，5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3a，7a-二氢噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(3H，6H)-二酮，如以下方案1中所示。 [0138] 方案1 [0139] [0140] 相反，从以10mg/kg的口服剂量给予相应的甲苯磺酸盐的猴获得的血浆中观察到较低水平的脱乙酰化形式的式I化合物和生物活性物质。几个因素可导致观察到的血浆中前药和活性物质浓度差异。不受特定理论的约束，一个假说是共结晶的更大的稳定性，相比相应的甲苯磺酸盐，共结晶在生物介质中的更大的溶解度以及肝和肾对共结晶的较低的清除速率可能促成了在口服给予戊二酸共结晶制剂后观察到的脱乙酰化和活性物质的较高血浆水平。 [0141] 基于PK结果，本发明的共结晶被认为是用于开发靶向癌症、病毒感染(包括HBV感染)的治疗的更好的候选治疗。 [0142] B.口服GLP毒理学研究 [0143] 作为本发明的共结晶的药物运载体，测试了三种载剂，不含防腐剂的Blanose 7LF PM(羧甲基纤维素钠)，Pluronic F60和聚乙烯醇。由于共结晶表现出良好的水溶性，因此不将表面活性剂加入到含共结晶的药物制剂中。 [0144] 使用含有不同量(浓度)的本发明共结晶的制剂进行毒理学研究。简言之，将已知量的戊二酸共结晶溶解在各运载体中，以提供含有100mg/mL，10mg/mL和1mg/mL游离碱(式I化合物)的制剂。将各测试制剂分成三份相等的部分并在室温2-8℃和-20℃下储存。储存七天后，通过超高效液相色谱(UPLC)分析各制剂的含量和纯度，并通过光学显微镜分析颗粒尺寸。还测量了每种制剂的pH。 [0145] 制剂的pH不受运载体的影响，并且在七天试验期间保持不变。根据使用的运载体，在所有储存温度下，测试制剂的测量pH值范围为4.0至5.6。虽然在所有测试制剂中观察到一定量的降解，但降解百分比在药学上可接受的范围内。然而，与使用其他两种运载体制备的制剂相比，含有Blanose 7LF PM的制剂显示出最大的降解百分比。 [0146] 如表9所示，在许多试验制剂中观察到双前药(式I化合物戊二酸共结晶)向式I化合物的单一前药(未乙酰化)形式的脱乙酰化。 [0147] 表9 [0148] [0149] [0150] 脱乙酰化在Blanose 7LF PM制剂中最显著，最少存在于Pluronic F60制剂中。这些结果表明运载体的性质可以影响活性药物的降解速率和程度、观察到的沉淀程度以及储存后固体饼状物质的形成。 [0151] 在PVA和Pluronic F60制剂中，沉淀和固体饼状产物的形成最显著。与PVA配方中形成的沉淀物不同，Pluronic F60配方中形成的沉淀物可以通过摇动容易地分散。Blanose制剂中的沉积物形成相对较慢。然而，一旦在Blanose制剂中形成固体饼状物，则该固体不能通过搅拌或摇动而容易地悬浮。 [0152] 在室温下储存1个月后，选择10％Pluronic F60制剂作为体外和/或体内功效研究的运载体，因为其即使在长时间储存后也能易于处理且具有提高的稳定性。 [0153] IV.制备方法 [0154] 可以通过将共晶成形剂的溶液与式I化合物的溶液组合而合成包含式I化合物和至少一种共结晶成形剂的共结晶。具体地说，将两种溶液以促进共结晶的共结晶成形剂与式I化合物的摩尔比组合。 [0155] 根据本发明方法的一个实施方式，共结晶成形剂和式I化合物以1∶2的摩尔比组合。由此获得的共结晶溶液过饱和以引发共结晶的形成。可以利用冷却、溶剂蒸发或添加反溶剂来使共结晶溶液过饱和并引发共结晶形成。包含式I化合物和至少一种共结晶成形剂的共结晶可以通过过滤或化学领域已知的其它合适的方法从共结晶溶液中分离。 [0156] 由于共结晶的形成需要式I化合物和共结晶成形剂之间的接触，因此在一个实施方式中，式I化合物和共晶体成形剂可以一起研磨，然后熔化所得固体混合物并冷却以形成共结晶。或者，结晶成形剂可以在与式I接触之前熔化，并使所得混合物共结晶。可通过在适于促进共结晶的条件下合并式I的化合物与共结晶成形剂或通过合并式I的化合物与共结晶成形剂的溶剂合物来获得本发明的共结晶。 [0157] 测定固体混合物存在共结晶可以通过本领域已知的常规方法进行。例如，使用粉末X射线衍射技术来测定结晶混合物中共晶体的存在是方便和常规的。以类似方式使用的其他技术包括差示扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)和拉曼光谱。单晶X射线衍射和固态NMR方法在鉴定共结晶结构中特别有用。 [0158] 图2显示了包含式I化合物和戊二酸作为示例性共结晶成形剂的共结晶的合成。为了比较的目的，图2还显示了制备5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯的对甲苯磺酸盐的方法。如图所示，合成方法在商业生产共结晶时操作简单，稳健，高效，且可扩大规模。此外，该方法是成本有效的，并且允许以良好的产率制造共结晶。 [0159] 简言之，脱氧腺苷(2)在酸性条件下经脱嘌呤。在一个实施方式中，通过使化合物2与乙酸酐、乙酸钾和冰醋酸接触以形成(3R，5S)-5-(甲基乙酰氧基四氢呋喃)-2，3-二基二乙酸酯(3)来实现脱嘌呤。 [0160] [0161] 然后在三氟甲烷磺酸四甲基甲硅烷基酯(TMSOTf)存在下将化合物3偶联至5-氨基-3H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(4)[根据Wolfe等，J.Org.Chem.1997，62，1754-1759]的方法制备以形成化合物5。虽然TMSOTf作为用于将化合物3与化合物4偶联的酸催化剂的示例，其它酸催化剂如AlCl3、SnCl4和TiCl4也可以与N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(“BSA”)或三甲基甲硅烷基氯化物等的硅化试剂一起使用。通常，化学计量的化合物3和4用于偶联反应。然而，稍过量的5-氨基-3H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(4)可以用于合成化合物5。根据一个方面，5-氨基-3H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(4)与化合物3的摩尔比的范围是约1.2∶1至约10∶1，约1.2∶1至约9∶1，约1.2∶1至约8∶1，约1.2：1至约7∶1，约1.2∶1至约6∶1，约1.2∶1至约5∶1，约1.2∶1至约4∶1，约1.2∶1至约3∶1，或约1.2∶1至约2∶1。 [0162] 通过将化合物5与脂肪酶435孵育来实现5-甲基乙酰氧基的选择性脱乙酰化。 [0163] [0164] 酶催化的脱乙酰化通过将酶的缓冲溶液加入到化合物5的有机溶液中来进行。或者，酶可以共价连接到固体支持物上，并且通过使固体支持的酶与化合物5的有机溶液接触来实现。使用固体支持的酶是有利的，因为它允许酶的高效循环并且允许更短的反应时间。 [0165] 化合物如5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯(6)难以处理。反应溶剂的蒸发或化合物6从反应混合物中沉淀是困难的，此外，提供了不合适于共结晶形成的次优产物。根据本公开的方法消除了分离化合物6的需要，因为反应混合物含有纯化状态的化合物6和适于引发共结晶的溶剂混合物。因此，根据本发明的共结晶可以通过使含有化合物6的反应混合物与共结晶成形剂(固体)或共晶体成形剂的溶液接触而容易地获得。 [0166] 根据一个实施方式，通过在环境温度下使包含化合物6和共晶体成形剂的反应混合物老化来引发共结晶的形成。例如，反应混合物可以在约-10℃至约35℃，约10℃至约25℃，或约10℃至约20℃的温度下老化。 [0167] 如果需要冷却来引发共结晶形成，共结晶混合物的温度可以以约1℃/分钟、约0.5℃/分钟或约0.25℃/分钟的速率冷却。对于一些实施方式，冷反应混合物的温度在约-20℃至约20℃，例如约-20℃至约-10℃，约-10℃至约0℃，约0℃至约5℃，或约0℃至约10℃的范围内。 [0168] 用于制备根据本发明的共结晶的其它技术包括但不限于机械共结晶合成，溶剂热共结晶合成，共结晶合成使用溶剂蒸发，共晶合成固相研磨方法和共结晶合成溶剂滴研磨方法。 [0169] 通过溶剂蒸发法合成共结晶包括制备式I化合物和合适的共结晶成形剂的分离溶液，将化学计量的式I化合物溶液与化学计量量的共结晶成形剂混合，并通过将反应混合物储存在适于引发共结晶形成的温度下，使所得到的含有式I化合物和共结晶成形剂的反应混合物饱和。 [0170] 根据一个实施方式，通过溶剂滴磨法获得本发明的共结晶。简言之，将式I化合物(化合物6)和共晶体成形剂在少量的合适的共结晶溶剂存在下一起研磨，其被认为起催化剂的作用。 [0171] 适于共结晶形成的溶剂包括例如，乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙酸乙酯、乙腈、乙酸异丙酯、THF及其混合物。在一个实施方式中，将戊二酸的乙醇溶液加入到化合物6的甲苯-乙醇溶液中。然后将所得的过饱和反应混合物冷却以形成5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-5-羟甲基四氢呋喃-3-基乙酸酯戊二酸共结晶。 [0172] [0173] 通常，使用等摩尔或更大摩尔量的共结晶成形剂来合成共结晶。根据反应化学计量，共结晶成形剂与式I化合物的摩尔比可以为约1∶1、2∶2、或约2∶1。化合物6的溶液和共结晶成形剂的溶液的浓度可在约50毫摩尔至约2.0摩尔，例如约250毫摩尔，约500毫摩尔，约600毫摩尔，约700毫摩尔，约800毫摩尔，大约900毫摩尔，约1摩尔，约1.2摩尔，约1.4摩尔，约1.6摩尔，约1.8摩尔或约2.0摩尔变化。 [0174] 共结晶的形成取决于共结晶成形剂的溶液浓度，式I化合物的溶液浓度，反应物(共结晶成形剂和式I化合物)和产物(共结晶)在适于引发共结晶形成的温度下在反应混合物中的溶解性。一般共结晶时间可以为约10分钟至约48小时，约10分钟至约24小时，约10分钟至约12小时，约10分钟至约10小时，约10分钟至约8分钟，约10分钟至约6小时，约10分钟至约4小时，约10分钟至约2小时，或约10分钟至约1小时。 [0175] 如此形成的共结晶可以通过重力过滤，真空过滤分离，然后洗涤分离的共结晶并干燥。也可以通过从反应混合物中蒸发溶剂来分离共结晶。分离的共结晶通常在约30℃至约70℃或约40℃至约60℃的温度下干燥。干燥方法可以在大气压或减压(真空)下进行，例如约0.1至约10毫米汞柱的减压范围。 [0176] 上述方法提供了纯度至少为95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％或99.9％的本发明的共结晶。使用本发明的方法合成以下示例性共结晶。 [0177] 实施例 [0178] 下面的合成方案仅是为了阐述，而不是用来限制权利要求的范围。 [0179] 在下文所述的合成方案中，除非另有说明，所有温度以摄氏度计，且所有份数和百分数以重量计。试剂从商业供应商处购买，除非另有说明，不经进一步纯化使用。所有溶剂均购自商业供应商，并按原样使用。 [0180] 以下反应通常在氩气或氮气的正压下于室温(除非另有说明)在无水溶剂中进行，并且反应烧瓶装有橡胶隔片以供通过注射器引入底物和试剂。将玻璃器皿烘干和/或加热干燥。所述反应由TLC检测和/或由LC-MS分析，并且根据起始物质的消耗判断是否结束。使用高强度二氧化硅(HSS)柱或YMC柱 进行超高效液相色谱(UPLC)的分析。一般流速为0.7mL至1.0mL/分钟，注射体积约为2-5μL。 [0181] 分析薄层色谱(TLC)可在预被覆硅胶60F2540.25mm板(EMD化学公司)的玻璃板上进行，并采用紫外光(254nm)和/或硅胶上的碘和/或采用TLC染剂的加热来观测，所述染剂例如磷钼酸乙醇、茚三酮溶液、高锰酸钾溶液或硫酸高铈溶液。 [0182] 在以600MHz操作的Bruker Avance 光谱仪上记录1H-NMR谱和13C-NMR。以CDCl3溶液(以ppm报告)，使用参比标准的氯仿(对质子7.27ppm，且对碳77.00ppm)、CD3OD溶液(对质子3.4和4.8ppm的参照标准，且对碳49.3ppm的参照标准)、DMSO-d6(对质子2.49ppm)或适时使用内部的四甲基硅烷(0.00ppm)获得NMR谱。若需要，可使用其它NMR溶剂。当报告峰值多重性时，使用以下缩写：s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，br(加宽)，bs(宽单重峰)，dd(双重双峰)，dt(双峰三重峰)。当给出时，偶联常数以赫兹(Hz)报告。 [0183] 5-氨基-3-(2’-O-乙酰基-3’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮)的戊二酸共结晶的合成 [0184] 偶联反应-(2S，4R，5R)-4-乙酰氧基-5-(5-氨基-2-氧代噻唑并[4，5-d]嘧啶-3(2H)-基-四氢呋喃-2-基-甲基乙酸酯(5)的合成 [0185] [0186] 根据PCT公开号：WO2008140549中描述的方案合成化合物5。简言之，向装有温度探针、冷凝器和氮气入口的三口烧瓶中加入5-氨基-3H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2-酮(化合物4)和乙腈。将N，O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)通过漏斗加入到化合物4的溶液中，然后在氮气气氛下在40℃下搅拌90分钟。冷却至5℃后，加入1，2，5-三-O-乙酰基-B-D-呋喃核糖(化合物3)的乙腈溶液，然后加入TMSOTf。 [0187] 然后将反应混合物加热至75℃，并在该温度下保持10小时。加热后，将含有反应混合物的烧瓶逐渐冷却至15℃。然后将水加入到1mL部分的冷反应混合物中，以淬灭反应同时维持反应混合物的温度为15℃。淬灭的反应混合物与硅藻土合并并用氢氧化钠中和。将去除硅藻土后得到的滤液与碳酸氢钠水溶液和固体氯化钠混合，然后转移到分液漏斗中并用乙腈萃取。浓缩有机层得到期望的产物，化合物5。化合物5的特性及其纯度通过HPLC使用可靠物质作为标准物测定。 [0188] B.选择性脱乙酰化-化合物6的合成 [0189] [0190] 将化合物5在乙腈中的溶液加入到与固体支持物结合的南极假丝酵母B型(Biocatalytics目录号IMB-111)脂肪酶的碳酸氢盐水性溶液中。将反应混合物(悬浮液)搅拌36小时，然后过滤酶连接的支持物。用乙酸乙酯萃取该滤液。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，与Norit 211搅拌90分钟，然后通过硅藻土滤器辅助物过滤得到所需的醇(6)。化合物6的特性及其纯度通过HPLC使用可靠物质作为标准物测定。 [0191] C.共结晶形成 [0192] 将含有17.2g化合物(6)[52.7mmol]的乙酸乙酯溶液(47.4mL)在60℃，180毫巴的减压下进行旋转蒸发以除去溶剂。将所得残留物溶于乙醇(110mL)中并减压浓缩(60℃，180毫巴)。然后将新鲜乙醇(83mL)加入到圆底烧瓶中的反应混合物中，并将混合物在室温下搅拌直到得到化合物(6)的透明黄色乙醇溶液。 [0193] 通过将戊二酸溶解在15mL乙醇中制备戊二酸溶液(3.62g，27.4毫摩尔)。然后将澄清的无色溶液在15分钟内逐滴加入到搅拌的乙醇溶液化合物(6)中，在加入戊二酸的过程中将其加热并保持在温度50℃。然后将共结晶混合物以0.25℃/分钟的速率冷却至30℃以引发共结晶形成。搅拌冷共结晶混合物后，没有形成晶体。 [0194] 将共结晶混合物在搅拌下再加热至50℃。将10mg式I化合物的戊二酸共结晶加入共结晶混合物中作为晶种以引发共结晶形成，并将混合物以0.25℃/分钟的速率冷却。随着温度降低，形成了无法搅拌的浓悬浮液。将共结晶混合物再加热至55℃并保持在该温度，直到获得容易搅拌的悬浮液。 [0195] 然后通过以0.25℃/分钟的速率降低温度将热的搅拌悬浮液逐渐冷却至约0℃。将冷共结晶混合物搅拌过夜，同时保持共结晶混合物的温度在0℃和5℃之间。通过抽滤收集共结晶的悬浮液，用冷乙醇(43mL)洗涤，并在真空烘箱(＜5毫巴)中在40℃的温度下干燥。产率-得到18.24g(88.1％)白色固体的戊二酸共结晶。通过HPLC测定共结晶的纯度，发现纯度为99.75％。 [0196] 表10显示了使用类似于实施例1中公开的方案合成的示例性共结晶和示例性共结晶的相应物理特性。 [0197] 表10 [0198] [0199] [0200] 如上所述，本发明共结晶的盐分因素(S)低于式I化合物的甲苯磺酸盐的盐分因素(STos为1.53)。由于它们较低的S-值，含有共晶体的组合物在较低口服剂量下达到式I化合物的较高稳态血浆浓度。因此，接受治疗的患者将需要比接受式I化合物的甲苯磺酸盐的组合物的患者所接受的更少的口服剂量的共结晶组合物以达到治疗上适合的式I化合物的血浆浓度。 [0201] V.对HBV病毒复制子复制活性的抑制 [0202] HBV感染是急性和慢性肝病的主要原因之一。虽然目前的HBV治疗方法有效降低血清HBV DNA水平，但是这些治疗剂在降低病毒清除速率方面的效果有限，并且通常需要长时间使用，这会引起严重的毒副作用。本发明提供了作为Toll样受体7(TLR-7)激动剂的式I化合物的共结晶，其在未成熟树突状细胞上表达。 [0203] TLR是通过刺激宿主中细胞因子和趋化因子的释放而激活免疫应答的病原体识别受体的家族。在宿主免疫系统激活时释放的细胞因子和趋化因子是有效的抗病毒剂，主要是由于其识别和杀死病毒感染细胞的能力。因此，分别评估式I化合物(双前药)，单一前药(脱乙酰化的式I化合物或式I化合物的氧化形式)和未乙酰化的氧化形式的式I化合物(生物活性物质)在体外抑制HBV复制的能力。方案1(上述)说明了双前药的结构，单一前药和生物活性物质的结构。 [0204] 通过监测含HBV感染的HepaRG细胞的培养物中分泌的HBV DNA水平和HBV表面抗原(HBsAg)水平，评价对病毒复制的直接抑制。通过将HBV感染的HepaRG细胞暴露于由未乙酰化的氧化形式的式I化合物(生物活性物质)(其是选择性TLR-7激动剂)刺激的外周血单核细胞(PBMC)的条件培养基中间接评估培养物中的病毒复制。 [0205] HepaRG细胞系的生成 [0206] HepaRG细胞(Cat#HPR101)、HepaRG生长培养基补充剂(Cat#ADD710)和HepaRG分化培养基补充剂(Cat#ADD720)购自Biopredics国际公司(法国雷恩)。虽然生长培养基补充剂中没有DMSO，但分化培养基补充剂含有2％DMSO。在含有生长培养基补充剂的William′s E培养基(WEM)(GIBCO))中，在含5％CO2的加湿气氛中于37℃培养细胞。为了起始分化，将生长培养基与分化培养基(含有分化培养基补充剂的WEM)以1∶1比例组合，并加入到融合的HepaRG细胞中。 [0207] 孵育三天后，将合并的培养基用分化培养基替换，并将细胞在分化培养基中再维持2至4周。分化培养基在整个孵育期间每2至3天更换一次。分化的HepaRG细胞(HepaRGd)显示由单层胆汁样细胞包围的肝细胞样细胞岛。在HBV感染和化合物治疗之前，将HepaRGd细胞以每孔50,000至60,000个细胞接种到胶原I包被的96孔板(吉布可公司，Cat#A11428-03)中。允许细胞在HBV感染之前在接种至少1周后在96孔板中恢复其分化表型。 [0208] HBV感染 [0209] 如Sell M.A.等，PNAS，84(4)：1005-1009所述，从HepG2.2.15培养细胞，一种支持HBV(基因型D，株系ayw)复制和病毒体分泌的细胞系收集HBV接种物。将HepG2.2.15细胞维持在含有预先包被胶原蛋白I的hyperflask(康宁公司)的含有1×Pen/Strep(英杰公司)、10％FBS和0.25mg/ml G-418(英杰公司)的DMEM+GlutaMAX-1(BD Biosciences)中。达到融合后，用含有1×Pen-Strep，2.5％FBS和1％DMSO的DMEM+GlutaMAX-1替换HepG2.2.15培养基3天，然后用含有1×Pen-Strep和1％DMSO的DMEM+GlutaMAX-1替换。在2周内每3至4天收集含1％DMSO的培养基，并且通过在Tv Beckman转子中20％蔗糖垫的超速离心以45,000rpm离心4小时，在4℃下将HBV感染性病毒粒子和亚病毒颗粒沉淀3小时。将沉淀以108-109基因组当量(GE)/ml的浓度重悬于WEM中，通过实时PCR测定，如下所述，使用含有基因型D HBV的质粒DNA作为内标。为了评估接种物的感染性，将96孔板中的HepaRGd细胞在含有50-200GE/细胞和4％PEG 8000(聚乙二醇8000，西格玛公司，Cat#P5413-500G)的分化培养基中在37℃下感染16小时。在感染结束时，移除HBV接种物，细胞用分化培养基洗涤3次。每2-3天补充分化培养基，通过测定分泌的HBV DNA、乙型肝炎表面(HBsAg)和/或e(HBeAg)抗原来监测HBV复制。 [0210] 分泌的HBV抗原和HBVDNA的检测 [0211] 按照由制造商(Autobio诊断公司，郑州，中国)推荐的说明书使用HBsAg化学发光免疫试验从50μL的HBV感染的HepaRG上清中检测HBsAg。使用MagNA Pure 96DNA和病毒NA小体积试剂盒(罗氏，Cat#05 467 497 001)，从50μL HBV感染的HepaRGd上清液中提取HBV DNA。使用EagleTaq主混合物试剂盒(罗氏，Cat#05529026 190)和以下加热/冷却循环条件用正向引物CTG TGC CTT GGG TGG CTT T，反向引物AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA和探针56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ(IDT DNA)扩增覆盖核心区的99个核苷酸片段：50℃下2分钟，95℃下10分钟，和40个循环的95℃下15秒和60℃下1分钟。使用ViiA7实时PCR系统(生命技术公司)进行所有PCR反应。 [0212] HBV病毒复制的抑制 [0213] 本发明的式I化合物的共结晶是双前药，其在体内酶促转化为生物活性药物的5-氨基-3-((2R，3R，5S)-3-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-3a，7a-二氢噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(3H，6H)-二酮，如上述方案1中所示。据信这些化合物通过刺激toll样受体，特别是TLR-7来释放细胞因子和趋化因子，发挥抗病毒活性。为了确定病毒复制抑制活性，合成了戊二酸共结晶(双前药)、脱乙酰化形式的式I化合物(单一前药)和生物活性物质(RO6871765)。 [0214] 测量HBV复制的直接和间接抑制活性。在本研究中，使用Roferon-A、IL-6、TNF-α、IP-10或DMSO作为无药物对照。对于戊二酸共结晶的直接研究储备溶液，在WEM生长培养基中制备式I化合物的脱乙酰化形式和生物活性物质(RO6871765)以及对照剂，最终体积为120μl，DMSO浓度为2％(v/v)。将这些试剂的等分试样在感染后第4天加入含有HBV感染的HepaRGd细胞的96孔培养板的独立孔中。每个孔中DMSO的终浓度为2％。在抑制研究中使用的HepaRGd细胞保持在含有2％DMSO的分化培养基中。为了评估HBV复制的间接抑制活性，将HBV感染的HepaRGd细胞与收集自DMSO(对照)或RO6871765(100μM)刺激的PBMC的条件培养基一起孵育，在分化培养基中连续稀释。 [0215] 通过向培养中的HBV感染的细胞中加入含有测试化合物的分化培养基等分试样或条件培养基的等分试样来发挥HBV病毒复制抑制活性。每2至3天向培养中的HBV感染细胞中加入含有测试化合物或条件培养基的已知等分试样的分化培养基，共7天。在治疗的第7天(感染后11天)，如上所述，使用50μL上清液分别用于使用CLIA或实时PCR测定分泌的HBV抗原或HBV DNA的水平。使用CellTiter-Glo(普洛麦格公司，Cat#G7571)测定细胞活力。通过使用Graphpad(加利福尼亚州拉由拉市)获得剂量-反应曲线。根据剂量-反应曲线计算EC50(引起50％抑制的有效浓度)和CC50(未处理细胞对照)值作为测试化合物的浓度或条件培养基浓度(对数稀释度)，其中与没有药物的对照相比，观察到HBV病毒复制活性降低50％。EC50和CC50值来自2-4次独立的HBV感染研究，每次一式两份进行。 [0216] RO6871765对HBV复制的直接影响 [0217] 先前的病毒抑制研究已经表明戊二酸共结晶(双前药)和脱乙酰化形式的式I化合物(单一前药)不能抑制培养的HepaRG细胞中的病毒复制。为了评估RO6871765(生物活性物种)是否在HepaRG细胞中抑制HBV病毒复制，感染的细胞在感染后第4天与已知浓度的RO6871765一起孵育。使用RO6871765的200μM储备液的系列稀释液来制备测试溶液。在病毒抑制研究中测试的RO6871765的浓度分别为200μM、66.67μM、22.22μM、7.41μM、2.47μM和0.82μM。每3天用含有已知浓度的RO6871765或2％DMSO(对照细胞)的新鲜培养基补充细胞培养基。作为阳性对照，使用以56pM，167pM和500pM三种不同浓度的聚乙二醇化干扰素-α2a处理的HBV感染的HepaRGd细胞。 [0218] 在治疗的第7天(细胞感染后11天)测量分泌的HBsAg和HBV DNA的水平。如图3A所示，RO6871765没有发挥任何直接的抗HBV作用。对于用最高浓度(200μM)的RO6871765孵育的细胞，检测到HBV DNA或HBsAg水平无变化。因此，RO6871765的EC50大于200μM(图3A，表11)。当用RO6871765处理HBV感染的HepaRGd细胞时，观察不到明显的细胞毒性(CC50＞200μM，最高浓度的RO6871765下，活力最大降低约17％)。 [0219] 表11 [0220] [0221] 相比之下，用聚乙二醇化干扰素-α2a处理的HBV感染的HepaRGd细胞显示出HBV复制的显著降低。在测试的最高浓度(500pM；见图3B，表12)下，分泌的HBV DNA和HBsAg的水平分别降低了76.9％±14.8％和46.0％±6.3％。 [0222] 表12 [0223] [0224] 这些结果表明RO6871765具有弱抗病毒活性。然而，令本发明人惊奇的是，从RO6871765获得的条件培养基刺激的PBMC显著降低来自HBV感染的培养的HepaRG细胞的HBV DNA和HBsAg分泌物，从而为RO6871765间接抑制HBV病毒复制提供支持。 [0225] RO6871765对HBV复制的间接影响 [0226] TLR-7激动剂刺激来自人PBMC的细胞因子和趋化因子的生成。通过将培养的PBMC与DMSO(对照)接触或100μM RO6871765(药物)与HBV感染的HepaRGd细胞接触获得条件培养基。 [0227] 将HBV感染的HepaRGd细胞与从健康供体-供体70615(图A-D)和供体77726(图E，F)分离的PBMC收集的各种稀释的条件培养基孵育。来自每个供体的PBMC用DMSO(图A，C，E)或100μM RO6871765(图B，D，F)刺激。图4A，4C和4E对应于使用DMSO刺激的PBMC对HBV病毒复制的抑制，而图4B，4D和4F对应于使用RO6871765刺激的PBMC的HBV病毒复制的抑制。进行三项实验。在第一个实验(图4A，4B)中，首先使用分化培养基将来自PBMC(供体70615)的条件培养基稀释10倍，然后以3倍增量连续稀释，随后将每种稀释的条件培养基加入HBV感染的HepaRGd细胞。在第二个实验(图4C，4D)中，首先使用分化培养基将来自PBMC(供体70615)的条件培养基稀释5倍，然后以5倍增量连续稀释，随后加入HBV感染的HepaRGd细胞。在第三个实验(图4E，4F)中，首先使用分化培养基将来自PBMC(供体77726)的条件培养基稀释5倍，然后以5倍增量连续稀释，随后加入HBV感染的HepaRGd细胞。通过监测在培养基中分泌的HBV DNA和HBsAg的水平，测定对照和RO6871765处理的细胞的HBV复制抑制活性。 [0228] 如图4所示，用DMSO处理的PBMC的条件培养基不诱导任何显著的抗病毒作用(参见图4A，4C和4E和表13)。相比之下，在用RO6871765处理的PBMC的条件培养基存在下，观察到分泌的HBV DNA和HBsAg水平的剂量依赖性降低(参见图4B，4D和4F，表13)。RO6871765对HBV DNA的平均EC50值为-2.5±0.4log10，相当于RO6871765刺激条件培养基的1∶318稀释度(表13)。RO6871765刺激条件培养基对HBV表面抗原(HBsAg)分泌的平均EC50值为-1.2log10，相当于1∶16稀释度(表13)。细胞活力测定显示，来自DMSO处理的PBMC的条件培养基没有显示出显著的细胞毒性作用，而用来自RO6871765刺激的PBMC的稀释的条件培养基(10倍和5倍稀释)处理的HBV感染的HepaRGd细胞显示细胞活力的分别轻微降低14％和19％(图4，表 13)。 [0229] 表13 [0230] [0231] [0232] aSD-标准偏差 [0233] 获得的用RO6871765处理的培养的PBMC的条件培养基的抗病毒效果最有可能归因于从PBMC释放细胞因子和趋化因子。来自条件培养基的细胞因子分析研究表明，RO6871765诱导干扰素α(IFN-α)，白细胞介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IFNγ诱导的蛋白10(IP-10)，而当用DMSO处理PBMC时，没有观察到这些细胞因子的释放。 [0234] 为了研究IFN-α2a(罗扰素(Roferon-A))，IL-6，TNF-α和IP-10对HBV复制的影响，使用HBV感染的HepaRG细胞测定进行这些细胞因子中的每一种的剂量依赖性滴定。测试的最高浓度为-对于罗扰素(Roferon-A)为1000IU/ml，对于IL-6、TNF-α和IP-10为1000ng/ml，随后将其转化为摩尔浓度进行比较。 [0235] 如图5所示，罗扰素(Roferon-A)和IL-6都显示出对分泌的HBsAg和HBV DNA的剂量依赖性抑制。罗扰素(Roferon-A)和IL-6对HBV DNA分泌的EC50值分别为1.0±0.3pM和0.027±0.0073nM。罗扰素(Roferon-A)和IL-6也分别以0.033±0.022nM和0.26±0.020nM的EC50值抑制HBsAg分泌。虽然TNF-α似乎抑制HBV复制，但是即使在约1nM的浓度下，该细胞因子也是细胞毒性的。TNF-α对HBV DNA和HBsAg分泌的EC50值分别为0.085±0.046nM和 0.32。即使在测试的最高浓度(EC/CC50＞115nM，参见图5)，也未观察到趋化因子IP-10的细胞毒性或HBV复制抑制作用。这些数据一起强烈地表明RO6871765刺激的PBMC条件培养基通过介导从人PBMC中释放IFN和细胞因子的间接机制来抑制HBV复制。 |
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