一种北葶新苷D及其制备方法与应用 |
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| 申请号 | CN201710797572.0 | 申请日 | 2017-09-06 | 公开(公告)号 | CN107501355A | 公开(公告)日 | 2017-12-22 |
| 申请人 | 河南中医药大学; | 发明人 | 冯卫生; 李孟; 郑晓珂; 杨方方; 张靖柯; 张志广; 吕锦锦; 赵璇; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及北葶新苷D及其制备方法与应用，有效解决从北葶苈子中提取北葶新苷D及用于制备 治疗 心肌细胞H9c2损伤药物的问题，北葶苈子清炒，加 水 煎煮，提取液减压浓缩，醇沉，上清液浓缩至无醇味，上Dianion HP-20柱，用水、 乙醇 梯度洗脱，收集40%乙醇洗脱液，然后用水离散溶解，离心，上清液浓缩，过Toyopearl HW-40柱色谱，用水、甲醇梯度洗脱，收集20%甲醇洗脱部位，过Sephadex LH-20柱色谱，用70%甲醇洗脱，收集流份，每管5mL，合并第25-30试管的流份，标为组分C2；组分C2用半制备HPLC分离，收集保留时间tR=23.0~23.6min的流份，干燥，得北葶新苷D。本发明原料丰富，制备方法科学合理，该化合物对心肌细胞有保护作用，可有效用于制备治疗心肌细胞H9c2损伤的药物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种北葶苈子中提取的北葶新苷D，该提取物分子式为C31H40O18，分子结构式为： |
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| 说明书全文 | 一种北葶新苷D及其制备方法与应用技术领域[0001] 本发明涉及医药，特别是一种北葶新苷D及其制备方法与应用。 背景技术[0002] 葶苈子为常用中药材，始载于《神农本草经》，列为草部下品，该药味辛、苦，性大寒，归肺与膀胱经，具有宣泄平喘、行水消肿的功效。2015版《中国药典》收录的“葶苈子”有南北之分，其中十字花科植物独行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟种子习称“北葶苈子”，而播娘蒿Descurainia Sophia(L.)Webbex Prantl.的干燥成熟种子习称“南葶苈子”。 [0003] 从研究的试验中发现，北葶苈子中含有一种鼠李糖酚苷类化合物，即北葶新苷D，但该类化合物如何从北葶苈子中提取出来，并有效用于制备治疗心肌细胞H9c2损伤的药物，至今未见有公开报导。 发明内容[0005] 本发明解决的技术方案是，一种北葶新苷D及其制备方法与应用，其中北葶新苷D分子式为C31H40O18，分子结构式见图1，该北葶新苷D的制备方法是： [0006] 取北葶苈子，采用清炒法炮制，温度240℃，炒制5.5min，取炒制的北葶苈子，每次加北葶苈子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液减压浓缩至相当于含生药2g/mL的浸膏，在室温下，浸膏用浸膏5倍体积、体积浓度为80％的乙醇醇沉，静置1h，将上清液倒出，沉淀再加入浸膏5倍体积、体积浓度为80％的乙醇醇沉，如此反复操作4次，将所得上清液浓缩至无醇味，上Dianion HP-20柱，依次用10倍柱体积的水、体积浓度20％、40％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，得40％乙醇洗脱部位A；在室温下，40％乙醇洗脱部位A用水离散溶解，用6000r/min的转速离心15min，温度20℃，过滤，滤液减压浓缩至原体积的28-29分之一；通过Toyopearl HW-40柱色谱，依次用水、体积浓度10％甲醇、体积浓度20％甲醇洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的4倍，流速6mL/min，收集20％甲醇洗脱部位，标为组分B3；组分B3通过Sephadex LH-20柱色谱，用体积浓度70％甲醇洗脱，用试管收集流份，流速为 1.5mL/min，每管5mL，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，合并第25-30试管的流份，标为组分C2； 组分C2用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为体积比的乙腈︰水＝22︰78的混合液，流速2.5mL/min，收集保留时间tR＝23.0～23.6min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新苷D。 [0007] 该化合物能够显著提高细胞活力，有效用于制备治疗心肌细胞H9c2损伤的药物。 [0008] 本发明的北葶新苷D是从北葶苈子中提取的一种新化合物，其原料丰富，制备方法科学合理，该化合物对心肌细胞有保护作用，可有效用于制备治疗心肌细胞H9c2损伤的药物，开拓了治疗心肌细胞损伤药物的新途径和北葶苈子新的药用价值和商业价值，有显著的经济和社会效益。附图说明 [0009] 图1为本发明的分子结构图。 [0010] 图2为本发明化合物北葶新苷D的1H-NMR谱(in CD3OD)图。 [0011] 图3为本发明化合物北葶新苷D的13C-NMR谱(in CD3OD)图。 [0012] 图4为本发明化合物北葶新苷D的HSQC谱图。 [0013] 图5为本发明化合物北葶新苷D的HMBC谱图。 [0014] 图6为本发明化合物北葶新苷D的HR-ESI-MS谱图。 [0015] 图7为本发明化合物北葶新苷D的IR谱图。 [0016] 图8为本发明化合物北葶新苷D的UV谱图。 [0017] 图9为本发明化合物北葶新苷D对阿霉素诱导的H9c2大鼠心肌细胞存活率的影响图(注：与正常组比：*:P<0.05**:P<0.01，与模型组比：#:P<0.05##:P<0.01)。 具体实施方式[0018] 以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。 [0019] 本发明在具体实施中，一种北葶新苷D及其制备方法与应用，其中北葶新苷D分子式为C31H40O18，分子结构式见图1，该北葶新苷D的制备方法是： [0020] 取北葶苈子10kg，采用清炒法炮制，温度240℃，炒制5.5min，取炒制的北葶苈子，每次加北葶苈子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液减压浓缩至相当于含生药2g/mL的浸膏(5L)，在室温下，浸膏用体积浓度为80％的乙醇25L醇沉，静置1h，将上清液倒出，沉淀再加入体积浓度为80％的乙醇25L醇沉，如此反复操作4次，将所得上清液浓缩至无醇味，上Dianion HP-20柱，依次用10倍柱体积的水、体积浓度20％、40％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，得40％乙醇洗脱部位A；在室温下，40％乙醇洗脱部位A用水离散溶解，用6000r/min的转速离心15min，温度20℃，过滤，滤液减压浓缩至原体积的28-29分之一；通过Toyopearl HW-40柱色谱，依次用水、体积浓度10％甲醇、体积浓度20％甲醇洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的4倍，流速6mL/min，收集20％甲醇洗脱部位，标为组分B3；组分B3通过Sephadex LH-20柱色谱，用体积浓度70％甲醇洗脱，用规格10×100mm的试管收集流份，流速为1.5mL/min，每管5mL，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，合并第25-30试管的流份，标为组分C2；组分C2用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为体积比的乙腈︰水＝22︰78的混合液，流速2.5mL/min，收集保留时间tR＝23.0～23.6min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新苷D。 [0021] 经液相色谱法测定，该提取物分子式为C31H40O18，分子结构式为： [0022] [0023] 淡黄色结晶性粉末(CH3OH)，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:353.0849[M+Na]+(calcd.For C14H18O9Na 353.0849)；UV(MeOH)λmax:202(0.65),219(0.56),263(0.58)nm；IR-1 -1(KBr)νmaxcm ：3422,2927,1670,1643,1582,1022,972cm ，命名为北葶新苷D，该北葶新苷D具有对心肌细胞保护作用，有效用于制备治疗心肌细胞H9c2损伤的药物，并经测试和试验取得了非常好的有益技术效果，有关试验资料如下： [0024] 1 仪器与试药 [0025] 核磁共振用Bruker AVANCEⅢ500核磁共振仪(TMS内标)(Bruker)，红外光谱用Nicolet is 10Microscope Spectrometer(Thermo Scientific,USA)，高分辨质谱用Bruker maxis HD mass spectrometer，紫外光谱用Shimadzu UV-2401PC apparatus，高效液相色谱用Waters Alliance系列2695高效液相系统，配备2998型二极管阵列检测器，Empower3色谱数据工作站，LC50型高压制备液相色谱仪，UV200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，YMC-PackODS-A色谱柱(250×10mm.D.S-5mm,12mm)(YMC有限公司)，其余有N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，A-1000S型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，N-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，FDU-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，AB204-N万分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)，iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD)，二氧化碳培养箱(上海STIK)，超净工作台(苏净集团)，Arium 611VF超级组合型超纯水器(SARTORIUS)，倒置显微镜(Nikon)，PB-10酸度计(德国赛多利斯集团)。 [0026] 柱层析填料Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20(日本三菱化学公司)，Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司)，Sephadex LH-20(Parmacia Biotech公司)，柱层析所用硅胶H(160- 200目)为青岛海洋化工厂生产，培养皿、96孔培养板、细胞冻存管(Corning公司)，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。 [0027] DMEM高糖培养液(Gibco)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco)，DMSO(Solarbio)；MTT(Biosharp)，DOX溶液(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，水为超纯水，PBS缓冲液等为自配。 [0028] 北葶苈子采自河南南阳，经河南中医药大学陈随清教授及董诚明教授鉴定为十字花科植物独行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟种子，采用该种子制备的本发明北葶新苷D。 [0029] 2 结构鉴定 [0030] 北葶新苷D，淡黄色结晶性粉末(CH3OH)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:353.0849[M+Na]+(calcd.For C14H18O9Na 353.0849)，确定其分子式为C31H40O18；UV(MeOH)λmax:202(0.65),219(0.56),263(0.58)nm；IR(KBr)νmaxcm-1：3422,2927,1670,1643,1582, 1022,972cm-1。其结构式及核磁数据如下： [0031] [0032] 表1 北葶新苷D的1H NMR(500MHz)和13C NMR(125MHz)数据(in CD3OD)[0033] [0034] [0035] 3 北葶新苷D对阿霉素(DOX)损伤大鼠心肌细胞H9c2的保护作用 [0036] 3.1 细胞 [0037] H9c2细胞株购自深圳市百恩维生物科技有限公司。 [0038] 3.2 细胞培养 [0040] 3.3 DOX诱导的H9c2大鼠心肌细胞损伤模型的建立 [0041] 传代培养时，将对数生长期的细胞以5×104的密度接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，换用含药的高糖DMEM培养液。DOX给予含5μg·ml-1DOX的含血清高糖DMEM培养液培养24h。 [0042] 3.4 实验分组 [0043] 每组设6个平行孔，设正常组(NC)、DOX组(M)、本发明给药组。DOX组：给予含5μg·ml-1DOX的含血清高糖DMEM培养液培养24h；北葶新苷D给药组：分别给予含5μg·ml-1DOX和1、2、4、8、16、32μM北葶新苷D的含血清高糖DMEM培养液培养24h。 [0044] 3.5 MTT法检测北葶新苷D对H9c2损伤细胞存活率的影响 [0045] 细胞接种于96孔板，贴壁后加药干预培养后，吸除上清液，各孔分别加入含1％MTT(5g/L)的高糖DMEM培养液200μl，37℃孵育4h，吸除上清液，加入150μL的DMSO，震荡10min使结晶充分溶解。用酶标仪检测490nm波长处OD值，用公式计算细胞存活率＝(OD实验组/OD对照组)×100％。实验重复3次，取平均值。 [0046] 3.6 统计方法 [0047] 实验数据用均数±标准差 表示，用SPSS18.0统计软件处理数据，各组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05表示有显著性意义，P<0.01表示有极显著性意义。 [0048] 3.7 结论 [0049] 试验结果表明：与空白组相比，模型组细胞活力显著降低(P<0.01)；与模型组相比，北葶新苷D给药剂量为2、16和32μM时，能够显著提高细胞活力(P<0.05)，在4和8μM时，能够极显著提高细胞活力(P<0.01)，表明北葶新苷D对心肌细胞有一定的保护作用。 [0050] 表2 北葶新苷D对阿霉素诱导的H9c2大鼠心肌细胞存活率的影响( n＝6)[0051] [0052] [0053] 注：与正常组比：*:P<0.05**:P<0.01，与模型组比：#:P<0.05##:P<0.01[0054] 本发明原料丰富，制备方法简单，开拓了治疗心肌细胞损伤药物的新途径，开拓北葶苈子的药用价值和商业价值，是治疗心肌细胞H9c2损伤药物上的创新，有显著的经济和社会效益。 |
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