[0001] 本发明涉及黄连素衍生物，尤其是涉及一种黄连素衍生物XMU-Ber122。

[0002] 黄连素(Berberine)，又称小檗碱，是从黄连、黄柏等药用植物中提取的一种季胺型异喹啉类生物碱，其游离碱型(氢氧化小檗碱)不稳定，在植物中以盐的形式存在。它具有广谱抗菌作用，对多种革兰阳性和阴性细菌有抑制作用，19世纪初，已被确认并药用，主要用于胃肠炎、细菌性痢疾。另外，黄连素可以治疗糖尿病和心血管疾病，具有确切的降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗、抗过氧化、抗高血压等作用。近年来，黄连素的抗肿瘤活性也越来越引起重视。

[0003] 尽管黄连素由于其自身的来源天然、药理学功能广泛、安全性高等优点，使其在现在流行的抗癌药物中显得非常罕见，掀起了国际上研究黄连素的热潮。但其具体的作用分子机制还未完全清楚。另外，黄连素本身有一些药学和化学弱点，比如，第一，黄连素水溶性[1-2]及脂溶性都很小，故口服吸收利用度比较低，导致其效率差 ，这是因为，从结构上看，黄连素作为一种常见的异喹啉生物碱，具有异喹啉并二氢异喹啉四环结构，分子内存在一个季铵盐单元以及两个烷氧基取代的苯环。从三维结构来看，黄连素是个近似平面的结构，芳环π体系的堆积作用一定程度上导致其在水中和有机溶剂中的溶解性都不好；第二，黄连素的主体活性成分小檗碱本身对内脏没有伤害，但目前临床应用的只有盐酸小檗碱这一种形式，其成盐的搭档氯离子存在一些不良影响和潜在风险(盐酸小檗碱进入胃肠后水解产生的盐酸刺激肠胃，会引起肠胃不适[3-5])；最后，由于黄连素通常用于治疗腹泻和胃肠炎，服用剂量小、时间短，不良反应很难发现，若需长期服用，就必须考虑它的成盐搭档氯离子在体内过度累积可能带来的伤害。

[0004] 自20世纪70年代至今，大量药物学家尝试对黄连素进行结构改造。目前，旨在提高黄连素抑癌活性的研究主要集中在增强黄连素与DNA结合能力，比如，在C9-O位置引入各种多种不同类型基团可显著提高黄连素与DNA的结合能力。然而，大部分研究并没有进一步检测这些衍生物的抗肿瘤活性。张万金等人发现，在C9-O位置引入侧链可以显著增强黄连素与DNA的结合能力，然而，这些衍生物并不能增强黄连素的抗肿瘤作用[6]。因此，旨在提高黄连素抑癌活性的结构改造可能并不适合以其与DNA的结合能力作为改造的判据。在另一研究中，在C9-O位置引入亲脂性基团可以将黄连素体外抑制肿瘤细胞生长的能力提高104倍，推测可能与其对细胞膜的亲和力增强有关，但这也将造成黄连素更差的水溶性和生物利用度，不利于黄连素在体内发挥抑癌作用。

[0005] 总之，由于黄连素的分子靶点不清楚，目前的改造比较盲目和随机，特别是在抗肿瘤活性方面的改造并未取得较好的进展。因此，只有找到黄连素的直接靶点，才能对黄连素进行理性而高效的设计、改造以及系统性的验证。

[0006] 参考资料：

[0007] [1]Xin  HW,Wu XC,Li Q,et al.The effects  of berberine on the pharmacokinetics of cyclosporin A in healthy volunteers[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2006,28(1):25-29。

[0008] [2]Qiu W,Jiang XH,Liu CX,Ju,et al.Effect of berberine on the pharmacokinetics of substrates of CYP3A and P-gp[J].Phytother Res,2009,23(11):1553-1558。

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[0010] [4]Sheng WD,Jiddawi MS,Hong XQ,et al.Treatment of chloroquine-resistant malaria using pyrimethamine in combination with berberine,tetracycline or cotrimoxazole[J].East Afr Med J,1997,74(5):283-284。

[0011] [5]Peng WH,Hsieh MT,Wu CR.Effect of long-term administration of berberine on scopolamine-induced amnesia in rats[J].Jpn J Pharmacol,1997,74(3):261-266.

[0012] [6]张万金.小檗碱衍生物的设计合成及其抗肿瘤和菌活性研究[D].广东中山大学,[博士论文],2007。

[0013] 本发明的目的在于提供一种黄连素衍生物XMU-Ber122。

[0014] 本发明所述黄连素衍生物XMU-Ber122的化学结构式为：

[0015]

[0016] 通过对黄连素进行改造，获得的化合物XMU-Ber122在RXRα的转录激活活性、溶解度、

[0017] 结肠癌细胞抑制活性三方面均优于黄连素。

[0018] 所述黄莲素的化学结构式为：

[0019]

[0020] 为了获得一种与黄连素相比，视黄醇受体RXRα转录激活活性更高、抗肿瘤活性更优、溶解度更好的黄连素结构类似物，命名为XMU-Ber122。

[0021] B-122是化合物XMU-Ber122的简称，BBR是黄连素的简称。

[0022] 与黄连素相比，XMU-Ber122在DMSO中的溶解度是黄连素的22倍；在水中的溶解度是黄连素的6倍。

[0023] 与黄连素相比，50μM浓度条件下，XMU-Ber122在结肠癌细胞KM12C细胞中视黄醇受体RXRα转录激活活性是同等条件黄连素的1.7～1.8倍。

[0024] 与黄连素相比，50μM浓度条件下，XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C细胞增殖抑制能力均优于黄连素。

[0025] 与黄连素一样，XMU-Ber122对结肠癌细胞的增殖有抑制作用，而对结肠上皮细胞NCM460无抑制作用。这说明，经过改造后，XMU-Ber122仍保留有黄连素的肿瘤选择性。

[0026] 与黄连素相比，50μM浓度条件下，XMU-Ber122在结肠癌细胞KM12C细胞中，在促进RXRα与β-catenin的结合方面，XMU-Ber122是黄连素的1.42倍。

[0027] 所述黄连素能够作为一种新型激动剂靶向RXRα，从而抑制结肠癌的细胞增殖。更重要的是，黄连素能通过RXRα的介导选择性抑制肠癌细胞的生长，而对正常肠上皮细胞的影响很小。尽管与临床治疗癌症的RXRα的天然配体9-cis-RA相比，黄连素激活RXRα的能力虽仍有差距，但其具有很好的安全性和选择性，因而通过针对黄连素的直接靶向RXRα进行理性设计和改造，利用全合成的策略对黄连素进行“定点突变”，以实现一些官能团的增加或敲除，合成一种新的黄连素衍生物XMU-Ber122。利用基于哺乳动物单杂交体系的双荧光素酶报告基因检测，分析XMU-Ber122对RXRα转录激活活性的影响；MTT比色法及Edu检测法测试衍生物对人结肠癌细胞增殖的影响；辅以哺乳动物双杂交系统，检测衍生物对RXRα和β-catenin结合产生的作用。结果证明，发现XMU-Ber122在RXRα转录激活活性、溶解度、抗肿瘤活性三方面均优于黄连素。附图说明

[0028] 图1为在结肠癌细胞KM12C中黄连素及XMU-Ber122对RXRα、RXRE转录激活活性的影响。

[0029] 图2为KM12C人结肠癌细胞中共转染pGL3-RXRE和pRL-tk报告基因质粒24h后分别孵育黄连素、XMU-Ber122处理15h最后进行双荧光素酶报告基因表达分析。

[0030] 图3为MTT法测定黄连素及XMU-Ber122对结肠癌KM12C细胞增殖能力的抑制作用。

[0031] 图4为EdU法测定黄连素及XMU-Ber122对结肠癌KM12C细胞增殖能力的抑制作用。

[0032] 图5为黄连素的结肠癌选择性。

[0033] 图6为XMU-Ber122的结肠癌选择性。

[0034] 图7为哺乳动物双杂交实验证明黄连素及XMU-Ber122能促进RXRα与β-catenin的结合。在KM12C人结肠癌细胞中，共转染pAct-RXRα、pBIND-β-catenin/33Y和pG5Luc报告基因质粒24h后，分别孵育黄连素、XMU-Ber122处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析，每组数据以Mean±SEM表示。

[0035] 下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。

[0036] 实施例1、黄连素及XMU-Ber122的溶解度评估

[0037] 通过观察新合成的黄连素衍生物XMU-Ber122，并与黄连素作对比，总结如表1所示，二者在物理属性上既有相同点，又有差异。第一，在结构上，二者的整体架构一致，均具有异喹啉并二氢异喹啉四环结构，分子内存在一个季铵盐单元以及两个烷氧基取代的苯环；不同的是，黄连素C2、C3位为一个亚甲二氧基，XMU-Ber122仅仅在C3位保留有一个甲氧基。第二，二者固态及溶液都为黄色，黄连素颜色比XMU-Ber122稍微深一些。第三，在溶解度方面，以DMSO为溶剂时，XMU-Ber122的完全溶解时间是黄连素的二十二分之一，我们可以保守地认为，XMU-Ber122的溶解度(DMSO)提高了20倍；以灭菌双蒸水为溶剂时，XMU-Ber122的完全溶解时间是黄连素的六分之一，我们可以保守地认为，XMU-Ber122的溶解度(水)提高了5倍。因此，我们得出结论，改造后的黄连素衍生物XMU-Ber122的溶解度比黄连素高了至少5倍，是溶解度更好的化合物。

[0038] 表1

[0039]

[0040] 实施例2、黄连素及XMU-Ber122在结肠癌细胞KM12C中视黄醇受体RXRα、RXRE转录激活活性的测定

[0041] 采用荧光素酶双报告基因实验测定黄连素及XMU-Ber122在结肠癌细胞KM12C中视黄醇受体RXRα转录激活活性。具体步骤如下：(1)用MEM完全培养基(货号Gibco，61100061，添加10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1mM维生素、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，1.5g NaHCO3/L)，在CO2培养箱中37℃、5％CO2、95％饱和湿度的条件下培养结肠癌细胞KM12C。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为104个/mL，传代到24孔细胞培养板中，每孔细胞数为20万细胞左右，待细胞密度达到85％时进行转染。具体转染过程如下：转染前将培养液换成细胞用 (Gibco，31985070)无血清培养基。在1.5mL离心管中分别配制以下两种溶液：①稀释1～2μg质粒于100μL无血清OPTI-MEM中；
②稀释2～8μL Lipofectamine 2000于100μL无血清OPTI-MEM中，室温放置5min。轻轻混匀两种溶液，室温放置20min，使质粒---脂质体复合物形成；再次混匀，然后缓慢均匀加到培养液。4～6h后，更换新鲜的MEM完全培养液。(2)待转染48h后，换成含有浓度分别为0、25、50μM的黄连素、XMU-Ber122的MEM无血清培养基培养15h左右；(3)弃去培养液，用500μL预冷的PBS清洗细胞两次，吸尽PBS；(4)然后向每孔中加入100μL 1×Passive lysis buffer。4℃放置1h裂解细胞；(5)用Dual-Luciferase  Assay System试剂盒测定进行荧光素酶报告基因的检测，取50μL细胞裂解上清液，避光条件下加入100μL荧光素素酶底物LAR II，迅速混匀，使用酶标仪(Bio-Tek)的自发光检测系统Luminescence检测萤火虫荧光素酶的活性。然后依然在避光条件下加入100μL Stop& 试剂，振荡混匀，用酶标仪(Bio-Tek)的自发光检测系统Luminescence检测海肾荧光素酶的活性。每个实验重复三次并取平均值作为实验结果。采用数理统计学软件Origin7.0进行统计学分析。

[0042] 结果如图1和2所示：通过在KM12C人结肠癌细胞中转染pBind-GAL4-RXRα/LBD和内参pG5Luc质粒24h后，加入黄连素和XMU-Ber122处理15h后，检测荧光素酶报告基因的激发程度，发现，这两种化合物均能显著提高RXRα/LBD的转录激活活性；并且，在50μM浓度条件下，XMU-Ber122对RXRα/LBD的转录激活活性的提高作用是黄连素的1.83倍左右，并呈显著性差异。通过在KM12C人结肠癌细胞中共转染pGL3-RXRE和pRL-tk报告基因质粒24h后，加入黄连素和XMU-Ber122处理15h后，检测荧光素酶报告基因的激发程度。结果发现，在结肠癌细胞KM12C中，黄连素及XMU-Ber122均能增强启动子中含RXRE的荧光素酶报告基因的转录水平，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，促进作用越强，表明黄连素和XMU-Ber122都能激活内源RXRα的转录激活活性，同时，二者相比，在50μM浓度条件下，XMU-Ber122对RXRα/LBD的转录激活活性的提高作用是黄连素的1.71倍左右，并呈显著性差异。每组数据以Mean±SEM表示。其中图1为KM12C人结肠癌细胞中，共转染pBind-GAL4-RXRα/LBD和内参pG5Luc报告基因质粒24h后，分别孵育黄连素、XMU-Ber122处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析；在结肠癌细胞KM12C中，黄连素及XMU-Ber122对RXRα、RXRE转录激活活性的影响。其中图1为KM12C人结肠癌细胞中，共转染pBind-GAL4-RXRα/LBD和内参pG5Luc报告基因质粒24h后，分别孵育黄连素、XMU-Ber122处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析；图2为KM12C人结肠癌细胞中，共转染pGL3-RXRE和pRL-tk报告基因质粒24h后，分别孵育黄连素、XMU-Ber122处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析；每组数据以Mean±SEM表示。

[0043] 实施例3、黄连素及XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C增殖能力的影响

[0044] 3-1.采用MTT法考查黄连素及XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C的增殖抑制作用[0045] 用MEM完全培养基(货号Gibco，61100061，添加10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1mM维生素、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，1.5g NaHCO3/L)，在CO2培养箱中37℃、5％CO2、95％饱和湿度的条件下培养结肠癌细胞KM12C。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为104/mL，到96孔细胞培养板中，每孔细胞数为104左右，培养过夜。待细胞贴壁后弃去原培养基，根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，即无药物细胞对照组、溶剂(DMSO)对照组、黄连素组(12.5、25、50μM)、XMU-Ber122组(12.5、25、50μM)。每孔的最终细胞培养液的体积为200μL。每组设5个重复，继续培养15h。接着，用pH 7.4的PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)洗涤2次，每孔加入20μL的
5mg/mL MTT和180μL新鲜的MEM完全培养基，继续培养细胞4h后，弃上清液。每孔加入200μL DMSO，在37℃条件下，震荡10分钟，使蓝紫色结晶甲臜完全溶解。以630nm为参考波长，立即用Bio-Rad酶标仪Model 680测定490nm光吸收值。每次实验均取同一传代细胞。按下式计算抑制率：抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％。

[0046] 结果如图5所示：黄连素及XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C都有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强。另外，同一浓度下，黄连素和XMU-Ber122的肿瘤抑制作用进行平行对比，发现，在6.25、12.5、25、50μM浓度条件下，XMU-Ber122对结肠癌细胞的增殖抑制作用均优于黄连素，且呈显著差异性。

[0047] 3-2.EdU试剂盒检测法

[0048] 采用EdU试剂盒检测法考查黄连素及XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C的增殖抑制作用：

[0049] (1)细胞培养：取对数生长的结肠癌KM12C细胞，以每孔10000个接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

[0050] (2)药物处理：待细胞贴壁后弃去原培养基，根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，即无药物细胞对照组、溶剂(DMSO)对照组、黄连素组(6.25、12.5、25、50μM)、XMU-Ber122组(6.25、12.5、25、50μM)。每孔的最终细胞培养液的体积为200μL。每组设5个重复，继续培养15h。

[0051] (3)EdU标记：

[0052] 用MEM完全培养基稀释EdU溶液，制备适量的50μM EdU培养基；每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2h，弃去培养基。

[0053] (4)细胞固定

[0054] 每孔加入100μL细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min；每孔加入2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃去甘氨酸溶液；每孔加入100μL PBS，脱色摇床清洗5min，弃去PBS；向每孔加入100μL渗透剂(0.5％Trition X-100的PBS)脱色摇床孵育10min；PBS清洗1次，5min。

[0055] (5)Apollo染色

[0056] 每孔加入100μL的1*Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后弃染色反应液；加入100μL渗透剂脱色摇床清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂；每孔每次加入100μL甲醇清洗2次，每次5min；PBS清洗1次，5min/次。

[0057] (6)DNA染色

[0058] 用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量的1*Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μL 1*Hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；每孔每次加入100μL的PBS清洗3次。

[0059] (7)图像获取及分析

[0060] 染色完成后，立即进行观测和统计。

[0061] 结果如图6所示，黄连素及XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C都有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强。另外，同一浓度下，黄连素和XMU-Ber122的肿瘤抑制作用进行平行对比，发现，在12.5、25、50μM浓度条件下，XMU-Ber122对结肠癌细胞的增殖抑制作用均优于黄连素，且呈显著差异性。

[0062] 实施例4、黄连素及XMU-Ber122的肿瘤选择性

[0063] 具体实施方法同实施例2，采用MTT法考查黄连素及XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C、结肠上皮细胞NCM460增殖的影响。实验结果如图7所示，黄连素及XMU-Ber122对结肠癌细胞KM12C都有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强。并且，XMU-Ber122的抑制作用比黄连素更为明显，在25、50μM浓度时均优于黄连素的效果，且呈显著性差异。

[0064] 相比之下，在25μM时，黄连素及XMU-Ber122对结肠上皮细胞株NCM460的增殖基本无抑制作用；在50μM时，二者对结肠上皮细胞株NCM460的增殖有抑制作用，但效果都不及对结肠癌细胞KM12C的抑制作用。这样的结果显示，黄连素、XMU-Ber122对正常结肠上皮细胞的损伤作用较小，说明我们改造出的衍生物XMU-Ber122保留了黄连素本身所具备的低毒、高选择性等优势，可以让药物在发挥抗癌功效的同时，最大程度的减少对正常结肠细胞的损伤。同时，也提示我们，在以后XMU-Ber122的开发应用中可以对用药浓度进行一定浓度范围内的临床摸索，便于降低临床用药毒性，提高临床用药效果。

[0065] 实施例5、哺乳动物双杂交实验证明黄连素及XMU-Ber122促进结肠癌细胞KM12C中RXRα与β-catenin的结合，从而抑制结肠癌细胞的增殖

[0066] 具体实验方法同实施例1。实验结果如图3和4所示，为了检测黄连素及XMU-Ber122能否通过以RXRα配体结合的方式促进RXRα与β-catenin的结合，我们在结肠癌细胞KM12C中，共转染质粒pAct-RXRα、pBIND-β-catenin/33Y和pG5Luc报告基因质粒24h后，分别加入黄连素、XMU-Ber122处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析。如图3和4所示，黄连素、XMU-Ber122都能增强RXRα与β-catenin的结合，并呈浓度依赖性，药物浓度越高，促进作用越强；同时，在50μM浓度条件下，XMU-Ber122对RXRα/LBD的转录激活活性的提高作用是黄连素的1.42倍左右，并呈显著性差异。