市购的人工移植骨通常由磷酸钙陶瓷(人骨骼的主要无机材料)制 成并且具有与人类松质骨类似的多孔结构。它们中的大多数实际上源 于动物(小牛)或海洋生命(海珊瑚)。它们打算提供一种互接的大孔结构 并且提供加强的骨骼传导性以便使自身骨骼组织再生和恢复。但是， 它们都没有提供与自体移植物的黄金标准等同的生物力学和骨骼整合 特性。
这些人工移植骨通常具有一种直径通常为100-500μm的互连大孔 结构，该结构为自身骨骼再生提供一种构架同时减少了恢复时间。多 孔结构的孔尺寸对于骨骼传导性而言是重要的。根据活体外和活体内 试验，骨骼组织向内生长的适当孔隙直径为200-300μm，如果孔隙 直径小于100μm，则骨组织会积累在该表面上而不会出现骨骼向内生 长。在植入之后，移植骨应该缓慢地降解并且由生长的骨骼所代替。 它应该导致通过受者的自身生骨活动在有缺陷的骨骼位置处进行骨骼 更新。但是，降解需要骨替代材料是微孔的，其孔隙直径为1-5μm。 “可降解”移植骨的溶解过程以两个步骤进行：烧结颗粒中的颈部的 细胞外溶解和这样分离的颗粒的细胞内吞噬作用。第一步骤在退火的 生物陶瓷块中是不可能的并且在那些具有厚连接壁的多孔人工移植骨 中非常困难，因为没有任何小颈部可以让这些细胞侵袭。
市购的人工移植骨通常具有随机分布的孔隙直径并且没有任何互 连的多孔结构的可观察到的优选取向。该结构有可能在活体内一段时 间之后防止血管发育，并且移植骨的中间通常保持没有骨骼。虽然大 多数市售移植骨具有与活体骨骼的矿物质相相似的化学组分，但是该 移植骨不适用于大型用途或者作为永久的替代物，因为营养成分不能 在手术之后流动穿过该人工多孔移植骨。

本发明提供一种新颖的制造方法，该方法生产出一种独特且非常 柔性的多孔结构。在最终产品中不必包含任何生物材料。它可以模仿 大型人类松质骨，并且孔隙直径可以从几个微米变化到几个毫米。该 方法能够得到可控的孔隙直径、形状和孔隙取向。可以提供大量尺寸 不同的互连管状孔(具有优选的取向)来迅速地通过整个结构来引导骨 骼向内生长和血管发育。该孔隙结构可以具有薄壁，从而使得造骨细 胞能够很容易附着并且刺激矿化作用。移植骨的尺寸和形状通过模制 方法来调节，或者可以通过整形外科医生在手术过程中通过工具例如 金刚石砂轮或高速钻来成型。
根据本发明，提供一种用于制备人工骨的方法，该方法包括：
(i)在惰性液体中制备出细分的生物相容陶瓷粉末、有机粘合剂和 造孔剂的混合物以形成主体，并且使得造孔剂中的至少一些沿着共同 轴线排列；
(ii)任意地使所得到的主体成型；
(iii)使得造孔剂在主体中形成多孔结构；
(iv)将成型的主体加热到足以使多孔结构定型的温度；并且
(v)进一步加热所述主体以消除残余的有机粘合剂和造孔剂并且使 它熔化。 本发明的详细说明
在已经对本发明进行了简要说明之后，现在将参照附图对本发明 进行说明，该附图显示出本发明的典型方法的流程图。
该方法的主要成分是生物相容陶瓷粉末、有机粘合剂和造孔剂。 陶瓷粉末可以是任何生物相容的陶瓷材料。例如，它可以是机械陶瓷， 从而所得到的人工移植骨具有足够的强度。可以使用的材料包括氧化 锆和氧化铝。但是，优选使用一种磷酸钙陶瓷材料。虽然可以为此使 用包括α-磷酸三钙(TCP)、β-TCP和羟基磷灰石(HA)Ca10(PO4)6(OH)2在内的所有医用级磷酸三钙，对于大型工件而言优选使用HA，因为它 更稳定。可以使用生物相容材料的混合物，例如磷酸钙陶瓷和氧化铝 或氧化锆的混合物。另外，可以在粉末中加入少量例如5％重量百分比 的硅石和有机锌化合物以提高其骨传导性。
优选的是，陶瓷粉末均匀地分散。颗粒越小，则表面积以及颗粒 被液体润湿的可能性越大；这也有利于最终烧结。一般来说，粉末不 会超过大约为100微米的平均直径。因此，优选的粉末将具有1nm-50 微米的平均粒径，例如为0.1-10微米。
有机粘合剂必须将陶瓷粉末粘结在一起以形成一种密实的结构， 并且在每个陶瓷颗粒与保持有惰性液体的间格处的间隙之间具有许多 接触点。有机粘合剂的精确特性不是严格的，只要它不会在烧制时留 下残余物；它通常为固体。已经发现，碳水化合物粉末尤其有用，特 别是玉米粉或小麦粉，但是也可以使用其它有机材料例如自然提取的 淀粉。本领域普通技术人员将知道可以使用什么样的可选材料。粘合 剂应该以粉末的形式结合进浆液中。
造孔剂用来在由陶瓷粉末和粘合剂形成的主体中形成孔。这通常 是通过从造孔剂中散发出气体来实现的。合适的造孔剂包括微生物例 如真菌如酵母细胞，以及源于磷和碳的酸的无机盐尤其是碱金属盐例 如磷酸和碳酸的钠盐。具体的实施例包括二磷酸二钠(disodium diphosphate)和碳酸氢钠。
浆液在惰性液体中形成，即该液体必须在室温下既不会与造孔剂 反应也不会与陶瓷粘合剂反应。通常，惰性液体为水，尤其是去离子 水，但是也可以使用有机液体例如乙醇。
在步骤(i)的优选实施方案中，首先制备出陶瓷粉末的浆液，然后 将有机粘合剂和造孔剂加入其中(在图中的步骤1和2)。但是，也可以 将陶瓷粉末、有机粘合剂和造孔剂混合在一起，然后加入液体溶剂。 在优选的实施方案中，首先通过将磷酸钙与水或其它惰性液体混合来 制备出磷酸钙陶瓷浆液。为了有助于分散，优选加入分散剂以确保陶 瓷粉末在整个浆液中均匀地分散。为此可以使用的典型分散剂包括酸/ 碱溶液和聚合物例如磷酸盐和丙烯酸酯聚合物。优选的分散剂包括氨 水、磷酸例如正磷酸、或丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物的铵盐例如 聚丙烯酸铵和聚甲基丙烯酸铵。
然后优选任意选用磨料例如氧化铝、不锈钢或碳化钨小球或圆柱 来研磨该浆液。这些磨料在研磨之后当然要被除去。
在优选的实施方案中，在通常带有橡胶壁的圆筒碾磨机中进行研 磨。通常密封的滚筒碾磨机能够以低速转动几个小时以形成高密度并 且分散良好的陶瓷浆液。通常优选的是，研磨操作花费至少1个小时 至50个小时以便使粉末的尺寸优化。要理解的是，在浆液中的粉末尺 寸可以决定孔隙的尺寸，因为该多孔结构实际上是一系列密实的不规 则陶瓷颗粒，在该方法的最后步骤期间这些颗粒熔合到它们相邻的颗 粒上。
之后通常将碳水化合物粉末和造孔剂逐渐加入到浆液中以形成所 述的高粘性弹性材料。优选的是，在密封的氧腔室中进行混合以便确 保所混合的材料是富含氧以供造孔剂反应使用。可以理解的是，尽管 造孔剂的量控制了最终产品的整体孔隙度，但是粘合剂的数量决定了 混合物的的弹性性能。
可以理解的是，在步骤(iii)中使用的精确条件将取决于造孔剂 的特性。因此，如果使用了酵母，则通常需要有营养物例如少量糖来 刺激新陈代谢从而产生二氧化碳。一般来说，升高主体温度将使得造 孔剂反应，从而导致气体散发。造孔步骤可以通过提高温度和/或压力 来加速，但是要理解的是，应该注意要确保将该温度保持在会杀死酵 母的温度以下。一般来说，28-30℃的温度将使得酵母形成孔。但是， 已经发现如果使用更大量的酵母的话，则可以容忍更高的温度例如40 ℃-一些酵母保持活着。孔隙直径在很大程度上由温度和所使用的造孔 剂量决定。使用密封的氧气腔室有助于该方法的再现性，但是当然也 可以只在空气中进行混合。
所使用的陶瓷粉末数量通常应该尽可能地高。通常，采用80wt％ 的陶瓷粉末、19wt％的碳水化合物和大约1wt％的酵母。因此一般来说， 使用50-90wt％的陶瓷、5-50wt％的粘合剂以及0.5-5wt％优选为0.5-3wt％ 的造孔剂。显然，所使用的造孔剂的精确量取决于该试剂的特性。
还要理解的是，假如还有足够的造孔剂，则孔隙直径随着时间将 增加。理想的是，孔隙直径应该大约为200-300微米。如果孔隙直径比 这个数值小得多的话，则就不够造骨细胞向内生长。另外，如果要求 以任意方式填满孔隙的话，则如下所述它们应该稍微比理想尺寸更 大，因为否则这些孔就不能保持这些分子。
要理解的是，主体在这个阶段处采取一种面团状外形，即它保持 着其形状。
优选的是，在任意成型步骤(ii)之前，将该产品转移到挤出机或 其它装置以为成型步骤提供必要的形状和尺寸(在图中的步骤3)。挤出 步骤的目的在于在最终的多孔结构中形成所要求的多孔状和取向。通 过使用不同的挤出力和不同形状的前模，该材料可以成形为具有所要 求排列的任意几何形状，例如在垂直或水平平面中的线性中空管、交 联矩阵或螺旋形式的孔。要理解的是，造孔剂将沿着挤出方向延伸并 且最终形成所要求的孔取向，即沿着共同轴线排列。显然，主体必须 具有足够的粘性如在一种面团状主体中的一样以便可以进行这种排 列。有时这可以只通过拉伸来实现。要理解的是，可以形成在使用良 好连接孔的微生物方面的特定优点。相反，化学试剂通常提高没有良 好连接的孔隙。
虽然挤出步骤对于形成模仿的松质骨或骨密质结构而言不是必要 的，但是如果人工移植骨要用在承受负载的用途中的话，则它通常是 必要的。这是因为，天然承重骨例如股骨和髋关节的矿物组份具有一 种管状结构而不是简单的松质骨结构。该管状多孔结构的取向将产生 负载应力分布，这导致承重骨比肋骨更坚固。
然后使该混合物任意成型(在图中的步骤4)。优选的是，在一个优 选密封的模具中使它成型。模具的三维尺寸形状可以采用计算机辅助 医学成像分析技术来设计，从而该形状可以复制病人的失去的骨结 构。一旦已经将主体密封在模具中，则可以升高模具的温度以便使得 造孔剂能够反应并且形成孔隙。要理解的是，由造孔剂的膨胀所产生 的力挤压着陶瓷粉末的质量。造孔剂的量与处理时间和处理温度一起 决定了最终产品的孔密度和机械强度。在优化的处理温度下完成该反 应所需要的总时间根据主体的尺寸通常为30-90分钟，优选为40-60 分钟，尤其优选大约为45分钟。
在步骤(iv)之前，如果使用水作为惰性液体的话，则优选将主体 的温度降低到水的冰点以下(在图中的步骤5)。优选的是，将密封模具 的温度降低到大约-5℃至液氮温度。冷冻步骤可以防止造孔剂进一 步反应。由水形成冰而导致的膨胀进一步提高了主体的多孔结构。然 后可以从该模具中除去该冷冻的试样。
然后，一般来说必须从主体中通常通过蒸发除去部分液体。这可 以在真空腔室中实现，期间水或其它液体从表面蒸发出来并且穿过该 密实体的水静压梯度形成用于使液体移动的驱动力。该液体从主体的 内部通过多孔通道流向表面，从而产生更均匀的压力。实际上，处理 温度、温度上升的速度、真空压力和升华过程的持续时间取决于主体 的尺寸和形状以及所采用的液体的特性。这些可以由常规试验来确 定。
步骤(iv)的目的在于使工件稳定(图中的步骤6)。为此，通常要求 预先加热其中安放有工件的氛围(它可以干燥或润湿)，通常为优选受 到湿度控制的炉子。例如100、130或150至230℃的温度对于稳定化而 言通常是适合的。一般来说，可以在1个小时内通常为5-50分钟例如 15-45分钟实现稳定化。已经发现，使用蒸汽是有利的，因为它通常 会引起有机粘合剂的聚合而不会在试样的表面上形成微小裂纹，这种 微裂纹可以由直接加热方法所引起。这些裂纹在进一步退火处理期间 会保留或加深并且因此大大地减低了生产率。
一旦主体已经稳定，需要的话对它进行机加工以消除任何不均匀 的毛边和/或调节工件的最终几何形状，从而使它与人工移植骨的所要 求形状相一致。
在步骤(v)中，对工件进行加热或烘焙，从而除去粘合剂以及任何 残留的造孔剂。一般来说，为此需要400-1000℃的温度。但是，这 确实在一定程度上取决于所使用的粘合剂量以及所施加的加热速度。 由于这个加热步骤通常导致产生含碳气体，因此要理解的是，加热应 该缓慢地进行以使得这些气体能够通过相互连通的多孔通道从人工骨 中分散出。如果这没有完成，则聚集的气体会形成足以对密实多孔结 构造成内部损坏的压力。一般来说，加热速度应该不超过10℃/分钟， 通常不大于5℃/分钟，并且为了得到大试样可以尽可能低到1或2℃/分 钟。
除去粘合剂的步骤通常在不再看到有含碳气体从该工件中出来时 完成。
优选的是，在这个加热步骤之后，然后在高温下通常为大约1200 —约1450℃下对试样进行退火或烧结，以便实现必要的生物机械强度 和生物相容性(在图中的步骤7)。同样，加热的温度和持续时间取决于 试样的尺寸和最初的陶瓷浓度。应该注意不要采用太高的温度，因为 这会引起这些小的相互连通的孔隙熔合，因此大孔开始隔离。
在一些情况中，该产品虽然对于一些用途而言强度足够但是对于 其它用途而言则强度不够。已经发现，可以通过将产品浸入在由陶瓷 粉末形成的陶瓷浆液通常为磷灰石中来提高它的强度，但是它不必与 最初所使用的一样。该浆液还应该包含与最初所使用的相同或不同形 式的分散剂。理想的是，该浆液在使用之前应该进行碾磨以便减小颗 粒尺寸，例如平均尺寸从5μm降至1μm。可以使该浆液静置例如一个 半小时以便使得大颗粒能够沉淀。从所形成的悬浮液中倒出例如平均 尺寸小于0.2μm的适当颗粒。
浸入通常应该持续至少0.5个小时，同时持续地对该浆液进行搅 拌。之后，最好使该浆液沸腾直到不再有任何气泡从该试样中逸出。 根据试样的尺寸，这通常需要10分钟-1个小时。该过程确保试样的 微孔被磷灰石颗粒填满。可以采用通过相互连通的大孔结构进行的离 心分离处理(例如速度为2500rpm-15000rpm)来除去任何多余的浆液和 磷灰石颗粒。这个进入步骤在必要时可以重复进行。之后，使该试样 再次进行退火步骤。
改善多孔结构的机械强度的另一种方法在于用聚合物优选为可生 物降解的聚合物例如聚己内酯(PCL)来将它加强；该聚合物作为填充 剂。为此，使该聚合物溶解在溶剂中以形成10-50wt％通常为20-40wt ％的浓度，然后将该主体浸入在它中5分钟至1个小时例如20分钟。然 后取出该主体并且进行离心分离以除去多余的溶液。然后最好对这些 试样进行加热以使得任何阻塞这些孔的聚合物熔化。该过程在必要时 可以反复进行。
在本发明的一个优选实施方案中，该人工骨的一些或所有孔可以 用作具有受控释放机构的药物输送系统。这通常可以通过将人工骨浸 入在具有所要求的细胞生长因子或药物的溶液中来实现。
目前，还没有任何有效的药物输送机构来将工程高分子量蛋白质 或酶输送进骨骼中。这可以通过本发明来实现，因为移植骨的尺寸可 以进行调节以适应该分子。因此，这样结合的高分子量工程蛋白质或 酶从移植骨中释放出以刺激骨骼向内生长，并且多孔矩阵可以引导造 骨细胞进行增殖和分化。因此，可以将包括转化生长因子(TGF-β1)、 骨骼形态形成蛋白质(BMP-2)和生骨蛋白质(OP-1)在内的用于骨骼向内 生长的生长因子以这样的方式结合进本发明的人工骨中。
可以结合的其它材料包括维生素例如维生素D和微量矿物质例如 可以以盐的形式结合的锌。
在一个优选实施方案中，这些分子可以与可生物降解聚合物一起 结合进这些孔中。该可生物降解聚合物有助于将活性分子固定在这些 孔中同时改善该人工骨的强度。
为此可以使用的适当的可生物降解聚合物包括淀粉通常为玉米淀 粉，或其他天然聚合物，或这些聚合物与例如聚乙烯或聚(乳酸)或 聚(乙醇酸)的混合物。一般来说，非天然形成的组分含量应该较低 以避免出现任何可能的负面生物效果。但是可以使用淀粉和50wt％的 低密度聚乙烯的混合物。
通过浸入从这些材料的溶液中提供活性化合物以及可生物降解的 聚合物(如果使用的话)。给人工移植骨施加轻微的真空是有用的，因 为它增加溶液的吸收。
如果进行这个浸入步骤几次的话，则可以相当显著地提高人工骨 的强度。通常可以通过离心分离来除去过多的可生物降解聚合物。
因此，要理解的是，本发明的人工移植骨可以用作用于生物体外 组织工程自体移植的3-D构架。
该方法的制造成本通常比现有的方法低得多，并且制造时间通常 比其他方法更快。在正常的情况中，甚至可以在24小时以内生产出形 状不规则的大型试样。因此，可以使它有序。例如，在上颌面手术之 前，可以根据病人的三维骨架扫描图像来形成移植骨的所要求形状。 因此，可以为每个病人单独形成移植骨。
以下实施例是本发明的示例说明。
实施例1
使用颗粒尺寸为0.6-1μm的市购医用羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2粉 末(ASTMF118588)来生产人工多孔移植骨。第一步骤是制备出这样一 种浆液，其中的组分有：
160克羟基磷灰石粉末
70毫升去离子水
2克聚丙烯酸铵
首先用调刀在塑料容器中将这些组分均匀混合。当已经形成均匀 的溶液时，用双刀搅拌器以大约1200rpm的速度进行机械搅拌5分钟。 这制备出大约115ml的浆液。然后将该浆液倒进圆筒碾磨机以便使凝 块进一步分散；这是一种聚乙烯烧瓶，10cm长并且直径为6cm，装有 100cm3的高密度小Al2O3圆柱体。该圆筒碾磨机密封并且以120rpm的 速度转动30分钟以形成一种均匀的浆液。
然后将70克细小的筛选小麦粉和7克酵母细胞逐渐加入到该浆液 中并且在混合器中打烂以形成可使用的塑料混合物。
A.没有进行挤出的试样
然后在没有挤出成型的情况下将该混合物等分，并且将它们放在 四个涂有特氟隆的没有密封的有盖培养皿中。然后将这些有盖培养皿 转移到处于28-30℃下的温度受控的恒温箱中。在恒温箱中的时间从 15分钟到1个小时分四次，并且每次具有15分钟的增量。在每个阶段 的最后，将其中一个有盖培养皿逐渐减低到液态氮的温度以使生物反 应停止并且准备下一步处理。
随后在温度为20℃并且压力为10-1至10-3mmHg的冷冻干燥室中 用2个小时从试样中除去多余的水分。然后在温度为200℃的炉子中使 被干燥的试样稳定30分钟。然后以每分钟5℃的速度将这些被格式化 的试样在炉子中逐渐加热并且保持在1000℃下以除去有机添加剂。随 后，在1250℃下对这些试样进行退火并且以每分钟5℃的速度逐渐冷 却到室温。
对每个烧结试样的多孔结构所进行的光学显微镜检测表明它们所 有都具有几乎与人松质骨等同的多孔结构。如在表1中所示一样，孔 和相互连通的孔隙直径随着保温时间而逐渐增加。     时间   孔隙直径     互连孔隙直径     15分钟   50-100μm     平均直径40μm     30分钟   300-500μm     平均直径200μm     45分钟   800-1000μm     平均直径400μm     60分钟   2000-3000μm     平均直径1000μm
B.通过挤出
在混合过程之后，通过挤出单元使混合物前进以形成圆柱形试 样。挤出单元的前模是两个相连的圆筒，其直径对于第一阶段和第二 阶段而言分别为5cm和3cm。将孔眼为3mm的钢网安装在第二阶段圆 筒的两个端部上。然后将该被挤出的混合物放在涂有特氟隆的没有密 封的板上。然后将该板与其混合物一起转移到温度为28-30℃的温度 受控的恒温箱中30分钟。然后，将该混合物转移到温度为-5℃的制冷 器中2个小时，随后在温度为20℃并且压力为10-1至10-3mmHg的冷冻 干燥室中用两个小时从试样中升华多余的水分。格式化、烧制和退火 处理与在部分A中所述的一样。该试样显示出一种均匀的管状多孔结 构，其孔隙直径为长800-1000μm并且平均直径大约为200μm。平均 直径大约为200μm的互连孔在这些管状大孔的端部处连接。该结构对 于骨骼向内生长和血管发育的引导而言是理想的。
C.通过密封的模制
挤出方法与在部分B中所述的一样。但是，在挤出过程中除去钢 网。将挤出的圆柱形试样转移到密封的圆筒形模具中。保温过程和升 华过程与在部分B中所述的那些一样，并且格式化、烧制和退火过程 与在部分A中所述的那些一样。该试样的横断面呈现出一种与人长骨 相似的结构。一种密实结构形成这些试样的外壳；它包括一种由以同 心层布置的Ca/P陶瓷制成的硬质、实际上为实心的物质。在这些试样 的中间发现与在松质骨/海绵骨中所发现的类似的多孔结构；该孔隙直 径逐渐减小并且最终与密实结构连接。
实施例2
将在实施例1B中所获得的多孔HA制品的试样浸入在平均颗粒尺 寸为0.2μm的沸腾HA浆液中。浸入时间为30分钟-90分钟，并且具有 30分钟的间隔，而且要不断地搅拌该浆液。之后，通过离心分离过程(速 度为2500-15000rpm)除去多余的浆液。然后在1280℃下对这些试样进 行5小时退火。
使用装配有2.5KN的测力计和计算机遥控装置的Lloyd桌上型测试 机对这些试样进行机械测试。通过0.1mm每分钟的十字头速度将负载 施加到这些试样(平均试样接触面积为0.8cm2)上直到出现脆断。在图2 中显示出所得到的结果。可以看出，多孔HA试样的压缩强度随着浸入 时间的增加而增加。
实施例3
通过放在60℃的炉子中使6克PCL在150cc玻璃烧杯中熔融。在固 态PCL已经熔融成清澈的粘性流体之后，加入20ml丙酮以溶解PC1并且 形成液态溶液。该溶液的粘度为0.8835±0.025pas。然后将实施例1B的 多孔试样浸在溶液中并且通过将其安放在处于57℃的恒温下的热板上 而保持沸腾。
在20分钟之后，取出这些试样并且进行离心分离过程(速度为2500 -15000rpm)以从互连大孔结构中除去任何多余的溶液。然后将这些 试样放在60℃的炉子中以使在大孔结构中任何阻塞的PCL熔融，并且 重复进行离心分离过程。
进行实施例2的机械测试。所得到的结果如在图3中所示一样。可 以看出，PCL加强的HA试样具有显著增强的压缩强度。
在浸入过程之前根据ASTMC134标准测量出的测试试样的孔特性 如下：   测试的多孔HA试样的孔隙度     总体积，cm3     1.06078±0.01493     开口孔的体积，cm3     0.79737±0.01935     密闭孔的体积，cm3     0.20262±0.00596     表观孔隙度，P％     79.6589+0.28677     吸水性，A％     133.81±1.89755     表观比重     2.93957±0.03229     体积密度，g/cm3     0.59597±0.0074