产尿素酶细菌通常被用于调解可渗透物质的表面和表面下的区域。这个大家已知 的矿物堵漏过程，已被用于石油工业，因为在石油工业中，加工过的物质由于渗透性 和多孔性的降低减少了液体的流动，这样可能会增加石油从储油库中的回复和/或限 制污染物从溢出位置扩散。
矿物堵漏是由于尿素酶降解尿素得到的产物氨会增加pH值，而该pH值的增加会 引起沉淀。然而，当这些矿物堵漏减少地质层组中的裂缝和其他裂纹的多孔性/渗透 性时，水泥的强度不能满足于其他应用范围。而且，用于形成矿物堵漏过程的控制将 受到以下情况的限制：结果不一致以及该方法在许多应用中不可行。
传统的水泥用于多种结构建筑应用。但是，由于传统水泥是作为相当稠的泥浆应 用，它不适合于喷雾应用，尤其是有必要在水泥粘合的材料表面或表面下方形成水泥 接合或保持多孔性的时候，传统水泥不适合应用。
本发明通过提供一种利用产尿素酶的微生物和确定量的其他反应物生产高强度 水泥的方法，以解决上述的限制。本发明还提供该高强度水泥的各种应用。

本发明提供了一种用可渗透性原料制成高强度水泥的方法，该方法包括步骤：将 原料与以下物质的有效量混合：(i)产尿素酶的微生物；(ii)尿素；和(iii)钙离子， 所述产尿素酶的微生物的有效量在标准条件下能提供每分钟水解0.5-50mM尿素的水 解速度。
本发明方法通过在原料中产生相对高品质的方解石，能制成高强度的水泥。因此， 本发明还提供了一种用可渗透性原料制成高强度水泥的方法，该方法包括步骤：将原 料与以下物质的有效量混合：(i)产尿素酶的微生物；(ii)尿素；和(iii)钙离子，所 述水泥是由在每升原料中加入至少33g方解石而制成。
本发明方法适于反应物的重复应用。因此，本发明还提供了一种用可渗透性原料 制成高强度水泥的方法，该方法包括步骤：
(a)将原料与以下物质的有效量混合：
(i)产尿素酶的微生物；(ii)尿素；和(iii)钙离子；
(b)添加至少一种(i)到(iii)的反应物；
所述产尿素酶的微生物的有效量在标准条件下能提供每分钟水解0.5-50mM尿素 的水解速度。
本发明的优点之一是它在应用中，不会对原料产生不必要的破坏或干扰。因此， 本发明还提供了一种用可渗透性原料在原位制成高强度水泥的方法，该方法包括步 骤：将原料与以下物质的有效量混合：(i)产尿素酶的微生物；(ii)尿素；和(iii)钙 离子，所述产尿素酶的微生物的有效量在标准条件下提供每分钟水解0.5-50mM尿素 的水解速度。
本发明的另一方面是一种用本发明方法制成的水泥。因此，本发明还提供了一种 用本发明方法制成的水泥，所述水泥包含细菌细胞，且具有至少0.05-5MPa的强度。
本发明可用于制造水泥，该水泥可应用于土木工程、采矿、腐蚀控制、环境以及 特殊材料的加工。本发明尤其适用于地面改进。土木工程应用包括将本发明方法用于 护岸、筑堤(如铁路筑堤、筑坝)和地面开挖隧道时加强和稳固泥土；打地基时改善 桩的表面摩擦(把桩连接成“远声场”)；增加桩的端承载力；在原位置变硬以减少桩 设计长度；改进非桩地基土壤的承受力；以及在遇到液化危险时稳固地震带的沙滩。
本发明方法还可用于建造急需的公路，即对公路、飞机跑道等道路的自然表面或 准备好的沙子表面进行处理，并快速修理地基下面退化的公路。
本发明方法还可用于保持、修复、加强和保护建筑物上风化的灰泥和石工术，该 建筑物如遗产建筑；还可用于巩固和保存壁画中衰落的石膏；还可用于在花园中创作 建筑特色以及用人工合成的沙岩/石灰石复制装饰物。
在采矿工业中的应用包括：在开挖和采矿过程中本发明方法可为新开垦的土地提 供支持；能加强尾矿坝以防止侵蚀和坡身不稳；可提供一个有渗透性的反应屏障，该 屏障能让排出物通过，并从矿物中除去酸性物质和重金属；可结合暴露表面上的灰尘 粒以减少灰尘；在钻孔和提取过程中，本发明方法能增加对石油地上凿洞退化的抵抗 力；本发明方法能增强海上建筑物对抗重力式地基和管道内或其下面所具有的沉淀物 的腐蚀。
本发明方法还拥有环境应用，如通过将环境中的污染物(如重金属、纤维制品、 放射性元素)与方解石水晶结构结合，从而稳定并去除该些污染物，此外，通过加固 外露的表面以及保护易于腐蚀的区域来控制海岸区和河流的腐蚀。
本发明方法的其他应用包括制作过滤器，如滤水器、钻孔过滤器以及把细菌细胞 及其酶固定在一个水泥活性的生物过滤器。
下面详细描述本发明生产高强度水泥的方法。
一种用可渗透性原料制成高强度水泥的方法，该方法包括步骤：将原料与以下物 质的有效量混合：(i)产尿素酶的微生物；(ii)尿素；和(iii)钙离子，所述产尿素酶 的微生物的有效量在标准条件下能提供每分钟水解0.5-50mM尿素的水解速度。
为本发明的目的，术语“水泥”指能把微粒原料如石块或沙子结合在一起的沉淀 物质。
为本发明的目的，术语“高强度水泥”指以下一种水泥：
(i)经产尿素酶的微生物作用而产生，该产尿素酶的微生物在标准条件下能提供 每分钟水解0.5-50mM尿素的水解速度；或
(ii)通过在每升原料中加入至少33g方解石而制成。
有许多方法可用于决定原料中方解石和碳酸盐的含量。一种方法是在原料用酸处 理时测量散发出的二氧化碳气体量。散发的二氧化碳量可通过测量气压(用压力计测 量的方法)或气体体积变化进行测定。知道了样品的质量和气体体积，就能计算出存 在的碳酸盐的量。测量方解石含量的Twp专门技术可参见“澳大利亚土壤和水化学方 法实验室手册”(G.E Rayment和F.R.Higginson编著，lnkata出版，悉尼，1992， 206-210页)第19章“土壤碳酸盐”。
较佳地，高强度水泥还具有：
(i)至少0.05到0.5MPa/(mM水解的尿素.min-1)的单轴压缩强度，优选的， 所述强度通过估算原料发出的超声波的速度进行确定；和/或
(ii)具有至少0.05到5MPa或2到5MPa的单轴压缩强度，优选的，所述强 度通过估算原料发出的超声波的速度进行确定。
超声波速度测量和耐压强度测量如UCS可用商业现有装置或通过专门的工程技术 实验室实现。通常，在超声波速度和UCS之间必须建立关联，以应对每种正在处理的 原料(或土壤)类型。一种方法包括如下步骤：(i)用处理中的具有不同粘度(和强 度)的材料预先制备圆柱形的矿样，(ii)测量穿过每种处理过的材料矿的超声波速度 (一种非破坏性的技术)，(iii)对每种处理过的矿通过将其塞入一个UCS挤压装置以 获得它们的破坏点，如破碎它们的压力，从而测量UCS值(一种破坏性的技术)，和 (iv)应用方程式计算该两种测量之间的关系，所述方程式如McNaIIy，G.H.1987中 所使用的方程式。用声波和中子测井估算煤层岩石的强度(地质勘探，Geoexploration 24：381-395)，但是，为适用于特定材料类型需重新计算该两个常数。
为本发明的目的，术语“可渗透性的”指原料能满足一种方法的全部过程，该过 程至少包括应用以下物质的一种去制成高强度水泥：(i)产尿素酶的微生物；(ii)尿 素；和(iii)钙离子。
应当认识到，将原料与(i)以产尿素酶微生物形式存在的尿素酶；(ii)尿素；和 (iii)钙离子这三种物质的有效量混合的步骤包含任何引起该三种物质集合的方法步 骤，且该步骤最终使原料制成高强度水泥。例如，在原料中可能已存在上述三种物质 的一种或两种，如果进行“混合”步骤，将会添加入仅缺少的成份。优选地，先把尿 素和钙离子混合，再将其加入到产尿素酶微生物中，然后把该三种成份的混合物应用 于原料。但是，应认为，所述物质成份还可以通过其他方式混合来实现本发明方法。
本发明基于一个惊奇的发现，即能用可渗透性原料与特定量的微生物、尿素及钙 离子进行反应制成高强度水泥。尤其是，申请人发现，相对于其他利用细菌作为尿素 来源的粘固技术，释放高尿素酶活性的微生物的量特别有用。本发明方法所用反应物 的量相对较大，要求生产大量的方解石。鉴于这一点，如果反应物以特定的量混合， 会在原料中和/或原料上形成高强度水泥。该成果尤其令人惊讶的是，所用的尿素和 钙离子等反应物的量会对产尿素酶的微生物起抑制和/或毒性作用，在这个意义上， 需要生产很少或不生产方解石。
重要地，通过使用不同成份的相对有效量，本发明方法能让应用者通过控制形成 的方解石的量及其形成速率来控制粘固。这种适应性意味着本发明方法有一个宽泛的 应用范围，该范围从要求原料有一个相当适度的强度增加到要求有更大增加。
因此，本发明还提供了一种用可渗透性原料制成高强度水泥的方法，该方法包括 步骤：将原料与以下物质的有效量混合：(i)产尿素酶的微生物；(ii)尿素；和(iii) 钙离子，所述水泥是由在每升原料中加入至少33g方解石而制成。
所述水泥可以由在每升原料中加入至少22-32g方解石而制成。作为选择，所述 水泥可以由在每升原料中加入至少33-75g或40-75g方解石而制成。
如果不想受任何特定效果方式的限制，用本发明方法获得的高强度水泥应被认为 是由于原料中方解石结晶的量和天然属性依次影响了结果制得的水泥的强度。还应认 为本发明方法所用的微生物及其数量也会影响方解石结晶，从而影响结果水泥的强 度。
按照本发明方法，组合的不同反应物的有效量会发生改变，因为其至少依赖于微 生物的产尿素酶的能力、可渗透性原料的特性、粘固发生的条件、希望水泥最后达到 的强度以及反应混合物中其他反应物的量。本发明说明书的内容能使一个技术熟练人 员按照常规的方式，确定一项特定应用中所需的不同反应物的相对量，因此，本说明 书内容为技术熟练人员提供了所有将本发明方法应用于不同原料的信息，以及提供了 适用于各种最终用途所需的信息。
依靠对本发明的特定应用或应用方式需求，可能需要水泥的快速生产。为本发明 的目的，快速生产指在本发明方法应用后约1-6个小时内原料至少要达到它最后强度 的60％-90％左右。较佳地，在本发明方法应用后约2-5个小时内原料至少要达到它最 后强度的60％-90％左右，更佳地，在本发明方法应用后约3-4个小时内原料至少要达 到它最后强度的60％-90％左右。
作为选择，缓慢形成水泥是优选的。为本发明的目的，缓慢形成指在本发明方法 应用后约1-6周内原料至少要达到它最后强度的60％-90％左右。较佳地，在本发明方 法应用后约2-5周内原料至少要达到它最后强度的60％-90％左右，更佳地，在本发明 方法应用后约3-4周内原料至少要达到它最后强度的60％-90％左右。
本发明方法可根据需要控制水泥形成的速度。当需要快速生产水泥时，能按照快 速生产条件选择反应物的量和/或相对量。
当需要快速生产时，产尿素酶微生物的有效量可以是在标准条件下能提供每分钟 水解0.5-50mM尿素的水解速度，较佳地，能提供每分钟水解1-25mM尿素的水解速 度，更佳地，能提供每分钟水解2-20mM尿素的水解速度，尤其更佳地，能提供每分 钟水解4-18mM尿素的水解速度。在本发明的一个特定实施方式中，产尿素酶微生物 的有效量为在标准条件下能提供每分钟水解2.2-13.3mM尿素的水解速度。为本发明 的目的，“标准条件”是1.5M尿素和25℃。
当需要快速生产水泥时，尿素的有效量将依赖于其他反应物的量，且该尿素有效 量能足以保证高强度水泥的形成。较佳地，尿素的有效量为终浓度至少在100-200mM， 更佳地，终浓度至少在200-300mM，尤其更佳地，终浓度至少在300-1500mM。在本 发明的一个特定实施方式中，尿素的有效量为终浓度至少是350mM、1500mM或2000mM。
当需要快速生产水泥时，钙离子的有效量将依赖于其他反应物的量，且该钙离子 有效量能足以保证高强度水泥的形成。较佳地，钙离子的有效量为终浓度至少在 50-200mM，更佳地，终浓度至少在200-500mM，尤其更佳地，终浓度至少在500-1500 mM。在本发明的一个特定实施方式中，钙离子的有效量为终浓度至少是100mM、1500mM 或2000mM。
当需要缓慢生产水泥时，控制至少一种反应物的量就能实现。较佳地，至少一种 反应物随时间加入的量要少于水泥快速生产所需的量，但是，该加入的反应物的量， 与其他反应物混合后，在经过了较长一段时间能产生高强度的水泥。在本发明的一个 实施方式中，随着时间加入的反应物是产尿素酶的微生物。作为选择，所述的三种反 应物，其随时间加入的量都可以少于水泥快速生产所需的量，但是，该加入的反应物 的量，与其他反应物混合后，在经过了较长一段时间能产生高强度的水泥。不过，当 随着时间加入所有反应物时，必须认识到反应物的相对量需要作改变。按比例缩减是 非线性的，因为Ca2+离子对尿素酶有减少抑制作用，而尿素能增加尿素酶的反应速度。 因此，为避免形成水泥(方解石)太快，相对来说，需加入产尿素酶微生物的量比钙 离子和尿素少。本领域技术人员能运用本发明包含的内容按照常规方法确定实现缓慢 生产的反应物的量。
如果产尿素酶的微生物能提供所需的尿素酶活性，该产尿素酶的微生物可以是各 种各样的。由于经济原因，所述微生物优选易于在无菌条件下培养，并使用相对便宜 的培养基。该微生物可以是原核生物如细菌。但是，该微生物也可以是单细胞真核生 物如菌类、酵母，如果植物或动物细胞能产生所需的尿素酶，该植物或动物细胞也能 作为本发明的微生物。
较佳地，所述微生物适于在以下至少一种条件下生存和/或成长：(i)相对高的尿 素浓度如本发明所述尿素的有效量；(ii)相对高的钙离子浓度如本发明所述钙离子 的有效量；(iii)至少7.5的碱性pH值如7.5-10；和(iv)相对高的温度，至少30℃。
本发明方法所用的微生物具有产尿素酶的自然属性，它还可具有一种或更多种对 本发明方法特别有用的特性。作为选择，本发明微生物可以是经过遗传工程改进而使 其能产尿素酶和/或具有一种或更多种对本发明方法特别有用的特性。
较佳地，本发明微生物是来源于芽孢杆菌科(Bacillacae)家族的细菌，更佳地， 本发明微生物选自下列种属：芽孢杆菌属(Bacillus)、芽孢八叠球菌属 (Sporosarcina)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、梭状芽孢杆菌属 (Clostridium)和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)，尤其更佳地，本发明微生物 为巴氏芽孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii)或与其功能相类似细菌。
与巴氏芽孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii)功能相似细菌是指那些细菌至 少具有一种与巴氏芽孢八叠球菌一样的特征，该特征对于本发明方法是有用的。本领 域技术人员能常规地鉴别这类细菌。当然，如果需要，也能将不同微生物联合使用。
可以用不同的形式提供尿素。优选地，以水溶液的形式提供尿素。
可以用不同的形式提供钙离子。可用盐的形式提供钙离子如硝酸钙或氯化钙。较 佳地，用钙盐混合物提供钙离子，以防止或减少由高浓度的特定阴离子引起的抑制作 用。在本发明一个特定的实施方式中，至少以两种盐的混合物形式提供钙离子，如硝 酸钙和氯化钙。可以按不同的比例提供盐混合物。但是，优选硝酸钙和氯化钙以50∶50 的比例混合。
如果原料具有可渗透性，它可能会有改变。较佳地，原料具有微粒结构。当原料 是岩石时，该原料可以是水成岩，如陆源岩石、化学/生化岩石或有机水成岩，所选 水成岩包括：砾岩、角砾岩、沙岩、粉砂岩、页岩、石灰石、石膏、白云岩、泥炭和 褐煤。作为选择，原料可以是松散的或部分结实的微粒材料，如沙子、土壤、粘土、 沉淀物、锯屑或其它易在原位粘固的材料。其他原料包括纸板、微粒板和软木材。应 认识到，原料的特性，如成分、微粒大小分布及空间百分比，也会影响本发明方法的 应用方式。
反应物混合的方式可根据需要作改变。微生物、尿素和钙离子可以混合在一起， 再用于原料。因此，本发明也提供了一种用可渗透性原料制成高强度水泥的方法，该 方法包括步骤：(a)预先将有效量的(i)产尿素酶微生物、(ii)尿素和(iii)钙离子混 合；(b)把步骤(a)的混合物与原料混合。
反应物也可以同时或连续加入原料中。例如，将微生物先加入原料中，接着，分 别加入尿素和钙离子或者把尿素和钙离子预先混合后加入原料中。在本发明的另一个 实施方式中，在原料中加入尿素和钙离子后，连续或同时加入微生物。
可以用多种方式将反应物加入原料中。可在压力下把反应物加入原料中，如冲刷 或注射；喷射、滴在原料上或滴流入原料中。作为选择，可根据原料的大小和形态把 原料浸入反应物中。
为了获得必要的高强度水泥，本发明方法可重复进行。因此，本发明还提供了一 种用可渗透性原料制成高强度水泥的方法，该方法包括步骤：将原料与有效量的(i) 产尿素酶微生物、(ii)尿素和(iii)钙离子混合，该步骤至少重复一次。
应认识到，本发明方法在为获得更高的强度而重复实施时，并不是所有的反应物 在每次重复中都需要加入。例如，第一次应用中加入的微生物所剩余的尿素酶活性， 可能对于本发明方法后来的轮回反应所需的尿素酶活性仍然是足够的。熟练的技术人 员很容易确定本发明方法后来的轮回反应所需反应物的确切的量。
原料的增加(如残渣)使微生物缺少，可能降低本发明方法的效率。这个问题可 能专门与使用非絮凝微生物有关。产尿素酶微生物可从没有进行粘固处理的原料中丢 失，因此，通过将微生物固定在粘固前的原料中，使产尿素酶微生物的消耗量降为最 低。较佳地，当形成高强度水泥时，出现在后面的重复反应中使用多倍量的反应物而 同时要求加入较少微生物的情况下，应用把微生物固定在原料中。因此，本发明还提 供了一种用可渗透性原料制成高强度水泥的方法，该方法包括步骤：(i)把微生物放 在原料上；(ii)将微生物固定在原料中；和(iii)将结合有固定化微生物的原料与有 效量的尿素和钙离子混合。
较佳地，用有效量的钙离子把微生物固定在原料中。所述钙离子的有效量可以有 变化但较适合在10-50mM左右。实施者不希望受任何特定的作用方式限制，但同时他 们相信钙离子与微生物接触后，微生物所分泌的低浓度碳酸盐会与钙离子结合，并在 微生物细胞表面形成碳酸钙。碳酸钙可以把细胞结合到原料上或以其他方式使微生物 更加稳固地保留在原料中。
重要的是，本发明方法可在原位置应用，而不必扰动原料。这对于应用非常重要， 由于原料的精细、易碎或其他原因，原料不应当被扰乱。例如，在地面改进的应用领 域，保持原料的一种或更多种现有特征如原料中存在的土壤结构和土层，是十分重要 的。
由于依靠原料和高强度水泥形成所需的不同条件，有必要在原料中不止一次地施 加一种或更多种反应物。因此，本发明还提供了一种用可渗透性原料制成高强度水泥 的方法，该方法包括：将原料与有效量的(i)产尿素酶微生物、(ii)尿素和(iii)钙离 子混合，超过一次地加入至少一种所述的(i)到(iii)的反应物。
较佳地，超过一次地加入尿素和钙离子。在这方面，在应用上，微生物可以保持 在可渗透性原料中，这使微生物能与增加的尿素和钙离子反应，并形成额外的水泥， 从而给予原料更高的强度。
实用性
按本发明形成高强度水泥的方法在土木工程、采矿、腐蚀控制、环境以及特殊材 料加工的各个领域具有不同的应用。本发明尤其适用于地面改进的应用。
土木工程应用包括将本发明方法用于护岸、筑堤(如铁路筑堤、筑坝)和地面开 挖隧道时加强和稳固泥土；打地基时改善桩的表面摩擦(把桩连接成“远声场”)；增 加桩的端承载力；在原位置变硬以减少桩设计长度；改进非桩地基土壤的承受力；以 及在遇到液化危险时稳固地震带的沙滩。
本发明方法还可用于建造急需的公路，即对公路、飞机跑道等道路的自然表面或 准备好沙子的表面进行处理，并快速修复老化的路面底基层。
本发明方法还可用于保存、修复、加强和保护建筑物上风化的灰泥和石工术，该 建筑物如遗产建筑；还可用于巩固和保存壁画中衰落的石膏；还可用于在花园中创作 建筑特色以及用人工合成的沙岩/石灰石复制装饰物。
在采矿工业中的应用包括：在开挖和采矿过程中本发明方法可为新开垦的土地提 供支持；能加强尾矿坝以防止侵蚀和坡身不稳；可提供一个有渗透性的反应屏障，该 屏障能让排出物通过，并从矿物中除去酸性物质和重金属；可结合暴露表面上的灰尘 粒以减少灰尘；在钻孔和提取过程中，本发明方法能增加对石油地上凿洞退化的抵抗 力；本发明方法能增强海上建筑物对抗重力式地基和管道内或其下面所具有的沉淀物 的腐蚀。
本发明方法还拥有环境应用，如通过将环境中的污染物(如重金属、纤维制品、 放射性元素)与方解石水晶结构结合，而将稳定并去除该些污染物，此外，通过加固 外露的表面以及保护易于腐蚀的区域来控制海岸区和河流的腐蚀。
本发明方法的其他应用包括制作过滤器，如滤水器、钻孔过滤器、把细菌细胞及 其酶固定在一个水泥活性的生物过滤器。
生产高强度水泥产品的方法
本发明提供了一种制成高强度水泥产品的方法，该方法包括将固体成分与有效量 的(i)产尿素酶微生物、(ii)尿素和(iii)钙离子混合。
所述固体成分可以是任何适于粘固在一起形成高强度水泥产品的固体或多份固 体。所述固体可以是不同大小的岩石。作为选择，所述固体可以是微粒材料如适于粘 固在一起形成水泥产品的粉末岩石或石灰石。
较佳地，在一个模具中混合反应物，以生产预定形状的水泥产品。所述形状可以 变化，包括模具和能用于装饰和结构的类似模具。
附图说明
图1是本发明用1.5M克分子数相等的尿素和钙溶液对粘固核心进行第一次(○) 和第二次(●)处理，24个小时后，在该粘固核心的整个90mm长度上记录单轴压缩 强度的曲线图；
图2是本发明对于第一次(○)和第二次(●)生物粘固处理，每输入尿素酶活性 所获得强度的曲线图；
图3是本发明在粘固过程中沿着粘固核心的三个位置上(15mm(●)、45mm(△) 和75mm(■))不同细菌酶浓度对强度进展的影响，以及伴随尿素水解(X)产生的铵 的曲线图，尿素酶应用酶活性为6mM(A)、9mM(B)和12mM(C)水解尿素.min-1的 完整细菌细胞；
图4是本发明使用了可溶性植物酶(9mM水解尿素.min-1)，在从注射端起沿着 粘固核心长度的三个位置上(15mm(●)、45mm(△)和75mm(■))随着时间产 生的强度进展变化以及在粘固反应过程中铵浓度(x)的曲线图；
图5是本发明在水解速度为6mM(口)、9mM(●)和12mM(△)水解尿素.min-1 的不同完整细胞的细菌尿素酶活性以及9mM水解尿素.min-1(■)的可溶性植物酶活 性下，粘固核心内原位尿素水解速度的曲线图；
图6是本发明对于从注射端起12mm的高活性粘固核心在每段间隔时间中每mM 水解尿素产生的强度变化(■)与每段间隔时间的尿素水解速度(●)是相对的；
图7是本发明对于从注射端起45mm(■)和75mm(口)的中活性粘固核心在每 段间隔时间中每mM水解尿素产生的强度变化与每段间隔时间的尿素水解速度(●) 是相对的图；
图8是本发明对于在砂粘固核心中第一次(口)和第二次(■)应用酶和反应物， 在原位分别产生的铵与时间的相关曲线图，两次应用都包含标准条件下酶活性为11 mM水解尿素.min-1的酶；
图9是本发明在前两次应用酶和反应物后，固定于粘固核心中的残余尿素酶活性 的曲线图；
图10是本发明将粘固液体注射入砂粘固核心的方法的示意图；
图11是本发明在生物粘固处理后在Koolschijn砂(K)和Koolschijn砂与10％ 泥炭混合物(KP)中的切变强度(■)和硬度(口)的柱状图(处理次数在括号中标 示)；
图12是本发明的Koolschijn砂在三次生物粘固处理之前和之后气孔体积差异的 柱状图；分析
图13是本发明对于在连续粘固柱子的不同距离采集的样本的NH4 +分析曲线图；
图14是应用本发明的一个优选实施例粘固的柱子在不同放大倍率下的两张照片。

本技术领域的技术人员要知道本发明可被变化和修改，而不只是明确描述的内 容，本发明应被理解为包括所有这样的变化和修改。本发明也包括所有单独、或全部 在说明书中提到的步骤、特征、成分及混合物，还包括这些步骤或特征的任何两个或 更多或所有的组合。
本发明范围并不限于描述的特定实施例，该实施例只是为了给出范例。功能相当 的产品、组分和方法无疑都将落在本发明的范围之内。
在此引用的所有出版物(包括专利、专利申请、杂志、实验室手册、书本、或其 他文献)已完全公开，因此集中在一起供参考。任何构成在先技术的文献，或是本发 明相关领域的技术人员所熟知的公知技术都不允许包含在本发明内容中。
整个说明书中，除非内容需要，术语“包括”将被理解为包含一规定的整数或包 含一组整数，但并不排除任何其他整数或整数群。
在本发明的详细描述中可发现所用的选择术语的其他定义，且这些定义贯穿始 终。除非有别的解释，本发明所使用的其他科学和技术术语与本发明所属技术领域内 常规技术具有相同的意思。
本发明将描述下面的实施例，该实施例的描述决不仅限于对在前描述的概括。
实施方式
通用材料和方法
(A)巴氏芽孢八叠球菌(S.pasteurii)的培养
(i)铵酵母抽提物培养基的培养
将巴氏芽孢八叠球菌在含有20g/L酵母抽提物、75mM(NH4)2SO4的培养基中， 在28℃条件下进行分批培养，该培养基在无菌消毒之前用4 M NaOH把pH调到9。
(ii)尿素酵母抽提物培养基的培养
尿素酵母抽提物培养基的培养是将巴氏芽孢八叠球菌在含有20g/L酵母抽提物 和75mM CO(NH2)2的培养基中进行分批培养，该培养基在高压灭菌后pH为7.5。高压 灭菌后在培养基中通过0.2μm灭菌过滤器加入尿素，以防止低于高压灭菌条件时产 生化学分解。
(iii)醋酸盐酵母抽提物培养基的培养
醋酸盐酵母抽提物培养基的培养，除了其培养基含10g/L酵母抽提物、100mM NaCH3COO和75mM(NH4)2SO4以外，其他培养条件与铵酵母抽提物培养基的培养条件 相同。
(B)分析方法
(i)尿素酶活性
尿素水解会按下面的方程式从非离子物质中释放出离子积：
H2N-CO-N2H+H2O 尿素酶 2NH4 ++CO3 2-
传导速率增加与存在的活性尿素酶浓度成比例。尿素酶活性可在过了三分钟后通 过计算传导率变化相对于时间的斜率来确定，所述传导率变化和时间在1.5M尿素、 25℃的标准条件下测得。
通过测量传导率的变化，将传导率增加的速率(mS/min)转换成尿素水解速率(被 水解的尿素mM/min)，而传导率的变化来源于尿素的完全水解，具体是：在1.5M 尿素、25℃的标准条件下，用商业获得的来自相同生物体的纯尿素酶(Sigma Cat.No. U-7127)完全水解尿素，产生的标准曲线(如下)以及水解最后出现的铵的量保证了 反应已经进行完全。

尿素完全水解后出现的传导率变化(■)和铵浓度(口)的标准曲线。
由该图可确定下面的关系式：
水解的尿素(mM)＝传导率(mS)×11.11(R2＝0.9988)
水解的尿素(mM)＝铵(mM)×0.50(R2＝0.9991)
(ii)确定生物量
生物量通过在600nm处进行光谱光度测量来确定。
(iii)NH4-N分析
铵浓度通过一种改进的Nessler方法进行光谱光度测量来确定。样品在13 500 rpm转速下离心5分钟，移开细胞并使上清液稀释到0-0.5mM的范围。在425nm下 读吸光值前，取2ml的该稀释样品和100μl Nessler试剂混合，并使其反应1分 钟。
实施例1在硅砂中的生物粘固
材料和方法
(A)将粘固反应物应用在核心处
粘固核心是由50ml的塑料注射器组成，在该注射器内干燥填充300μm的硅砂， 且在填塞硅砂的过程中，对注射器保持不断地振动，以使塞入的硅砂具有平均密度。 接着，用水对粘固核心冲洗，并轻打注射器以去除气泡。用水冲洗以后，砂子占据的 体积会由于沙粒之间的润滑作用而减小，塞子将被适应于维持一个有限的压力。
Ca/尿素溶液和细胞在注射入粘固核心之前要直接进行预混合，该预混合通过把 两种溶液一起倒入一个容器，再用第二个50ml注射器操作吸取和排出两次，以确保 充分混合。粘固核心吸入溶液的体积是硅砂体积的1.5倍，以保证水的完全置换。
(B)原位粘固测量
在粘固核心沿着长度的三个位置(从注射末端起15、45和75mm)，发出穿过核 心直径的超声波，并测量强度。在整个实验过程中重复进行测量。更高强度的结合(粘 固)会使声波以更快的速度传播(即速度越快，粘度越强)。同时，通过一根插在粘 固核心注射器下面的毛细管将1ml样品从粘固核心中排出，以避免超声信号中断。 该排出的样品在13500rpm下离心，从而移去所有悬浮颗粒(砂子或细菌)，该悬浮 物接着被转移到一个干净的管子中，-20℃保存，以等待铵分析。
超声波速度既可以测浸透的样品(湿速度)，也可以测干的样品(干速度)。为了 测量干样品的超声波速度，对穿过0.300mm的硅砂确定了下面的关系式：
σ = 1272 × exp ( - 14461 v )
其中，σ＝单轴压缩强度(MPa)
v＝超声波速度(m.s-1)
对于测量湿样品的超声波速度，用下面关系式将湿速度转换成干速度后，上述关 系式仍能使用：
v(干)＝v(湿)-600m.s-1
其中，v(干)＝干超声波速度(m.s-1)，v(湿)＝湿超声波速度(m.s-1)。
(C)NH4-N分析
铵浓度用上面通常材料和方法部分所述的方法进行确定。
(D)酶速度对强度的影响
用1.5M克分子数相等的尿素/钙溶液(钙由0.75M Ca(NO3)2和0.75M CaCl2提 供)处理8个粘固核心，并用不同浓度的尿素酶(细菌尿素酶活性)使粘固核心的物 质以不同的速度粘固。进行两次冲洗，并在24个小时后在3个位置(A、B和C)测 量超声波。
(E)在粘固过程中的强度进展
为了研究粘固过程中的强度进展，对4个粘固核心进行42小时的不断监测，且 在该42小时中，施加细菌和反应物。这一研究方法随着反应的进行，能观察到强度 的变化。
细菌酶体系也被比作是可溶性的植物酶体系。为了阐明产生最高粘固强度的尿素 水解速度，需计算每mM被水解尿素的强度变化以及将该强度变化与每个间隔的尿素 水解速度作比较。
(F)酶的多次应用
通过在两次连续的处理中施加相同量的细菌酶和反应物，可对酶多次应用的效果 进行量化。经插在粘固核心注射器内的毛细管，将样品定期移去，可确定铵的产量。 在两次处理之间，用水冲洗粘固核心，以去除任何废液。第二次处理是在第一次处理 的24小时后进行，每次处理都含有11mM urea.min-1的酶活力和1.5M克分子数相 等的尿素/钙溶液。
(G)酶固定和反应物的再处理
为了确定两次粘固处理后在粘固核心中存在的剩余尿素酶活性是否能被再使用， 在第三次处理中只加入钙和尿素反应物(没有任何额外的酶)。
结果
(A)酶速度对强度的影响
在每个粘固核心的三个位置(A、B和C)测量的速度都在10％以内，说明沿着粘 固核心长度的粘固度是一致的。为了获得全面的粘固核心结果，对该三个位置的速度 求平均值(见图1)。经过一次生物粘固处理后，将会观察到强度随着酶活力的增加而 增加(见图1)。
图2阐明了强度相对于使用酶量的进展。强度的量可由加入系统中的酶量除得 (如：如果两次应用4.4mM urea.min-1的酶产生出18MPa的强度，那么相对于加入 酶量的强度进展将是18÷8.8＝2.05MPa.(mM urea.min-1)-1)。
(B)在粘固过程中的强度进展
图3表示的是在粘固过程中的关于强度进展的数据。
相对于可溶性植物酶系统，细菌酶系统在速度和强度进展的特性方面显示出明显 的区别(见图4)。而且，在可溶性植物系统中的原位产铵速度明显低于细菌系统的产 铵速度(见图5)。
图6和图7分别显示了中活性粘固核心(9mM urea.min-1)和高活性粘固核心(12mM urea.min-1)的尿素水解速度的数据。
(C)酶的多次应用
在粘固的最初几个小时中，第一次处理保持产铵速度在7.2mM NH4 +.Min-1，此时 酶速度为每分钟水解3.6mM尿素。在第二次应用中，尿素水解的初始速度将是7.8mM 尿素/min-1速度的两倍，说明来自第一次处理的细菌尿素酶活性在第二次应用中仍然 具有活性(见图8)。第二次应用处理中更高的活性水平将使反应提早完成。
(D)酶固定和反应物的再处理
尽管没有额外的酶加入，但是在4个小时内产生了约1M铵(每分钟产铵4.5mM)， 这相当于尿素酶的平均活性为每分钟水解尿素2.25mM(见图9)。粘固核心中的残余 酶仅能为超过4小时没有铵产生后的最初几个小时提供活性。
实施例2在其它砂中的生物粘固
材料和方法
(A)Vegemite醋酸盐培养基
Vegemite醋酸盐培养基由13.5 g.L-1的Vegemite组成，通过重力沉淀去除 Vegemite中的固体物质，接着将固体物质的上面部分移入其它容器，并以冰醋酸形式 加入150mM醋酸盐。用6M NaOH调pH至7。
为了接种培养，对培养基进行消毒，并加入10g.L-1通过无菌过滤、后消毒的尿 素。对于中试培养，培养基不需要消毒灭菌，添加的尿素也不需要无菌过滤。
(B)10L中试接种培养
中试接种体在一个10L的搅拌罐式反应器(Chemap，德国)中，在30℃、起始pH 为8.25的无菌条件下进行生长。
(C)100L中试培养
中试培养并不在无菌的条件下进行，它在一个定制的120L玻璃纤维气升式反应 器(经佩思(澳大利亚城市)的安德鲁布朗公司的允许，courtesy of Andrew Brown &Co.，Perth)中进行，该反应器的工作体积为100 L。
该容器温度控制在30℃，起始pH为8.25。
(D)尿素酶活性和生物数量
尿素酶活性、特异尿素酶活性和生物数量可按上述通常材料和方法部分所述的内 容计算。
(E)粘固
粘固试验可以在以下原料中实施：小于300μm的硅砂(如所有小于300μm的 砂粒)、含一些页岩的商业Dutch结构的砂子(Koolschijn)或每个试验所显示的9 份Koolschijn砂和1份泥炭的混合物(Koolschijn砂和泥炭由荷兰GeoDelft提供)
将干燥的砂子用连续振动的方式填塞入38(内径)×170mm PVC的管柱中，使 砂子粘固核心的平均密度为1.75 g.cm3左右，或使砂子/泥炭粘固核心的平均密度为 1.65 g.cm3左右。然后用水冲洗粘固核心的上方，并轻拍管柱，以去除气泡。钙/尿 素溶液和酶在由压力容器注射入粘固核心之前迅速进行预混合(见图10)。迅速混合 粘固反应物(钙/尿素溶液和细菌细胞)并将其放入所述容器中，该容器为密闭容器， 且用压缩空气对该容器加压。然后，打开液体管线，使粘固溶液朝上涌向粘固核心。 当粘固核心充分浸透后，关闭液体管线，使粘固溶液在粘固核心中保持24个小时。 一次处理四个粘固核心。
冲入的水为气孔体积(空体积)的一倍半，以确保由水完全取代。在粘固流之间， 水冲洗粘固核心以去除任何失效的液体，每个粘固核心的冲洗次数在每次试验中都有 显示。粘固后，粘固核心用漂白液冲洗，并在60℃烘干。
(F)尿素酶的准备
用一个10L的搅拌罐式反应器为100L的中试反应器生产合适的接种体。在无 菌条件下，在Vegemite醋酸盐培养基上培养巴氏芽孢八叠球菌(S.pasteurii)。
将5L接种体从上述接种体培养物转移到中试气升式反应器(5％接种体)中，并 在非无菌条件下的Vegemite醋酸盐培养基上培养。以前的实验显示S.pasteurii能 在非无菌条件下并有50％污染的情况下进行培养，不会影响尿素酶的活性水平。中试 培养在非无菌的“干净”条件下进行，包括接种前用5％次氯酸盐溶液清洗反应器的内 部，再用清水洗净反应器的内部。最大尿素酶活性约为每分钟水解6mM尿素。
(G)确定生物粘固后的强度特征
运用8.75mM尿素.min-1的尿素酶活性进行Koolschijn砂粘固，该尿素酶来自 Vegemite醋酸铵培养基上培养的细胞，粘固的Koolschijn砂再注射入15psi的粘固 核心。
用Koolschijn砂(K)或90％Koolschijn砂加上10％泥炭的混合物(w/w)(KP) 制备样本，并用2、3或4生物粘固处理方式处理。
粘固后，用三轴试验研究粘固核心的强度特征，并确定切变强度和硬度。三轴试 验是对圆柱形岩石样本在限制压力的条件下进行的压缩试验，其中加载路径由计算机 跟踪。该三轴试验的目的是模拟原位岩石材料在遭受限制压力和偏应力的时候可能发 生的情形。在三轴剪切阶段之前，用CO2充满样本以去除任何非水溶性气体，并用水 浸透样本。用杨氏系数在50％峰值应力下确定硬度，并在50％最大偏应力下确定切变 强度。
切变强度是测量原料经受剪切失效前有多少力(力÷面积)能够被应用(剪切失 效情形是指没有以额外的变形和应力重新分配作为结果，土壤不能再承受外加负载的 增加)。硬度是在50％切变强度下应力和应变之间的比例，且硬度能给出一个力的估值， 该力能产生特定水平的转移。
为了确定粘固后气孔体积缩小的程度，将处理后的气孔体积与松散砂的气孔体积 进行比较。用30cm水头差异、300kPa回压以及100kPa.的固结压力进行渗透率试 验。
结果
(A)生物粘固
易于生物粘固的Koolschijn砂在强度和硬度上有明显改善，由因数8引起的切 变强度的普遍增加，由因数3引起的硬度增加(图11)。
Koolschijn/泥炭(KP)样本明显不同，它与K砂相比，显示出较小的强度和硬度。 与未粘固的K砂相比，对KP的两次生物粘固处理没有得到改善。然而，应注意到未 粘固的KP砂的强度特性还没有被确定，可能会更低。增加KP砂的应用次数能改善切 变强度(图11)。
气孔体积能减小2～14％，表明粘固以后有微小减少，因此使粘固核心的渗透率 在很大程度上没有变化(图12)。
实施例3提高生物粘固的深度
材料/方法
在含有6mM Ca2+的培养基中培养细菌，接着在维持11:39分钟的7.5psi压力 (1.4L/hr)下以向上冲洗的方式，将650mL细菌培养物(尿素酶活性大约为每分钟 水解10mM尿素)应用于1m的砂柱。在1.25M Ca2+和1.7M尿素冲入该内含细菌细胞的 柱子后，该柱子在室温保持48个小时。
结果
获得了一致的强度。通过铵分析证实柱子粘固的均匀(见图13)。附上的图14A和 14B是粘固后柱子的两张照片。
实施例4为生物粘固固定细菌
材料/方法
在用于生物粘固的细菌的生长培养基中加入6mM钙，并在冲洗柱子后估算砂柱 上细菌的保持力。
结果
生长培养基中加入6mM钙，能增加所用细菌株的粘性。将细菌冲入柱子超过1m， 在第二次冲洗后超过50％的细菌会留在柱子中。当细菌在没有钙的培养基中培养时， 第二次冲洗后将有超过80％的细菌从柱子上丢失。
本发明的方法使用于原料的尿素酶活性的量得到严密控制，同时使本方法的细菌 丢失降为最低，本方法包括一次以上反应物的应用。
实施例5用固定化的细菌对硅砂进行粘固
下面实施例描述硅砂的生物粘固，尤其是应用于沙土壤的土壤稳固。
材料/方法
在一个内径为29mm的60ml PVC圆柱形容器中填塞干燥的经洗过的SiO2砂。将 具有尿素酶活性的细菌培养物(巴氏芽孢杆菌，Bacillus pasteurii)在1L的烧瓶 中，28℃，摇动培养24个小时，所用的培养基含有0.3M尿素和6mM CaCl2。
通过测量约0.5mS.min-1传导率的变化，可得细胞的尿素酶活性为每分钟水解 5.6mM尿素。该细菌尿素酶活性水平足以在砂子内产生强而快速的粘固，不需要浓缩 细胞，因而避免了可能昂贵的进一步浓缩细菌的步骤。
用一个慢流蠕动泵(泵排量为每分钟15ml)将含有细菌细胞的培养液向上冲入 圆柱形容器，直至3倍空体积的细菌悬液被抽出。允许在该圆柱形容器的上方流出多 余的含有一些细菌的溶液。剩余的细菌悬浮液在圆柱容器中保持约48个小时。这段 时间使细菌粘附到砂粒上，从而避免细菌在接下来的钙/尿素溶液的冲洗中被洗掉。
用含有氯化钙和尿素(都为1M浓度)的等摩尔溶液，以相同的蠕动泵，向上冲 洗该圆柱形容器，直到所用冲洗的溶液体积达到圆柱形容器空体积的1.3倍。室温孵 育24小时后，用相同的氯化钙/尿素溶液第二次冲洗圆柱形容器，以进一步形成方解 石结晶。如果所需的强度较小，可省去第二次冲洗。
结果
从PVC圆柱形容器中移出硅砂粘固的圆柱形样本，并测量它的不封闭的压缩强 度。测得的不封闭压缩强度为1.7 MPa。