一种SnOx@TiO2@mC复合材料、适体传感器及其制备方法、应用 |
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| 申请号 | CN201710617560.5 | 申请日 | 2017-07-26 | 公开(公告)号 | CN107381631A | 公开(公告)日 | 2017-11-24 |
| 申请人 | 郑州轻工业学院; | 发明人 | 张治红; 胡彬; 王明花; 宋英攀; 何领好; 杨龙钰; 刘永康; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种SnOx@TiO2@mC 复合材料 、适体 传感器 及其制备方法、应用，属于 生物 传感器 技术领域。本 申请 采用BSA、Na2SnO3·3H2O和 钛 酸四丁酯制备出一种适用于TOB检测的SnOx@TiO2@mC的介孔纳米复合材料，该材料中由BSA制得的介孔 碳 具有高的 比表面积 ，对生物分子的 吸附 、固定能 力 和良好的电化学活性，SnOx良好的 生物相容性 和电化学活性，TiO2良好的生物相容性、无毒和相对良好的电化学性质。使用该材料制备电化学适体传感器，其在TOB实际样品的检测中体现了高的测定效率，TOB的检出限为6.7pg·mL-1，并表现出良好的选择性，高 稳定性 ，可重复性，以及对实际样品的适用性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种SnOx@TiO2@mC复合材料，其特征在于：以Na2SnO3·3H2O、钛酸四丁酯为反应原料，牛血清蛋白为模板，先于93-97℃、溶液条件下保温反应10-14h得前驱体，再将前驱体于 |
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| 说明书全文 | 一种SnOx@TiO2@mC复合材料、适体传感器及其制备方法、应用技术领域背景技术[0002] 氨基糖苷(AGs)是由两个或多个氨基糖组成的化合物，其通过糖苷键连接到2-脱氧链霉胺支架上。托普霉素(TOB)为AGs中的一种，是由黑暗链菌霉产生的广谱氨基糖苷类抗生素，对广谱细菌特别是铜绿假单胞菌表现出杀菌活性。与其他氨基糖苷类似，TOB具有副作用如肾毒性。当在生物液体中进行TOB检测时，存在TOB发色团效应差，灵敏度低，检测复杂，测定稳定性差等问题。为了定量检测TOB含量，削弱TOB的副作用，达到最佳治疗效果，有研究开发了高效液相色谱(HPLC)，放射免疫测定(RIA)，微生物测定，电化学检测(ECD)，荧光共振能量转移(FRET)测定和比色测定等方法。通常情况下，由于这些方法缺乏托普霉素分子的不饱和化学键，因此需要预处理和后处理步骤，使得这些方法复杂、耗时、昂贵。因此，在临床生物样品分析中建立敏感和选择性策略以确定TOB的含量是非常必要的。在这些技术中，电化学方法具有反应快，灵敏度高，成本低，小型化和现场分析等优点，有希望成为快速检测抗生素的新方法。 [0003] 最近，在化学和生物化学传感器开发中使用核酸适体是一个快速扩展的领域，其中适体是单链DNA或RNA寡核苷酸，其通过指数富集的适体系统进化体外选择，适体具有把特异性目标结合形成三维结构的能力。具有特征的二级结构，如发夹的适配体可以在不存在配体的情况下重组，形成较高的空白信号。因此，单位点结合方法是分析小分子时唯一的选择。适体由于具有高亲和力和特异性，稳定性好，成本低的优点，广泛用于生物分子检测。生物亲和电化学传感器通常依赖于亲和剂(蛋白质，酶，核酸)与电极表面的偶联。电极固定的亲和剂之间的特异性目标识别被转导成与分析物的浓度相关的电化学数据。 [0004] 为了提高电化学生物传感器的测定效率，开发新型电极材料的关键步骤是对生物分子探针具有较高的生物亲和力。随着近几十年来纳米技术的发展，纳米材料在电化学生物传感器方面受到极大的关注，因为它们能够满足上述电极材料的要求。另外，考虑到生物传感应用，这些氧化物的化学稳定性和产生表面羟基键的能力使得它们作为探针分子共价接合的相关材料。因此，有大量关于纳米材料应用于检测痕量分析物的敏感层的报告。在许多纳米材料中，碳材料在诸如传感、电子、能量存储和转换装置以及生物技术的各种电化学应用中是非常有意义的。在与这些领域相关的研究中，已经开发了各种碳材料，包括石墨烯、碳纳米管(CNTs)和有序介孔碳(OMC)。OMC广泛用于生物分析，电极材料，客体分子和超级电容器。然而，大多数未改性的碳纳米材料仍然难以稳定地固定在电极表面并直接固定生物组分。最近，已经开发了用于碳表面的化学改性的各种方法。用于官能化碳表面的最广泛使用的技术涉及用酸或臭氧进行氧化，由此产生氧化官能团如羧酸，酯和醌。然而，该方法在氧化处理期间可能导致低的结合密度和孔结构的损坏。 [0005] 最近，诸如DNA，蛋白质或微生物的生物大分子提供了用于制备纳米颗粒或纳米团簇的绿色化学方案，其不仅将增加其生物相容性，而且还将提供具有许多官能团的表面。BSA已经被认为是一种丰富的多功能的生物大分子，可以有效地模拟荧光/催化金属纳米团簇和金属纳米材料的直接取向生长。 [0006] 最近，用于电化学细胞传感器的感测界面的蛋白质介导的无机纳米材料的合成是有吸引力的，原因如下：合成条件是温和的，即在室温附近，在水溶液中，在中性pH下；尺寸、形状、形态和晶体结构复杂可控；所得产品具有多功能和生物相容性。有研究开发了掺入双金属Au-Ag发光纳米团簇(NC)的阳离子BSA纳米粒子体系，用于在人宫颈癌细胞中递送治疗性自杀基因；合成了以BSA的模板Cu纳米团簇(CuNCs@BSA)和单壁碳纳米管(SWCNT)的生物相容性纳米复合材料，制备了一种高灵敏度的电化学生物传感器，作为有机磷酸盐模型的对氧磷。由于可以形成生物分子和金属氧化物组成的均相纳米复合材料，可以进一步通过在高温下煅烧直接合成嵌入金属氧化物晶体的介孔碳材料。 [0007] 公布号为CN106564939A的中国发明专利公开了一种蜂窝状SnO2/TiO2复合型纳米材料的合成方法，但是其是用来制备成气敏电极用来检测甲醛。目前，还没有找到一种适用于检测TOB的介孔纳米复合材料，因此也没有找到一种灵敏度高、特异性强，适用于生物液体的检测TOB的适体传感器。 发明内容[0008] 本发明的目的在于提供一种SnOx@TiO2@mC复合材料，该材料在用于检测TOB时灵敏度高、特异性强。 [0009] 本发明还提供了上述复合材料的制备方法。 [0010] 本发明还提供了采用上述复合材料的适体传感器。 [0011] 本发明还提供了上述适体传感器的制备方法。 [0012] 本发明还提供了上述复合材料、适体传感器的应用。 [0013] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是： [0014] 一种SnOx@TiO2@mC复合材料，以Na2SnO3·3H2O、钛酸四丁酯为反应原料，牛血清蛋白为模板，先于93-97℃、溶液条件下保温反应10-14h得前驱体，再将前驱体于500-900℃、惰性气氛中煅烧1.5-2.5h，即得；所述x为0、1、2。 [0015] 优选的，所述煅烧的温度为900℃。 [0016] 所述Na2SnO3·3H2O、钛酸四丁酯、牛血清蛋白的质量比为0.2-0.3：0.9-1.1：4-5。 [0017] 上述的SnOx@TiO2@mC复合材料，具体制备过程如下： [0018] 1)将4-5质量份的牛血清蛋白溶于400-500质量份水中，然后加入0.1-0.2质量份的NaOH混匀，得混合溶液； [0019] 2)在步骤1)得到的混合溶液中加入0.2-0.3质量份的Na2SnO3·3H2O和0.9-1.1质量份的钛酸四丁酯分散，然后加热至93-97℃，保温搅拌10-14h，得反应物； [0020] 3)将步骤2)得到的反应物冷却至室温，离心收集沉淀物，将沉淀物于55-65℃下真空干燥20-28h，得前驱体； [0021] 4)将步骤3)所得的前驱体在通入N2的条件下于500-900℃煅烧1.5-2.5h，冷却即得。 [0022] 步骤1)中加入NaOH的过程中进行搅拌。 [0023] 步骤2)中所述分散采用剧烈搅拌。 [0024] 步骤3)中沉淀物采用重复离心收集沉淀的方法得到。 [0025] 将步骤3)中收集的沉淀物用水洗涤3-5次，然后再真空干燥。 [0026] 步骤4)中以5℃min-1的升温速率升至煅烧温度。 [0027] 本发明的SnOx@TiO2@mC复合材料中，BSA在高温下生成直径约500～900nm的松散碳球，Na2SnO3·3H2O、钛酸四丁酯反应后生成的SnOx、TiO2纳米颗粒被碳层包埋。本发明的开发出一种适用于TOB检测的SnOx@TiO2@mC的介孔纳米复合材料，该材料结合各个组分的优点，其中由BSA制得的介孔碳具有高的比表面积，对生物分子具有良好的吸附、固定能力和优良的电化学活性，SnOx良好的生物相容性和电化学活性，以及TiO2良好的生物相容性、无毒和相对良好的电化学性质，最终得到的SnOx@TiO2@mC纳米复合材料可以应用于TOB靶向适体链固定的支架材料。该SnOx@TiO2@mC纳米复合材料在制备成电化学适体传感器时，在TOB实际样品的检测中表现出高灵敏度，优异的选择性，良好的性能和可接受的适用性。 [0028] 上述的SnOx@TiO2@mC复合材料的制备方法，以Na2SnO3·3H2O、钛酸四丁酯为反应原料，牛血清蛋白为模板，先于93-97℃、溶液条件下保温反应10-14h得前驱体，再将前驱体于500-900℃、惰性气氛中煅烧1.5-2.5h，即得；所述x为0、1、2。 [0029] 优选的，所述煅烧的温度为900℃。 [0030] 所述Na2SnO3·3H2O、钛酸四丁酯、牛血清蛋白的质量比为0.2-0.3：0.9-1.1：4-5。 [0031] SnOx@TiO2@mC复合材料的具体制备过程如下： [0032] 1)将4-5质量份的牛血清蛋白溶于400-500质量份水中，然后加入0.1-0.2质量份的NaOH混匀，得混合溶液； [0033] 2)在步骤1)得到的混合溶液中加入0.2-0.3质量份的Na2SnO3·3H2O和0.9-1.1质量份的钛酸四丁酯分散，然后加热至93-97℃，保温搅拌10-14h，得反应物； [0034] 3)将步骤2)得到的反应物冷却至室温，离心收集沉淀物，将沉淀物于55-65℃下真空干燥20-28h，得前驱体； [0035] 4)将步骤3)所得的前驱体在通入N2的条件下于500-900℃煅烧1.5-2.5h，冷却即得。 [0036] 步骤1)中加入NaOH的过程中进行搅拌。 [0037] 步骤2)中所述分散采用剧烈搅拌。 [0038] 步骤3)中沉淀物采用重复离心收集沉淀的方法得到。 [0039] 将步骤3)中收集的沉淀物用水洗涤3-5次，然后再真空干燥。 [0040] 步骤4)中以5℃min-1的升温速率升至煅烧温度。 [0041] 本申请的SnOx@TiO2@mC复合材料的制备方法再现性好，制得的复合材料为介孔炭包被SnOx、TiO2，SnOx@TiO2@mC纳米复合材料不仅具有高的比表面积和良好的电化学活性，而且具有特殊的生物亲和力，其电气性能和生物传感效率都非常的好。 [0042] 采用上述的SnOx@TiO2@mC复合材料的适体传感器，工作电极为金电极，在金电极的表面设置有SnOx@TiO2@mC复合材料层，SnOx@TiO2@mC复合材料层上连接有TOB靶标适体。 [0043] 上述的适体传感器，由包括如下步骤的方法制得：将所述SnOx@TiO2@mC复合材料悬浮液滴凃到预处理的金电极上，干燥10-14h，得SnOx@TiO2@mC/Au电极；然后将SnOx@TiO2@mC/Au电极浸入TOB靶标适体溶液中1.5-2.5h，即得。由于托普霉素和适配体序列中10个核苷酸之间共存在15个氢键结合位点，其中7个位于碱基和托普霉素之间，而8个在托普霉素和RNA骨架之间。靶向RNA与托普霉素相互作用之后会引起很大的构象变化，进一步导致电化学信号的变化。 [0045] 所述靶标适体可以为本领域常用的TOB靶标适体。优选的，所述TOB靶标适体为单链RNA，其序列为5'-ACUU GGUU UAGG UAAU GAGU-3'。 [0046] 上述的适体传感器的制备方法，其特征在于：包括：将所述SnOx@TiO2@mC复合材料浇铸到预处理的金电极上，干燥10-14h，得SnOx@TiO2@mC/Au电极；然后将SnOx@TiO2@mC/Au电极浸入TOB靶标适体溶液中1.5-2.5h，即得。 [0047] 所述预处理包括：将裸金电极用氧化铝浆抛光后用食人鱼溶液超声波洗涤1-2次，再用水洗涤1-2次，然后对金电极进行化学清洁。 [0048] 所述预处理包括：将裸金电极用氧化铝浆抛光后用预热的食人鱼溶液超声波洗涤1-2次，再用水洗涤1-2次，然后对金电极进行化学清洁。 [0049] 所述TOB靶标适体为单链RNA，其序列为5'-ACUU GGUU UAGG UAAU GAGU-3'。 [0050] 上述的SnOx@TiO2@mC复合材料、适体传感器在检测托普霉素方面的应用。 [0051] 本申请制得的适体传感器体现了高的测定效率，在0.01～5ng·mL-1的线性浓度范围内检测TOB的检出限为6.7pg·mL-1。另外，基于SnOx@TiO2@mC的适体传感器与共存物质表现出良好的选择性，高稳定性，可重复性，以及对实际样品的适用性。附图说明 [0052] 图1为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料的FTIR及XRD光谱图； [0053] 图2为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料的XPS测量光谱图； [0054] 图3为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料Sn 3d、Ti 2p和O 1s的XPS测量光谱图； [0055] 图4为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料C1s和N1s的XPS光谱图； [0056] 图5为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料在77K的氮气吸附～解吸等温线图； [0057] 图6为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料的拉曼谱图； [0058] 图7为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料的SEM图； [0059] 图8为SnOx@TiO2@BSA及SnOx@TiO2@mC材料的TEM和HR-TEM图； [0060] 图9为SnOx@TiO2@mC900材料制得的传感器的CV曲线和EIS曲线； [0061] 图10为SnOx@TiO2@mC材料制得的四种适配器的检测效率比较图； [0062] 图11为用于检测不同浓度的TOB的EIS图及ΔRct和TOB浓度之间的对应校准曲线图； [0063] 图12为适体传感器的选择性、重现性、稳定性测试图。 具体实施方式[0064] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。 [0065] 以下实施例及试验例中使用Cu Kα作为辐射源，在Rigaku D/Max-2500X射线测定仪上记录粉末X射线衍射测定。在配有Al阳极(Al-Kα1486.6eV)的Thermo Fisher ESCALAB 250Xi光电子能谱仪上进行X射线光电子能谱(XPS)。使用在400-4000cm-1范围内的Bruker TENSOR27 FTIR仪器从KBr粉末样品中记录傅里叶变换红外(FTIR)光谱。使用JSM-6490LV扫描电子显微镜进行场致发射扫描电子显微镜(FE-SEM)。使用JEOL JSM-6490L V系统进行透射电子显微镜(TEM)研究。使用Micromeritics ASAP 2010仪器进行N2吸附～解吸等温线，液体氮气温度为77K。比表面积由Brunauer-Emmett-Teller(BET)法计算。 [0066] 以下实施例及试验例中电化学测量在装有普通三电极系统的CHI760E电化学工作站(上海辰华)上进行，其中包括作为工作电极的金电极，作为对电极的Pt电极和Ag/AgCl-1(饱和KCl)作为参考电极。在5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)中扫描速率为50mV·s 的循环伏安法(CV为-0.2V至0.8V)混合物作为氧化还原探针在0.1M PBS(含有0.1M KCl的pH 7.4)中。电化学阻抗谱(EIS)记录在0.01Hz-100kHz的频率范围内，幅度为5mV。 [0067] 规定了各种浓度的TOB用于敏感性研究(在分析物检测的每个步骤之后，用PBS彻底漂洗电极)。对于每个测量，进行三个平行实验，并且在本申请中应用它们的平均值。 [0068] 实施例1 [0069] 制备SnOx@TiO2@BSA纳米复合材料和SnOxTiO2@mC纳米复合材料。 [0070] 使用BSA作为模板制备SnOx@TiO2@BSA纳米复合材料。具体的，包括： [0071] 1)将BSA(4.48g)溶于500mL超纯水中，并在磁力搅拌下加入NaOH(0.15g)以形成均匀溶液； [0072] 2)在先前的混合溶液中加入Na2SnO3·3H2O(0.266g)和钛酸四丁酯(1mL)，所得混合物在室温下再剧烈搅拌30min，然后在油浴中加热至95℃，加热搅拌12h； [0073] 3)冷却至室温后，通过反复离心收集SnOx@TiO2@BSA沉淀物，并用超纯水洗涤数次，在60℃下真空干燥24h； [0074] 4)随后，将SnOx@TiO2@BSA纳米复合材料在管式炉中用不同温度，即300,500,700,900℃下以5℃min-1的升温速率煅烧，并在N2气氛中分别保持2h。在自然冷却至室温后，得到SnOx@TiO2@mC纳米复合材料的黑色粉末(分别为SnOx@TiO2@mC300，SnOx@TiO2@mC500，SnOx@TiO2@mC700和SnOx@TiO2@mC900)。 [0075] 实施例2 [0076] 采用SnOx@TiO2@mC900纳米复合材料制备电化学核酸适体传感器。 [0077] 1、设计传感器 [0078] 众所周知，电极适配体上的探针堆积密度对其电化学生物传感器的敏感性起着重要作用。最佳包装密度取决于两个因素，即用于锚定的平台的强生物亲和力和探针所使用的特定适体结构。在本工作中，选择通过一步煅烧制备的SnOx@TiO2@BSA纳米复合材料形成的SnOx@TiO2@mC作为固定探针分子的敏感层。SnOx@TiO2@mC纳米复合材料对生物分子特别是寡核苷酸链表现出强烈的生物亲和力，由三维和多孔纳米结构带来的高的比表面积，以及源自中孔碳的良好电化学活性。使用RNA链5'-ACUU GGUU UAGG UAAU GAGU-3'(两端不修饰)作为探针检测靶分子托普霉素。由于托普霉素和适配体序列中10个核苷酸之间共存在15个氢键位点，其中7个位于碱基和托普霉素之间，而8个在托普霉素和RNA骨架之间。靶向RNA与托普霉素相互作用之后会引起很大的构象变化，进一步导致电化学信号的变化。 [0079] 2、配制各个溶液 [0080] 通过混合0.1M Na2HPO4和0.1M KH 2PO4制备磷酸盐缓冲溶液(0.1M PBS，pH7.4)。 [0081] 通过将1.65g K3[Fe(CN)6]，2.11g K4[Fe(CN)6]，8.0g NaCl和7.45g KCl溶解在1L PBS中来制备电解质溶液。 [0082] 在0.1M PBS(pH 7.4)中制备适体溶液(100nM)和不同浓度的TOB溶液(即0.01,0.05,0.1,0.5,1和5ng·mL-1)；适体为序列为5'-ACUU GGUU UAGG UAAU GAGU-3'的RNA单链。 [0083] 所有溶液在每个实验之前制备并在4℃下储存直至使用。 [0084] 称量1mg SnOx@TiO2@mC材料置于2mL超纯水中分散均匀以备使用。 [0085] 3、制备传感器 [0086] 直径3mm的裸金电极用氧化铝浆(0.05μm)抛光，然后用食人鱼溶液(v(H2SO4):v(H2O2)＝7:3)和超纯水进行超声波洗涤。然后，通过在CHI760E电化学工作站(上海辰华)上的-0.2V至1.6V(相对于Ag/AgCl)0.5M H2SO4中的氧化还原循环对金电极进行电化学清洁。-1 SnOx@TiO2@mC900悬浮液的浓度为0.5mg·mL 。然后，将5μL SnOx@TiO2@mC悬浮液浇铸到预处理的金电极上，并在环境空气中干燥12h，其以SnOx@TiO2@mC900/Au的形式供给。然后，将SnOx@TiO2@mC900/Au电极浸入TOB靶标适体(Apt)溶液(100nM)中2h，并用PBS彻底洗涤。得到了基于Apt/SnOx@TiO2@mC900/Au的电化学适体传感器。为了比较，以相同的方式制备SnOx@TiO2@mC300，SnOx@TiO2@mC500和SnOx@TiO2@mC700适体传感器。 [0087] 实施例3 [0088] 本实施例中的SnOx@TiO2@mC复合材料，具体制备过程如下： [0089] 1)将4质量份的牛血清蛋白溶于400质量份水中，然后加入0.1质量份的NaOH搅拌混匀，得混合溶液； [0090] 2)在步骤1)得到的混合溶液中加入0.2质量份的Na2SnO3·3H2O和0.9质量份的钛酸四丁酯剧烈搅拌分散，然后加热至93℃，保温搅拌10h，得反应物； [0091] 3)将步骤2)得到的反应物冷却至室温，重复离心收集沉淀物，收集的沉淀物用水洗涤3次，然后于55℃下真空干燥20h，得前驱体； [0092] 4)将步骤3)所得的前驱体在通入N2的条件下，以5℃min-1的升温速率升至煅烧温度900℃煅烧1.5h，冷却即得。 [0093] 本实施例中核酸适体传感器，制备过程如下：将裸金电极用氧化铝浆抛光后用热食人鱼溶液超声波洗涤1次，再用水洗涤1次，然后对金电极进行化学清洁；然后将上述制得的SnOx@TiO2@mC复合材料浇铸到预处理的金电极上，干燥10h，得SnOx@TiO2@mC/Au电极；然后将SnOx@TiO2@mC/Au电极浸入TOB靶标适体溶液中1.5h，即得。 [0094] 实施例4 [0095] 本实施例中的SnOx@TiO2@mC复合材料，具体制备过程如下： [0096] 1)将5质量份的牛血清蛋白溶于500质量份水中，然后加入0.2质量份的NaOH搅拌混匀，得混合溶液； [0097] 2)在步骤1)得到的混合溶液中加入0.3质量份的Na2SnO3·3H2O和1.1质量份的钛酸四丁酯剧烈搅拌分散，然后加热至97℃，保温搅拌14h，得反应物； [0098] 3)将步骤2)得到的反应物冷却至室温，重复离心收集沉淀物，将沉淀物用水洗涤5次，于65℃下真空干燥28h，得前驱体； [0099] 4)将步骤3)所得的前驱体在通入N2的条件下，以5℃min-1的升温速率升至煅烧温度700℃煅烧2.5h，冷却即得。 [0100] 本实施例中核酸适体传感器，制备过程如下：将裸金电极用氧化铝浆抛光后用食人鱼溶液超声波洗涤2次，再用水洗涤2次，然后对金电极进行化学清洁；然后将上述制得的SnOx@TiO2@mC复合材料浇铸到预处理的金电极上，干燥14h，得SnOx@TiO2@mC/Au电极；然后将SnOx@TiO2@mC/Au电极浸入TOB靶标适体溶液中2.5h，即得。 [0101] 试验例1 [0102] 检测SnOx@TiO2@mC系列的纳米复合材料的化学和晶体结构。 [0103] 记录制备的SnOx@TiO2@mC系列的纳米复合材料样品的FT-IR光谱，以鉴定纳米复合材料中化学键的类型。结果如图1所示，(A)FT-IR和(B)XRD光谱(a)SnOx@TiO2@BSA,(b)SnOx@TiO2@mC300,(c)SnOx@TiO2@mC500,(d)SnOx@TiO2@mC700,和(e)SnOx@TiO2@mC900。 [0104] 对于SnOx@TiO2@BSA复合材料(如图1-A曲线a所示)，3420cm-1处的峰可能来自O-H-1 -1的收缩振动。在蛋白质二级结构独特的光谱中发现了两个区域(1,700cm 至1,600cm 和1, 550cm-1至1,500cm-1)，对应于酰胺I和II的吸收光谱。在不同温度下制备SnOx@TiO2@mC后，对于SnOx@TiO2@mC(如图1-A中曲线b，c，d和e所示)，蛋白质和O-H的特征峰消失，而来自BSA的-CHx的2850-3000cm-1处的峰值严重下降。在500-700cm-1处的宽峰归因于Ti-O-Ti或Sn-O-Sn-1 伸缩振动。SnOx@TiO2@mC900在630cm 处显示出强峰，表明形成了结晶TiO2和SnOx。 [0105] 使用XRD表征SnOx@TiO2@mC纳米复合材料的晶体结构(如图1-B所示)。对于SnOx@TiO2@BSA(曲线a)和SnOx@TiO2@mC300(曲线b)，没有观察到明显的峰，因为SnOx和TiO2纳米颗粒被的来自BSA分子的碳层覆盖。在较高的温度下，例如500℃(曲线c)，可以观察到Sn(JCPDS卡号04-0673)和锐钛矿TiO2(JCPDS卡号21-1272)衍射图。在SnOx@TiO2@mC700(曲线d)的情况下，2θ＝27.5°，36.1°，41.3°，44.0°，54.3°，56.6°和69.0°处的峰可以被索引到(110)，(101)，(111)，(210)，(211)，(220)和(301)晶面的金红石TiO2(JCPDS 21-1276)。另外，在2θ＝26.6°，33.9°和51.8°的峰被归属于典型的四方晶SnOx(JCPDS卡41-1445)。当煅烧温度升高到900℃(曲线e)时，样品的XRD图谱显示了Sn，SnOx和金红石型TiO2的特征衍射峰。 [0106] 通过XPS分析研究了SnOx@TiO2@mC和SnOx@TiO2@BSA复合材料的化学成分的变化。结果如图2、3、4所示，图2中(a)SnOx@TiO2@BSA,(b)SnOx@TiO2@mC300，(c)SnOx@TiO2@mC500，(d)SnOx@TiO2@mC700和(e)SnOx@TiO2@mC900的XPS测量光谱；图3中(A)Sn 3d(B)Ti 2p和(C)O 1s(a)SnOx@TiO2@BSA,(b)SnOx@TiO2@mC300,(c)SnOx@TiO2@mC500,(d)SnOx@TiO2@mC700和(e)SnOx@TiO2@mC900的XPS光谱；图4中SnOx@TiO2@BSA(a1,a2),SnOx@TiO2@mC300(b1,b2),SnOx@TiO2@mC500(c1,c2),SnOx@TiO2@mC700(d1,d2),和SnOx@TiO2@mC900(e1,e2)的C1s和N1s的XPS扫描谱图(如图2)表明，五个样品中存在C，N，Ti，Sn和O元素。由于蛋白质的存在，也观察到P和S的变化。每种元素的原子比(％)总结在表1中。随着煅烧温度从300℃升高到900℃，C原子从 44.15％升高到75.58％。图4中SnOx@TiO2@BSA和SnOx@TiO2@mC样品的C 1s XPS光谱，(a1，b1，c1，d1和e1)分为五个成分。最低结合能量特征(284.6eV)是由于C-C/C-H组。第二个峰是由于C-S/C-N基团(285.7eV)，因此对应于BSA的结构。以286.6eV为中心的峰归因于C-O基团。在287.8和292.0eV的峰为蛋白质分子中的N-C＝O和π-π*。样品的N 1s的XPS光谱主要由两部分组成，可以分成C-N/N-H(398.4eV)和N-C＝O(400.4eV)(a2，b2，c2，d2和e2)。如图3-A所示，在五个样品的XPS光谱中观察到大量的Sn 3d信号，其中487.2和495.6eV处的两个分离的峰分别为Sn 3d5/2和Sn 3d3/2。 [0107] 表1 在300,500,700和900℃下制备的SnOx@TiO2@BSA和SnOx@TiO2mC的原子比％[0108] [0109] 在BSA为模板制备的SnOx@TiO2纳米复合材料上进行了N2气体吸附研究，如图5所示，图5中SnOx@TiO2@BSA,SnOx@TiO2@mC300,SnOx@TiO2@mC500,SnOx@TiO2@mC700,和SnOx@TiO2@mC900纳米复合材料在77K的氮气吸附～解吸等温线。 [0110] 所有样品的等温线相似，可以鉴定为IV型，这是介孔材料的特征。纳米复合材料显示I型和IV型N2吸附～解吸等温线的组合，这是同时具有微孔和介孔的特征。由BJH法得到SnOx@TiO2@BSA的BET表面积约为161.9m2·g-1，平均中孔尺寸为34nm。 [0111] 如表2所示，在300℃煅烧后，材料的BET表面积降至152.1m2·g-1，表明可能是中孔C堵塞碳孔。对于SnOx@TiO2@mC500和SnOx@TiO2@mC700，BET表面积从38.8到48.1m2·g-1。在SnOx@TiO2@mC900的情况下，等温线可以确定为IV型，这是介孔材料的特征。SnOx@TiO2@mC900表现出IV型N2吸附～解吸等温线，这是介孔的特征。中孔碳形成后，表面积大大增加到98.2m2·g-1。介孔结构和相对较高的表面积可以增强纳米复合材料向适体链的固定能力。 [0112] 表2 SnOx@TiO2@BSA在300,500,700和900℃下煅烧的结构特性 [0113]a 2 -1 材料 S总(m·g ) SnO2@TiO2@BSA 161.9 SnO2@TiO2@mC300 152.1 SnO2@TiO2@mC500 38.8 SnO2@TiO2@mC700 48.1 SnO2@TiO2@mC900 98.2 [0114] 试验例2 [0115] SnOx@TiO2@mC复合材料的拉曼光谱。 [0116] 通过拉曼光谱研究了SnOx@TiO2@mC纳米复合材料的形成性质(如图6所示，(a)SnOx@TiO2@BSA,(b)SnOx@TiO2@mC300，(c)SnOx@TiO2@mC500，(d)SnOx@TiO2@mC700，(e)SnOx@TiO2@mC900复合材料的拉曼谱图)。对于原始的SnOx@TiO2@BSA，没有观察到特征峰(曲线a)。对SnOx@TiO2@mC300纳米复合材料进行分析，得到相同的结果，表明在300℃下未形成碳相。当煅烧温度升至500℃时，拉曼光谱结果显示，复合材料出现了两个谱带，D(～1350cm-1)和G(～1585cm-1)带，这是由于材料的局部缺陷/紊乱和碳材料的sp2杂化造成的。煅烧温度从 500℃升至900℃后，对于SnOx@TiO2@mC500，SnOx@TiO2@mC700和SnOx@TiO2@mC900三种材料，D和G带的强度比(R＝ID/IG)为0.97,0.96和1.03。ID/IG强度比从0.96(SnOx@TiO2@mC500)稍微增加到SnOx@TiO2@mC900的1.03，表明在较高温度下形成较小的平面内sp2结构域。温度在500- 900℃时，形成的为介孔碳。 [0117] 试验例3 [0118] SnOx@TiO2@mC系列纳米复合材料的表面形貌。 [0119] SnOx@TiO2@BSA纳米复合材料表现出不规则的颗粒状，其聚集成非常松散和多孔的结构。随着退火温度从300℃提高到900℃，纳米颗粒的尺寸增加，这是由于SnOx和TiO2晶体的形成(如图7所示，(a)300,(b)500,(c)700,(d)900℃制备的SnOx@TiO2@mC的SEM图像)。SnOx@TiO2@mC纳米复合材料的TEM图像(图8-a，c，e和g，依次为300℃、500℃、700℃、900℃)证明SnOx或TiO2纳米颗粒被碳层包埋。还对SnOx@TiO2@mC进行了HR-TEM和衍射分析。SnOx和TiO2纳米晶体的HR-TEM图像，其中晶格间距确定为Sn(200)的0.292nm，SnO(101)的 0.298nm，SnO2(110)0.335nm，锐钛型TiO2(101)0.351nm，金红石TiO2(110)0.324nm，如图8(b，d，f和h，依次为300℃、500℃、700℃、900℃)所示，它们对应于XRD结果。值得注意的是，当煅烧温度高达900℃时，形成直径约500～900nm的松散碳球(图8g中的插图)，这可能会影响材料的电气性能和生物传感效率的相关纳米复合材料传感器。 [0120] 试验例4 [0121] SnOx@TiO2@mC系列纳米复合材料的电化学性能 [0122] 为了评估基于SnOx@TiO2@mC纳米复合材料的TOB检测的适体传感器的灵敏度和效率，在含0.14M NaCl和0.1M KCl的5mM Fe(CN)63-/4溶液中测量CV和EIS。 [0123] 结果如图9和图10所示，图9(a)CV曲线和(b)EIS曲线是检测程序使用基于SnOx@TiO2@mC900 5mM的Fe(CN)63-/4-传感器检测TOB的伏安特性曲线(插图中(b)是Randles等效电路，在Rs溶液电阻，Rct是电荷转移电阻，CPE是恒定的相位元件，W是Warburg阻抗)；图10基于(a)SnOx@TiO2@mC300,(b)SnOx@TiO2@mC500,和(c)SnOxTiO2@mC700的电化学适体传感器在含有0.14M NaCl和0.1M KCl的5mM Fe(CN)63-/4-的TOB检测的EIS图。(d)使用TOB检测程序中的Rct值(ΔRct)的变化的四种适配器的检测效率比较。 [0124] 如图9-a所示，裸Au电极的CV显示一对显著的氧化还原峰。对于SnOx@TiO2@mC改性电极(SnOx@TiO2@mC/Au)，电流响应略有下降。当目标适体被固定在SnOx@TiO2@mC膜(Apt/SnOx@TiO2@mC/Au)的表面上时，电流响应明显降低，因为适体的覆盖物阻止电子进入改性表面。在TOB检测(TOB/Apt/SnOx@TiO2@mC/Au)之后，电流响应持续下降，导致系统的电子转移效率较低。基于四种适配器的TOB检测的EIS如图9-b和10-a、b、c所示。观察到在TOB检测过程中Rct值连续增加的类似趋势。在SnOx@TiO2@mC900的情况下，裸露的Au电极呈现几乎直线，其Rct值为0.12kohm。对于SnOx@TiO2@mC900修饰的Au电极，Rct值增加到0.32kohm，这归因于电极在电极-电解质溶液界面处的转移能力降低。适体在SnOx@TiO2@mC900的表面上的锚定导致由于阻挡层的形成而引起的Rct值(0.62kohm)的增加。在1ng·mL-1TOB存在下，适体链优先与靶分子结合，导致Rct值明显增加(2.37kohm)。由于Rct(ΔRct)值的变化可以表示阻挡层的结合情况。在TOB检测过程中从每个步骤计算ΔRct值，这些总结如图10-d所示，以比较不同材料基适配器的检测效率。结果表明，SnOx@TiO2@mC900表现出最佳的适体定位量和TOB的检测效率。因此，在以下实验中使用基于SnOx@TiO2@mC900纳米复合材料的适体传感器进行进一步检测TOB的灵敏度测试。 [0125] 试验例5 [0126] 基于SnOx@TiO2@mC纳米复合材料的电化学核酸适体传感器的灵敏度。 [0127] 为了评估TOB检测的灵敏度，Apt/SnOx@TiO2@mC900/Au电极吸附在0.01至5ng·mL-1范围内不同浓度的TOB，其EIS曲线如图11-a所示，(a)EIS图用于检测不同浓度的TOB。浓度为0,0.01,0.05,0.1,0.5,1和5ng·mL-1；(b)ΔRct和TOB浓度之间的对应校准曲线。插图：线性拟合曲线ΔRct作为TOB浓度对数的函数。误差条代表三个平行实验的标准偏差。随着TOB浓度的增加，随着其在复合材料表面上的吸附形成，Rct值降低。复合电极的Rct值与SnOx@TiO2@mC吸附值之间的差异△Rct，复合电极作为测量信号。△Rct值与TOB浓度呈对数线性关系(如图11-b)。TOB的动态检测范围为0.01～5ng·mL-1，回归方程为△Rct(kohm)＝1.716+-1 0.877logCTOB(ng·mL )，回归系数为0.9914。在信噪比为3时，最低检测限(LOD)计算为 6.7pg·mL-1。此外，开发的TOB检测传感器的分析性能与文献报道的其他测定方法的分析性能进行了比较，总结在表3中。所提出的传感器的线性范围和LOD显著提高，并且还实现了较低的LOD。 [0128] 表3 所构筑传感器与其他检测方法的对比 [0129] [0130] 试验例6 [0131] 核酸适体传感器的选择性、可重复性及稳定性及对实验样品的测定。 [0132] 1、对制备的电化学适体传感器的用1ng·mL-1TOB在各种干扰物，包括(Mg2+，Ca2+，Cl-，SO42-，NO3-和CO32-)离子，生物分子(葡萄糖，L-丙氨酸和DL-苯丙氨酸(DL-PHE))，浓度相对较高(100ng·mL-1)的抗生素(卡那霉素(KANA)，硫酸链霉素(ST)，盐酸强力霉素(Doxy)和盐酸土霉素(OTC))里进行选择性评估。很明显，只有TOB显示出ΔRct值(1.76kohm)的剧烈变化。Ca2+，L-丙氨酸，KANA和OTC的共存(分别为0.21,0.24,0.17和0.18kohm的ΔRct值)在TOB检测中表现出非常低的表观干扰。没有观察到其他离子，生物分子和抗生素的实质信号，证实了所提出的测定法的优异选择性(图12-a)。 [0133] 本申请分别平行制备了五个SnOx@TiO2@mC900基适体传感器，并研究了选择性，重复性和稳定性，结果如图12所示，(a)选择性和(b)用于检测TOB的SnOx@TiO2@mC900基适体传感器的重现性(c)传感器检测1ng·mL-1TOB的稳定性测试。 [0134] 研究它们的ΔRct值(图12-b)，确定1ng·mL-1TOB的相对标准偏差(RSD)为4.3％，表明开发的适应传感器具有可接受的重复性。另外，将SnO2@TiO2@mC900基适配器在4℃下储存在冰箱中，每天测试一次灵敏度。对于1ng·mL-1TOB的ΔRct反应在15天后为其初始值的90.2％，表明适配器的稳定性也较好(图12-c)。根据结果，提出的适配传感器的选择性，重复性和稳定性都是可以接受的。 [0135] 2、人体尿液和血清的化学成分相当复杂，包括蛋白质，离子，营养物质和其他物质。这些组分中的一些可能会干扰检测信号，导致非特异性Rct或电流变化。为了避免血清或尿液的非特异性吸附，加标样品用PBS稀释100倍。将不同浓度的TOB分别加入血清和尿液配制成不同浓度的实际样品溶液(即0.01,0.05,0.1,1和5ng·mL-1)，然后按照上述步骤进行预处理和分析。然后进行实际样品的电化学测试。 [0136] 分析结果如表4所示。从表4可以看出，所有测试的人血清稀释液都提供了合适的剂量反应曲线，证实亲和力结合需要特定的盐浓度。还检查了当没有进行盐校正测定时，位移事件不发生(数据未显示)。必须强调，即使在最低稀释的情况下，校准曲线也呈现出非常相似的斜率。这些结果表明离子强度是识别事件的关键实验条件。稀释度仅改变检测限。稀释度越高，检测限就越差。为了能够确定血清中的托普霉素，选择最低稀释度是因为线性范围覆盖整个生理范围。在这种情况下，这种适应传感器可用于治疗控制。 [0137] 表4 血清与尿液的EIS测定结果 [0138] [0139] [0140] 总结：概括来说，以BSA为模板，制备了SnOx@TiO2@BSA纳米复合物，进一步通过在不同温度下煅烧而得到一系列嵌入SnOx和TiO2纳米晶体的介孔碳复合材料。SnOx@TiO2@BSA复合物合成方法是用钛酸四丁酯和三水合硒酸钠为前驱体及BSA为模板通过一步法获得。结果证明通过升高煅烧温度，BSA分解为多孔碳材料，无机氧化物转化为纳米晶体，包括SnO,SnO2,Sn和TiO2纳米晶体。在这一系列的SnOx@TiO2@mC纳米复合物中，SnOx@TiO2@mC900纳米复合材料为分布均匀的纳米微球，具有较大的比表面积(98.2m2·g-1)且展现了较好的电化学活性。同时，以该材料为支撑材料显示出对核酸适体高的生物亲和性。构筑的以SnOx@TiO2@mC900为基体的电化学传感器对TOB检测显示出超低的检测限(6.7pg·mL-1)。这种材料用于检测TOB同时还显现出优良的选择性、良好的重现性及稳定性。这项工作制备了新型嵌入纳米晶体的介孔碳材料，其具有良好的电化学活性和可控的形貌，所构筑的核酸适体电化学生物传感器能够用于有害氨基糖苷类抗生素的灵敏快速检测。 |
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