具有两性离子的纳米粒子表面改性用分子筛的合成及其应用 |
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| 申请号 | CN201180052679.3 | 申请日 | 2011-10-28 | 公开(公告)号 | CN103189306B | 公开(公告)日 | 2016-10-05 |
| 申请人 | 浦项工科大学校产学协力团; | 发明人 | 金圣智; 朴埈赫; 南周泽; 陈昊; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种可提高 纳米粒子 分散性的表面改性方法及利用该方法制备的分散性得到提高的纳米粒子，更具体地，涉及纳米粒子表面结合两性化合物，从而提高表面分散性的方法及利用该方法的纳米粒子。依据本发明的纳米粒子，在纳米粒子表面同时形成阴离子与阳离子，具有电 稳定性 ，因此可在宽pH范围内保持稳定，在盐浓度较高时也可稳定分散，且减少非特异性 吸附 。利用本发明的纳米粒子可制备将非特异性吸附降至最小化的新型特异性物质或 传感器 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种纳米粒子，其特征在于，其由下列化学式(I)所示的两性离子分子筛表面改性， |
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| 说明书全文 | 具有两性离子的纳米粒子表面改性用分子筛的合成及其应用技术领域[0001] 本发明涉及一种可提高纳米粒子分散性的表面改性方法及利用该方法制备的分散性得到提高的纳米粒子，更具体地，涉及纳米粒子表面结合两性化合物，从而提高表面分散性的方法及利用该方法制备的纳米粒子。 背景技术[0002] 已公开有多种用于制备纳米粒子的方案，除了传统物理粉碎方法外还有火焰裂解法（flame pyrolysis）、喷雾热分解法（spray pyrolysis）、溶胶-凝胶法（sol-gel process），溶剂热分解法（solvothermal method）等方法。纳米粒子的情况下，由于形成纳米粒子时，纳米粒子表面存在不稳定性，纳米粒子形成的同时会出现聚团现象，为克服这种现象开发有多种方案。 [0003] 三星电气有限公司在韩国公开专利第2008-0004831号中公开有一种金属氧化物纳米粒子及其制备方法。所述方法是用限制分子包绕铜前体表面，从而制得稳定的金属氧化物纳米粒子；在韩国专利第820231号中公开有一种金属纳米粒子的制备方法，所述方法是喷雾注入金属前体溶液，从而制备金属纳米粒子；并且韩国专利第790948号中公开有一种金属纳米粒子的制备方法，所述方法是在金属前体溶液中使用分散稳定剂，从而制备金属纳米粒子。 [0004] 成均馆大学的产学协力团在韩国专利第861355号中公开有利用化学镀液的纳米粒子制备方法；韩国生产技术研究院在韩国公开专利第2008-81630号公开有一种金属纳米粒子的制备方法，所述方法是将化学镀液喷雾于基片上，从而制备金属纳米粒子。 [0005] 发明人崔永浩在韩国专利第555584号中公开有一种利用电分解法制备纳米粒子的方法；高丽大学产学协力团在专利第724807号中公开有一种利用油酸制备锡氧化物纳米粒子的方法和锡氧化物纳米粒子。 [0006] 并且，也有在金属纳米粒子中导入如胺或者抗坏血酸钠等配体，并固定于活性炭、无机氧化物、高分子聚合物、沸石等上，使其稳定的方案。延世大学在韩国公开专利第10-2008-0021535号中公开有一种利用多官能团配体对纳米粒子表面进行改性及制备水溶性纳米粒子的方法。 [0007] 能在水溶液中稳定分散的纳米粒子作为革新性的材料，其是生物工程及生物医学工程研究中备受瞩目的材料，其在国内外需求均非常高，因此仍在从不同方面对能使多种纳米粒子在水溶液中稳定分散的技术进行研究。对于获得均匀、稳定的纳米级的新型纳米粒子及其制备方法方面也在不断提出要求。 发明内容[0008] 本发明要解决的技术问题 [0009] 本发明所要解决的问题是提供一种在宽pH范围和盐浓度下稳定的新型纳米粒子。 [0010] 本发明所要解决的另一问题是提供一种在宽pH范围和盐浓度下稳定的新型纳米粒子的制备方法。 [0011] 本发明所要解决的再一问题是提供一种能提高纳米粒子稳定性的改性方法。 [0012] 本发明所要解决的又一问题是提供一种能提高纳米粒子稳定性的新型化合物。 [0013] 本发明所要解决的又一问题是提供一种在宽pH范围和盐浓度下具有稳定性的新型纳米级量子点及其用途。 [0014] 技术方案 [0015] 为解决上述问题，依据本发明的纳米粒子的特征在于，其是表面同时具有阴离子和阳离子的两性纳米粒子。 [0016] 本发明的纳米粒子理论上不会被限制，但两性离子分子在宽pH范围，高盐浓度下，与仅带正电荷或者负电荷的分子相比，受较少的因离子引起的电荷屏蔽效应，因此能形成稳定的分散体。 [0017] 本发明中，上述纳米粒子是指直径小于1000nm的纳米级粒子。在部分实施例中，上述纳米粒子根据美国国家科学基金会（National Science Foundation）的定义，其直径小于300nm。部分具体例中，纳米粒子根据国立卫生研究院（National Institutes of Health）的定义，其直径小于100nm。 [0018] 本发明中，上述纳米粒子可由金属、非金属、陶瓷、塑胶、高分子聚合物、生物学材料、半导体、量子点、复合材料等多种材料构成，或者也可以是荧光性粒子。上述所谓的复合材料例如可以是内部有类似于陶瓷或高分子聚合物等非金属材质的成核剂，外部则可以是用金属涂布的粒子。 [0019] 本发明中，上述纳米粒子可以由一个纳米粒子构成，或者也可以是由多个金属纳米粒子聚集成一个纳米粒子的形态。上述纳米粒子可以是内部充满的高密度纳米粒子，或者也可以是内部形成有隔室或空间的纳米粒子形态。本发明的一个实施方式中，上述纳米粒子可构成单层或多层的形态。 [0020] 本发明中，所谓总体上呈中性是指粒子表面的阴离子和阳离子保持均衡，从而表现为中性。本发明中，上述所谓的中性是指采用动态光散射法测定表面电荷时，测定值一般在-5mV至+5mV之间，其表面电荷的绝对值不超过10mV。 [0021] 本发明的一个方面，上述纳米粒子是纳米粒子的表面结合两性离子分子筛或化合物的两性纳米粒子。 [0022] 本发明中，上述两性离子分子筛或两性离子化合物是指化合物中包含各一个以上的阴离子和阳离子的化合物。本发明中，上述分子筛或者化合物可以是例如单体，二聚体、三聚体等低聚物或者高分子化合物，优选分子筛长度较纳米粒子的外径短，从而分子筛不能报复纳米粒子，并且在分散的状态下结合成从粒子中心向外部延伸的形态，从而使两性离子分布在纳米粒子的最外侧表面。 [0023] 本发明中，上述两性离子化合物如图1所示，可由与纳米粒子结合的表面结合区域，连接区域及官能团区域构成，最好为一端形成与纳米粒子的结合部，另一端具有形成两性离子的形态。 [0024] 在本发明的实施方式中，表面结合区域是具有能与纳米粒子强力结合能力的部分，只要能与纳米粒子表面稳定结合即可使用，例如可以是巯基（-SH）、二巯基（-CS2，-PS2，-CH（SH）（CHCH2SH））、氨基（-NH2,-NH）、膦酸酯基（-PO3H）、磷基 （-P）、氧化膦基 （-P=O）、羧基（-COOH）、羟基（-OH）、咪唑基（-imidazole）、二醇基 （-diole）等，但不局限于此。 [0025] 本发明中，上述连接区域是将表面结合区域和官能团区域有效连接的部分，例如包括酰胺键（-CONH-）、碳键（-（CH2）n-），聚乙二醇（-（CH2CH2O）n-）、三唑（triazole）等，但不局限于此。在发明的实施方式中，上述连接区域可以结合一个以上的分子而形成，最好形成为可将分子整体以高密度涂布于纳米粒子表面。 [0026] 本发明中，上述官能团区域是具有将纳米粒子稳定分散于溶剂的功能，并以化学方式与连接区域结合的部分，两性离子包括磺酸甜菜碱基 （-N（+ CH3）2CH2CH2CH2SO3-）、羧酸甜菜碱基 （-N（+ CH3）2CH2CH2CH2COO-）、磷酰胆碱 基 （-PO4-CH2CH2N+）等，根据目的的不同不仅局限于此。用这些分子进 行表面取代的纳米粒子，最外层表面露出官能团区域，因此能使得纳米粒子具有两性离子分子本身的特性。 [0027] 在本发明的一个实施方式中，半胱氨酸（cystein）是构成蛋白质的单体，即作为氨基酸的一种，由于其具有巯基（-SH），因此这部分是与纳米粒子表面结合的表面结合区域，另一端同时具有羧酸基（-COO-）和胺基（-NH3+），因此这部分成为官能团区域。结果发现用半胱氨酸处理表面的纳米粒子，在pH7附近时半胱氨酸起到两性离子分子筛的作用，可使表面电荷接近于中性。 [0028] 本发明的一个方面，本发明的纳米粒子制备方法，其特征为，该方法是将纳米粒子与两性离子分子筛反应，制备两性离子纳米粒子的方法。 [0029] 在本发明的实施方式中，上述两性离子纳米粒子可通过以下步骤制备：在纳米粒子表面导入能够与两性离子分子筛进行取代的表面分子筛，例如导入配体；以及将上述表面分子筛和两性离子分散体进行取代。 [0030] 本发明的一个方面，本发明的特征在于，在纳米粒子表面形成两性离子分子筛，从而抑制纳米粒子的非特异性吸附。 [0031] 其中，术语“非特异性吸附”是指纳米粒子或纳米粒子内部所包含的物质与外部物质特异性结合以外的力，例如由离子键，分子间引力形成的吸附。 [0032] 在此，术语“抑制”是指纳米粒子表面形成两性离子分子筛后，纳米粒子的吸附力在特定环境下减小。 [0033] 理论上虽然没有限制，但本发明的纳米粒子，表面为稳定的中性状态，因此在多种环境中可减少由离子键或者分子间引力所产生的非特异性吸附。 [0034] 在本发明的一个实施方式中，量子点等荧光纳米粒子在表面形成两性离子分子筛后非特异性吸附减少，对于粘附体的吸附力显著下降，例如生物体内细胞膜或塑胶表面等表面，尤其是表面带正电或负电静电的粘附体。 [0035] 本发明的一个方面，本发明的复合体，其特征为，其包含表面形成两性离子分子筛的纳米粒子和与上述纳米粒子结合的特异性结合体。 [0037] 本发明中，上述纳米粒子可有效地用作荧光体或载运体。在本发明的实施中，上述复合体中的纳米粒子为荧光性、吸光性或发光性纳米粒子，例如可为纳米级的量子点，此时复合体不会发生纳米粒子的非特异性吸附，而是依靠特异性结合体与特定物质结合，产生荧光、吸光或者发光等现象。利用纳米粒子独特的光学特性的情况下，可用于磁共振成像的造影剂，生物体内近红外线荧光成像。可获得将两性离子分子导入至纳米粒子表面，并将非特异性吸附降至最低的纳米粒子。此时，由于将作为成像标记因子使用的纳米粒子的非特异性吸附降至最低，从而具有可选择性观察需要成像对象的优点。 [0038] 本发明的另一实施方式中，上述复合体中纳米粒子可以是包含生理学物质、药学物质或组合物的纳米大小的载运体。此时，依靠特异性结合体的作用，复合体能够选择性地运输或者结合至需要此药学或生理学物质的部位。 [0039] 本发明的一个方面，提供一种两性离子纳米粒子的制备方法，其特征为，所述方法是在分散介质中使纳米粒子和两性离子分子筛反应，从而制备两性离子纳米粒子。 [0040] 本发明中，上述分散介质为有机溶剂、水或者其两者的混合物，且上述两性离子分子筛与分散的纳米粒子，通过配体取代等方法反应。 [0041] 本发明的另一方面，提供由下述化学式（Ⅰ）构成的两性离子分子筛： [0042] [0043] 本发明的另一方面，提供依据图2制备上述化学式（Ⅰ）所示的两性离子分子筛的方法。 [0044] 本发明的又一方面，本发明的特征在于，将两性离子分子筛与表面结合，从而减少表面的非特异性吸附力。 [0045] 本发明中，上述表面是指通过多种物理化学方法能与两性离子分子筛结合的表面。例如可以为能够与两性离子分子筛结合的玻璃或高分子聚合物薄膜所形成的表面。 [0047] 正如本发明，表面导入有两性离子分子筛的传感器，由于非特异性吸附力弱，能将与生物体内其它蛋白质的非特异性吸附降至最低，从而可大大提高信噪比（signal/noise ratio），而信噪比是传感器最为重要的要求条件之一。 [0048] 有益效果 [0049] 两性离子分子改性的纳米粒子表面能在宽pH变化或高盐浓度环境中，保持其表面分子的官能团部位的性质不发生改变。因此，可以维持两性离子分子总体电荷接近于0的特性，使与蛋白质及磷脂的非特异性吸附最小化。附图说明 [0050] 图1为将用于表面改性分子的两性离子分子的结构模式图。 [0051] 图2表示两性离子分子的合成过程，其中（i）羰基二咪唑，N,N-二甲基乙二胺/无水氯仿；（ii）1,3-丙烷磺内酯/无水氯仿；（iii）硼氢化钠/去离子水。 [0052] 图3为在有机溶剂中，用两性离子分子对合成的纳米粒子进行表面取代，从而制备表面得到改性的两性离子分子的纳米粒子的模式图。 [0053] 图4为在有机溶剂中，用含有羧基的分子对合成的纳米粒子进行表面取代，从而制备改性的纳米粒子的模式图。 [0054] 图5为在有机溶剂中，用两性离子分子及含有羧基的分子同时对合成的纳米粒子进行表面取代，从而制备两种分子混合改性的纳米粒子的模式图。 [0055] 图6中左侧为量子点随pH环境变化（pH5-10）的水化尺寸，右侧为量子点随盐浓度变化（离子强度：0.05-5M）的水化尺寸。其值越高时，越不稳定，在水溶液中分散也越不均匀，形成凝集体使量子点的可应用性降低。 [0056] 图7是为了确认量子点与聚合物微球的非特异性结合的荧光显微镜照片，比例尺（scale bar）=5μm。 [0057] 图8是与量子点共同培养的子宫颈癌细胞的共聚焦显微镜照片，照片中绿色代表量子点，比例尺（scale bar）=20μm。 具体实施方式[0059] 实施例1 [0060] 两性离子配体的合成 [0061] 将硫辛酸（图2中的（1））溶解于无水氯仿后，在常温、真空环境中添加至1.3当量的羰基二咪唑中搅拌5分钟，后对剩余的除了羰基二咪唑的反应溶液层进行分离。在氮气环境中，将相当于5当量硫辛酸的N,N-二甲基乙二胺溶解于无水氯仿后，用冰浴降低其温度的状态下加入上述溶液搅拌1小时。其结果产物为图2中的（3）。将反应溶液用10%NaCl水溶液3次提取，、用三级蒸馏水（利用反渗透膜过滤的蒸馏水）进行1次提取并进行精制，然后加入1,3-丙烷磺内酯在常温搅拌24小时，滤出生成的固体（结果产物为图2中的（4））。然后用2N NaOH将该产物溶解于pH调至9的水溶液中，，添加2当量的NaBH4在常温下搅拌4小时。合成的两性离子配体（图2中的（5））不经过精制过程，直接使用。 [0062] 纳米粒子的合成 [0063] 本说明书中示出的纳米粒子的合成方法仅为多种合成方法中的一种典型例，其并不局限于此。为合成纳米粒子之一的量子点，需作如下准备。十八碳烯和油酰胺放入圆底烧瓶中，加热至100℃，并轮流交替为真空状态和注入氮气状态，且最终使周围环境替换为充满氮气的环境，之后使圆底烧瓶的温度升至300℃。将分别溶解镉（Cd）和硒（Se）的十八碳烯溶液以Cd：Se=1:5的比例同时添加至高温烧瓶中，此时的Cd与Se的比例可以根据所需要的纳米粒子的大小进行调节。后使反应容器烧瓶缓慢冷却，获得分散于有机溶剂中的纳米粒子。 [0064] 实施例2 [0065] 表面由两性离子表面分子改性的纳米粒子的合成 [0066] 将有机溶剂中合成的纳米粒子分散于氯仿中。将之前合成的两性离子分子（图2中的（5））过量溶解的水溶液与合成的纳米粒子在常温下搅拌。两性离子分子具有的官能团之一的二硫酚与以膦酸或一级胺作为官能团的有机分子配体相比，具有与纳米粒子（量子点）更强的表面结合力。因此，量子点表面的有机分子配体被两性离子分子进行配体取代，从而使量子点分散于水溶液层。之后将氯仿层进行层分离去除，仅对水溶液层进行透析，去除残余的配体。和图1一样，图3将使用的两性离子分子图式化。表面结合区域用四边形，连接区域用波浪线，官能团区域用椭圆形表示。 [0067] 实施例3（比较实施例1） [0068] 利用含有羧基（-COOH）的分子进行表面改性的纳米粒子的合成 [0069] 将有机溶剂中合成的纳米粒子分散于氯仿中。将之前合成的含有羧基的分子（图2中的（2））过量溶解的水溶液与精制的量子点在常温下搅拌。此时，纳米粒子表面的有机分子配体被含有羧基的分子进行配体取代，从而使纳米粒子分散于水溶液层。之后将氯仿层进行层分离去除，仅对水溶液层进行透析，去除残余的配体。和图1一样，图4将使用的含有羧基的分子图式化。表面结合区域用四边形，连接区域用波浪线，官能团区域用椭圆形表示。 [0070] 实施例4 [0071] 同时利用两性离子分子和含有羧基的分子进行表面改性的纳米粒子的合成 [0072] 将有机溶剂中合成的纳米粒子分散于氯仿中。将之前合成的两性离子分子（图2中的（5））和含有羧基的分子（图2中的（2））过量溶解的水溶液与精制的纳米粒子在常温下搅拌。此时，纳米粒子表面的有机分子配体同时被两性离子分子及含有羧基的分子配体进行配体取代，从而使量子点分散于水溶液层。之后将氯仿层进行层分离去除，仅对水溶液层进行透析，去除残余的配体。和图1一样，图5将使用的表面分子筛图式化。表面结合区域用四边形，连接区域用波浪线，官能团区域用椭圆形表示。 [0073] 实施例5 [0074] 测定用两性离子分子表面改性的纳米粒子水化尺寸随pH及盐浓度的变化 [0075] 进行纳米粒子的表面改性后，纳米粒子会表现出两性离子分子官能团区域的性质。为确认该现象，与实施例2一样用两性离子分子取代纳米粒子以及与实施例3一样用含有羧基（-COOH）的分子对纳米粒子进行表面取代，之后测定纳米粒子的水化尺寸。这里使用的纳米粒子是量子点，具有接受光之后能发出特定波长光的性质，此量子点均匀分散于溶液时，水化尺寸约为6-7nm。 [0076] 两性离子分子取代的纳米粒子的情况下（实施例2），随pH或盐浓度的变化，观察到的其水化尺寸的变化不是很大。但是作为对照组，官能团区域不是两性离子分子，而是由含有羧基（-COOH）的分子取代的纳米粒子（实施例3），随着pH或盐浓度的变化，其水化尺寸发生了显著的变化。结果表明，两性离子分子与对照组相比，可使纳米粒子表面在宽pH及盐浓度范围内保持稳定。能维持一定尺寸是指:两性离子分子可在多种水溶液环境中，使纳米粒子有效地分散和稳定化。 [0077] 实施例6 [0078] 确认与高分子聚合物微球非特异性吸附程度 [0079] 图7的结果表明，由两性离子分子取代的纳米粒子（实施例2）与聚合物微球间的非特异性结合，由于两性离子分子的表面取代发生了降低。通常例如DNA阵列分析（array assay），微型实验室（Lab on a chip）等，可携带、用于研究的基板基底的传感器，为了降低费特异性吸附程度，在基板表面涂布牛血清白蛋白（Bovine serum albumine）等生物分子。但是经此类方法处理的表面并不能使非特异性结合完全消失，即仍然会出现。 [0080] 因此，在类似方法实现的高分子聚合物表面上希望观察到纳米粒子的非特异性吸附发生减少的现象。首先在涂布由牛血清白蛋白聚合物微球中混入纳米粒子，经一定时间后充分清洗残余的量子点后，用荧光显微镜观察微球表面非特异性吸附的纳米粒子的荧光，本说明书中以量子点作为示例。 [0081] 可确认用羧基分子（-COOH）作为官能团区域分子进行表面取代的纳米粒子（实施例3），易吸附于聚合物微球表面，因此在微球表面可观察到纳米粒子（即，本说明书举例的量子点）的荧光。但是用两性离子分子进行表面取代的量子点的情况下，几乎观察不到荧光。因此可确定总体带中性电荷，使静电引力降至最低，从而显著降低了非特异性吸附程度。 [0082] 实施例7 [0083] 确认与活细胞的非特异性结合程度 [0084] 图8为分别用两性离子分子进行表面取代的量子点（实施例2）和含有羧基的分子进行表面取代的纳米粒子（实施例3）处理子宫颈癌细胞后，用共聚焦显微镜观察的图片。以下照片中显示绿色的部分为观察到量子点荧光的部分，此图片是仅对从细胞内部发出的荧光对焦，从而进行选择性观察。 [0085] 获得了与之前实施例6相似的结果，即用两性离子分子取代的纳米粒子（实施例2）与聚合物微球的非特异性吸附减少。将两性离子分子作为官能团区域，进行表面取代的量子点，与对照组，即使用含有羧基的分子进行表面取代的量子点相比，其细胞内部和轮廓部分完全没有观察到量子点的荧光。 [0086] 用两性离子分子取代的纳米粒子的情况下，可降低因与细胞表面的静电引力而引起的相互作用，因此，在细胞内部及轮廓未观察到由非特异性吸附引起的细胞内化。但是对照组，即使用含有羧基的分子进行表面取代的纳米粒子的情况下，可观察到对细胞的非特异性结合，还有它所导致的细胞内化。这些结果证明利用两性离子可显著降低量子点对于细胞的非特异性结合，从而揭示了该方法在纳米粒子表面改性技术方面的利用可能性，以将其用于V生物体成像技术开发中。 [0087] 实施例8 [0088] 确认利用量子点-蛋白质复合体的选择性标记能力 [0089] 用羧酸和两性离子同时进行表面取代的纳米粒子（实施例4）的情况下，可通过与生物分子之一的链霉亲和素的生物聚合，产生稳固的共价键，从而形成复合体。本说明书中纳米粒子以量子点为例，蛋白质以链霉亲和素为例，因此通过生物聚合合成了量子点-链霉亲和素复合体。图9是在涂布由生物素的聚合物微球中混入量子点-链霉亲和素复合体后，观察其荧光和透射成像的照片。链霉亲和素和生物素间由于多重氢键的作用，存在非常大的引力，即，抗体和抗原之间的结合等强大的分子间引力。因此链霉亲和素可轻易标记于涂布由生物素的聚合物微球上，量子点-链霉亲和素复合体也可因相同原理标记于涂布由生物素聚合物微球上。作为对照组，实施例4中合成的量子点，不与链霉亲和素构成复合体，而是直接混合于涂布有生物素的聚合物微球上时，由于量子点表面的两性离子分子，非特异性吸附程度降低，因此无法观察到量子点的荧光。 |
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