비피도박테리움 CECT 7765 및 과체중, 비만 및 관련 병리의 예방 및/또는 치료에서의 그의 이용

비피도박테리움 CECT 7765 및 과체중, 비만 및 관련 병리의 예방 및/또는 치료에서의 그의 이용{BIFIDOBACTERIUM CECT 7765 AND USE THEREOF IN THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF EXCESS WEIGHT, OBESITY AND RELATED PATHOLOGIES}

본 발명은 약학 조성물 또는 제제의 치료 활성 분야 및 식품 분야에 속한다. 특히, 본 발명은 비피도박테리움 슈도카테눌라텀 ( Bifidobacterium pseudocatenulatum ) CECT 7765 균주, 그의 세포 성분, 대사산물 및 분비된 분자, 다른 미생물과의 조합물, 및 상기 언급된 생성물들을 포함하는 조성물, 및 B. 슈도카테눌라텀 ( B. pseudocatenulatum ) 균주의 이용 또는 비만, 과체중, 고혈당증 및 당뇨병, 바람직하게는 제 2형 진성 당뇨병, 간 지방증 또는 지방간, 이상지질혈증(dyslipidemia), 대사성 증후군, 비만 및 과체중관련 면역계 기능이상, 및 비만 및 과체중 관련 장 미생물군의 불균형화된 조성의 예방 및/또는 치료를 위한 CECT 7765 균주의 이용에 관한 것이다.

과체중과 비만은 이들의 증가하는 만연함와 공동-질병상태로 인하여 오늘날 주요한 보건 문제 중 하나이다. 이들은 예로서, 대사성 증후군, 고혈압, 이상지질혈증, 당뇨병, 심혈관 질환, 동맥경화증, 간 지방증 또는 지방간 및 일부 유형의 암을 포함한다.

비만은, 체지방의 과도한 증가를 일으키는, 섭취(consumption)와 에너지 소비간의 양성적이며 장기간의 불균형의 결과로서 발생한다. 상이한 말초 조직과 기관들간의 소통을 가능하게 하는 신경내분비계 및 전체적으로 체중 조절에 기여하는 중추신경계에 의하여 합성된 펩티드 및 호르몬들이 에너지 균형 제어에 관여된다. 지방 조직 (렙틴) 및 췌장 (인슐린)으로부터의 신호들은 장기간 섭취 제어 (Konturek 등, 2004. J Physiol Pharmacol ., 55: 137~154)에 기초가 된다. 인슐린은 지방 조직의 적절한 작용 제어 및 그 안에서의 트리글리세라이드의 축적의 제어 및 글루코오스 섭취에 있어서 가장 중요한 호르몬이다. 지방은 인슐린 및 기타 호르몬 (렙틴)에 대한 반응물로서, 지단백질 리파제를 자극하고 지방분해는 억제함으로써 정상의 인슐린-민감성 지방 조직에 저장된다. 그러나, 비만과 관련된 지방 조직에서 지방산의 과도한 축적은 인슐린 민감성을 감소시키고, 이는 트리글리세라이드 형태의 유리 지방산의 축적을 몇몇 기관과 조직(간, 근육, 심장 등)으로 전환시켜서 렙틴 생산 또는 민감성에서의 변경을 일으키고 전염증성 시토카인 (proinflammatory cytokine) 합성을 증가시키는데, 이는 관련 질환들(대사성 증후군, 심혈관 질환, 등)의 발생 위험을 더욱 높인다. 인슐린 신호화(signaling)도 중추 신경계에서 에너지 균형 제어 및 글루코오스 항상성을 위해 필수적인데, 이는 식욕억제 인자들로서 함께 작용하여 섭취를 감소시키는, 렙틴과 같은 다른 조절 인자들과 이의 상호작용에 따라 달라진다 (Gerozissis K., 2004. Eur J Pharmacol ., 490(1-3): 59~70). 렙틴은 우선적으로 지방 조직에 의해, 그리고 보다 적은 양으로는 위(stomach)와 같은 다른 조직에 의하여 합성되는 호르몬/아디포카인(adipokine)으로, 이의 합성은 인슐린에 의하여 자극된다. 중추신경계 수준에서, 렙틴은 식욕을 억제하고, 에너지 소비를 증가시키며, 인슐린 분비를 촉진하는 췌장 β-세포 기능과 같은 생명유지 과정들(vital processes)에 이용된다 (La Cava A, Matarese G. The weight of leptin in immunity. Nat Rev Immunol. 2004 May;4(5):371~9). 말초적 수준에서, 렙틴은 지방산과 트리글리세라이드 합성을 감소시키고 지질 산화를 증가시킴으로써 작용한다. 그럼에도 불구하고, 비만 환자에서 이러한 아디포카인의 말초 농도는 비정상적으로 높고, 아디포카인 내성이 발생된다. 대사 장애에 대한 마커인 것에 추가하여, 비만 환자에서 높은 렙틴 농도는 면역 반응을 변경시킬 수 있으며, 비만 관련 염증 상태에 기여한다.

비만은 가벼운 만성 염증 상태로도 여겨지며, 이는 환자들이 평생 앓을 수 있는 제 2형 진성 당뇨병과 같은 대사 장애의 원인이 되는, 시토카인, 아디포카인 및 기타 전염증성 단백질의 지방 조직에서 전신 수준으로 높은 생산에 의하여 특징된다 (Tilg and Moschen, 2006. Nat Rev Immunol ., 6: 772~783). 비만 및 대사 장애들에 관련된 염증 인자들은 특히 전염증성 시토카인 TNF-α 및 IL6 및 마크로파지 화학주성인자(chemoattractant) 단백질 MCP1를 포함한다. 특히, TNF-α는 인슐린의 작용에 관련된 유전자들의 발현을 감소시키고 (예로서, 이의 수용체 유전자 발현), 인슐린 신호화를 약화시키고, 인슐린-자극된 지단백질 리파제의 작용을 억제한다. MCP1은 체중 증가와 관련된 지방 조직 내로 마크로파지의 침윤을 유리하게하고, 이는 전염증성 시토카인 (TNF-α)의 증가된 생산 및 인슐린 내성 및 간지방증의 발생에 영향을 미친다. 이러한 과정에서 전염증성 시토카인의 기능은, 지방증(steatosis), 인슐린 내성 및 제 2형 진성 당뇨병과 같은 병리들 (Tilg and Moschen, 2006. Nat Rev Immunol ., 6: 772-783)을 개선하기 위한 항-TNF-α 항체-기재 약물을 사용함으로써 증명될 수도 있다.

비만은 상이한 면역계 세포, 예컨대 마크로파지, 수지상 세포 및 T-세포에서의 기능에서의, 병원균 및 기타 항원에 대한 방어의 결핍과 관련되고 수술 후 감염과 합병증의 보다 높은 위험 관련되는, 변경에 의해서도 특징된다. 지방조직 마크로파지는 보다 낮은 대식작용 능력 및 감소된 호흡성 분출(burst)을 갖는데, 이는 감염성 성분들에 대한 선천성(innate) 면역계의 반응에 관련된 과정들이다 (Zhou 등, 2009. Proc Natl Acad Sci USA , 106(26):10740~5). 나아가, 수지상 세포는 예로서 백신접종시 항체 생산 및 감염된 경우 기억 T-세포 반응의 원인이 되는 적응성 면역 반응에 관여되는 T-세포 자극 능력이 파괴된다 (Karlsson 등, 2010. J Immunol ., 184:3127-33).

높은 에너지 부하를 갖는 식품 섭취의 규칙적인 증가 및 적은 운동과 연관된 사회적 변화들은 세계적으로 증가된 비만 발생의 주요 원인인 것으로 여겨진다. 그럼에도 불구하고, 저칼로리 다이어트와 증가된 운동에 기초한 전통적인 치료는 비만 제어에서 감소된 효능을 나타내며, 일반적으로 제한되고 일시적인 체중 손실을 일으킨다. 약물학적 전략의 이용 역시, 부작용을 일으키기 때문에 만족스럽지 못하다. 결과적으로, 치료를 개선하고 이러한 병리를 예방할 수 있는 신규 중재 전략이 여전히 요구되고 있다.

인간의 장에서 콜로니를 형성하는 미생물상(microbiota)은, 개인의 대사 및 면역학적 기능을 조절할 수 있는 그의 능력을 통하여, 비만 및 관련 질병에 관련된 신규한 인자인 것으로 여겨진다 (Sanz 등, 2010. Proc Nutr Soc ., 14: 1~8.). 비만과 관련된 미생물상의 조성은, 비만 제어를 위한 대안으로서 장 생태계의 의도적인 조작을 제안도 이끌었다 (Ley 등, 2006. Nature , 444: 1022~1023; Nadal 등, 2008. Int J Obes ., 33(7): 758-67). 이러한 의미에서, 락트산 박테리아 및 비피도박테리아군으로부터의 미생물들의 비만 또는 관련 질병들의 치료에의 이용은 다른 공보 또는 특허에서 제안되어 왔다. 국제 특허 출원 WO2007/043933호는, 락토바실러스 F19와 NCFB 1748 및 B. 락티스 (B. lactis) Bb12 균주가 발효유 형태로 체중 제어 및 식욕 감소에 사용될 수 있다는 것을 제안하지만; 그럼에도 불구하고 균주보다는 유단백질 및 그 안에 함유된 칼슘이 그 원인이 될 수 있는 것이고, 효과는 단지 소장에서의 대사에 관련된 유전자 발현의 변형에만 근거한 것임을 제안한다; 그러나, 비만은 많은 다른 기관 및 조직에 영향을 끼친다. 미국 특허출원 US 20100061967 A1호 역시 위장관에서만 포만감을 조절하는 펩티드의 발현을 조정하는 박테리아의 이용을 제안한다. 또다른 특허 출원(WO2009153662)은 당뇨병에서 비피도박테리아 및 락토바실러스의 이용을 제안하고 있으며, 이는 이들 미생물이 중추신경계 또는 이러한 병리의 기원 및 전개에 관련된 기타 과정의 수준에서의 효과에 대한 고려 없이, 단지 말초 조직 염증을 감소시키는 능력에만 근거한 것이다. 미국 특허출원 제 US20100150890호는, 대사 및 에너지 소비가 가속화되도록, 교감 신경계의 기능을 자극하는 생균제(probiotic) 박테리아의 이용을 제안하고 있다; 그러나, 교감신경 활성도(sympathetic tone) 또한 일부 비만 환자들에서 증가된다. 미국 특허출원 제 US20100111915호는, 생균제 박테리아의 비피도제닉 효과(bifidogenic effect) (장 내 비피도박테리아의 총 량을 증가시킴)에 기초하여 비만을 예방하기 위한 어린시절에 생균제 박테리아의 일반적인 이용을 제안하지만, 비피도박테리아의 성질이 각 균주에 특이적이라는 것을 고려한다면, 비피도박테리아의 단순한 일반적인 증가가 비만 발생을 일으키는 특이적 과정을 변경시킬 수 있다는 방식에 대한 어떠한 근거도 제공하고 있지는 않다. 나아가, 상기 언급된 특허 문헌과 관련하여 수행된 연구들은 비피도박테리움 속 균주를 이용하여 수행된 것이 아니라, 락토바실러스 속 균주 또는 이들과 B. 락티스 Bb12의 조합 및 식이에 대한 변경들을 이용하여 수행되었으므로, 결과들은 비피도박테리아에 기인한 것이 아닐 수 있고(US20100111915; Luoto 등, 2010. Br J Nutr ., 103(12): 1792~9; Luoto 등, 2010. Int J Obes (Lond). Mar 16), 어떤 경우들에서도 이들은 본 발명의 균주들과 상이한 것이다. 또다른 특허 출원 US20050112112호는 단당류 및 이당류로부터 중합체들을 생성하는 미생물들의 이용을 제안하여, 개인에서 이들 화합물들의 특정 흡수를 감소시키거나, 또는 비피도박테리아와 조합된 키토산과 같은 성분을 이용하여 특이적으로 콜레스테롤 흡수를 감소시키는 것이 제안되며 (JP10306028), 이들 모두는 식이 중 특정 성분과 관련된 비만 문제를 감소시키기기 위한 부분적인 방법들이다.

따라서, 예로서 면역계의 약한 작용에 대한 그의 관계 및 말단 및 중추 수준에서 글루코오스 대사 및 인슐린 내성과의 그의 연결관계 상에 함께 작용하고, 상이한 만성 병리들의 원인이 되는 혈액 및 말초 조직에서의 지질 축적이 변경되는 과체중, 비만, 및 당뇨병, 이상지질혈증, 간 지방증 및 대사성 증후군과 같은 관련 병리들과 같은 질병들을 예방 및/또는 치료하는데 더욱 적당한 전략들을 발견하여야 할 문제가 여전히 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 비피도박테리움 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주, 세포 성분, 대사산물, 상기 균주의 분비된 분자 및 다른 미생물들과 이의 조합에 관한 것이며, 상기 언급된 생성물들을 포함하는 조성물, 그리고 감염과 같은 다른 병리들에 대한 효과와 더불어, 당뇨병, 이상지질혈증, 간 지방증, 대사성 증후군 또는 면역계 기능이상과 같은 관련 변화들(alterations)의 예방 및/또는 치료를 위한 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 과체중 및/또는 비만 문제와 관련되지 않은 이들 변화들의 예방 및/또는 치료를 위한 상기 균주의 이용에도 관한 것이다.

B. 슈도카테눌라텀 종에 속하는 CECT 7765 균주는, 다른 비피도박테리움 속 의 종 및 다른 젖산 박테리아 속들 중 동일 종의 다른 균주들에 비해 더욱 양호한 면역학적 성질을 갖는다. CECT 7765 균주는, 다른 종 및 동일 종들의 균주와 비교하여 마크로파지에서의 TNF-알파 전염증성 시토카인의 현저히 더욱 낮은 생산을 유도한다 (약 2.5 내지 12.6배 더 낮음; 표 1); 나아가, 이는 더욱 낮은 MCP1 (약 1.2 내지 38.2배 더 낮음; 표 1) 생산도 유도한다. 상기 배경기술 항목에서 설명된 바와 같이, 마크로파지에 의한 이들 시토카인 및 케모카인의 합성은 비만, 당뇨병, 이상지질혈증 및 기타 관련 대사 장애들과 직접 관련된다. 추가적으로, CECT 7765 균주는, 다른 비피도박테리움 속 균주에 비해 더욱 높은 비율로, 이들 병리들과 역의 관계에 있는 항-염증성 시토카인, 예컨대 IL10의 합성을 유도한다 (1.9 내지 4.8배 더 높음; 표 2). 선택된 박테리아의 면역학적 성질이 락토바실러스 및 비피도박테리움 속의 모든 세균 균주에 공통된 것은 아니며, 이들 모두의 공통된 특징은 낮은 등급의 만성 염증의 질환과 이들의 관련이기 때문에, 이러한 성질들로 인해 이는 과체중 및/또는 비만의, 그리고 비만 및 과체중과 함께 또는 이와 독립적으로 존재하는, 관련 병리들의 치료 및 예방에서의 적용에 특히 적합하게 된다.

당 기술 수준과 달리, 본 발명은 다원적인 전망으로 비만 치료에 접근하며, 나아가 어떤 알려진 비피도박테리움 속 균주에 대해서도 설명된 적이 없는, 이러한 병리 또는 관련 병리들의 예방 및/또는 치료에 대한 새로운 주요 타겟에 작용한다. 가장 흥미로운 사실은 이 속 또는 종의 알려진 균주들 중 어떤 것도 본 발명에서 보인 모든 증상들의 동시 및 효과적인 치료에 유용한 것으로 밝혀진 적이 없다는 것이다.

따라서, 본 발명은 과체중 및/또는 비만 및 소정의 관련 병리들 예컨대 이에 제한되지는 않지만 당뇨병, 간 지방증, 이상지질혈증 또는 대사성 증후군의 치료를 위한 고가의 B. 슈도카테눌라텀 종 균주 기술을 제공하는 것이다.

본질적으로, 본 발명의 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765를 이용함으로써 제공되는 장점들은 다음과 같다:

- B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주의 투여는 비만 및 비-비만 환자에서의 지방세포의 크기를 감소시킨다(실시예 4 참조). 특히, 비만인 동물들에 대한 CECT 7765 균주의 투여는 작은 크기(1000~2000 mm ² )의 지방세포들의 증가를 일으키는 반면, 상기 균주를 투여받지 않은 비만 동물들에서는 큰 크기(4000~6000mm ² )의 지방세포들을 증가가 있다 (실시예 4, 도 5).

CECT 7765 균주가 지방세포의 크기를 감소시킨다는 사실은, 시간이 흐름에 따라 유지되고 다수의 지방세포에서 일어나는 경우 과체중 및 비만을 일으킬 수 있는 지방세포 비대의 치료에 유용하다는 것을 증명한다. 이는 큰 크기의 지방세포들이 예비지방세포 분화를 통한 지방세포형성을 촉발하고, 피드백 과정을 생성하는 성장 인자들을 보다 높은 농도로 분비하기 때문이다. 비대성 지방세포는 염증성 시토카인 및 케모카인 (TNF-a, MCP-1, IL-6, 레지스틴(resistin), 등)의 비정상적인 높은 농도를 더욱 생산하며, 이는 간세포에서의 인슐린 신호화를 저해하고 인슐린 내성 및 기타 합병증을 유발한다. 지방세포들의 증가된 크기는 간으로의 지방산의 증가된 공급과도 관련되며, 이는 간 지방증 및 그의 합병증을 일으킨다. 따라서, 균주는 유사하게 이들 관련 병리들을 예방 또는 개선시킬 수 있다.

- 본 발명의 균주물의 투여는 비만 및 비-비만 환자 (실시예 4, 도 6)의 간에서 축적된 지방의 감소를 일으킨다. 특이적으로, 균주는 4 등급 최대 지방 함량 간세포들의 수를 감소시키고 (> 66%), 3 등급 간세포들은 증가시킨다 (34~66%의 ㅈ지방 함량); 그러나, 본 균주를 투여받지 않은 비만 동물들에서, 간세포 유형의 비율은 반대로, 최대 지방 함량 간세포가 우세하다. 대조군 동물에서, 균주의 투여는 2 등급 간세포들을 증가시키고 (지방 함량 < 33%), 3 등급 간세포들은 감소시키는데 (34~66% 지방 함량), 이는 균주를 받지 않은 동물들에서 일어나는 것과 반대이다. 따라서, 균주의 투여는 식이에 의하여 유도 또는 유도되지 않은 간에서의 지방의 총 누적을 감소시킨다는 것을 증명한다.

따라서, CECT 7765 균주는 간 지방증의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 병리는 고에너지 부하의 식이 및 비만과 관련된 병리로 여겨질 수 있지만 (비만 환자에서 60~90%로 존재), 과체중 및/또는 비만에 의하여 유발되는 것이 아닌, 비제한적인 예로서 감염 및 영양 또는 유전적 대사 질환들에 의하여 유발될 수 있는 경우들이 있다.

- B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주는 장세포에서의 카일로마이크론(chylomicron)의 수를 감소, 즉 흡수될 수 있는 식이에서의 지방 양을 감소시키고, 카일로마이크론의 형태로 림프 및 혈액, 이에 따라 말초 조직으로 통과된다 (실시예 6, 도 7). 이러한 성질은 말초 혈액 트리글리세라이드의 농도에서의 감소에도 반영되었다 (실시예 5). 지방 조직에서의 지방 축적 증가를 일으키기 때문에 과체중 및/또는 비만의 원인이 될 수 있음에 추가하여, 식이로부터의 증가된 지방 흡수는, 예로서 과체중 또는 비만 유발 없이 기타 병리, 예컨대 본 발명의 범주를 제한함이 없이, 동맥경화증, 이상지질혈증, 대사성 증후군, 심혈관 병리 및 기타 지질 대사와 글루코스 대사간의 관련으로부터 유래하는 기타 질환들의 원인일 수 있다. 이상지질혈증은 식이로부터 흡수된 지방 뿐 아니라 다른 대사 질환들, 예컨대 지방세포 인슐린 내성의 결과일 수도 있으며, 이는 비만에 필수적으로 관련되지 않아도, 지방세포들이 간에서 사용될 지방산들을 방출하도록 만들어서 트리글리세라이드 합성 및 분비 및 말초 혈액 트리글리세라이드의 증가를 일으킨다. 이상지질혈증도, 비만, 인슐린 내성, 또는 식이로부터의 지방 흡수에서의 증가와 반드시 관련됨 없이, 이러한 대사 질환에 유전적으로 걸리기 쉬운 대상에 존재한다. 따라서, CECT 7765 균주는 식이로부터의 지방 과다 흡수와 관련된 질병들의 예방 및/또는 치료 및 이상지질혈증의 방지 및/또는 치료에 유효하다 (예로서, `고중성지방혈증(hypertriglyceridemia) 및 과콜레스테롤혈증).

- CECT 7765 균주는 글루코스 대사 질환을 조절하고, 인슐린 합성 및 기능과 관련된 말초 혈액 글루코스 농도를 증가시킨다 (고혈당증) (실시예 5). 글루코스에서의 증가는, 다른 원인들 중, 인슐린 내성 또는 인슐린 합성의 부족으로 인하여 일어나날 수 있는 것으로, 이는 비만과 반드시 연관되지는 않는다.

- CECT 7765 균주는 선천성 및 후천성 면역계의 작용을 개선시켜서, 비만 및 비-비만 환자에서 감염성 약물, 항원 또는 알레르겐에 대한 이들의 반응 능력을 증가시킨다. 특히, 고지방 식이에 의하여 유도된 비만의 동물 모델에의 균주 투여는 무엇보다도, 대식작용 및 시토카인 합성에서 마크로파지의 기능을 개선시킨다 (실시예 3, 도 2 및 3). 본 발명의 균주물은 후천성 면역계 수지상 세포 및 T-세포의 기능도 개선시킨다 (실시예 3, 도 4).

따라서, CECT 7765 균주는 감염 예방 및 치료, 및 예로서 백신화 및 면역화 과정에서 보호 반응의 개선에 유용하므로, 추가의 긍정적인 효과를 가지며, 면역계의 이러한 기능들은 과체중 및 비만 환자에서 변경되기 때문이다. 나아가, 본 발명의 균주는 비만 및 과체중과 연관 또는 연관되지 않은 면역억제 (기초적으로 마크로파지, 수지상 세포 및 T-세포))를 제시하는 기타 질병들 (예로서, 당뇨병)의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.

- CECT 7765 균주는, 이 균주로 처리되지 않은 것들에 비하여, 균주 처리된 비만 및 정상 체중 대상에서의 말초 및 중추 수준에서 전염증성 단백질을 보다 적은 양으로 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 균주물은 말초계 및 중추 신경계에서 TNF-α 합성도 감소시키며, 이의 합성은 비만 및 기타 병리에서 증가되어 인슐린 및 렙틴 내성의 발달에 기여하고, 거식(anorexigenic) 효과 (배고픔에 대한 느낌을 감소시킴) 및 이들의 체중 및 글루코스 대사 조절 기능을 저해한다 (실시예 3). 상기 균주는 말초 혈액 렙틴 농도가 증가된 비만 환자에서 그 농도도 감소시키며, 이는 연소에 유리하고 정상 체중 대상에서 그 농도를 증가시켜서 정상 체중 대상에서는 역으로 식욕 및 섭취의 감소 및 에너지 소비 및 지질 산화를 증가시켜, 이에 따라 체중을 감소시키는데 기여한다 (실시예 3, 도 8).

따라서, CECT 7765 균주는, 말초 혈액 내 및 중추 신경계 모두에서 그 합성이 비만 및 그와 관련된 특정 질병들, 비제한적인 예로서 당뇨병, 이상지질혈증, 대사성 증후군, 심혈관 질환 및 지방증에서, 그리고 과체중 및/또는 비만과 반드시 연관되지는 않은 기타 질병들에서 변경되는, 단백질 및 호르몬 (시토카인, 케모카인 및 아디포카인)의 생산을 조절하며, 따라서 이들 병리의 치료 및 예방에 유용할 수 있다.

- 나아가, CECT 7765 균주는 과체중 및 비만과 관련된 변경들 및 이들 변경들에 의하여 유발된 염증 효과를 정상화시킴에 의한 장 미생물군 조성을 회복시키고, 체중 증가, 인슐린 내성, 대사성 내독소혈증(endotoxemia), 간 지방증 및 장 장벽 기능의 변경에 관련된다 (실시예 3). 본 발명의 균주는, 다른 근간성(underlying) 병리와 일차적으로 또는 이차적으로 연관될 수 있거나, 또는 그를 촉발시킬 위험이 있는 병원성 또는 기회감염성(opportunistic) 장내세균의 이상증식을 감소시키는데 사용될 수도 있다. 따라서, CECT 7765 균주는 감염 및 장 미생물군에서의 변경과 관련된 질환의 예방 및 치료에 추가적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 한 측면은 수납번호(accession number) CECT 7765의 B. 슈도카테눌라텀 균주에 관한 것이다. 상기 균주는 Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) (스페인 균주 보관소)에 2010년 7월 21에 기탁되었고, 수납번호 CECT 7765를 부여받았다. 상기 국제 기탁 기관의 주소는: Universidad de Valencia / Edificio de Investigacion / Campus de Burjassot / 46100 Burjassot (발렌시아)이다.

본 발명의 CECT 7765 균주의 과학적 분류는 다음과 같다: 세균 계/ 악티노박테리아 문/ 비피도박테리알레스 ( Bifidobacteriales )목/ 비피도박테리아세( Bifidobacteriaceae ) 과/비피도박테리움 ( Bifidobacterium) 속/ 슈도카테눌라텀 ( pseudocatenulatum ) 종.

상기 균주의 특징은 다음과 같다:

- CECT 7765 박테리아가 산화 또는 발효시키는 기질들은 D-아라비노스, 리보스, B-메틸-D-자일로시드, 갈락토스, D-글루코스, α-메틸-D-만노시드, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 아르부틴, 에스쿨린(esculin), 셀로비오스, 말토스, 락토스, 멜리비오스, 멜레지토스 및 자일리톨이다.

- CECT 7765 균주는, 오르토 니트로페닐-βD-갈락토피라노시다제 및 아르기닌 디하이드로라제 효소 활성을 갖는다.

- 상기 균주는 31℃ 내지 42℃를 포함하는 범위의 온도에서 성장하며, 최적 성장은 37℃에서 일어난다.

- 상기 균주는 5 내지 8을 포함하는 pH 범위에서 성장하며, 최적 성장은 pH 7에서 일어난다.

나아가, 상기 균주는 위장 스트레스 조건 (산 pH 및 높은 담즙 농도)에서 안정하다. 위를 비우는데 걸리는 평균 시간 (2 시간) 동안 위 조건 중에서 인큐베이션 후의 이의 생육능은 64~95%이고, 담즙 염 (0.5 및 1%) 존재 하에서의 이의 성장은 80 내지 90%로 유지된다. 기술적인 보존 공정 조건 (동결, 냉동건조, 등) 및 식품 제조 조건 (냉장, 냉동건조, 발효, 등)에서도 저항성이고, 상이한 산업적 규모의 미생물 생산 배지에서 성장한다. 예로서, 균주는 MRS 상용 실험실용 배지에서 수득되는 것에 실질적으로 균등한 우유에서의 성장 및 GEM 산업용 생산 배지에서 더욱 큰 대수적 단위를 보인다. 생체 내 실험에서, 구강 투여 후 장 통과에서 생존할 수 있어서, 투여된 초기 투여량에 비하여 단지 1~2 대수 단위의 감소를 나타내며, 이는 환자 및 분석되는 샘플의 유형 및 투여 후 경과 시간에 따라 달라진다. 이들 모든 성질들은 이의 장 내 생육능, 지속성 및 유효성을 확인시켜준다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주의 유도 균주에 관한 것으로, 여기에서 상기 균주는 본 발명 전체를 통하여 설명된 능력을 유지 또는 개선시킨다. 유도체 미생물은 이에 제한되지는 않지만, 예로서 돌연변이 유발 약제 또는 스트레스 유발 약제 존재 하에서 원래의 미생물을 성장시키는 것과 같은 당 기술 분야에서 알려진 돌연변이 방법에 의하여, 또는 특정 유전자들을 변경시켜고자 하는 유전공학적 조작을 통하여 천연적으로 또는 의도적으로 생산될 수 있다. 더욱 바람직한 실시양태에 따르면, B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주의 유도체 균주는 유전적으로 변경된 돌연변이이다. 돌연변이 균주 도는 유도체 균주라는 용어는 균등하게 사용될 수 있다.

B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 또는 그의 임의의 돌연변이 또는 그의 유도체는 기재된 효과들을 실행하는, 예컨대 본 발명의 바람직한 실시양태에 따른, 임의의 형태로 사용될 수 있으며, B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주는 생육가능한 세포 형태 (배양성 또는 비-배양성), 또는 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에 따른 형태로, 이 균주는 비-생육성 세포 형태 (예로서 이에 제한되지는 않지만, 열, 동결 또는 자외선 방사와 같은, 당 기술분야에 알려진 임의의 기술에 의하여 비활성화된 "죽은(dead)" 세포)이다.

이하에서, 전술된 바람직한 실시양태 및 "본 발명의 균주" 측면 또는 "본 발명의 균주"에서 설명된 B. 슈도카테눌라텀 종의 세균 균주들 중 임의의 것을 참조할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 균주를 포함하는 미생물 조합물에 관한 것이다. 미생물 조합물은, 동일 종 또는 상이한 종들의 또다른 균주 또는 또다른 분류학적 군의 미생물들의 한 세트의 세포들 함께 사용되는, 본 발명의 균주의 세포들의 한 세트이거나, 또는 본 발명의 균주의 적어도 하나의 세포이다. 미생물 조합물의 세포들은 비-생육성 또는 생육성일 수 있으며, 이들의 형태학에 관계없이, 발생 또는 성장 상태에서의 임의의 시기일 수 있다 (잠복기, 지수성장기, 정지기, 등).

본 발명의 바람직한 실시양태는, 조합물이 본 발명의 균주 외의 적어도 또다른 하나의 미생물을 포함하는 것인 미생물 조합에 관한 것이며, 상기 조합물의 부분일 수 있는 미생물은 예로서 이에 제한되지는 않지만, 다음과 같다:

- 적어도 하나의 또다른 비피도박테리움 속 균주, 비제한적인 예로서 B. 롱 검( B . longum ) CECT 7347 균주 또는 다른 B. 슈도카테눌라텀, B. 카테눌라텀, B. 브레베 ( B. breve ) , B. 롱검 하위종(subsp.) 롱검 , B. 롱검 하위종 인펀티스(infantis ) , B. 락티스 하위종 락티스 , B. 락티스 하위종 아니말리스 ( animalis ) , 또는 B. 아돌레슨테스 ( adolescentes ) 종 균주 .

- 장, 식품 또는 환경 기원의 적어도 하나의 젖산 박테리아. 상기 젖산 박테리아는 이에 제한되지는 않지만, 락토바실러스, 락토코커스, 엔테로코커스, 프로피오니박테리움, 류코노스톡 , 웨이셀라 ( Weissella), 페디오코커스(Pediococcus) 또는 스트렙토코커스 속의 박테리아를 포함하는 리스트로부터 선택된다.

- 장, 식품 또는 환경 기원의 원핵생물의 다른 계통발생적 군, 속 또는 종의 적어도 하나의 균주, 이에 제한되지는 않지만 예를들어, 아르카에(Archaea), 프르미쿠테스(Frmicutes), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 악티노박테리아, 베루코미크로비아(Verrucomicrobia), 푸소박테리아(Fusobacteria), 메타노박테리아(Methanobacteria) , 스피로카에테스 ( Spirochaetes), 피브로박테레스(Fibrobacteres), 데페리박테레스(Deferribacteres), 데이노코커스(Deinococcus), 테르무스, 시아노박테리아, 메타노브레비박테리움, 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 루미노코커스(Ruminococcus), 코프로코커스(Coprococcus), 서브돌리그래뉼럼(Subdoligranulum), 도레아(Dorea), 불레이디아(Bulleidia), 아나에로푸스티스(Anaerofustis), 제멜라(Gemella), 로세부리아(Roseburia), 카테니박테리움(Catenibacterium) , 다이알리스터(Dialister), 아나에로트렁쿠스(Anaerotruncus), 스태필로코커스(Staphylococcus), 미크로코커스(Micrococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 박테로이데스(Bacteroides), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 프레보텔라(Prevotella), 유박테리움(Eubacterium), 아케르만시아(Akkermansia), 바실러스, 부티리비브리오 또는 클로스트리듐;

- 적어도 하나의 곰팡이 또는 효모 균주, 예로서 이에 제한되지는 않지만, 사카로마이세스, 캔디다, 피키아(Pichia), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 토룰롭시스(Torulopsis), 아스퍼질러스(Aspergillus), 라이조푸스(Rhizopus), 무코 또는 페니실리움 속에 속하는 하나.

이하에서, "본 발명의 조합물"로서 또는 "본 발명의 미생물 조합물"로서 전술된 문단에서 기재된 미생물 조합물 중 임의의 것을 참조할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은, 본 발명의 균주로부터 또는 본 발명의 미생물 조합물로부터 수득된, 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자들 또는 임의의 조합물에 관한 것이다. 본 발명은 기타 식품, 식물성 제품 및 약물 성분과 함께, CECT 7765 균주로부터 또는 본 발명의 미생물 조합물로부터 수득된, 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자 또는 이의 임의의 조합물들도 고려한다.

박테리아의 세포 성분들은 세포벽 성분 (예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 펩티도글리칸), 핵산, 막 성분, 또는 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 기타 물질 및 이의 조합물들, 예컨대 지단백질, 당지질 또는 당단백질을 포함할 수 있다. 대사물질은 세균 성장 동안, 기술 공정에서의 이용 (이에 제한되지는 않지만 예로서 식품 또는 약물 조제 공정), 생성물 저장 동안 또는 위장 통과 동안의 대사 활성 결과로서 세균에 의하여 생산 또는 변경된 임의의 분자를 포함한다. 이들 대사산물들은, 이에 제한되지는 않지만, 유기산 및 무기산, 단백질, 펩티드, 아미노산, 효소, 지질, 탄화수소, 지단백질, 당지질, 당단백질, 비타민, 염, 금속 또는 핵산들을 포함한다. 분비된 분자들은 성장, 기술 공정에서의 그의 이용 (예로서, 식품 또는 약물 조제), 생성물 저장 또는 위장 통과 동안 세균에 의하여 수출 또는 방출된 임의의 분자를 포함한다. 이들 분자들의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 유기산 및 무기산, 단백질, 펩티드, 아미노산, 효소, 지질, 탄화수소, 지단백질, 당지질, 당단백질, 비타민, 염, 금속 또는 핵산이 있다.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 균주 또는 본 발명의 미생물 조합물 또는 본 발명의 균주의 세포 성분, 대사산물, 분비 분자들, 또는 이들의 임의의 조합물들을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

조성물은 일반적으로 정의되며, 적어도 임의의 농도의 본 발명의 균주, 또는 적어도 본 발명의 균주의 세포 성분, 대사산물, 분비 분자들 또는 이들의 임의의 조합물들로 이루어지는 성분들의 세트이다.

약학 조성물은 임의의 농도의 적어도 본 발명의 균주 또는 적어도 본 발명의 균주의 세포 성분, 대사산물, 분비 분자들 또는 이들의 임의의 조합물로 이루어지는 성분들의 세트로, 환자의 일반적인 건강 상태의 개선을 포함한, 환자의 물리적 또는 심리적 안녕을 개선시키는 적어도 하나의 적용 분야를 갖는다.

의약품이라는 용어는 본 발명에서 정의된 것과 같은 "약학 조성물"의 의미인 보다 제한된 의미를 갖는데, 이는 의약품은 환자에서 예방 또는 치료 효과, 즉 생리학적 효과를 필수적으로 포함하기 때문이다. "의약품"이라는 용어는 하기에서 충분히 설명될 것이다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 약학 조성물이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 더 포함한다.

"부형제"라는 용어는 본 발명의 조성물의 임의의 성분의 흡수를 돕고, 상기 성분들을 안정화시키거나, 또는 일관성(consistency)을 제공하거나 또는 그를 더욱 풍미좋게 하는 풍미제를 제공하는 의미에서 약학 조성물의 제조를 보조하는 물질을 의미한다. 따라서, 부형제는, 예로서 전분, 당 또는 셀룰로오스와 같이, 성분들을 서로 결합된 채로 유지시키는 기능, 감미 기능, 착색 기능, 의약품의 보호 기능, 예로서 의약품을 공기 및/또는 수분으로부터 분리시키는 기능, 예로서 2염기성 염화칼슘과 같은, 정제, 캡슐 또는 임의의 다른 제공 형태용 충전제 기능, 성분들의 용해 및 그들의 장 흡수를 촉진시키는 붕괴 기능을 가지며, 본 문단에서 언급되지 않은 부형제의 또다른 형태가 배제되는 것은 아니다. 따라서, "부형제"라는 용어는 갈레닉(galenic) 형태들을 포함한, 그들의 제조 및 안정성을 가능하게 하거나, 그들의 관능성을 변경시키거나 또는 약학 조성물의 물리화학적 성질 및 그의 생물학적 이용성을 결정하기 위하여, 활성 성분 또는 그들의 연합물에 첨가되는 물질로서 정의된다. "약학적으로 허용가능한" 부형제는 용어는 약학 조성물의 화합물의 활성을 가능하게 하여야만 하며, 즉 상기 성분들과 혼화성이어야만 한다.

"갈레닉 형태 또는 투약 형태"라 함은 여기에 의약품을 구성하기 위하여 활성 물질 및 부형제가 순응되어지는 제시 형태이다. 약학 조성물은 제조자에 의하여 제시된 형태 및 투여되는 형태에 의한 형태의 조합물로 정의된다.

"담체" 또는 비히클은, 바람직하게는 불활성 성분이다. 담체의 기능은 다른 성분들의 혼입을 촉진시켜 더 양호한 투약 및 투여를 가능하게 하거나, 또는 약학 조성물 일관성 및 형태를 제공하도록 하는 것이다. 따라서, 담체는 의약품에서 본 발명의 약학 조성물의 임의의 성분들을 특정 부피 또는 중량으로 희석하는데 사용되는 물질; 또는 상기 성분들을 희석하지도 않고, 더욱 양호한 투약 및 투여를 가능하게 하거나 또는 의약품에 일관성 및 형태를 제공할 수 있는 물질이다. 제시 형태가 액체인 경우, 약학적으로 허용가능한 담체는 희석제이다.

나아가, 부형제 및 담체는 약물학적으로 허용가능하여야만 하는데, 즉 부형제 및 담체는 이들이 투여되는 생물에 유해하지 않은 것으로 허용 및 평가된다.

또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 약학 조성물은 또다른 활성 성분을 더 포함한다. 상기 약학 조성물이 다른 치료제를 사용하는 것이 필요할 수 있는 경우, 치료 효능의 요구에 추가적으로, 본 발명의 조성물 및 또다른 치료제의 조합을 이용하는 것이 매우 필요하거나 또는 권장될 수 있도록 하는 추가적인 기본적인 이유가 있을 수 있다. "활성 성분"이라는 용어는, 인간, 동물, 식물 또는 화학 기원 또는 또다른 유형인지의 여부에 관계없이, 의약품을 구성하기 위해 적당한 활성이 있는 임의의 물질이다.

각 경우에서 의약품의 제시 형태는 사용된 투여 유형에 적합화되어 본 발명의 조성물은 치료적으로 유효한 양으로, 용액 형태 또는 임의의 다른 임상적으로 허용되는 투약 형태로 제시될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사, 흡입제, 겔, 미소구체 또는 에어로졸의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에 따르면, 약학 조성물은 경구 투여에 적당한 형태로 존재한다.

경구 투여에 적당한 형태는 경구 투여를 가능하게 할 수 있는 물리적 상태를 의미한다. 경구 투여에 적당한 상기 형태는 이에 제한되지는 않지만, 드롭(drop), 시럽, 허브티, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 즉석(extemporaneous) 현탁액, 음용성(drinkable) 바이알, 정제, 캡슐, 과립화제(granulate), 교갑(cachet), 환약, 펠렛, 패스틸(pastille), 트로키(troche) 또는 동결건조물을 포함하는 리스트로부터 선택된다.

또다른 가능성으로, 약학 조성물은 설하, 비강, 척추강내, 기관지, 림프, 직장, 경피 또는 흡입 투여에 적당한 형태로 제시된다. 본 발명의 균주로부터 또는 본 발명의 미생물 조합으로부터 수득된, 본 발명의 균주, 본 발명의 미생물 조합, 세포 성분, 대사산물, 분비 분자 또는 이들의 임의의 조합은, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 리포좀 또는 마이셀과 연합될 수 있다.

본 발명의 설명에서 사용된 의미에서, "치료유효량"이라는 표현은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여되는 경우, 하기 정의된 것과 같은, 포유동물, 바람직하게는 인간에서 관심대상의 질병 또는 병리학적 상태의 예방 및/또는 치료를 유발하기에 충분한 약학 조성물의 성분의 양을 지칭한다. 치료유효량은 임의의 제시 형태의, 예로서 본 발명의 균주, 본 발명의 미생물 조합물, 세포 성분들, 대사산물, 분비된 분자 또는 이들의 임의의 조합물의 활성에 따라 변화될 것이며, 치료유효량은 또한 그 화합물의 작용의 대사 안정성 및 기간, 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 환자의 식이, 투여 방법 및 시간, 배출속도, 약물들의 조합, 특정 질병 또는 병리학적 상태의 심각성, 및 치료를 받는 환자에 따라서도 변화될 것이지만, 본 기술분야의 당업자는 그의 지식 및 이러한 설명에 따라 치료유효량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 영양 조성물이다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시양태는 영양 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 식품, 뉴트라슈티컬(nutraceutical), 보충제(supplement), 생균제 또는 공생제(symbiotic)이다.

본 발명의 영양 조성물이라는 용어는, 그를 섭취하는 대상에게 제공되는 영양소에 관계없이, 그 생물의 하나 이상의 몇몇 기능에 유리하게 작용하여 보다 나은 건강 상태 및 안녕을 제공하는 식품을 지칭한다. 결과적으로, 상기 영양 조성물은 질병 또는 질병-유발 인자의 예방 및/또는 치료를 위해 의도될 수 있다. 따라서, 본 발명의 "영양 조성물"이라는 용어는 기능성 식품 또는 특정 영양 목적을 위한 식품 또는 의약 식품의 동의어로서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것과 같은, "뉴트라슈티컬"이라는 용어는 식품 중 분리된 성분들로, 건강에 대한 유익한 효과를 갖는 투약(dosed) 방식으로 사용되는 성분들을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 것과 같은, "생균제"라는 용어는 적합한 양으로 공급되는 경우, 숙주 생물의 건강에 유익한 살아있는 미생물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 것과 같은, "공생제"라는 용어는 프리바이오틱(prebiotic) 및 생균제의 혼합물을 함유하는 식품들을 지칭한다. 이들은 일반적으로 성장 및/또는 대사 활성 및 요약하면 그와 조합된 생균제의 효과, 예컨대 비제한적인 예로서, 프룩토올리고당 또는 갈락토올리고당과 비피도박테리아의 연합을 유리하게 하는 프리바이오틱을 포함한다.

"보충제"라는 용어는, "식사 보충제", "영양 보충제" 또는 식품 보충제"라는 용어들 중 임의의 것과 동의어로, 식이를 보완하고자 의도된 "식품성분"이다. 식이 보충제의 일부 예들은, 이에 제한되지는 않지만, 비타민, 미네랄, 식물 생산물, 아미노산 및 식품 성분들 예컨대 효소 및 선분비(glandular) 추출물을 포함한다. 이들은 기존 식품의 대체물로서, 또는 식사 또는 식이의 단일 성분으로서 제공되는 것은 아니고, 식이의 보충물로서 제공된다.

더욱 바람직한 실시양태에 따르면, 식품은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택된다: 유제품, 식물성 제품, 육제품, 스낵(snack), 초콜렛, 음료 또는 유아식. 유제품은 이에 제한되지는 않지만, 발효 유제품 (이에 제한되지는 않지만, 예로서 요거트 또는 치즈) 또는 비-발효 유제품 (이에 제한되지는 않지만, 예로서 아이스크림, 버터, 마가린, 유청)을 포함하는 리스트로부터 선택된다. 식물성 제품은 이에 제한되지는 않지만, 예로서 임의의 제시 형태의 발효된 또는 비-발효된 곡물을 포함한다. 음료는 이에 제한되지는 않지만 임의의 과일 주스 또는 비-발효유를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태는 본 발명에 설명된 조성물들 중 임의의 조성물로, 상기 조성물은 최종 조성물 1g 또는 1밀리리터 당 10 ³ 내지 10 ¹⁴ 콜로니 형성 유닛 (cfu)의 균주 농도를 갖는다. 균주의 농도는 적절하게, 치료유효량 또는 영양적으로 유효한 농도이다. 영양 조성물 및 약학 조성물은, 이에 제한되지는 않지만, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 마이크로캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 페이스트, 좌약, 주사, 흡입제, 겔, 미소구체 또는 에어로졸의 형태로 제형화될 수 있다.

이하에서, "본 발명의 조성물" 또는 "발명의 조성물"이라는 용어에 의하여 전술된 문단들에서 정의된, 조성물, 일반 조성물, 약학 조성물 또는 영양 조성물 중 임의의 것을 참조할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 약학 조성물, 의약품 또는 영양 조성물의 생산을 위한, B. 슈도카테눌라텀 종의 CECT 7765 균주의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면은 영양 조성물, 의약품 또는 영양 조성물의 생산을 위한, 본 발명의 균주, 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합물, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 문단에서 정의된 임의의 약학 조성물은 의약품의 생산을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 관련된 의약품은 인간 또는 수의학적 용도를 위한 것일 수 있다. "인간 용도를 위한 의약 제품"은 인간에서의 질병들의 치료 또는 예방을 위한 성질을 갖거나 또는 약물학적, 면역학적 또는 대사적 작용을 나타냄으로써 생리학적 기능을 회복, 교정 또는 변형시키는 목적 또는 의약 진단을 수립하기 위한 목적을 위하여 인간에서 사용되거나 또는 투여될 수 있는 임의의 성분 또는 성분들의 조합이다. "수의학적 용도를 위한 의약 제품"은 동물 질병에 대해 치료 또는 예방 성질을 갖거나, 또는 약물학적, 면역학적 또는 대사적 작용을 나타냄으로써 생리학적 기능을 회복, 교정 또는 변형시키는 목적 또는 수의학적 진단을 수립하기 위한 목적을 위하여 동물에 투여될 수 있는 임의의 성분 또는 성분들의 조합이다. 사료에 혼합되기 위하여 제조된, "약을 섞은 사료를 위한 예비 혼합물(pre-mixture)"도 "수의학적 의약품"으로 여겨질 것이다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 의약품 생산 또는 영양 조성물 생산, 과체중, 비만의 예방 및/또는 치료 또는 그와 관련된 임의의 병리 또는 기능장애 (예로서, 면역계 기능장애)의 예방 및/또는 치료를 위한, 본 발명의 CECT 7765의 균주인 B. 슈도카테눌라텀 종 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합물들, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 명세서에서 이해되는 바와 같이, "치료"라는 용어는 환자 (바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간)에서 관심 대상의 질병 또는 병리학적 상태의 결과로서 유발된 효과를 제어하는 것을 지칭하며, 이는 다음을 포함한다:

(i) 질병 또는 병리학적 상태를 저해, 즉 그의 전개를 정지시킴;

(ii) 질병 또는 병리학적 상태를 완화, 즉, 질병 또는 병리학적 상태 또는 그의 증후학의 퇴화를 일으킴;

(iii) 질병 또는 병리학적 상태를 안정화시킴.

본 명세서에서 이해되는 바와 같이, "예방"이라는 용어는 질병의 발발을 방지, 즉 일정 대상(바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간)에서 특히 상기 대상이 병리학적 상태에 대한 소인이 있는 경우 질병 또는 병리학적 상태가 일어나는 것을 방지하는 것으로 이루어진다.

본 명세서에서 사용된 것과 같이, "과체중"이라는 용어는, 대상이 체질량지수 (BMI)가 25 이상인 것으로 특징되는 병리를 지칭한다. BMI는 개인의 체중과 신장간의 관계의 측정치이다. BMI는 다음 식으로 계산된다: 질량 (Kg)/신장 ² (m). 과체중은 BMI 25 이상 30 미만으로 특징된다.

BMI가 30 이상인 경우, 대상은 "비만"을 앓는 것이며, 비만은 상이한 수준으로 분류되며, BMI 40 초과인 대상은 병적인 비만인 것으로 간주된다. 비만은, 인간 및 기타 포유동물의 지방 조직에 저장된 에너지 비축분이 건강한 한계를 초과한 임상적 상태이다. 지질 축적은 상이한 조직들에서 지방 침착, 과체중, 비만 및 상기 과체중 또는 비만과 연관된 일련의 병리들을 일으키며, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 제 2형 진성 당뇨병 및 임신성 당뇨병, 이상지질혈증 (바람직하게는, 고지혈증 및 과콜레스테롤혈증), 심혈관 질병, 고혈압, 지방간 (바람직하게는 비-알코올성 지방간 또는 간 지방증, 비-알코올성 지방간염, 간경변 또는 간염), 대사성 증후군, 암, 감염 등이 있다. 상기 병리와 이들의 과체중 또는 비만과의 연관성의 관계는 당 기술분야에서 잘 알려져 있다 (예컨대 WO/2010086454 또는 WO/2008119110). 따라서, 의약품, 약학 조성물 또는 영양 조성물의, 과체중 및/또는 비만과 연관된 병리들의 예방 및/또는 치료에서의 용도는 상기 연관성이 광범위하게 증명되어왔기 때문에 당연시되며, B. 슈도카테눌라텀 종 균주 또는 본 발명의 균주의 이용은 당업자가 예측하는 바와 같이, 과체중 및/또는 비만을 원인으로 한 질병의 발발을 예방할 수 있을 것이다.

BMI가 대상이 비만을 앓는지의 여부를 결정하는데 일반적으로 사용되지만, 그러한 목적을 위한 다른 파라미터들이 있다. 절대 허리 둘레 (남성에서 102cm 초과, 여성에서 88cm 초과이면, 그 대상은 비만을 앓는 것이다 [복부 비만]) 또는 허리-엉덩이 비율 (남성에서 0.9 초과, 여성에서 0.85 초과이면, 그 대상은 비만을 앓는 것이다)은 복부 비만의 척도로서 사용된다. 비만을 결정하기 위한 대안적인 방법은 체지방 백분율을 측정하는 것이다 (남성에서 약 25% 초과의 체지방, 여성에서 약 30% 초과의 체지방을 갖는 경우 그 대상은 비만을 앓는 것이다). 복부 비만 (주로 남성형 또는 허리 비만으로, 높은 허리-엉덩이 비율에 의하여 특징됨)은 대사성 증후군에 대한 중요한 위험 인자로, 이 하나에 제한되는 것은 아니지만, 이는 대상이 심혈관 질병 및 제 제 2형 진성 당뇨병을 아주 잘 걸릴 수 있도록 하는 일련의 변경 및 위험인자이다.

건강에 대한 비만의 효과는 상이한 세포 및 조직에서의 지방 덩어리의 증가 결과, 나아가 만성 염증 상태 및 면역계 기능장애 결과로 여겨지며, 이는 대사 장애와 더불어, 상기 언급된 상이한 병리들의 원인이다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 비만 또는 과체중 환자에서 지방 조직의 성장 및 분화 및 과체중 및 비만의 전 단계를 감소시키기 위한 용도; B. 슈도카테눌라텀 종 균주 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합의 용도; 또는 본 발명의 조성물, 의약품 생산, 영양 조성물 생산을 위한 용도에 관한 것으로, 따라서 지방세포 비대의 예방 및/또는 치료에 사용된다. 실시예 4 및 도 5에서 증명되는 바와 같이, 본 발명의 균주물은 지방세포의 크기를 감소시키는데, 생애(특히 소아 및 청소년기) 중 소정 단계에서의 지방세포의 증가 (비대)는 특히 성인 연령에서 과체중 및 비만, 및 기타 관련 합병증의 발생을 일으키기 쉽게 한다. 특히, 비만 동물에 CECT 7765 균주의 투여는 작은 크기의 지방세포 수에서의 증가, 및 큰 크기의 지방세포 수의 감소 (실시예 4, 도 5)를 일으킨다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 본 발명의 간 지방증 또는 지방간의 치료를 위한, 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한, B. 슈도카테눌라텀 종 균주 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 실시예 4에서 증명된 것과 같이, 비만인 동물 모델 및 대조군 동물 (비만이 아님) 모두에 대한 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주의 투여는 높은 지방 축적을 가진 간세포의 수를 감소시킨다. 전체적으로, 이는 본 발명의 균주가 간에서 지방 축적을 감소시킨다는 것을 의미한다.

B. 슈도카테눌라텀 종 균주 또는 본 발명의 균주는, 과체중 및/또는 비만과 관련된 질환으로서 전술된 문단에서 정의된, 간 지방증 또는 지방간의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 본 발명은 이에 제한되지는 않지만, 예로서 비-알코올성 간염, 지방간염, 섬유화증, 경변증(cirrhosis), 말기 간 질병 또는 간 암종과 같은, 간 지방증의 악화와 관련된 병리의 예방 및/또는 치료에도 관한 것이다. 나아가, B. 슈도카테눌라텀 종 균주 또는 본 발명의 균주는, 반드시 비만 또는 과체중 대상에서 존재하는 것은 아니지만, 다른 질환들의 결과인, 간에서 지질 축적 및 염증을 나타내는 이들 또는 기타 병리들에 사용될 수 있다. 이러한 질환은 이에 제한되지는 않지만, 예로서 영양 질환 (이에 제한되지는 않지만, 예로서 흡수불량, 단백질-열량 영양실조 또는 비경구적 영양), 유전성 또는 비-유전성 대사 질환 (이에 제한되지는 않지만, 예로서 무베타지단백혈증(abetalipoproteinemia), 또는 전신 카르니틴 결핍), 약물 노출(이에 제한되지는 않지만, 예로서 코르티코이드 또는 이부프로펜) 또는 독소 (이에 제한되지는 않지만, 예로서 알코올)에 의한 질병, 감염에 의한 만성 또는 급성 간염, 경변증, 섬유화증, 말기 간 질병, 간 암종, 또는 뇌하수체선 장애를 포함한다. 특히, 지방증은 제 2형 진성 당뇨병을 갖는 환자들의 약 50%에 영향을 미친다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 대조군에 비하여, 혈액 지질 농도(예로서, 이상지질혈증), 바람직하게는 혈액 트리글리세라이드 농도에서의 변경에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한, B. 슈도카테눌라텀 종 균주, 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합물, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것으로, 따라서, 그의 혈액 농도를 정상화하는데 사용된다. 의약품 또는 영양 조성물은 이상지질혈증 (이상지질혈증과 동의어)의 처리에 바람직하게 사용된다. 이상지질혈증은 바람직하게는 고중성지방혈증 또는 과콜레스테롤혈증이다. 이상지질혈증은, 혈액 지질 및 지단백질 농도에서의 이후 변경을 갖는, 지질 대사 질환만이 공통된 요소인 병리학적 상태이다. 이상지질혈증은 비만 및 고지방 식이의 섭취 및 지방 흡수 증가와 연관되거나 또는 연관되지 않을 수 있다. 차례로, 이들 변경들은 다른 병리들 중, 높은 위험율의 심혈관 질환 및 당뇨병의 높은 위험율과 관련된다. 정상의 대상 및 비만 대상 모두에서 본 발명의 균주는 지질 흡수 및 혈액 트리글리세라이드 수준을 감소시켜, 설명된 응용에 유효하다는 것을 입증하며, 이는 실시예 5에서 증명되는 바와 같다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 미처리된 대조군에 비하여 식이로부터 흡수된 지질의 양을 감소시키 위한 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한 B. 슈도카테눌라텀 종 균주 , 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

실시예 6에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 균주는 장내 장세포 중 카일로마이크론의 수를 감소시키는데, 즉 이는 50% 초과까지 흡수된 식이로부터의 지방 양을 감소시킨다는 것이다(실시예 6; 도 7). 카일로마이크론은, 음식물로부터의 지질이 그 안에 포장되어, 장에서 말초 조직에 의하여, 사용될 림프 및 혈액으로 수송되는 형태로, 이 기작을 통하여 투여된 균주는 생물에서 그의 흡수 및 축적을 제한한다. 지방세포 조직에서 그의 축적에서의 증가를 일으킴으로써 과체중 및/또는 비만의 원인이 될 수 있음에 추가하여, 음식물에서 지방의 흡수는 비만 유발 없이 다른 병리의 원인이 될 수 있으며, 이들이 본 발명의 범주를 제한하지는 않지만 예로서: 지방 축적이 일어나는 플라크(plaque)를 갖는 동맥의 내막이 두꺼워지는 것에 의하여 특징되는 동맥경화증, 및 혈장 지질 농도에 의한 변경에 의하여 특징되는 이상지질혈증 (트리글리세라이드 및/또는 콜레스테롤 및 관련 지단백질), 보다 높은 심혈관 위험과 관련된 병리들, 또는 글루코스 대사와 지질 대사와의 관계로부터 유래되는 다른 변경들 (이에 제한되지는 않지만 예로서 인슐린 내성 또는 당뇨병).

본 발명의 바람직한 실시양태는 대조군에 비하여 더욱 높은 혈당치에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한 B. 슈도카테눌라텀 종 균주 , 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것으로, 이에따라 이는 처리되지 않은 대상에비하여 혈당 농도를 감소시키고 (고혈당증), 그의 정상적인 생리학적 수준을 유지시키고 식후 (postprandial) 혈당 반응을 조절하는데 사용된다.

공복 혈당에서의 증가 (고혈당증) 및 식후 혈당 반응의 변경은, 비만이 있거나 또는 비만 없이, 기타 대사 장애 또는 약물과의 상호작용으로 인한, 인슐린 내성에 의하여 (충분한 인슐린을 생산하지만 신체가 정상적으로 반응하지 않는 환자) 또는 인슐린 합성의 결여에 의하여 유발될 수 있다. 본 발명의 실시예 5는 본 바람직한 실시양태에 대한 실험적 뒷받침을 제공한다. "보다 높은 혈당 수준에 의하여 유발되는 질병"이라는 표현은 건강한 개인에서 예측되는 정상의 포도당 값, 즉 약 72 mg/dl 혈액 내지 110 mg/dl 혈액 또는 공복 동안 4 mmol/l 내지 7 mmol/l, 또는 식후 한시간 반 후에 측정시 약 < 180 mg/dl (또는 10 mmol/l)보다 더 높은 혈당 농도에 기인한 건강에서의 변경에 관한 것이다. 각 대상에서 특징적인 조건에 의해 겪게되는 변이량이 고려되어야 하기 때문에, 상기 값은 근사 평균 값이다. 더욱 높은 혈당 수준에 의하여 유발된 질병은 이에 제한되지는 않지만 예로서 신경장애 (말단 및/또는 기관에서의 신경에 대한 손상), 망막병증 (눈의 망막에 대한 손상), 신경병증 (신부전증을 유발할 수 있는 신장에 대한 손상), 심혈관 질환 (예로서, 고혈압 또는 심근경색), 뇌혈관 질병 (예로서, 대뇌 혈전증)을 포함한다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 특히 당뇨병의 예방 및/또는 치료를 위한, 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한, B. 슈도카테눌라텀 종 균주, 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 더욱 바람직한 실시양태는, 반드시 필수적이지는 않으나, 과체중 및/또는 비만 관련 병리인 제 2형 진성 당뇨병의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다.

제 2형 진성 당뇨병은 조직에서 인슐린 생산 및 인슐린 민감성에서의 상대적인 결함, 따라서 글루코스의 부족한 말초적 이용에 의하여 특징된다. 제 2형 진성 당뇨병은 전체 당뇨 환자 중 80%~90%를 차지한다. 이는 종종 생애 중 성인 단계에서 발생되며, 비만과 매우 공통적으로 관련된다. 그러나, 몇몇 약물 및 기타 원인들이 이 유형의 당뇨병을 일으킨다. 예로서, 당뇨병은 종종 코르티코이드의 장기간 투여, 치료되지 않은 혈색소침착증과 종종 관련되며, 항상 비만과 관련되는 것은 아니지만 임신성 당뇨병과 관련된다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 비만 또는 과체중 대상, 및 과체중 또는 비만 전 단계에서 지방 조직의 성장 및 분화를 감소시키기 위한, 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한 B. 슈도카테눌라텀 종 균주 , 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것으로, 따라서 이는 대사성 증후군의 예방 및/또는 치료에 사용된다. 대사성 증후군은 당뇨병 및 심혈관 질병의 위험을 함께 증가시키는 대사성 질환의 세트를 지칭하며, 비만, 이상지질혈증 (예로서, 트리글리글리세라이드혈증 및 과콜레스테롤혈증) 및 고혈당증의 조합을 포함한다. 이전의 예들에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 균주는 이들 질환들 및 따라서 대사성 증후군의 동시 치료 및 예방에 유용하다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 대조군 대상에 비하여 선천성 및 적응성 면역 반응의 변경과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한, 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한, B. 슈도카테눌라텀 종 균주 , 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것으로, 따라서 이는 미처리 대상에 비하여 선천성 및 적응성 면역계의 기능을 개선시키는 데 사용된다. 이러한 병리는 바람직하게는 과체중, 비만 및 이들 면역 기능의 변경을 일으키는 관련 질환들이다. 실시예 3은 이러한 측면에서의 실험 데이터를 나타낸다.

"선천성 및 적응성 면역 반응과 관련된 질병"이라는 표현은 선천성 및 적응성 면역계의 기능의 면역억제를 나타내는 질병을 지칭한다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 대조군에 비하여 전염증성 단백질의 더욱 높은 생산과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한, B. 슈도카테눌라텀 종 균주 , 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 실시예 2 및 3은 이에 관한 실험 데이터를 나타낸다.

전염증성 단백질의 예들은 이에 제한되지는 않지만 시토카인, 케모카인 및 아디포카인을 포함한다. 전염증성 단백질은 바람직하게는 IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16, TNF-알파 또는 MCP1 및 렙틴, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리스트로부터 선택된다. 전염증성 단백질은 더욱 바람직하게는 TNF-알파, IL-6, MCP1 및 렙틴 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 리스트로부터 선택된다.

"전염증성 단백질의 보다 높은 생산과 관련된 질병"이라는 표현은, 적어도 상이한 유형의 조직의 염증 (전염증성)에 관련된 단백질의 생산에 의하여 유발되는 질병을 지칭한다. 전염증성 단백질의 보다 높은 생산과 관련된 질병 중 일부는 과체중 및/또는 비만과도 관련되며, 이에 제한되지는 않지만 예로서, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 대사성 증후군, 지방간, 비-알코올성 간염, 고혈압, 이상지질혈증, 심혈관 질환, 동맥경화증, 지방간염, 또는 암이 있다. 전염증성 단백질의 더욱 높은 생산을 갖는 관련된 질병들은 과체중 및/또는 비만과 관련되지 않거나, 또는 이에 제한되지는 않지만 예로서 상기 언급된 질병들 (예로서, 당뇨병) 및 알러지성 염증과 같은 기타 질병들과 같이 비만 부재 하에 존재할 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 대조군에 비하여, 비만 대상에서 렙틴의 농도를 감소시키기 위하여 및/또는 비만이 아닌 대상에서 상기 호르몬 농도를 증가시키기 위하여, 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한, B. 슈도카테눌라텀 종 균주, 본 발명의 균주, 본 발명의 미생물 조합물, 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 비만이 아닌 대상에서, 렙틴에서의 증가는 섭취에서의 감소 및 에너지 소비 및 지질 산화에서의 증가를 일으킨다. 대조적으로, 비만 환자에서는, 렙틴의 농도 감소는 대사 장애의 정상화 및 염증 감소에 기여한다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는, 장 미생물군의 조성을 회복하거나, 또는 장 내용물 중 장내세균의 농도를 감소시키기 위한, 의약품의 생산 또는 영양 조성물의 생산을 위한, B. 슈도카테눌라텀 종 균주 , 또는 본 발명의 균주, 또는 본 발명의 미생물 조합물, 또는 세포 성분, 대사산물, 분비된 분자, 또는 이들의 임의의 조합, 또는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 장 미생물군의 조성의 회복, 또는 장 내용물 중 장내세균의 농도의 감소가 과체중 환자, 비만 환자에서 또는 그와 관련된 임의의 병리를 갖는 대상에서 실시된다.

장 미생물군의 회복은, 미처리된 대조군에 비하여, 비제한적인 예로서, 장 내용물 중 장내세균의 농도의 감소 및 비피도박테리아 및/또는 락토바실러스들에서의 증가에 기초할 수 있다. 실시예 3.6에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 균주의 투여는 결장 내 총 비피도박테리아의 농도에서 적어도 1 로그 단위의 농도를 증가시키며, 장내세균과 같은 잠재적으로 염증성인 세균의 농도의 적어도 0.5 로그 단위의 감소를 일으킨다. 이는 내장에서 말초 조직 (예로서 간)으로 전달될 수 있는 전염증성 신호의 감소도 수반하며, 이는 비만 환자 또는 비만이 아닌 대상에서 상이한 병리에 의하여 영향받을 수 있다.

본 명세서의 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 사용된 "포함하다" 및 그의 변형 형태들은 기타 다른 특징부, 첨가제, 성분 또는 단계를 배제시키고자 하는 것이 아니다. 당업자는, 본 발명의 다른 목적, 장점 및 특징들을 부분적으로는 발명의 상세한 설명, 그리고 부분적으로는 본 발명의 실시로부터 유추할 수 있을 것이다. 하기 도면 및 실시예들은 예시적으로서 제공되며, 이로써 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.

도 1은 비만인 C57BL/6 마우스들 (n=6/군)에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 대식작용에 연관된 마크로파지의 호흡성 분출에 대한 효과를 나타낸다.
ND, 표준 대조군 동물; HFD, 고지방 식이; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765.
도 2는 비만인 C57BL/6 마우스들 (n=6/군)에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 상이한 자극들 (지질다당류 [LPS] 및 배설물)과 관련된 시토카인 합성 (TNF-알파)에서의 마크로파지의 기능에 대한 효과를 나타낸다.
ND, 표준 대조군 동물; HFD, 고지방 식이; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765. 흑색 막대: 대조군; 연회색: LPS; 암회색: 배설물.
도 3은 비만인 C57BL/6 마우스들 (n=6/군)에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 수지상 세포와 T-세포와의 상호작용 및 이들의 증식능에 대한 효과를 나타낸다.
CD4+ T-세포들 (L)을 7주 동안 균주 투여된 (10 ⁸ cfu/일) 비만인 C57BL/6 마우스들 (n=6/군)의 상이한 실험군의 성숙한 수지상 세포(DC)와 함께 인큐베이션하였다. 혼합물 중 세포 비율 (L/DC)은 1:1, 1:2 및 1:4였다.
ND, 표준 대조군 동물; HFD, 고지방 식이; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765.
도 4는 비만인 C57BL/6 마우스 (n=6/군)에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 상이한 자극들(LPS 및 배설물)에 대한 시토카인 합성에서의 수지상 세포들의 기능에 대한 효과를 보여준다.
ND, 표준 대조군 동물; HFD, 고지방 식이; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765.
도 5는 비만인 C57BL/6 마우스 (n=6/군)에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 크기 범위로 분류한, 지방세포 발달에 대한 효과를 보여준다.
ND, 표준 대조군 동물; HFD, 고지방 식이; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765.
도 6은 비만인 C57BL/6 마우스 (n=6/군)에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 지방증 발달 (간에서의 지질 축적)에 대한 효과를 보여준다.
세포에서 지방 축적 정도에 따른 지방 간세포의 수는 헤마톡실린 에오신으로 염색된 간조직의 조직학적 섹션(section)에 나타난다.
ND, 표준 대조군 동물; HFD, 고지방 식이; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765.
도 7은 비만인 C57BL/6 마우스 (n=6/군)에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 헤마톡실린 에오신으로 염색된 조직학적 섹션에서 장세포에 형성된 카일로마이크론의 수에 대한 효과를 나타낸다.
HFD, 고지방 식이의 동물; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765.
도 8은 비만인 C57BL/6 마우스 (n=6/군) 및 대조군 마우스에서 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 (10 ⁸ cfu/일)의 7주간 투여의, 말초 혈액 렙틴 농도에 대한 효과를 나타낸다.
L, pg/ml로 나타낸 렙틴; HFD, 고지방 식이의 동물; HFD+P, 고지방 식이 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765; SD, 표준 식이의 동물; SD+P 표준 식이의 동물 + B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765.
도 9는 변성 기울기 겔 전기영동 (DGGE)에서의 전기영동에 의한 본 발명의 균주의 종의 동정을 나타낸다.
컬럼 M1은 하기 나타낸 참조 미생물들의 DNA 단편들에 대응하는 상이한 밴드들 Bx를 나타낸다: B1은 B. 아돌레슨티스(adolescentis) LMG 11037T; B2는 B. 안굴라텀 ( angulatum ) LMG 11039T; B3: B. 롱검 하위종 인판티스 CECT4551T; B4: B. 슈도카테눌라텀 CECT 5776; B5: B. 아니말리스 하위종 락티스 DSM 10140T.
컬럼 M2에서, B6는 B. 비피둠(bifidum) LMG 11041T; B7은 B. 롱검 하위종 롱검 CECT 4503T; B8은 B. 카테눌라텀 LMG 11043T; B9는 B. 덴티움 CECT 687; B10은 B. 아니말리스 하위종 아니말리스 LMG 10508T이다.
컬럼 I1에서, 밴드는 본 발명의 CECT 7765 균주를 나타낸다

실시예

본 발명은 본 발명자들에 의하여 수행된 하기 분석에 의하여 예시된다. 본 특허 문헌에서 제공된 하기 특정 실시예들은 본 발명의 성질을 예시하기 위하여 제공된다. 이들 실시예들은 예시적인 목적을 위해서만 포함되며, 본 명세서에서 특허엉구된 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 따라서, 기재된 실시예들은 그의 적용 분야를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1. B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주의 분리 및 동정

비피도박테리움 속 균주를, 분석 전 적어도 한달 동안 비피도박테리아 함유 식품을 먹지 않고, 항생제 처리되지 않은 건강한 모유수유 마우스들의 배설물로부터 분리하였다. 이 샘플을 4℃에서 유지시키고, 채집 전 2시간 미만 내에 분석하였다. 이들 각각의 2g을 130 mM NaCl (PBS) 농도를 포함하는 10mM 인산염 버퍼 중에 희석시키고, Lab-Blender 400 스토머커(stomacher) (Seward Medical, London, UK)에서 3분 동안 균질화시키고, 펩톤수 중에 희석하였다. 상이한 10배수 희석물들의 0.1ml 분취액을 0.05% 시스테인 (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C), 및 80mg/ml의 무피로신을 함유하는 MRS 한천 (Man Rogose and Sharpe; Scharlau, Barcelona) 중에 접종시켰다. 접종한지 무산소 조건에서 (AnaeroGen, Oxoid, UK) 37℃에서 48시간 후, 분리된 콜로니들을 선발하고 그램(Gram) 염색 하에서 그 형태학을 연구함으로써 그 정체를 확인하였다. 분리물의 정체는 총 DNA로부터 16S RNA 유전자를 서열분석함으로써 확인하였다. 서열분석된 단편을 프라이머 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3': 서열번호: 2) 및 1401r (5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3': 서열번호: 3)를 이용하여 증폭되었으며, GFX ^TM PCR 상업 시스템 (Amershan, Bioscience, UK)을 이용하여 정제되었다. 프라이머 530f (5'-GTGCCAGCAGCCGCGG-3': 서열번호: 4) 및 U-968f (5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3': 서열번호: 5)이, 다른 저자들에 의하여 설명된 방법에 따라, 서열분석을 위하여 더 사용되었다 (Gerhard 등, 2001. Appl. Environ. Microbiol ., 67: 504~513; Satokari 등 , 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504~513; Favier 등, 2002. Appl. Environ. Microbiol ., 68: 219~22). 서열분석은 ABI 3700 자동 DNA 서열분석기( Applied Biosystem, Foster City, CA )를 이용하여 수행되었다.

CECT 7765 균주의 16S 리보좀 RNA 유전자의 1.28kb 서열은 서열번호: 1이다. 가장 밀접하게 관련된 서열들의 연구를 BLAST 알고리즘을 이용하여 (Altschul 등, 1990. J. Mol Biol., 215: 403~410) GenBank 데이터베이스에서 수행하였다.

가장 유사한 서열들에 대한 서열번호: 1의 비교에 따라, B. 슈도카테눌라텀 종의 다른 박테리아에 대하여, 예로서, B. 슈도카테눌라텀 B1279 균주에 대하여 (GenBank 수납번호 NR_037117.1) 99% 동일성이 수득되었다. 이들 결과들은 본 발명의 균주가 상기 종들에 속할 수 있는 가능성이 있다는 것을 나타내었다.

종들의 동정은 이전의 연구에서 기재된 것과 같이 DGGE에 의해서도 확인되었다 (Satokari 등, 2001. Applied and Environmental Microbiology, 67, 504~513). 16S rRNA 유전자의 서열 (520 pbb)을 프라이머 Bif164 및 Bif662-GC를 이용하여 증폭하였고, 증폭된 단편들을 범용 돌연변이 검출 시스템(Universal Mutation Detection System) 전기영동 장치(Bio-Rad, Richmond, CA)에서 분리하였다. 45~55% 변성 경사를 겔 중에서 수립하였으며, 여기에서 100%는 7M 농도의 우레아 및 40% 포름아미드에 상응하였다 (부피/부피). 전기영동 이동은, 각 종에 대한 참조문헌으로서 사용된 콜렉션(collection) 균주들에 비교하였다.

도 9에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 균주의 전기영동 이동 밴드 (겔 래인 I1: B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765)는 참조로서 사용된 동일 종의 또다른 균주 ( B. 슈도카테눌라텀 CECT 5776)와 일치하였다.

본 발명의 균주는 프라이머 M13 (5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3': 서열번호: 6) 및 Del (5'-CCGCAGCCAA-3': 서열번호: 7)를 사용한 RAPD 분석을 통하여 그리고 상기 기재된 방법론에 따라 (Hoffmann 등, 1998. Zentralbl Bakteriol. 288, 351~60; Svec 등 2010. Antonie Van Leeuwenhoek. 98: 85~92) 분자 타이핑하였다. 임의적으로 증폭된 DNA 단편들의 프로파일은 본 발명의 균주물이( B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765) 동일 종의 다른 균주들과 상이하다는 것을 증명하였다.

실시예 2. 시험관 내 저등급 만성 염증에 연루된 마크로파지의 반응을 조절하는 능력에 따른 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주의 선발

2.1. 장 세균 배양물 및 상등액의 제조

균주를 0.05% 시스테인 (MRS-C)을 포함하는 10ml의 MRS 브로스(broth) ( Scharlau Chemie SA, Barcelona, Spain) 중에 접종하여 24시간 동안 배양하고, 이들을 무산소 조건에서 37℃에서 22시간 동안 인큐베이션하였다 ( AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK ). 세포들을 원심분리 (6,000 g , 15분)에 의하여 채집하고, PBS (10mM 인산나트륨, 130mM 염화나트륨, pH 7.4) 중에서 2회 세척하고, 20% 글리세롤을 함유하는 PBS 중에 재현탁시켰다. 이들 현탁액의 분취액을 액체 질소로 동결시키고, -80℃에서 보존시켰다. 동결-해동 사이클 후 생육성 세포들의 수를 MRSC 한천 플레이트 중에서 48시간 동안 인큐베이션한 후 계수하여 측정하였다. 생육능은 모든 경우에서 90% 초과였다. 각 분취액을 단일 분석에 사용하였다. 사멸된 박테리아의 효과를 평가하기 위한 목적으로, 분취액 일부를 냉각-비활성화 (3~20℃ 동결 및 해동 사이클) 및 가열-비활성화시켰다(80℃에서 30분). 수득된 상등액의 pH 값을 NaOH를 이용하여 7.2로 조절하고, 여과 (0.22-㎛ 공극 크기)에 의하여 멸균시켜서 생육가능한 세포들의 존재 가능성을 없앴다. 무세포 상등액의 분취액을 사용시까지 -80℃에서 보존하였다.

2.2. 마크로파지 배양 및 자극.

Raw 264.7 쥐과의 마크로파지 세포주로부터의 세포들을 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, Sigma, USA)에서 배양하고, 10% 우태혈청 (Gibco, Barcelona, Spain), 스트렙토마이신 (100 mg/ml, Sigma) 및 페니실린 (100 U/ml, Sigma)으로 보충하였다. 자극 실험을 수행하기 위하여, 37℃, 5% CO ₂ 하에서, 세포들을 24웰 편평 바닥 폴리스티렌 플레이트 (Corning, Madrid, Spain) 중에서 10 ⁶ 세포/ml의 농도로 접종하였다. 1 x 10 ⁶ 콜로니 형성 유닛 (cfu)/ml의 생세균 및 사멸세균의 현탁액 및 150ml 부피의 상등액을 자극물로서 사용하였다. 대장균 O111:B4 (Sigma, St. Louis, MO)로부터 정제된 1 mg/ml의 농도의 지질다당류 (LPS)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 비자극화된 PBMC에서 시토카인 생산을 음성 대조군으로서 분석하였다. 각 유형의 자극물들은 각 실험에서 이중으로 분석하였다. 배양물 상등액을 원심분리에 의하여 채집, 분획화하고, 시토카인 및 케모카인 검출까지 -20℃에서 분취액 중에 저장하였다.

2.3. 시토카인 및 케모카인 결정

본 발명의 상등액의 시토카인 (TNF-α, IL-6, IL10 및 MCP1)의 농도를 ELISA 키트 (BD Biosciences, San Diego, CA)를 이용하여 제조자 설명서에 따라 측정하였다.

본 발명의 균주물은, 마크로파지의 지방조직으로의 이동에 연루되고, 또한 인슐린 및 렙틴의 작용에 내성을 유발하는 비만과 관련된 만성 염증 조건에 연루되는, 전염증성 분자 (TNF-α 및 IL-6) 및 화학주성 분자 (MCP1)의 농도를 낮게 유도하는 그의 능력으로 인하여, 특히 락토바실러스 및 비피도박테리움 속으로부터 선택하였다 (표 1). CECT 7765 균주를 TNF-a, IL-6의 보다 낮은 농도의 생산을 유도하는 것이며, 이는 MCP1의 보다 낮은 생산을 유도한 2 개의 균주들 중 하나였다 (표 1). 본 발명의 균주도 마크로파지에 의하여 높은 농도의 항-염증성 및 조절 시토카인 (IL-10, 표 2)을 유도하기 때문에 선택되었으며, 이는 비만 관련해서 염증을 감소시키는데 기여할 수 있다 (표 2). 선택된 박테리아의 면역학적 성질은 락토바실러스 및 비피도박테리움 속의 모든 장세균 또는 동일한 종의 기타 균주에 공통적이지 않은 것으로, 따라서 이에 의하여 이들은 과체중, 비만 및 관련 변경들 및 이전의 섹션에서 설명된 기타 질병들의 치료 및 예방에서 적용에 특히 적합하게 된다.

TNF-α, IL-6 및 MCP1의 생산에서의 증가는 과체중, 비만 및 관련 병리들과 관련되지만, 대조군에 비하여, 상기 병리들에만 관련될 뿐 아니라, TNF-α, IL-6 및 MCP1에서의 증가에 의하여 유발된 임의의 병리와도 관련되고, 이는 설명 중 전술한 문단에 설명된 바와 같다.

실시예 3. 면역계 세포의 기능, 말초 혈액 및 중추 신경계에서 면역학적 및 내분비 파라미터, 및 장 미생물군 및 그의 염증성 성질에 대한, B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주의 투여 영향

3.1. 본 발명의 균주물의 배양물의 제조

CECT 7765 균주를 0.05% 시스테인 (중량/부피)을 포함하는 MRS 배양액 ( Scharlau Chemie SL- Barcelona, Spain) 중에서 무산소 조건에서 37℃에서 22시간 동안 배양하였다 ( AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK ). 세포들을 원심분리 (6,000 g , 15분)에 의하여 채집하고, 인산염 버퍼 용액 (PBS, 10mM 인산나트륨, 130mM 염화나트륨, pH 7.4)로 2회 세척하고, 10% 탈지우유(skim milk) 중에 재현탁시켰다. 이들 현탁액의 분취액을 액체 질소로 동결시키고, 사용시까지 -80℃에서 보존시켰다. 0.05% 시스테인을 이용하여 MRS 한천 플레이트 중에서 48시간 인큐베이션 후 계수하여 박테리아의 생육능을 확인하였으며, 이는 약 90%였다. 각 분취액은 단지 한번만 해동시켰다.

3.2. 비만 동물 모델 및 샘플링

C57BL-6 성인 수컷 마우스들 (6~8주; Harlan Laboratories)을 사용하였다. 동물들을, 12시간 명/암 사이클을 이용하여 제어된 온도에서, 40~50% 상대 습도 분위기에서 유지하였다. C57BLACK6 마우스들은 C57BL-6 또는 블랙 6으로 약기되며, 인간 질병의 연구에서 유전적 조작을 위한 실험실 마우스들의 동족혼(endogamic) 균주에 가장 널리 사용된다.

60%의 에너지가 지질 형태로 제공된 고지방 식이 (HFD)로 7주 동안 공급하여 비만 동물들의 군을 생성한 반면 (60/지방, Harlan Laboratories), 비만이 아닌 동물들에게 통상의 음식물을 투여하였다. 마우스들은 물과 음식에 자유로이 접근하였다. 체중은 매주 모니터링하였다. 실험은 동물 윤리회 기준에 따라 수행하였다.

동물들을 임의의 4개 군으로 나누었다 (n=6/군): 통상의 식이 공급군 (대조군), 본 발명의 균주물이 투여된 대조군 (대조군-균주), 고지방 식이 공급군 (비만) 및 CECT 7765 균주 (비만-균주)가 투여된 비만. 균주를 위장관을 통하여 7일 동안 10 ⁸ cfu/일의 매일 투여량으로 투여하였다. 대조군 및 비만군에는 위약으로서 동일한 방식으로 물을 투여하였다.

이 후, 동물들을 마취시키고, 경추탈골에 의하여 희생시키고, 상이한 생물학적 샘플들을 취하였다. 말초 혈액에서 면역학적 파라미터들 (시토카인, 아디포카인 및 케모카인)을 ELISA를 이용하여 결정하였다. 염증성 시토카인 (TNF-알파)의 농도 또한, 전술된 섹션에서 설명된 바와 같이, ELISA 분석에 의하여 폴리트론(polytron)으로 미리 균질화된 뇌 샘플의 상등액에서 결정하였다. 배설물 샘플을 취하여 균주 투여의 미생물상 조성에 대한 효과 및 하기 설명되는 바와 같이 수득된 마크로파지, 수지상 세포 및 T-세포의 시험관 내 배양에 대한 면역학적 반응-자극 효과도 결정하였다.

3.3. 마크로파지에 대한 효과의 평가

선천성 면역 시스템 세포들의 반응 개선에 대한 CECT 7765 균주의 투여 효과를 증명하기 위한 목적을 위하여, 56℃에서 30분 동안 불활성화된 10% 우태혈청 (Gibco, Barcelona, Spain), 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 및 100 U/ml의 페니실린 ( Sigma Chemical Co .)으로 보충된, 둘베코 변형 이글 배지 용액 (DMEM) (Sigma™, St. Louis, MO/USA)를 복막내 경로에 의하여 무균적으로 주사함으로써 마크로파지를 수득하였다. 각 실험군의 마우스들로부터 수득된 마크로파지들을 중간 DMEM 중 1x10 ⁵ 세포/ml의 농도로 조절하고, 5% CO ₂ 분위기 중에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰들을 무혈청 DMEM으로 세척하여 비-부착된 세포들을 제거하였다. 부착된 세포들을 24시간 동안 인큐베이션하고, 이 기간 이후, 각 마우스 실험군의 배설물 (PBS 중 희석 1/9) 및 양성 대조군으로서 1 ㎍/ml의 살모넬라 티피무리움 LPS (Sigma Chemical Co, Madrid, Spain)로 자극하였다. 동시에, 기저(basal) 시토카인 생산을 알고자 하는 목적으로 비자극된 마크로파지를 평가하였다. 자극 후, 상등액을 채집하고, 그 안에 있는 하기 시토카인의 농도를 결정하였다: ELISA에 의하여 TNF-α, IL6 및 IL-10 (Ready SET Go! Kit, BD Bioscience, San Diego, CA, USA).

3.4. 수지상 세포 및 T-세포에 대한 효과의 평가

수지상 세포의 T-세포 반응, 이에 따라 적응성 면역반응을 자극하는 능력의 개선에 대한 본 발명의 균주물의 투여 효과를 증명하기 위한 목적으로, 혼합 림프구 반응에서 CD4+ T-세포의 증식 반응을 유도하는 성숙한 수지상 세포의 능력을 측정하였다. 상기 기재된 것과 같이 본 발명의 균주물이 투여되거나 또는 투여되지 않은 비만 및 대조군 마우스들로부터 추출된 세포들의 반응을 비교함으로써 분석을 수행하였다.

마우스의 경골 및 대퇴골의 골수로부터 수지상 세포들을 생성하였다. 각 마우스들의 경골 및 대퇴골을 추출하고 주변 조직을 무균적으로 제거하였다. 말단을 절단한 후, 그를 주사기 및 0.45mm 직경의 바늘을 이용하여 PBS로 플러싱(flushing)하여 골수를 추출하였다. 수득된 세포들을 PBS로 1회 세척하고, 항생제 (페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml), 10% FBS 및 20ng/ml의 마우스 GM-CSF로 보충된 RPMI 중에서 희석된 10 ⁶ 세포들의 분취액을 100mm 플라스크 중에 접종하였다. 3일째에, 10ml의 배양 배지를 첨가하고, 7일째에, 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 8일째에, 부드럽게 피펫팅하여 비-부착된 세포들을 수확하였다. 세포들을 PBS를 이용하여 세척하고, 마우스 GM-CSF 없이 배양 배지 중에 재현탁시켰다.

혼합 림프구 반응을 수행하기 전에 24시간 동안 LPS (100 ng/ml)를 첨가하여 수지상 세포들 (DC)을 활성화시켰다. 성숙한 DC를 사용하여 CD4+ T-세포들을 자극하는데 사용하였다. CD4+ T-세포들을 7~8주령의 C57BL/6 마우스들의 비장으로부터 분리하였다. 적출 후, 비장을 FBS를 갖는 PBS 중에 현탁시키고, 나일론 메쉬를 통하여 통과시키고, 수득된 세포 현탁액을 1회 세척하고 용균 버퍼 중에 5분 동안 재현탁시켰다. PBS로 2회 세척 후, CD4+ T-세포들 (CT)을, L3T4-CD4+ 마이크로비즈 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)를 제조자 설명에 따라 이용하여 양성 선발에 의하여 면역유전학적으로 분리하였다.

혼합된 림프구 반응을 수행하기 위하여, DC의 분취액을 96-웰 플레이트 중에 3벌로 분포시켜, 각 경우에서 100㎕의 배양 매질 중 1:1, 1:2, 1:4의 비율로 (L/DC) 1x10 ⁵ CD4+ T-세포 (L)를 자극하고, 이들을 5% CO ₂ 분위기 중 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. DC 및 CD4+ T-세포들을, 마이토겐으로서 사용되는 ConA (5 ㎍/ml; Sigma) 없이 또는 이와 함께, 대조군으로서 사용하였다. 림프구 증식은 ELISA 키트 (BrdU-비색 분석; Roche, Diagnostic, Germany)을 이용하여 결정하고, 440nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다.

본 발명의 균주는, 식이에 의하여 유도된 비만을 갖는 대상에게 생체 내 적용되는 경우, 선천성 및 적응성 면역계 세포의 작용을 개선시켜, 감염성 약제, 항원 또는 알레르겐에 대한 이들의 반응능을 증가시킨다. 특히, 고지방 식이에 의하여 유도된 비만 동물 모델들에의 균주 투여는, 특히 대식작용 및 시토카인 합성에서의 마크로파지의 기능을 개선시킨다 (도 1 및 2). 균주의 투여는 외래 알레르겐 또는 자극물 (효모/병원균)에 반응하여 복막 마크로파지의 호흡성 분출을 증가시켜, 대식능을 개선시키고, 이에 따라 면역학적 방어능을 개선시킨다 (도 1). 이러한 능력은 비-비만 대조군에 비하여 비만 동물들에서 현저히 감소된다 (도 1). 초기 연구들도 병원균을 제거하기 위한 대식세포들의 호흡성 분출이 당뇨병을 갖는 대상에서도 변경된다는 것을 보여주고 있다 (Marhoffer 등 , 1992. 당뇨병 Care , 15(2): 256-60). 나아가, 비만 및 대조군 동물들로부터 추출된 복강 마크로파지 및 이들의 병원균의 지질다당류 (LPS)를 이용한 시험관 내 자극의 배양은, 본 발명의 균주물의 투여가, 가능한 감염을 중단시키는 책임이 있는 TNF-α와 같은 시토카인 합성을 개선시킨다는 것을 보여준다 (도 2). 본 방법의 균주물은, 생체 내 투여되는 경우, 수지상 세포 및 T-세포의 기능도 개선시킨다. 균주 투여되고 상이한 비율의 (1:1, 1:2 및 1:4) T-세포 존재 하에 인큐베이션된 비만 마우스들로부터 추출된 수지상 세포들은, 균주가 투여되지 않은 비만 동물들에서는 감소된 성질인, 그들의 증식 및 활성화능이 증가된다 (도 3). 시험관 내에서 LPS를 이용한 이들의 자극 후, 병원균들에 대한 반응에 연루된 시토카인들 (예로서, TNF-α)의 보다 높은 분비를 유도하는 능으로 인하여, 균주 투여된 비만 동물들에서 수지상 세포들의 최선의 작용도 증명되었다 (도 4). 본 발명의 균주물의 이러한 성질들은 이를 적합하게 하는데, 이는 수지상 세포들 및 T-세포들의 작용성이 비만 및 당뇨병과 같은 관련 질병에서 변경되기 때문이다. 특히, 수지상 세포들은 체중 증가와 관련된 기능적 변경들을 갖는데, 이는 이들의 항원 제시능 및 동종성(llogeneic) T-세포 자극능의 감소에 의하여 특징된다 (Macia 등 , 2006. J Immunol ., 177(9): 5997~6006; Verwaerde 등, 2006. Scand J Immunol ., 64(5): 457~66). 자극(마이토겐 또는 항원)에 대하여 실험된적 없는 (naive) T-세포의 전염증성 성질은 증가되어, 비만과 관련된 저등급 만성 염증성 단계에 기여할 수 있으며, 대조적으로 항원에 이전에 노출되었던 T-세포들은 증식 결합을 가지며, 바람직하게는 Th2형 시토카인을 분비한다. 이들 모두 비만 대상에서 높은 감염율 및 백신 및 감염에 대한 T-세포-매개된 반응의 결여를 설명하여 준다 (Karlsson 등, 2010. J Immunol ., 184: 3127~33). T-세포들의 기능도 당뇨병에서 결핍되어, 자극에 반응한 증식능 및 IL2 합성능을 감소를 나타낸다 (Chang and Shaio. 1995. 당뇨병 Res Clin Pract ., 28(2): 137~46).

생체 내 투여된 본 발명의 균주는 시토카인, 케모카인 및 아디포카인 생산을 조절하고, 그의 합성은 비만 및 말초 혈액에서의 관련 질병에서 변경된다. 비만 동물 모델 및 대조군에서 유도된 변화들은 염증성 시토카인 TNF-α의 농도 감소를 포함한다. 아디포카인 렙틴은 비만 동물에서 감소되고, 비만을 증가시키고, 염증성 과정에 기여할 수 있다. 그러나, 대조군 동물에서, 균주는 섭취를 감소시키고, 에너지 소비와 지질 산화를 증가시키고, 과체중 및 비만을 방지하는데 기여하는 렙틴 합성을 유도한다.

3.5. 뇌에서 염증성 시토카인의 농도에 대한 효과의 전개

본 발명의 균주물은 또한 중추 신경계에서 TNF-α 합성을 현저히 감소시키며, 그의 합성은 비만을 증가시키고 인슐린과 렙틴 내성의 발달에 기여하여, 그들의 거식성 효과 (배고픈 느낌의 감소) 체중 조절 및 당 대사 조절 기능을 저해한다 (De Souza 등, 2005. Endocrinology., 146: 4192~9).

3.6. 장 미생물군의 조성 및 그의 염증성 성질에 대한 효과의 평가

CECT 7765 균주는 장 미생물군의 조성을 회복시켜, 과체중 및/또는 비만과 관련된 변경들 및 이들 변경을 유발하는 염증성 효과를 정상화시키고 또한 과체중 및/또는 비만과만 관련되지 않은 기타 병리학적 조건들 관련된 변경들도 정상화시킨다. 본 발명의 균주의 투여는 락토바실러스 및 비피도박테리아의 수를 증가시키고, 장 함유물 중 장내세균의 수를 적어도 1/2 대수 단위로 감소시킨다. 미생물상의 조성에서의 이러한 변화는 추가적으로 전염증성 성질의 감소 및 그의 항염증성 성질의 증가로 번역된다. 마크로파지와 수지상 세포 모두에서, 균주 투여된 비만 동물들의 미생물상은 보다 낮은 전염증성 시토카인 합성, 예컨대 TNF-α 합성을 유도하고, 균주 투여되지 않은 비만 동물들에서보다 더 많은 항-염증성 시토카인 IL-10 합성을 유도한다 (실시예 3; 도 2 및 4). 장 미생물군의 변경은 체증 증가, 인슐린 내성, 비만 및 당뇨병을 유발하는 가능한 염증성 자극들 중 하나인 것으로 고려되며 (Cani and Delzenne 2009. Curr Opin Pharmacol ., 9(6): 737~43), 상기 변경은 나아가 또다른 유형의 병리학적 상태를 유발한다.

실시예 4. B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 투여의 간 및 지방 조직에 대한 효과

실시예 3에 기재된 동일한 마우스들 및 동일한 실험군에서, 이들 중 2개에 동일한 섭생법에 따라 본 발명의 균주물을 투여한 것들을 사용하였다. 처리 기간 후, 동물들을 마취시키고, 경추탈골에 의하여 희생시키고, 지방 조직 (정소상체) 및 간 조직 샘플을 취하였으며, 이들을 식염수로 세척하고 10% 포르말린을 갖는 버퍼 중에 고정시키고, 파라핀 고정하여, 4~5㎛ 섹션으로 절단하고, 이들을 에마톡실린 에오신으로 염색시켰다. 명시야(bright-field) 광학 현미경 (Olympus)을 이용하여, 하기 척도에 따라 각 고정된 섹션의 10 필드를 분석함으로써 지방증의 심각성 (간에서의 지방 축적)을 측정하였다: 등급 1 (지방증 없음); 등급 2, 간세포 중 지방이 세포의 33% 미만을 점유한 경우; 등급 3, 간세포 중 지방이 세포의 34~66%를 점유한 경우; 등급 4, 간세포 중 지방이 세포의 66% 초과를 점유한 경우. 지방세포들의 크기를 NIS Elements BR 2.3 소프트웨어를 이용하여 영상 분석에 의하여 측정하고, 실험군 및 조직 유형 당 적어도 100개의 세포들을 평가하였다.

본 발명의 균주물은 정소상체 조직에서 지방세포들의 크기를 감소시키는데, 생에 중 소정의 단계들 (소아 및 청소년)에서 이의 증가 (비대)는 성인 연령에서 과체중 및 비만 발생을 촉진하며 섭취 및 에너지 소비간의 양성적인 불균형과 관련된다 (Macia 등, 2006. Genes Nutr ., 1: 189~212). 대조적으로, 지방세포들의 크기에서의 감소는 인슐린 내성 및 글루코스 농도의 감소와 관련된다 (Varady 등 , 2009. Metabolism 58: 1096~101). 특히, 본 발명의 균주물의 비만 동물 모델에의 투여는, 1,000 내지 2000 mm ² 범위의 작은 크기의 지방세포들의 증가를 일으키는 반면, 균주 투여되지 않은 비만 동물들에서는 4000 내지 6000 mm ² 범위의 큰 크기의 지방세포들이 증가된다 (도 5). 유사한 효과가 비만이 아닌 동물들에서 관찰된다.

지방세포들의 증가된 크기도, 간으로의 지방산의 증가된 공급과 관련되며, 이는 간 지방증 및 이의 합병증을 일으켜서, 균주는 이들 변경을 방지 또는 개선시키는 데 유사하게 기여할 수 있다. 따라서, B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주는 지방세포의 크기를 감소시키는데, 즉 이는 비대를 일으키고, 시간 경과에 따라 유지되면 과체중 및 비만을 유발 및 비만과 반드시 연관되지 않는 기타 병리들을 일으킬 수 있는 이러한 유형의 세포들의 발전에서의 변경의 치료에 유용하다.

본 발명의 균주물은 고지방 식이의 섭취, 비만 및 비-알코올성 간염과 같은 상이한 병리들과 관련된 간에서의 지방 축적 (지방증)을 감소시킨다 (Musso 등 , 2010. Hepatology 52: 79~104). 특히, 본 발명의 균주물의 비만 동물 모델에의 생체내 투여는 높은 지방 축적을 갖는 등급 4의 간세포 (세포 중 66% 초과로 점유)의 감소, 및 지방 함량이 적은 등급 3의 간세포 (세포 중 34~66% 점유)의 증가를 일으키는 반면, 균주 투여되지 않은 비만 동물들에서는 반대의 효과를 갖는다. 대조군 동물들에서, 균주의 투여는 등급 3을 소비하여 등급 2 간세포 (지방이 간세포의 33% 미만을 점유함)를 증가시키며, 균주를 수령받지 않은 동물들에서는 반대 현상이 일어난다 (도 6).

실시예 5. 글루코스, 인슐린, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 말초 혈액 농도에 대한 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 투여의 효과

실시예 3에 기재된 동일한 마우스들 및 동일한 실험군들에서, 이들 중 2개에 동일한 섭생법에 따라 본 발명의 균주를 투여한 것들을 사용하였다. 처리 기간 후, 동물들을 마취시키고, 경추탈골에 의하여 희생시키고, 비색정량법 (Quimica Clinica Applicada, SA, Amposta, Spain)에 의하여 글루코스, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 농도를 결정하기 위하여 말초 혈액 샘플을 취하고, 인슐린 농도를 ELISA에 의하여 결정하였다 ( BD Bioscience, San Diego, CA, USA ). 또한, 동물을 희생시키기 전에, 식후 혈당 반응 또는 내당능(글루코스 내성)을 측정하였다. 금식 기간 후, 기저 글루코스 농도를 측정하고, 그 후 체중 kg 당 2g의 글루코스 부하를 각 마우스에게 투여하고, 반응 스트립을 이용하고 (Ascensia Esyfill, Bayer), 검출 한계가 30 내지 550 mg/dl 인 대응 글루코스 측정기(Ascensia BRIO, Bayer)를 이용하여 글루코스를 매 15분 또는 30분마다 측정하였다.

생체 내 투여된 본 발명의 균주는 비만의 금식한 동물들에서 글루코스의 말초 혈액 농도를 감소시킴으로써 글루코스 대사를 조절한다: 예로서, 비만 마우스들에서 검출된 492.7 (SD 18.3) mg/dl의 글루코스의 높은 혈청 농도를 본 발명의 균주물의 투여를 통하여 정상화시키고자 하여, 인슐린의 농도에서의 감소에 비례하여 316.5 (SD 20.5) mg/dl의 값에 도달하였다. 나아가, 본 발명의 균주물의 비만 동물에의 투여는 식후 글루코스 최대치를 감소시켰으며 (411.7 [SD 49.9] 대 352.0 [25.8]), 글루코스 곡선 하에서의 영역을 감소시켰다 (5.422 대 4.779 cm ² ). 경구 투약 후 글루코스의 혈장 농도의 증가 및 고농도의 지속성은 인슐린 합성 또는 인슐린에 대한 반응 또는 기타 원인들에서의 변경을 나타내며, 이는 본 발명의 균주물에 의해 양성적으로 조절되어, 인슐린 내성 및 당뇨병을 발전시킬 위험을 증가시키고 치료를 개선시킬 수 있다.

생체 내 투여된 본 발명의 균주는 특히 비만 동물에서 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 말초 혈액 농도를 감소시키는 지질 대사를 조절한다: 예로서 비만 마우스에서 검출된 196.0 (SD 14.3) mg/dl의 트리글리세라이드의 높은 혈청 농도는 본 발명의 균주물의 투여에 의하여 현저히 감소되어, 147.5 (SD 12.5) mg/dl의 값에 도달할 수 있다. 유사하게, 비만 동물 중 콜레스테롤의 높은 혈청 농도 146.9 (SD 12.7) mg/dl는 본 발명의 균주물의 투여에 의하여 현저히 감소되어 94.4 (SD 5.7) mg/dl에 도달한다.

실시예 6. 장에서 음식물로부터의 지질의 흡수에 대한 B. 슈도카테눌라텀 CECT 7765 균주 투여의 영향

실시예 3에 설명된 동일한 비만 모델 및 동일한 실험군들에서, 이들 중 2개에 동일한 섭생법에 따라 본 발명의 균주를 투여한 것들을 사용하였다. 처리 기간 후, 동물들을 마취시키고, 경추탈골에 의하여 희생시키고, 내장 조직 샘플을 취하여 수용액으로 세척하고, 10% 포르말린을 갖는 버퍼 중에 고정시키고, 파라핀 고정하여, 4~5 ㎛ 섹션들로 절단하고 헤마톡실린 에오신으로 염색하였다. 장세포 당 카일로마이크론의 수를, 명시야 광학 현미경(Olympus)을 이용하여 각 고정된 섹션의 10 필드를 계수함으로써 측정하고, 장세포 당 카일로마이크론의 수로 표시하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 균주는 장세포 내에서 형성된 카일로마이크론의 수를 50% 초과로 감소시킨다. 이들 결과들은 실시예 5의 결과들에 일치하며, 이는 본 발명의 균주가 혈중 트리글리세라이드 농도를 감소시킨다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC) <120> BIFIDOBACTERIUM CECT 7765 AND ITS USE IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF OVERWEIGHT, OBESITY AND RELATED PATHOLOGIES <130> P7858PC00 <150> ES P201031811 <151> 2010-12-07 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1280 <212> DNA <213> Bifidobacterium pseudocatenulatum CECT 7765 <400> 1 gcttggtggt gagagtggcg aacgggtgag taatgcgtga ccgacctgcc ccatacaccg 60 gaatagctcc tggaaacggg tggtaatgcc ggatgctccg actcctcgca tggggtgtcg 120 ggaaagattt catcggtatg ggatggggtc gcgtcctatc aggtagtcgg cggggtaacg 180 gcccaccgag cctacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ttgggactga 240 gatacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc 300 ctgatgcagc gacgccgcgt gcgggatgac ggccttcggg ttgtaaaccg cttttgatcg 360 ggagcaagcc ttcgggtgag tgtacctttc gaataagcac cggctaacta cgtgccagca 420 gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgta 480 ggcggttcgt cgcgtccggt gtgaaagtcc atcgcttaac ggtggatctg cgccgggtac 540 gggcgggctg gagtgcggta ggggagactg gaattcccgg tgtaacggtg gaatgtgtag 600 atatcgggaa gaacaccaat ggcgaagtca ggtctctggg ccgttactga cgctgaggag 660 cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtgga 720 tgctggttgt ggggcccgtt ccacgggttc cgtgtcggac ctaacgcgtt aagcatcccg 780 cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaagaaatt gacgggggcc cgcacaagcg 840 gcggagcatg cggattaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctgggct tgacatgttc 900 ccgacagccg tagagatatg gcctcccttc ggggcgggtt cacaggtggt gcatggtcgt 960 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctg 1020 tgttgccagc acgtcatggt gggaactcac gggggaccgc cggggtcaac tcggaggaag 1080 gtggggatga cgtcagatca tcatgcccct tacgtccagg gcttcacgca tgctacaatg 1140 gccggtacaa cgggatgcga cacggcgacg tggagcggat ccctgaaaac cggtctcagt 1200 tcggattgga gtctgcaacc cgactccatg aaggcggagt cgctagtaat cgcggatcag 1260 caacgccgcg gtgaatgcgt 1280 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 27f <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 1401r <400> 3 cggtgtgtac aagaccc 17 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 530f <400> 4 gtgccagcag ccgcgg 16 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer U-968f <400> 5 aacgcgaaga accttac 17 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer M13 <400> 6 gagggtggcg gttct 15 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer Del <400> 7 ccgcagccaa 10