공액 지방산의 제조방법 및 그 방법에 의해 얻어진 음식품

공액 지방산의 제조방법 및 그 방법에 의해 얻어진 음식품{PROCESS FOR PRODUCING CONJUGATED FATTY ACID AND FOOD/DRINK OBTAINED BY THE PROCESS}

본 발명은 특히, Lactobacillus oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis , 또는 Bifidobacterium pseudocatenulatum 으로부터 선택되는 1종이상의 세균을 이용하여 특정의 공액 지방산을 효율적으로 제조하는 방법 및 이 방법에 의해 얻어진 공액 지방산을 함유하는 음식품에 관한 것이다.

공액 지방산은 인접하는 탄소가 단결합을 사이에 두고 이중결합을 가진 지방산이지만, 특히 탄소수 18의 지방산 분자 내에 공액디엔을 1개 갖는 공액 리놀산은, 다양한 생리활성을 갖는 것이 명백히 되어 있다.

공액 리놀산을 공업적으로 제조하는 방법으로서는, 예를 들면 리놀산을 함유하는 유지, 혹은 유리형의 리놀산을 에틸렌글리콜 등의 유기용매하에서 공액화하는 알칼리 공액화법이 알려져 있다.

알칼리 공액화법에서는, 통상 불포화 지방산과 과잉의 알칼리를 유기용매중에서 150℃이상으로 가열한다. 이 때, 얻어지는 공액 지방산은, 이중결합의 결합위치나 배치가 다른 혼합물의 형태이고, 예컨대 원료에 리놀산을 이용한 경우에는, cis-9, trans-11형 혹은 trans-9, cis-11형, trans-10, cis-12형의 공액 리놀산이 얻어지고, 이 외에도 몇개의 위치 혹은 어느정도 이성체를 함유하고 있다.

따라서, 상기 공액 지방산의 생리작용은, 공액 지방산의 혼합물로서의 작용이고, 특정의 공액 지방산이 제조될 수 있으면 학술적으로도 공업적으로도 응용가치는 높다. 또, 알칼리 공액화법에서는, 환화 및 기타 부반응도 일어나고, 공액 지방산의 수율이 저하되는 것, 정제가 곤란하게 되는 것 등의 문제점도 지적되고 있다.

한편, 미생물 혹은 그 효소가 공액 지방산을 만드는 것이 보고되어 있다. 예를 들면, 루멘세균(rumen bacteria)이 다가 불포화 지방산으로부터 공액 지방산을 생산하는 것(Shorland FB, et al., Nature, vol.175, p.1129, 1955)을 비롯하여, 트레포네마(Treponema)(Yokoyama, et al., J. Bacteriology, vol.107, p519-527, 1971), Butyrivibrio fibrisolvens(Kepler CR, et al., J. Biol. Chem., vol.242, p5686-92, 1967), Propionibacterium freudenreichii(Jiang J., Doctoral thesis, Swedishi Uni. Uppsala, 1998), 여러 가지의 폐의 병원균의 십여퍼센트(Jack CIA, et al., Clinica Chlimica Acts., vol.224, p139-4, 1994) 등이 리놀산 이성화 활성을 갖고, 또 이들의 미생물에 의해서 생산되는 공액 리놀산은 cis-9, trans-11형 이성체가 주체인 것도 보고되어 있다.

한편, 반추동물은 스스로의 체내에서 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 생산하고 있기 때문에, 유제품이나 축육에는 cis-9, trans-11형 공액 리놀산이 많이 함유되어 있고, 따라서 cis-9, trans-11형 공액 리놀산은 통상의 식생활에서 사람이 섭취하는 기회가 많은 공액 리놀산이라고 생각된다. 그 때문에, 본 이성체의 생리효과에 대해서는 많은 연구가 행해지고, 여러가지 암에 대한 방어작용이 있는 것이 명확해졌다(Ha, YL, et al., Cancer Research vol.50, p1097-1101, 1990, Ip C., et al., Cancer Research vol.51, p6118-6124).

이상과 같이, 미생물을 사용하면 항암작용이 기대되는 cis-9, trans-11형 공액 리놀산 함량이 높은 생성물이 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 그러나, 부산물이 적고, 충분한 양의 공액 리놀산을 생산하는 미생물은 아직 발견되지 않고 있다.

한편, 장내 세균의 일종인 유산균이나 Bifidobacterium 속 세균도 식품에의 이용가치가 높은 미생물로서 알려져 있다. Bifidobacterium 속 세균은, 사람 대장에 정착하여 변성 개선, 장내 부패억제 등, 여러 가지 유익한 작용을 나타내는 것 때문에 근래에는 발효유 등으로도 이용되게 되어 왔다.

그러나, Bifidobacterium 속 세균은 편성 혐기성이고 산소의 존재하나 저pH하에서는 사멸되기 쉽기 때문에, Bifidobacterium 속 세균을 이용한 연구를 행하기 위해서는, 적절한 작업환경이나 숙련된 조작이 필요하게 된다. 이러한 이유도 있고, 공액 리놀산 제조도 포함하여 Bifidobacterium 속 세균을 이용한 물질생산에 관한 연구는 거의 행해져 있지 않았다.

그러한 중에, 유산균을 이용하여 공액 리놀산을 0.001∼5중량%를 함유하는 발효유 조성물과 그 제조방법이 제안되어 있다(한국 특허공개번호; 특2001-0089858호(KR2001-0089858) 공개일 2001.10.12).

상술한 바와 같이, 알칼리 공액화법은, 고온에 있어서의 반응으로 인해 부반응이 일어나기 쉽고 특정의 공액 지방산을 얻는 것이 곤란하며, 그 후의 정제공정이 번잡한 등의 문제점이 있었다. 또, 미생물에 의한 변환반응에서는 all trans형 공액 리놀산도 동시에 부산되어 버리고, 공액 리놀산 전체의 생산량도 반드시 만족할 수 있는 것은 아니었다.

또, 상기 한국공보에 있어서 유산균의 이용에 의해 얻어지는 발효유 조성물에 대해서, 공액 리놀산을 생성하는 유산균으로서는, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis 가 개시되어 있지만, 동일 종이어도 균주가 상위하면 생성되지 않는 것이 나타내어지고, 또한 본 발명에 이르는 과정에서도 그러한 시사는 있었다. 또, 생성량에 대해서도 기질의 리놀산 100에 대하여 5이상을 생성하는 균종은 몇개 있었지만, 10이상을 생성하는 균종은 얻을 수 있는 것은 없었다.

본 발명은, 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 이중결합을 적어도 2개이상 갖는 불포화 지방산을 공액화하는 것을 목적으로 하고, 특히, 리놀산으로부터 생리효과가 높은 cis-9, trans-11형 공액 리놀산만을 선택적이고 또한 높은 함유율로 효율적으로 얻는 방법을 얻는 것을 목적으로 한다. 또한, 리놀산으로부터 생리효과가 높은 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 높은 함유율로 효율적으로 생산하는 능력을 갖는 세균, 및 공액 지방산을 함유한 음식품을 얻는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 세균을 이용한 공액 리놀산의 제조방법을 발견하기 위하여 예의 연구를 진행한 결과, 어느 종의 Lactobacillus 속 세균 및/또는 Bifidobacterium 속 세균에 공액화 처리능, 즉, 불포화 지방산분자 내의 이중결합의 위치를 이동시켜 이중결합끼리가 서로 공액되는 상태로 이성화하는 능력이 있는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명에 따른 공액 지방산의 제조법은, 공액화 처리능을 갖는 Lactobacillus 속 및/또는 Bifidobacterium 속 세균의 생균, 사균체, 균체 추출액 또는 그 세균에 의해 얻은 효소를 이용하여 이중결합을 적어도 2개이상 갖는 불포화 지방산을 공액화함으로써 상술의 과제를 해결하는 것이다.

구체적인 공액화 처리능을 갖는 세균으로서는, 공액화 처리능을 갖는 Lactobacillus oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis , 또는 Bifidobacterium pseudocatenulatum 으로부터 선택되는 1종이상의 세균의 생균, 사균체, 균체 추출액 또는 그 세균에 의해 얻은 효소를 이용하여, 이중결합을 적어도 2개이상 갖는 불포화 지방산을 공액화한다.

본 발명에 의한 방법에 있어서는, Lactobacillus 속 세균 및/또는 Bifidobacterium 속 세균의 생균, 사균체, 균체 추출액 또는 그 세균에 의해 얻은 효소를 이용하여 이중결합을 적어도 2개이상 갖는 불포화 지방산을 공액화가는 것이기 때문에, 생리활성이 높다고 되어 있는 cis-9, trans-11형 공액 리놀산으로 대표되는 공액 지방산을 선택적이고 또한 높은 함유율이며 고수율로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 공액 지방산의 제조방법에서 이용되는 Lactobacillus oris 는 사람의 타액으로부터 분리된 세균이다(Farrow JAE et al., Int. J. Syst. Bacteriol. vol.38, p116, 1988). 균주로서는 예를 들면 Lactobacillus oris NCDO 2160(ATCC 49062), NCDO 2162, NCDO 2163, NCDO 2164 등이 있고, 특히 NCDO 2160(ATCC 49062)이 바람직하다.

또, Lactobacillus pontis 는 호밀빵 종으로부터 분리된 세균이고(Vogel, RF, et al., Int. J. Syst. Bacteriol., vol.44, p223-229, 1994), 균주로서는 예를 들면 Lactobacillus pontis ATCC 51518, ATCC 51519 등이 있고, 특히 ATCC 51518을 이용하는 것이 바람직하다.

또, Lactobacillus panis 는 호밀빵 종으로부터 분리된 세균이고(Strohmar, W., Diekmann, H., Z.Lebensm. Unters. Forsch, vol.194, p536-540, 1992), 균주로서는 예를 들면 Lactobacillus panis JCM 11053 등이 열거되고, 특히 JCM 11053을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 공액 지방산의 제조방법에서 이용되는 Bifidobacterium breve 는 유아·포유우의 대변, 질에서 분리된 균주이다. 균주로서는 예를 들면 Bifidobacterium breve ATCC 15698, ATCC 15701, YIT 10001 등이 열거되지만, 특히 Bifidobacterium breve YIT 10001은 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 높은 함유율로 효율적으로 제조할 수 있는 우수한 주이다. 또한, Bifidobacterium breve YIT 10001은 평성13(2001)년 8월 14일자로 도꾸리쯔교세이호진 상교기쥬쯔 소고겡뀨죠 특허생물 기탁센터에 FERM P-18459로서 기탁되고, 평성14(2002)년 10월 11일자로 FERM BP-8205로서 국제기탁에의 이관이 완료되어 있다. 이 Bifidobacterium breve YIT 10001주는, 리놀산-BSA-복합체를 함유하는 GAM broth(닛스이세이야쿠(주)사 제품)로 적어도 24시간, 전배양된 후, 이 배양된 Bifidobacterium 속 세균을 리놀산-BSA-복합체를 함유하는 유배지에 3.8wt% 접종하여 144시간 진탕배양함으로써, 배지중에 적어도 0.5㎎/5㎖의 공액 리놀산을 생산하는 능력을 갖는, 공액 리놀산 생산능이 매우 높은 주이기 때문에 바람직하다. 이와 같이 우수한 생산능을 갖는 주는, 이것을 이용하여 리놀산을 함유하는 식품소재(예를 들면 유원료)를 발효한 경우에, 발효후의 발효식품(예를 들면 발효유) 중에, 생리효과를 기대할 수 있을 정도의 공액 리놀산을 생산시킬 수 있으므로, 식품제조의 작업성 등에 있어서 특히 적합한 것이다.

또, Bifidobacterium infantis 는 유아의 대변으로부터 분리된 균주이다. 균주로서는, 예컨대 Bifidobacterium infantis ATCC 15702가 있다.

또, Bifidobacterium bifidum 은 성인·유아·포유우의 대변, 질로부터 분리된 균주이고, 균주로서는 예컨대 Bifidobacterium bifidum YIT 4007(FERM BP-791) 등이 있다.

또, Bifidobacterium pseudocatenulatum 은 하수, 유아의 대변, 포유 송아지의 대변으로부터 분리된 균주이고, 균주로서는, 예컨대 Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC 27919 등이 있다.

본 발명에 있어서, 원료로서 이용되는 이중결합을 적어도 2개이상 갖는 불포화 지방산은 특별히 한정되지 않고, 예컨대 리놀산, 리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등 어느 것도 바람직하게 사용할 수 있다. 특히, 리놀산을 원료로 하여 공액 리놀산을 생성시킨 경우, 생리활성이 보고되어 있는 특정의 이성체가 특이적이고 또한 효율적으로 생성되고, 다른 이성체(부산물)의 양은 극미량으로 되기 때문에 바람직하다.

또, 상기 불포화 지방산은 염 또는 에스테르 등을 형성하고 있어도 좋고, 염으로서는, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류금속염, 암모늄염 등이 열거되고, 에스테르로서는 메틸에스테르, 에틸에스테르 외에 상기 지방산을 함유하는 그 밖의 지질류(인지질, 당지질 등), 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드 등을 이용하는 것도 가능하다.

또, 천연유지도 원료로서 이용할 수 있고, 예를 들면 리놀산을 분자 내에 많이 함유하는 것으로서는 홍화유, 면실유, 대두유, 해바라기씨 오일, 옥수수유, 땅콩유, 쌀겨유, 아마인유, 카카오유 등의 식물유래의 천연유지 등이, 리놀렌산을 분자 내에 다량 함유하는 것으로서는 정어리유, 청어유, 대구유 등의 동물유래의 천연유지 등이 있고, 또한 이들 리파아제 분해물 등도 원료로서 이용하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서는, 이중결합을 적어도 2개이상 갖는 불포화 지방산을 함유하는 배지에, 상술의 Lactobacillus 속 세균 및/또는 Bifidobacterium 속 세균을 접종하고, 배양하는 것이 바람직하다. 이를 위한 배지로서 유배지를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 공액 지방산을 제조하기 위해서 Lactobacillus 속 세균 및/또는 Bifidobacterium 속 세균, 특히 Lactobacillus oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis , 또는 Bifidobacterium pseudocatenulatum 으로부터 선택되는 1종이상의 세균을 이용하여 불포화 지방산을 공액화하는 처리로서는, 원료의 불포화 지방산을 함유하는 증식배지 중에서 세균을 배양하여 직접 공액 지방산을 생성시키는 방법, 혹은 어떠한 방법으로 세균을 배양하고 집균하여 세정한 균체(세정 균체)를 원료의 불포화 지방산을 함유하는 용액에 첨가하여 반응시킴으로써 공액 지방산을 생성시키는 방법 등 어떤 방법을 이용하는 것도 가능하다. 또한, 불포화 지방산을 함유하는 용액중에서는, 세균의 생균체뿐만 아니라, 사균체, 균체 추출액, 균체로부터 추출한 효소 등을 이용하여 반응을 행하는 것도 가능하다.

Lactobacillus oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis , 또는 Bifidobacterium pseudocatenulatum 등의 Lactobacillus 속 세균 및/또는 Bifidobacterium 속 세균을 배양하기 위한 배지로서는, Lactobacillus 속 세균 및/또는 Bifidobacterium 속 세균의 증식용으로 통상 이용되는 배지나 우유를 함유하는 유배지를 사용할 수 있고, 특히 우유를 이용한 배지중에서 불포화 지방산을 처리하는 것이 바람직하다.

통상 이용되고 있는 증식배지, 예를 들면 MRS배지나 GAM broth 등을 이용하면, 리놀산 등의 원료유류가 배지에 분산되지 않고 처리효율도 나빠지기 때문에, BSA(소혈청 알부민) 등의 지질결합 단백질이나 계면활정제의 첨가나, 엄격한 조건에서의 균질화처리가 필요하게 된다. 그러나, 유배지를 이용한 경우에는, BSA의 첨가를 하지 않아도 원료유류의 균질화가 비교적 용이하게 되고, 작업성, 처리효율이 향상되며, BSA 등의 첨가에 의한 비용상승을 억제할 수 있다. 또, BSA 등의 지질결합 단백질이나 계면활성제는, 풍미에의 영향을 주어버리기 때문에, 특히 공액 지방산을 함유하는 식품제조에 있어서 본 발명을 이용하는 경우에는, BSA를 함유하지 않아도 효율적으로 반응을 행할 수 있는 유배지를 이용하여, 발효유를 제조하는 것이 바람직하다.

유배지에 있어서, 이러한 우수한 분산성이 얻어지는 이유로서는, 우유중에 함유되는 단백질 성분 등의 영향을 생각할 수 있지만 확실하지는 않다. 또, 본 명세서중에 있어서 우유란, 우유·산양유 등의 짐승유의 생유, 탈지분유, 전지분유, 생크림, 혹은 두유·아몬드유·코코넛밀크 등의 식물유의 각종 유단백 함유물을 가리킨다.

또, 상기 비용면 등의 문제는 있지만, Lactobacillus 속 세균, Bifidobacterium 속 세균에 의한 공액 리놀산의 제조에 있어서, 리놀산과, BSA, 지질결합 단백질 및 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종의 소재와의 복합체를 첨가한 배지에서 전매용을 행하는 것이 바람직하다. 본 배양에 있어서의 공액 리놀산의 생산량을 효과적으로 증가시킬 수 있기 때문이다. 또, 전배양의 시간은 적어도 12시간으로 하는 것이 바람직하고, 특히 20시간 이상으로 하는 것이 바람직하다.

또, Lactobacillus oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis , 또는 Bifidobacterium pseudocatenulatum 등의 Lactobacillus 속 세균 및/또는 Bifidobacterium 속 세균의 세정균체 혹은 균체분말, 사균체, 균체 추출액 등을 이용하여 반응을 행하는 경우, 세정 균체나 균체분말, 사균체, 균체 추출액의 조제는 정법에 따르면 된다. 예를 들면, 세정균체는 생리식염수나 완충액 등으로 배양균체를 세정하여 얻을 수 있고, 균체분말은 동결건조나 분무건조 등의 건조기술에 의해 얻을 수 있다.

사균체를 얻는 방법으로서는, 세포벽 용해효소를 작용시키는 방법 외에, 저침투압으로 처리하는 방법, 동결융해하는 방법, 고압처리하는 방법, 파쇄처리하는 방법, 가열처리하는 방법 등이 있다. 그 중에서도 균체를 가열처리하여 자기융해시키는 방법은, 비용을 들이지 않고 대량의 균체를 처리할 수 있는 점에서 바람직하다. 균체 추출액은, 상기와 같이 하여 얻은 세정균체, 균체분말, 사균체 등에 적절한 용매를 첨가한 후, 원심분리 상청으로서 얻을 수 있다.

공액화 처리능을 갖는 Lactobacillus oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis , 또는 Bifidobacterium pseudocatenulatum 로부터 선택되는 1종이상의 세균을 이용하여 공액 지방산을 제조하기 위한 공액화 처리법으로서 보다 구체적으로는, 예를 들면 이하의 (a)∼(e)를 들 수 있다.

(a) 상기 세균을 증식배지나 유배지(발효유)중에서 배양하여 발효생산의 형태로 불포화 지방산을 공액화하는 방법

(b) 불포화 지방산을 상기 세균의 세정균체로 공액화하는 방법

(c) 상기 세균 균체분말을 이용하여 불포화 지방산을 공액화하는 방법

(d) 상기 세균 사균체를 이용하여 불포화 지방산을 공액화하는 방법

(e) 상기 세균 균체 추출액을 이용하여 불포화 지방산을 공액화하는 방법

이하, 처리법 (a)∼(e)에 대해서 상세하게 설명한다.

(a) 상기 세균을 증식배지나 발효유중에서 배양하여 발효생산의 형태로 불포화 지방산을 공액화하는 방법 :

증식배지 혹은 발효유중에서 공액화를 행할 때는, 기본조작은 일반적으로 행해지고 있는 방법으로 행하면 된다. 스타터로서는 이하의 것을 이용하는 것이 바람직하다.

우선 균체 조제에 있어서 변환능을 효율적으로 유도하기 위하여, 리놀산 등의 불포화 지방산을 MRS(LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO사 제품)배지 등의 유산균용 증식배지나 GAM배지(GAM broth, 닛스이세이야쿠(주)사 제품) 등의 혐기성 균용 증식배지에 첨가하였다. 이 농도는 0∼0.2%이고, 특히 0.05∼0.1%가 바람직하다.

이 때의 배양은, pH3.5∼5.5에서 정지하는 것이 바람직하고, 특히 4.5∼5.5에서 정지하는 것이 바람직하다. pH3.5이하까지 배양하면 균의 과증식에 의해 공액화능이 저하되어 버리는 경우도 있고, pH5.5이상에서는 공액화를 행하는데 충분한 균체량이 얻어지지 않기 때문이다.

이상과 같이 하여 배양한 배양액을 스타터로서 이용하는 것이 바람직하고, 스타터 접종량은 발효유 조정용 배지의 0.5∼8%가 바람직하고, 특히 1∼4%정도가 바람직하다. 원료는 배지중에 0.02∼0.8%정도가 바람직하고, 특히 0.1∼0.2%가 바람직하다. 배양온도는 20∼40℃정도, 바람직하게는 28∼37℃이다.

보다 효율좋게 목적으로 하는 공액 지방산을 얻기 위해서는, 배양은 pH3.5∼5.5에서 정지하는 것이 바람직하고, 특히 pH4.5∼5.5에서 정지하는 것이 바람직하다. 또, 중화배지에서도 마찬가지로 목적으로 하는 공액 지방산을 얻을 수 있다.

(b) 불포화 지방산을 상기 세균의 세정균체로 공액화하는 방법 :

처리법(a)의 스타터 조제시와 동일한 배양조건에 의해서 배양한 균체를 생리식염수로 세정한 것을 회수하고, 완충액으로 현탁시켰다. 이 균체를 현탁시키는 완충액 및 세정균체반응은 적당한 pH를 유지할 수 있는 조건의 수용액을 이용하여 행한다. 예를 들면 0.1∼1.0M의 인산 완충액이 바람직하고, pH는 5.0∼7.5이지만, 바람직하게는 6.0∼7.0이다. 균체 현탁액의 균체농도는, 습중(濕重)으로 0.025∼0.25%이며, 바람직하게는 0.025∼0.1%이다. 원료는 첨가시의 원료를 소혈청 알부민(BSA)과의 혼합액으로 하고 있고 원료농도는 반응용액중에 0.1∼4.0%정도 첨가하는 것이 바람직하고, 특히 0.3∼1.0%가 바람직하다.

또, BSA의 혼합비율은 원료에 대하여 5분의 1정도가 바람직하다. 세정균체에 의한 변환반응시의 온도는 20∼52℃이지만, 바람직하게는 32∼37℃이다. 변환생성의 적정한 시간은 1∼96시간이며, 바람직하게는 24∼72시간이다. 또, pH를 중화하면서 배양한 균체도 마찬가지로 이용할 수 있다.

(c) 상기 세균 균체분말을 이용하여 불포화 지방산을 공액화하는 방법 :

세균 균체분말은, 예를 들면 처리법(a)의 스타터 조제시의 배양조건과 동일한 방법으로 얻은 세균 균체를 건조처리에 의해 분말화함으로써 얻는 것이 가능하다. 건조처리방법으로서는 동결건조, 분무건조 등을 이용할 수 있다. 또, 균체분말 조제후의 변환반응은 처리법(b)의 세정균체반응의 반응조건과 동일하게 행하면 좋다.

(d) 상기 세균 사균체를 이용하여 불포화 지방산을 공액화하는 방법 :

상기 세균 균체는, 예를 들면 처리법(a)의 스타터 조제시의 배양조건과 동일한 방법으로 얻은 상기 세균 균체의 세포벽을 파괴함으로써 얻을 수 있다. 세포벽 파괴는, 세포벽 파괴효소로 처리하는 방법이나, 균체를 용매에 현탁시켜서 저침투압으로 처리하는 방법, 동결융해하는 방법, 고압처리하는 방법, 파쇄처리하는 방법, 가열처리하는 방법 등을 이용할 수 있다. 세포벽 파괴액 조정후의 변환반응은, 처리법(b)의 세정균체반응의 반응조건과 마찬가지로 행하면 된다.

(e) 상기 세균 균체 추출액을 이용하여 불포화 지방산을 공액화하는 방법 :

상기 세균 균체 추출액으로서는, 예를 들면 처립법(b)∼(d)와 같은 방법으로 얻은 상기 세균 세정균체, 균체분말, 사균체 등을 적절한 용매로 추출하고, 원심분리 등의 방법에 의해 잔사를 제거하여 얻을 수 있다. 또, 세균 추출액 조제후의 반응은 처리법(b)의 세정균체반응의 반응조건과 동일하게 행하면 된다.

상기 (a)∼(d) 등, 상기 세균에 의해 얻어지는 반응액 또는 배양액의 지방산 조성은, 가스크로마토그래피 분석에 의해 내부 표준물질과 각 지방산의 면적값의 비율을 기초로 각 지방산량을 산출할 수 있다. 또한, 예를 들면 공액 리놀산을 대상으로 하는 경우에는 가스크로마토그래피는 표 1에 나타내는 조건으로 행하면 된다.

본 발명에 의해 얻어지는 공액 지방산은, 의약품, 식품, 화장품 등의 형태로 투여할 수 있다. 예를 들면 공액 리놀의 생리효과를 소구(訴求)하는 의약품이나 영양보조식품 등의 형태로 이용하는 경우이면, 캡슐제, 과립제, 정제, 산제 등의 고형제제 혹은 시럽제 등의 액상제제로서 경구투여할 수 있다. 또, 경구투여제가 아니라도, 주사제, 피부외용제, 직장투여제 등 비경구 형태로 투여하는 것도 가능하다.

각 제제의 제조시에는, 유당, 전분, 결정셀룰로오스, 유산칼슘, 메타규산알루민산 마그네슘, 무수규산 등의 부형제, 백당, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피로리돈 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 등의 붕괴제, 스테아린산 마그네슘, 탈크, 모노글리세리드, 자당 지방산 에스테르 등의 활택제나, 기타 의약·식품 등으로서 허용될 수 있는 성분을 적절히 사용하면 된다.

또, 마찬가지의 생리효과를 기대하여 일반식품형태(「명백한 식품」의 형태)로 사용하는 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 공액 지방산을 그대로 혹은 적절히 정제처리한 것을 유지, 정과, 발효유, 엿, 조미료, 조미된 분말 등의 음식품에 첨가하여, 통상적인 방법을 이용하여 제조하면 된다. 발효식품으로서 이용하는 경우에는, 발효원료중의 이중결합을 2개이상 갖는 지방산을 첨가하고, 발효균에 의해 발효(배양)시켜, 제조할 수 있다. 특히 리놀산을 함유하는 우유를 발효한 발효유로 하면, 상기와 같이 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 특이적이고 또한 다량으로 함유시키는 것이 용이하기 때문에 바람직하다.

본 발명은, 특히, Lactobacillus oris ATCC 49062, Lactobacillus pontis ATCC 51518 , Lactobacillus pontis ATCC 51519 , Lactobacillus panis JCM 11053, Bifidobacterium breve YIT 10001, Bifidobacterium breve ATCC 15698, Bifidobacterium breve ATCC 15701, Bifidobacterium bifidum YIT 4007, Bifidobacterium infantis ATCC 15702 및 Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC 27919으로부터 선택되는 1종이상을 이용함으로써, 공액 리놀산의 대부분이 cis-9, trans-11형 공액 리놀산인 조성물을 얻을 수 있다. 또, 본 발명에 있어서 고함유 cis-9, trans-11형 공액 리놀산 조성물이란, cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 제외한 각종 공액 리놀산 이성체의 비율이 적어도 모든 공액 리놀산에 대하여, 10%를 초과하지 않는 공액 리놀산 조성물을 가리키며, 이러한 조성물은 식품 등에의 이용시에 낮은 첨가량으로 제암작용 등의 생리작용을 기대할 수 있고, 풍미면, 작업성으로부터도 우수한 것이다. 특히, cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 제외한 각종 공액 리놀산 이성체의 비율이 4%를 초과하지 않는 조성인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상술의 본 발명에 따른 방법에 의해서 얻어진 공액 지방산을 함유하는 음식품도 제공한다.

또, 발효유란, 우유 등 생령에 의해 정해져 있는 발효유, 유제품 유산균 음료 등의 생균함유 타입의 음료나 살균처리가 실시된 발효유를 함유하는 유성 음료, 또한 캐피어(kefir) 등의 것이다. 발효시에는, 그 밖의 균, 예를 들면 Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus zeae, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus delbrueckii ( ss. bulgaricus ) , Lactobacillus delbrueckii ( ss. delbrueckii ) 등의 Lactobacillus 속 세균이나 Streptococcus thermophilus 등의 Streptococcus 속 세균 , Lactococcus lactis ( ss. lactis ) , Lactococcus lactis ( ss.cremoris ) , Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis 등의 Lactococcus 속 세균 , Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc lactis 등의 Leuconostoc 속 세균 , Enterococcus feacalis, Enterococcus faecium 등의 Enterococcus 속 세균 등을 사용할 수 있다.

또, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis 등의 Bifidobacterium 속 세균이나 효모 기타 미생물을 사용하여도 좋다. 이것은 1종 또는 2종이상을 조합하여 사용할 수 있다.

또, 이들 식품에는, 그 밖의 식품소재, 즉 각종 당질이나 유화제, 증점제, 감미료, 산미료, 과즙 등을 적절히 배합하여도 좋다. 구체적으로는, 자당, 이성화당, 포도당, 과당, 팔라티노스, 트레할로스, 락토오스, 크실로오스 등의 당류, 소르비톨, 크실리톨, 에리스리톨, 락티톨, 팔라티니트, 환원 물엿, 환원 맥아당 물엿 등의 당알콜, 단순당 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 레시틴 등의 유화제, 카라기난, 구아검, 크산탄검, 펙틴, 로카스트빈검 등의 증점(안정)제를 예시 할 수 있다. 이 외에도, 비타민A, 비타민B류 등의 각종 비타민류나 칼슘, 철, 망간, 아연 등의 미네랄류를 배합하여도 좋다.

이들 의약품, 식품 등의 형태에서의 사용시에는, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 공액 지방산을 적절히 배합할 수 있다. 또, 공액 지방산의 생리효과를 소구하는 경우이면, 그 결과를 얻을 수 있고, 또한 과잉섭취 등의 문제가 발생하지 않는 정도의 양, 10㎎∼1000㎎/일 정도의 섭취가 목표로 하는 양을 적절히 배합하여 두면 된다.

도 1은 Lactobacillus oris 에 의하여 생산된 공액 리놀산의 이성체 가스크로마토그램의 챠트이고, a부분은 리놀산 표준품, b부분은 공액 리놀산 표준품, c부분은 Lactobacillus oris 에 의한 반응액의 챠트를 나타낸다. 또한, 도면중 피크A는 내부 표준물질(17:0), 피크B는 리놀산, 피크C는 cis-9, trans-11형 공액 리놀산, 피크D는 trans-10, cis-12형 공액 리놀산, 피크E는 전체 cis형 공액 리놀산, 피크F는 전체 trans형 공액 리놀산, 피크C+D+E+F는 공액 리놀산을 나타낸다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 조금도 제약되지 않는다.

실시예 1 : 공액 지방산을 생산하는 Lactobacillus 속 세균의 스크리닝

100mM 인산 완충액(pH6.5) 1mL중에 리놀산 50㎎과 BSA 10㎎을 용해하고, 미리 리놀산-BSA-복합체 용액을 조제하였다.

15mL의 0.07% 리놀산 함유 MRS(LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO사 제품)배지에 Lactobacillus 속 세균을 접종하고, 28℃, 120rpm, 20시간 진탕배양하였다. 얻어진 배양약은 pH4.7이었다.

이 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 생리식염수로 2회 세정하여 세정균체를 얻었다. 이 세정균체에 리놀산-BSA-복합체 용액을 100μL, 100mM 인산 완충액(pH6.5)을 0.9mL 첨가하고, 산소흡수·탄산가스 발생제(Anaero Pack, 미츠비시가스카가쿠(주)사 제품)로 혐기상태로 유지한 산소 불투과성의 비닐봉지 내에서 37℃, 120rpm으로 24시간 반응하였다.

얻어진 반응액에 내부 표준물질(HEPTADECANOIC ACID)을 1㎎ 첨가후 Bligh-Dyer법으로 추출하고, 메틸에스테르화(4% 염산메탄올 용액으로 30분간 실온정치) 후, 가스크로마토그래피의 분석에 제공하여 지방산 분석을 행하였다.

공액 리놀산의 피크는 표준품(리놀유시제 CLA80)의 리텐션 타임을 기준으로 판단하고, 기질로서 첨가한 리놀산을 100으로 하였을 때의 상대값을 산출하였다. 그 결과, 표 2에 나타내는 바와 같이 Lactobacillus oris 로 공액 리놀산의 생산이 확인되었다. 이 Lactobacillus oris NCDO2160은 ATCC 49062로서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 등록되어 있다.

실시예 2 : 공액 지방산을 생산하는 Bifidobacterium 속 세균의 스크리닝

100mM 인산 완충액(pH6.5) 1mL중에 리놀산 50㎎과 BSA 10㎎을 용해하고, 미리 리놀산-BSA-복합체 용액을 조제하였다. 이 리놀산-BSA-복합체 용액 200μL를 GAM broth(닛스이세이야쿠(주)사 제품) 15mL에 첨가한 후, Bifidobacterium 15균주를 각각 접종하여 35℃, 120rpm, 48시간 진탕배양하여 Bifidobacterium 속 세균 배양액을 조제하였다.

15mL용량 시험관(캡이 달림)에 5mL 분주한 10% 스킴밀크(포도당 1%, 대두 펩티드 0.1% 첨가) 배지에, 리놀산-BSA-복합체 용액을 100μL(리놀산 함량 5㎎) 및 먼저 조제한 Bifidobacterium 속 세균 배양액을 200μL 첨가하고, 캡을 밀폐하였다. 이 배지를 35℃, 120rpm으로 144시간 진탕배양하여 발효유를 조제하였다. 얻어진 발효유에 내부 표준물질(HEPTADECANOIC ACID)을 1㎎ 첨가후 Bligh-Dyer법으로 추출하고, 메틸에스테르화(4% 염산메탄올 용액으로 30분간 실온정치) 후, 가스크로마토그래피의 분석에 제공하여 지방산 분석을 행하였다. 결과를 다음의 표 3에 나타낸 다.

공액 리놀산의 피크는 표준품(리놀유시제 CLA80)의 리텐션 타임을 기준으로 판단하고, 해석을 행하였다. 그 결과, Bifidobacterium breve YIT 10001(FERM BP-8205), Bifidobacterium infantis ATCC 15702, Bifidobacterium bifidum FERM BP-791, Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC 27919로 공액 리놀산의 생산이 확인되었다.

특히, Bifidobacterium breve YIT 10001(FERM BP-8205)은 첨가한 리놀산(5㎎) 중 11.4%(=0.57㎎/5㎎×100)가 공액 리놀산으로 변환되어 있고, 이들 생산된 공액 리놀산의 대부분이(96%이상(0.57/0.59×100)) cis-9, trans-11형 공액 리놀산이었다. 그러나, 같은 Bifidobacterium breve 에서도 Bifidobacterium breve YIT 4064나 Bifidobacterium breve YIT 4065에는 공액 리놀산 생산활성은 확인되지 않고, 공액 리놀산 생산활성은 Bifidobacterium breve 중에서도 특별한 균주에 한정되는 것이 확인되었다.

실시예 3 : Lactobacillus 속 세균의 공액 지방산의 이성체의 동정

실시예 1에서 Lactobacillus oris 에 의해서 생산된 공액 리놀산의 이성체를 조사하였다. 도 1은 Lactobacillus oris 에 의하여 생산된 공액 리놀산의 이성체의 가스크로마토그램의 챠트이다. 도 1에 나타낸 바와 같이 Lactobacillus oris 에 의해서 생산된 공액 리놀산의 모두가 cis-9, trans-11형 공액 리놀산이었다. 이상의 결과로부터, 수많은 유산균 중에서 Lactobacillus oris 가 선택적이고 또한 높은 함유율로 효율적으로 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 생산하는 것이 명백하게 되었다.

실시예 4 : 발효유중에서의 Lactobacillus속 세균의 공액 지방산의 생산

100mM 인산 완충액(pH6.5) 1mL중에 리놀산 50㎎과 BSA 10㎎을 용해하고, 미리 리놀산-BSA-복합체 용액을 조제하였다. 이 리놀산-BSA-복합체 용액 200μL를 MRS(LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO사 제품)배지 15mL에 첨가한 후, Lactobacillus oris 를 접종하여 28℃, 120rpm, 20시간 진탕배양하여, pH4.7의 배양액을 조제하였다.

15mL용량 시험관(캡이 달림)에 5mL 분주한 10% 스킴밀크(포도당 1%, 대두 펩티드 0.1% 첨가) 배지에, 리놀산-BSA-복합체 용액을 100μL, 먼저 조제한 각 균주의 배양액을 200μL 첨가하고, 캡을 밀폐하였다. 이 배지를 28℃, 120rpm으로 48시간 배양하여 pH4.6의 발효유를 조제하고, 실시예 1과 마찬가지로 지방산 분석을 행하였다.

그 결과, 첨가한 리놀산의 2.0%가 공액 리놀산으로 변환되어 있었다. 생산된 공액 리놀산의 모두가 cis-9, trans-11형 공액 리놀산이고, 실시예 3과 같은 결과가 얻어졌다. 이상의 결과로부터 발효유중에서도 Lactobacillus oris 가 선택적이고 또한 효율적으로 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 생산하는 것이 명백하게 되었다.

실시예 5 : Bifidobacterium 속 세균의 세정균체반응에 있어서의 공액 지방산의 생산

100mM 인산 완충액(pH6.5) 1mL중에 리놀산 50㎎과 BSA 10㎎을 용해하고, 미리 리놀산-BSA-복합체 용액을 조제하였다.

이 리놀산-BSA-복합체 용액 15mL의 GAM broth(닛스이세이야쿠(주)사 제품) 에 0.07%의 비율로 첨가한 후, Bifidobacterium breve YIT 10001(FERM BP-8205)을 각각 접종하여 35℃, 120rpm, 48시간 진탕배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 생리식염수로 2회 세정하여 세정균체를 얻었다.

이 세정균체에 리놀산-BSA-복합체 용액을 100μL, 100mM 인산 완충액(pH6.5)을 0.9mL 첨가하여, 질소가스로 기상을 치환한 후 마개로 밀폐하여 시험관 내를 혐 기상태로 유지하고 37℃, 120rpm으로 72시간 반응하였다.

얻어진 반응액에 내부 표준물질(HEPTADECANOIC ACID)을 1㎎ 첨가후 Bligh-Dyer법으로 추출하고, 메틸에스테르화(4% 염산메탄올 용액으로 30분간 실온정치) 후, 가스크로마토그래피의 분석에 제공하여 지방산 분석을 행하였다.

그 결과, Bifidobacterium breve YIT 10001(FERM BP-8205)에서는, 첨가한 기질중의 리놀산의 0.9%가 cis-9, trans-11형 공액 리놀산으로 변환되어 있었다.

실시예 6 : Lactobacillus oris 사균체에 의한 공액 지방산의 생산

100mM 인산 완충액(pH6.5) 1mL중에 리놀산 50㎎과 BSA 10㎎을 용해하고, 미리 리놀산-BSA-복합체 용액을 조제하였다. 이 리놀산-BSA-복합체 용액 200μL를 MRS(LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO사 제품)배지 15mL에 첨가한 후, Lactobacillus oris 를 접종하여 28℃, 120rpm, 20시간 진탕배양하여, pH4.7의 배양액을 조제하였다.

이 배양액 0.5mL를 0.3% 글루코스 첨가 ILS 배지 15mL에 접종하고, 37℃, 120rpm으로 18시간(pH5.6까지) 배양하고, 원심분리하고 균체를 회수하여 0.2M 글리신 완충액(pH10.6)으로 2회 세정하고, 세정후 균체를 6.7% 자당-50mM 트리스아미노메탄-1mM EDTA 용액 2mL에 용해하였다. 이 액에 lysozyme 용액(10㎎/mL in 25mM 트리스아미노메탄, pH8.0, 세이카가쿠고교(주)사 제품) 0.8mL 및 N-Acetylmuramidase 수용액(1㎎/mL, 세이카가쿠고교(주)사 제품) 0.15mL를 첨가하고, 37℃, 120rpm으로 30분 반응하였다. 반응액을 센트리플렙10(amicon사 제품)에 옮겨 농축조작을 행함으로써 Lactobacillus oris 사균체 현탁액을 약 0.6mL 얻었다.

이 사균체 현탁액에 리놀산-BSA-복합체 용액을 100μL, 100mM 인산 완충액(pH6.5)을 0.9mL 첨가하고, 산소흡수·탄산가스 발생제(Anaero Park, 미츠비시가스카가쿠(주)사 제품)로 혐기상태로 유지한 산소 불투과성 비닐봉지 내에서 37℃, 120rpm으로 24시간 반응하였다.

얻어진 반응액에 대하여 실시예 1과 동일하게 지방산 분석을 행한 결과, 첨가한 리놀산의 1.6%가 공액 리놀산으로 변환되어 있었다. 생산된 공액 리놀산의 모두가 cis-9, trans-11형 공액 리놀산이고, 세정균체 및 발효유중과 동일한 결과가 얻어졌다. 이상의 결과로부터, 세포벽을 파괴한 사균체라도 Lactobacillus oris 가 선택적이고 또한 효율적으로 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 생산하는 것이 명백하게 되었다.

실시예 7 : Lactobacillus pontis 에 의한 공액 지방산의 생산

100mM 인산 완충액(pH6.5) 1mL중에 리놀산 50㎎과 BSA 10㎎을 용해하고, 미리 리놀산-BSA-복합체 용액을 조제하였다. 이 리놀산-BSA-복합체 용액 200μL를 MRS(LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO사 제품)배지 15mL에 첨가한 후, Lactobacillus pontis (ATCC 51518)를 접종하여 28℃, 120rpm, 48시간 진탕배양하여, pH4.9의 배양액을 조제하였다.

15mL용량 시험관(캡이 달림)에 5mL 분주한 10% 스킴밀크 배지를 멸균한 후, 리놀산-BSA-복합체 용액을 100μL, 먼저 조정한 각 균주의 배양액을 400μL 첨가하고, 캡을 밀폐하였다. 이 배지를 28℃, 120rpm으로 48시간 배양하여 pH5.5의 발효유를 조정하고, 실시예 1과 마찬가지로 지방산 분석을 행하였다.

그 결과, 첨가한 리놀산의 0.5%가 공액 리놀산으로 변환되어 있었다. 생산된 공액 리놀산의 모두가 cis-9, trans-11형 공액 리놀산이었다. 이상의 결과로부터 Lactobacillus pontis 가 선택적이고 또한 높은 함유율로 효율적으로 cis-9, trans-11형 공액 리놀산을 생산하는 것이 명백하게 되었다.

실시예 8 : Bifidobacterium breve YIT 10001(FERM BP-8205)을 이용한 공액 리놀산 함유 발효식품의 조제

탈지분유를 10%, 포도당을 1%, 대두펩티드를 0.1% 함유하는 배지에, 기질로서 리놀산을 0.1% 또는 1.0% 첨가하여 150㎏/㎠의 균질화 처리를 행한 후, 오토클레이브에서 115℃, 10분간의 멸균처리를 행하여 발효식품 조제용 배지를 제작하였다.

GAM broth(닛스이세이야쿠(주)사 제품) 15mL에 Bifidobacterium breve YIT 10001(FERM BP-8205)를 접종하여 35℃, 120rpm, 48시간 진탕배양하여 Bifidobacterium 속 세균 배양액을 조제하였다. 이 배양액 6mL를 먼저 제작한 발효식품 조제용 배지 150mL에 접종하고, 기상을 질소가스로 치환한 후, 혐기적으로 35℃, 120rpm으로 72시간 정치배양하여 발효식품을 조제하였다.

얻어진 반응액에 대하여 실시예 2와 마찬가지로 지방산 분석을 행한 결과, 첨가한 리놀산의 일부가 공액 리놀산으로 변환되어 있는 것을 알 수 있었다. 생산된 공액 리놀산의 모두가 cis-9, trans-11형 공액 리놀산이었다.

또, 조제한 발효식품의 관능평가를 행한 결과, 리놀산 무첨가의 것과 동등한 것이 얻어졌다.