双歧杆菌CECT7765及其在预防和/或治疗超重、肥胖和相关病理中的用途

申请号 CN201180059983.0 申请日 2011-12-07 公开(公告)号 CN103619343A 公开(公告)日 2014-03-05
申请人 高等科学研究委员会; 发明人 约兰达·桑斯·埃兰斯; 约兰达·阿莱特·圣克鲁斯; 保拉·高芬;
摘要 本 发明 涉及假链状双歧杆菌CECT7765菌株,其细胞组分,代谢产物和分泌的分子,与其他 微 生物 的组合,以及包括上述所有物质的组合物,还涉及假链状双歧杆菌种的用途,或涉及使用CECT7765菌株 预防 和/或 治疗 肥胖、超重、高血糖和糖尿病,尤其是2型糖尿病、肝性脂肪变性或脂肪肝、血脂异常、代谢综合症、与肥胖和超重相关的免疫系统功能 缺陷 ,还涉及与肥胖和超重相关的肠内微生物丛组成的失衡。
权利要求

1.一种保藏号为CECT7765的假链状双歧杆菌菌株。
2.如权利要求1所述的菌株中衍生出来的菌株。
3.如权利要求2所述的菌株,其中所述菌株是经过遗传修饰的突变体。
4.如权利要求1至3中任一项所述的菌株,其中所述菌株以活细胞的形式存在。
5.如权利要求1至3中任一项所述的菌株,其中所述菌株以非活细胞的形式存在。
6.一种包括如权利要求1至5任一项所述菌株的生物组合。
7.如权利要求6所述的微生物组合,其还包括至少另一种微生物。
8.如权利要求7所述的微生物组合,其中所述另一种微生物是肠细菌或乳酸菌。
9.从如权利要求1至5中任一项获得的所述菌株或从权利要求6至8中任一项所述微生物组合中获得的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其任意组合。
10.一种包含如权利要求1至5中任一项所述的菌株的组合物,或如权利要求6至8中任一项所述的微生物组合,或如权利要求9所述的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其任意组合。
11.如权利要求10所述的组合物,其中所述组合物是药物组合物。
12.如权利要求11所述的组合物,其中所述组合物进一步包括至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
13.如权利要求11或12中任一项所述的组合物,其中所述组合物进一步包括另一种活性物质。
14.如权利要求11至13中任一项所述的组合物,其中所述组合物以适合口服、舌下、鼻腔、鞘内、支气管、淋巴、直肠、透皮、吸入或肠外的形式施用。
15.如权利要求14所述的组合物,其中所述组合物以适合口服施用的形式存在。
16.如权利要求10所述的组合物,其中所述组合物是营养组合物。
17.如权利要求16所述的组合物,其中所述组合物是食品、营养品、补充物、益生菌或共生菌。
18.如权利要求16或17中任一项所述的组合物,其中所述食品选自奶制品、植物制品、肉制品、点心、巧克、饮料或婴儿食品。
19.如权利要求10至18中任一项所述的组合物,其中所述组合物含有浓度为每克或每
3 14
毫升的最终组合物中10 至10 的菌落形成单位(cfu)的菌株。
20.一种假链状双歧杆菌种的菌株用于制备药物组合物、药物制剂或营养组合物的用途。
21.如权利要求1至5中任一项所述的菌株,或如权利要求6至8中任一项所述的微生物组合,或如权利要求9所述的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其任意组合,或如权利要求10所述的组合物,用于制备药物组合物、药物制剂或营养组合物中的用途。
22.如权利要求20或21所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗超重和/或肥胖。
23.如权利要求20或21所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗高血糖和/或糖尿病。
24.如权利要求22所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗2型糖尿病。
25.如权利要求20或21所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗肝性脂肪变性或脂肪肝。
26.如权利要求20或21所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗血脂异常。
27.如权利要求26所述的用途,其中所述血脂异常是高甘油三酯血症。
28.如权利要求26的用途,其中所述血脂异常是高胆固醇血症。
29.如权利要求20或21所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗代谢综合症。
30.如权利要求20或21所述的用途,其中相对于未处理的受试者,所述药物制剂或所述营养组合物用于改善超重受试者或肥胖受试者的免疫系统的功能。
31.如权利要求30所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗肥胖受试者或超重受试者中的感染。
32.如权利要求20或21所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于预防和/或治疗脂肪细胞肥大。
33.如权利要求20或21所述的用途,其中相对于未处理的对照受试者,所述药物制剂或所述营养组合物用于减少非肥胖受试者的能量摄入和增加能量的消耗。
34.如权利要求20或21所述的用途,其中所述药物制剂或所述营养组合物用于减少外周和中枢平上的与超重、肥胖和相关病症发生相关的促炎性蛋白的合成。
35.如权利要求20或21所述的用途,其中相对于未处理的对照,所述药物制剂或所述营养组合物用于减少肠内肠细菌的浓度。
36.如权利要求35所述的用途,其中减少所述肠内肠细菌的浓度是在超重或肥胖的受试者中实施的。

说明书全文

双歧杆菌CECT7765及其在预防和/或治疗超重、肥胖和相

关病理中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及药物组合物或制剂的治疗活性领域和食品领域。具体地,本发明涉及假链状双歧杆菌CECT7765菌株,其细胞组分、代谢产物、分泌的分子、与其他生物的组合,以及包含上述物质的组合物,也涉及使用假链状双歧杆菌种的菌株或使用CECT7765菌株预防和/或治疗肥胖、超重、高血糖和糖尿病,尤其是2型糖尿病、肝性脂肪变性或脂肪肝、血脂异常、代谢综合症、与肥胖和超重相关的免疫系统功能紊乱、与肥胖和超重相关的肠内微生物从组成失衡。技术背景
[0002] 由于不断增长的患病率和发病率,超重和肥胖症已经成为当今主要的公共健康问题之一。它们包括,例如,代谢综合症、高血压、血脂异常、糖尿病、心血管疾病、动脉粥样硬化、肝性脂肪变性或脂肪肝,以及一些癌症类型。
[0003] 肥胖症是由于能量消耗和摄入之间的长期不平衡导致的,这带来体内脂肪的过量增加。神经内分泌系统合成的多肽和激素能够在不同的外周组织和器官与以及在中枢神经系统之间传递,该过程涉及能量平衡的控制,而中枢神经系统总的来说,是能够调节体重的。脂肪组织(瘦素)和胰腺(胰岛素)产生的信号是长期消耗控制的基础(Konturek等,2004.J Physiol Pharmacol.,55:137-154)。胰岛素是调节脂肪组织正常工作以及其中甘油三酯的积累和葡萄糖摄入的最重要的激素。脂肪储藏在正常的胰岛素-敏感脂肪组织中,它们通过刺激脂蛋白脂肪酶和抑制脂肪分解来响应胰岛素和其他激素(瘦素)。然而,脂肪酸在与肥胖相关的脂肪组织中的过量积累降低了胰岛素敏感性,而以甘油三脂形式存在的游离脂肪酸积累转移到一些器官和组织(肝脏、肌肉、心脏等),并导致瘦素产量或敏感性的改变,增加促炎细胞因子合成,这增高了相关疾病(代谢综合症,心血管疾病等)的发病险。胰岛素信号对于中枢神经系统的能量平衡控制和葡萄糖稳态也是必需的,这取决于它与其他调节因子的相互作用,例如瘦素,它们一起作为食欲减退因子,减少消耗(Gerozissis K.,2004.Eur J Pharmacol.,490(1-3):59-70)。瘦素是一种主要由脂肪组织合成的激素/脂肪因子,也能通过其他组织微量合成,如胃。瘦素的分泌是由胰岛素刺激的。在中枢神经系统平上,瘦素可以抑制食欲,增加能量消耗,并且参与很多重要的过程,例如胰腺的β细胞功能,利于胰岛素分泌(La Cava A,Matarese G.The weight of leptin in immunity.Nat Rev Immunol.2004May;4(5):371-9)。在外周水平,瘦素通过减少脂肪酸和甘油三酯的合成并增加脂肪化而发挥作用。不过,在肥胖的个体中,该脂肪因子的外周浓度异常地高,导致了脂肪因子抗性的发展。除了能够作为代谢紊乱的标记,肥胖个体中的高瘦素浓度可能会调节免疫应答,导致肥胖相关炎症
[0004] 肥胖症同样被认为是一种轻度慢性炎症,其特征在于脂肪组织和全身水平中的细胞因子、脂肪因子和其他促炎蛋白的高产量,造成代谢紊乱如患者会永久罹患2型糖尿病(Tilg and Moschen,2006.Nat Rev Immunol.,6:772-783)。与肥胖症和代谢紊乱相关的炎性因子特别包括促炎细胞因子TNF-α和IL6,以及巨噬细胞趋化蛋白MCP1。特别地,TNF-α降低参与胰岛素作用的基因的表达(例如胰岛素受体的基因表达),减弱胰岛素信号,并且抑制胰岛素刺激的脂蛋白脂肪酶的作用。MCP1有利于巨噬细胞对增重相关脂肪组织的浸润,这导致增加促炎细胞因子(TNF-α)的产生并发生胰岛素抗性和肝性脂肪变性。使用抗TNF-α基于抗体的药物能够改善这些病症,如脂肪变态、胰岛素抗性和2型糖尿病,这同样证明了促炎细胞因子在该过程中起作用(Tilg和Moschen,2006.Nat Rev Immunol.,6:772-783)。
[0005] 肥胖症同样以不同免疫系统细胞的功能改变为特征,所述免疫系统细胞如巨噬细胞、树突细胞和T细胞,与针对病原体和其他抗原的防御缺陷、手术后感染及并发症的高风险性有关。脂肪组织巨噬细胞具有较低的吞噬能以及降低的呼吸爆发,这些过程都参与先天免疫系统对抗传染原的应答(Zhou等,2009.Proc Natl Acad Sci U S A,106(26):10740-5)。此外,树突细胞刺激T细胞的功能受到干扰,而该过程参与适应性免疫应答,例如,在疫苗接种中产生抗体,在感染的情况下记忆性T细胞的应答(Karlsson等,2010.JImmunol.,184:3127-33)。
[0006] 与高能量食品消耗和低体力活动相关的社会变化认为是全球性肥胖发生率增高的主要原因。尽管如此,基于低热量饮食并增加体力运动的传统治疗在肥胖控制中效果有限,通常只是导致有限的、暂时性的体重下降。使用药物策略也同样不能令人满意,因为它带来副作用。因此,人们仍然在寻找能够改进治疗和预防这些疾病的新的干预策略。
[0007] 定殖于人类小肠内的微生物丛被认为是参与肥胖和相关疾病的一个新的因素,通过它的调节代谢和个体免疫功能的能力起作用(Sanz等,2010.Proc Nutr Soc.,14:1-8.)。检测与肥胖相关的微生物丛组成的改变提供了对肠道生态系统有目的的操作,其可以作为控制肥胖的另一种方法(Ley等,2006.Nature,444:1022-1023;Nadal et al.,2008.Int J Obes.,33(7):758-67)。从这个意义上来说,不同的公开物或专利都提出了使用乳酸菌和双歧杆菌菌群来治疗肥胖或相关病症的用途。国际专利申请WO2007/043933提出,乳酸杆菌F19和NCFB1748以及乳酸双岐杆菌Bb12菌株可以用于控制体重,以发酵奶的形式降低食欲;然而,这些效果由发酵牛奶内含有的乳蛋白所引起而不是由菌株本身引起,并且,这些效果只是基于与小肠代谢相关的基因表达的调控;尽管如此,肥胖涉及许多其他的器官和组织。专利申请US20100061967A1同样提出了使用能够调控多肽表达的细菌只能够用于调节胃肠道的饱食。另外一个专利申请(WO2009153662)提出了在糖尿病中使用双歧杆菌和乳酸杆菌仅仅是基于这些微生物能够降低外周组织炎症的能力,而并没有考虑到中枢神经系统水平或其他参与这些病症的起源和发展的过程中的效果。专利申请US20100150890提出益生菌用于刺激交感神经系统功能的用途,因此加速新陈代谢并消耗能量;然而,在一些肥胖患者中也生了交感紧张增加。专利申请US20100111915提出益生菌在儿童中用于预防肥胖的用途,这是基于他们的双歧化效果(增加了肠内双歧杆菌的总量),而并没有提供任何关于双歧杆菌的增加能够调控导致肥胖发生的过程的机理;此外,还要考虑到双歧杆菌的功能对每个菌株都具有特殊性。此外,上述专利文献中的研究并没有使用双歧杆菌属菌株来研究,而是使用乳酸杆菌属或乳酸杆菌属与乳酸双歧杆菌Bb12的组合,以及在饮食中改良使用,因此,这些效果并不能归因于双歧杆菌(US20100111915;Luoto等,2010.Br J Nutr.,103(12):1792-9;Luoto等.2010.Int J Obes(Lond).Mar16),并且,这些菌株与本申请的菌株是不同的。另外一个专利申请US20050112112提出利用单糖和双糖产生聚合物的微生物用于减少个体对这些化合物的特异性吸收,通过个体或通过利用这些物质,例如壳聚糖,与双歧杆菌联合特异性地降低胆固醇吸收(JP10306028),这些全部都是减少与饮食的特殊组分相关的肥胖带来的问题的部分方法。
[0008] 因此,寻找预防和/或治疗诸如超重、肥胖及相关病症,如糖尿病、血脂异常、肝性脂肪变性以及代谢综合症等疾病更为合适的策略仍然是一个问题,共同作用于与免疫系统紊乱的关系和与葡萄糖代谢和外周以及中枢水平的胰岛素抗性的联系,以及与不同慢性病症有关的血中和外周组织中脂质积累的改变的联系。

发明内容

[0009] 本发明涉及假链状双歧杆菌CECT7765菌株,其细胞组成、代谢产物和所述菌株分泌的分子、与其他微生物的组合,以及包含上述物质的组合物,还涉及该菌株预防和/或治疗超重和/或肥胖以及相关病症,如糖尿病、高血糖、肝性脂肪变性、代谢综合症,或免疫系统功能紊乱带来的其他病症如感染的用途。本发明也涉及所述菌株用于预防和/或治疗与超重和/或肥胖无关时的上述这些病症的用途。
[0010] 属于假链状双歧杆菌种的CECT7765菌株,与同种的其他菌株,或其他双歧杆菌属菌种和其他乳酸菌属相比,具有更优良的免疫特性。与同种的其他菌株相比,CECT7765菌株能够显著降低巨噬细胞中TNF-α促炎细胞因子的产生(大约降低了2.5至12.6倍;表1);此外,它同样降低了MCP1的产生(大约降低了1.2至38.2倍;表1)。正如背景技术部分所描述的,通过巨噬细胞合成的这些细胞因子和趋化因子直接与诸如肥胖、糖尿病、血脂异常和其他相关代谢紊乱有关。另外,CECT7765菌株诱导抗炎性细胞因子的合成,如IL10,与这些病症的负相关比率高于其他的双歧杆菌属菌株(提高了1.9至4.8倍;表2)。所选择的细菌的免疫特性不是所有乳酸杆菌和双歧杆菌属的细菌菌株共有的,因此与肥胖和超重一起或独立出现时,这些特性使得所选择的细菌尤其适合用于预防和治疗超重和/或肥胖以及相关病症,这是因为这些疾病的共同特征都与低水平慢性炎症相关。
[0011] 和现有技术不同,本发明达到了利用多因子的度来治疗肥胖,并且,本发明通过作用于新的关键靶标来预防和/或治疗该病症或相关病症,而这些病症并没有描述表明能用其他任何已知的双歧杆菌属菌株进行治疗。最令人感兴趣的事实是,本发明中至始至终都表明没有任何一个已知的上述菌属或菌种的菌株被证明对于上述这些病症有同时和有效治疗。
[0012] 因此,本发明为现有技术提供了一种具有很高价值的假链状双歧杆菌菌株,用于治疗超重和/或肥胖以及特定的相关病症,例如但不限于糖尿病、肝性脂肪变性、血脂异常或代谢综合症。
[0013] 本质上,使用本发明的假链状双歧杆菌CECT7765菌株的优点如下:
[0014] -在肥胖和非肥胖个体中,施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株均减小了脂肪细胞的体积(见实施例4)。特别地,施用CECT7765菌株的肥胖动物小体积脂肪细胞2
(1000-2000μm)增多,然而没有施用CECT7765菌株的肥胖动物则是大体积脂肪细胞
2
(4000-6000μm)增多(实施例4,图5)。
[0015] CECT7765菌株减小脂肪细胞体积的事实证明它对于治疗脂肪细胞肥大是有用的,而如果脂肪细胞肥大持续时间过长并且涉及的脂肪细胞数目过多的话,将会导致超重和肥胖。这是因为大体积脂肪细胞会分泌更高浓度的生长因子,所述生长因子在前体脂肪细胞分化过程中诱发脂肪生成,产生反馈回路。此外,肥大脂肪细胞还会产生异常的高浓度炎性细胞因子和趋化因子(TNF-α、MCP-1、IL-6、抵抗素等),这些因子会抑制肝细胞中的胰岛素信号,并且引起胰岛素抗性和其他并发症。脂肪细胞增大的体积也与肝脏的脂肪酸供给量增加有关,这种增加会导致肝性脂肪变性及其并发症。因此,该菌株能够预防或改善这些相关的病症。
[0016] -在肥胖和非肥胖个体中施用本发明的菌株导致肝脏中脂肪积累的下降(实施例4,图6)。具体地,该菌株降低了4级最大脂肪含量肝细胞的数量(>66%)并增加了3级肝细胞(34-66%脂肪含量);尽管如此,在没有施用该菌株的肥胖动物中,上述类型的肝细胞比例恰恰相反,即最大脂肪含量肝细胞数量占绝大多数。在对照动物中,施用该菌株增加了2级肝细胞(脂肪含量<33%)的数量,并减少了3级肝细胞(34-66%脂肪含量)的数量,这和没有接受该菌株治疗的动物的情况恰恰相反。从而证明施用该菌株减少了由饮食或不由饮食诱导的,肝脏中脂肪的总积累。
[0017] 因此,CECT7765菌株能够用于预防和/或治疗肝性脂肪变性。该病症被认为是与高能量饮食和肥胖(存在于60-90%的肥胖个体中)相关的病症,但是也存在不是由超重和/或肥胖引起的情况,然而,非限制性例子是由感染和营养或遗传性代谢紊乱引起的情况。
[0018] -假链状双歧杆菌CECT7765菌株减少了肠上皮细胞中乳糜微粒的数量,也就是,减少了饮食中能被吸收并以乳糜微粒形式通过淋巴和血液到达外周组织的脂肪的量(实施例6,图7)。同样外周血甘油三酯浓度的降低反映出该特性(实施例5)。除了能成为超重和/或肥胖的原因之外,它还能引起脂肪组织中脂肪的积累,从饮食中增加脂肪吸收可能成为其他病症的原因而不会引起超重或肥胖,例如,但不限制本发明的范围,动脉粥样硬化、血脂异常、代谢综合症、心血管疾病和其他一些由脂肪代谢和葡萄糖代谢衍生的疾病。血脂异常也是,不仅由饮食中的脂肪摄入引起,同样也由其他代谢紊乱引起,例如并不是必然与肥胖相关的脂肪细胞胰岛素抗性,这种抗性使得脂肪细胞释放出将会被肝脏利用的脂肪酸,从而提高甘油三酯的合成和分泌,以及增高外周血甘油三酯。血脂异常同样出现在那些具有遗传性患病倾向的个体中,而同样并不是必然与肥胖、胰岛素抗性或饮食中的脂肪摄入有关。因此,CECT7765菌株对于预防和/或治疗与从饮食中过量脂肪摄入有关的疾病和预防和/或治疗血脂异常(例如高甘油三酯血症和高胆固醇血症)是有效的。
[0019] CECT7765菌株调控葡萄糖代谢紊乱,增加与胰岛素合成和功能相关的外周血糖浓度(高血糖)(实施例5)。在其他原因中,因为胰岛素抗性或者胰岛素合成的缺乏也会发生葡萄糖增高,但是这并不是必然与肥胖相关的。
[0020] 在肥胖和非肥胖个体中,CECT7765菌株改进了先天和适应性免疫系统细胞的功能,增强了他们对于传染原、抗原或过敏原的应答能力。特别地,给高脂肪饮食诱导的肥胖动物模型施用该菌株改善了吞噬作用和细胞因子合成中的巨噬细胞的功能(实施例3,图2和3)。本发明的菌株也改善了适应性免疫系统中树突细胞和T细胞的功能(实施例3,图4)。
[0021] 因此,CECT7765菌株具有额外的积极效果,因此它对于预防和治疗感染以及改善诸如在疫苗接种中和在免疫过程中的保护性应答是有用的,这是因为免疫系统的这些功能在超重和肥胖个体中发生了改变。此外,本发明的菌株对于治疗或预防其他与肥胖和超重相关或者不相关的免疫抑制(基本上是巨噬细胞、树突细胞和T细胞)的疾病(例如糖尿病)。
[0022] 相比起那些没有接受菌株治疗的个体,CECT7765能够在接受治疗的肥胖或正常体重个体的外周和中枢水平上诱导低量的促炎性蛋白。因此,本发明的菌株同样在外周系统和在中枢神经系统中减少了TNF-α的合成,而该物质的合成在肥胖或者其他病症中是上升的,这导致发生胰岛素和瘦素抗性,抑制它们的食欲抑制效果(降低饥饿感)和调节体重和葡萄糖代谢的功能(实施例3)。该菌株同样降低肥胖个体中的外周血瘦素浓度,在这些个体中外周血瘦素是升高的,并且它对于炎症是有用的,同时增高正常体重个体中的瘦素浓度,在这些个体中它对于降低食欲和消耗以及增加能量消耗、脂肪氧化以及降低体重是起负作用的(实施例3,图8)。
[0023] 因此,CECT7765菌株调控蛋白和激素(细胞因子、趋化因子和脂肪因子)的产生,这些物质的合成在肥胖症和其他与之相关的疾病诸如但不限于糖尿病、血脂异常、代谢综合症、心脑血管疾病和脂肪变性中,或者是非必然与超重和/或肥胖相关的其他疾病中被改变,无论是在外周血还是中枢神经系统中,因此它能够用于治疗和预防这些病症。
[0024] 此外,通过标准化与超重和肥胖相关的改变以及由这些改变导致的炎性效应,CECT7765菌株可以修复消化道微生物丛的组成,这些都与增重、胰岛素抗性、代谢内毒素症、肝性脂肪变性以及肠道屏障功能的改变有关(实施例3)。本发明的菌株同样用于降低病原性或免疫系统有害性(opportunistic)肠杆菌的过度生长,这些菌直接或者间接与其他潜在的病症有关,或者这菌具有诱发这些病症的风险。因此,CECT7765菌株还可以用于预防和治疗感染以及与肠内微生物丛改变有关的疾病。
[0025] 本发明的一个方面涉及保藏号为CECT7765的假链状双歧杆菌的菌株。所述菌株于2010年7月21日保藏在Colección de Cultivos Tipo(西班牙典型培养物保藏中心)(CECT)并且给予保藏号CECT7765。所述国际保藏机构的地址是:Universidad de Valencia/Edificio de Investigación/Campus de Burjassot/46100Burjassot(巴伦西亚)。
[0026] 本发明的CECT7765菌株的科学分类是:界:细菌/:放线菌/目:双歧杆菌目/科:双歧杆菌科/属:双歧杆菌属/种:假链状双歧杆菌。
[0027] 所述菌株的特征在于:
[0028] -CECT7765细菌氧化或发酵的物质是:D-阿拉伯糖、核糖、B-甲基-D-木糖苷、半乳糖、D-葡萄糖、α-甲基-D-甘露糖苷、N-乙酰基葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、松三糖和木糖醇。
[0029] -CECT7765具有下述酶活性:正-硝基苯基-βD-吡喃半乳糖苷酶和精酸双水解酶。
[0030] -该菌株生长的温度范围介于31至42°C之间,最适生长温度是37°C。
[0031] -该菌株生长的pH范围是5至8,最适生长pH是7。
[0032] 此外,该菌株在胃肠应激条件下稳定(酸性pH和高胆汁浓度)。在胃条件(胃蛋白酶3g/l,pH值3和2.5)培养平均胃排空时间(2h)后,它的活力为64-95%,在胆汁盐的存在下(0.5和1%),它的生长保持在80-90%。它也能抵抗技术保护的操作条件(冷冻、冻干等)和食品制备条件(冷藏、冻干、发酵等),并且它能在不同的工业范围的微生物生产培养基上生长。例如,该菌株在牛奶中和在MRS商业实验用培养基中能够等同生长,并且在GEM工业生产培养基中具有更好的对数单位。在体内,口服给药后它能够在小肠运输中存活,根据初始施用量并取决于个体以及分析的样本类型和施用后的时间,表明它只会降低1-2个对数单位。所有这些特征都确保了它在肠内的活力、持久性和有效性。
[0033] 本发明的另一个优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌CECT7765菌株的衍生菌株,其中所述菌株能够保持或者改进本发明所述的这些能力。该衍生微生物可以通过自然方法或有意地通过本领域已知的定向突变来产生,例如但不限于在突变或应激诱导剂的存在下培养原始微生物,或者通过基因工程的方法来修饰特定基因。根据更优选的实施方案,假链状双歧杆菌CECT7765菌株的衍生菌株是经过基因修饰的突变体。术语突变菌株或衍生菌株在使用中是无差别的。
[0034] 假链状双歧杆菌CECT7765菌株或其任何突变体或衍生物可以以任何一种能够产生所述效果的形式来使用,例如,根据本发明优选的实施方案,假链状双歧杆菌CECT7765菌株是以活细胞的形式(可培养的或不可培养的),或者根据本发明的另一优选的实施方案,该菌株是以非活细胞的形式(可由本领域中已知技术失活的“死”细胞,例如但不限于加热、冷冻或紫外照射)。
[0035] 下文中提到的在优选实施方案中所述的假链状双歧杆菌菌种的任何细菌菌株都认为是“本发明的菌株”或“发明的菌株”。
[0036] 本发明的另一方面涉及包含本发明菌株的微生物组合。该微生物组合是本发明菌株的一组细胞,或是至少一种本发明菌株的细胞,与同种不同菌株或者不同种或者其他分类学微生物组群中的一组细胞组成的。该微生物组合中的细胞可以是非活性或活性细胞,并且在任何生长或发展状态的阶段(潜伏期、指数期、稳定期等),而不考虑它们的形态学。
[0037] 本发明优选的实施方案涉及微生物组合,其中所述微生物组合包括至少一种不是本发明菌株的微生物,例如但不限于,能够成为所述组合的部分的微生物是:
[0038] -至少一种其他的双歧杆菌属菌株,非限制性例子是长双歧杆菌CECT7347菌株或者其他假链状双歧杆菌、链状双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌长形亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、乳双歧杆菌乳亚种、乳双歧杆菌动物亚种或青春双歧杆菌种株。
[0039] -至少一种肠道、食品或环境来源的乳酸菌。乳酸菌选自下列细菌,包括但不限于:乳杆菌属、乳球酸属、肠球菌属、丙酸杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属(weissella)、片球菌属或链球菌属。
[0040] -至少一种其他肠道、食品或环境来源的原核生物系统发生群(phylogenetic group)、属或种,例如但不限于:古细菌、厚壁菌、硬壁菌、变形菌、放线菌、疣微菌、梭杆菌、产甲烷菌、螺旋体、纤维杆菌、脱杆菌、异常球菌、栖热菌、蓝细菌、甲烷杆菌、消化链球菌、瘤胃球菌、粪球菌属、Subdoligranulum、Dorea、丹毒丝菌、Anaerofustis、兼性双球菌、罗斯氏菌(Roseburia)、Catenibacterium、小杆菌、Anaerotruncus、葡萄球菌、微球菌、丙酸杆菌、大肠杆菌、普拉梭菌、拟杆菌、parabacteroides、普氏菌、真细菌、疣微菌(Akkermansia)、芽孢杆菌、丁酸弧菌或梭状芽孢杆菌;
[0041] -至少一种真菌酵母菌株,例如但不限于,酵母菌属、念珠菌属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、球拟酵母属、曲霉属、根霉菌属、毛霉菌属或青霉菌属。
[0042] 下文中提到的之前的段落中所描述的任何微生物组合都被认为是“本发明的微生物组合”或“发明的微生物组合”。
[0043] 本发明的另一方面涉及由本发明的菌株或本发明的微生物组合中获得的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其他组合。本发明还包括由CECT7765菌株或与其他食品、植物制品和药物成分一起的本发明微生物组合中得到的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其他组合。
[0044] 细菌的细胞组分可以包括细胞壁组分(例如但不限于肽聚糖)、核酸、膜组分、或其他诸如蛋白质、脂质和水化合物及其组合,例如脂蛋白、糖脂或糖蛋白。代谢产物包括由于细菌在生长过程、工艺处理(例如但不限于食品或药物的制备过程)以及产品储藏或胃肠运输的代谢活动中产生或修饰的任何分子。这些代谢产物的例子包括但不限于:有机酸无机酸、蛋白质、多肽、氨基酸、酶、脂类、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。分泌的分子包括任何细菌在生长过程、工艺处理(例如食品或药物的制备过程)以及产品储藏或胃肠运输中排出或释放的任何分子。这些分子的例子包括但不限于有机酸和无机酸、蛋白质、多肽、氨基酸、酶、脂类、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。
[0045] 本发明的另一方面涉及包括本发明的菌株或微生物组合及其细胞组分、代谢产物、分泌的分子或任何组合的组合物。
[0046] 组合物,通常定义,是一组组分,其包括至少一种任何浓度的本发明的菌株,或至少一种本发明菌株的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或任何组合。
[0047] 药物组合物是一组组分,包括至少一种任何浓度的本发明的菌株,或至少一种本发明菌株的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或任何组合,具有至少一种能改进受试者体力或心理状态的应用,其包括改进他/她的健康状况。
[0048] 术语药物制剂的含义有限,只是指“药物组合物”,正如本发明所定义的,因为药物制剂对受试者必须包括保护性或治疗性的效果,例如生理效果。术语“药物制剂”将在下文中定义。
[0049] 本发明另一优选的实施方案涉及组合物,其中所述组合物是药物组合物。在更优选的实施方案中,药物组合物进一步包括至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0050] 术语“赋形剂”是指能够帮助吸收本发明的组合物中任意一个组分的物质,它能够固定所述组分或者从给予粘稠性或增加口味使得它味道不错的意义上来说,它有助于药物组合物的制备。因此,赋形剂应当具有能够保持组分相互连接的功能(例如淀粉、糖或纤维素),增甜功能,着色功能,保护药物制剂的功能,例如将其从空气和/或水汽中隔离开来,作为药片、胶囊或其他存在形式的填充物,例如磷酸氢钙,分解功能,以便于帮助组分的溶解和肠道吸收,这些赋形剂并不排除该段中未提及的任何一种类型的赋形剂。因此,术语“赋形剂”定义为这样的物质,包括在格林形式(galenic forms)中,加入赋形剂至活性成分中,或者它们的组合中,以确保它们的制备和稳定性,修饰药物组合物的感官特性或确定药物组合物的理化性质和生物活性。“药学上可接受的”赋形剂必须允许药物组合物中化合物的发挥活性,也就是,必须与所述组分相容。
[0051] “格林形式或剂量形式”是指适于构成药物制剂的活性成分和赋形剂。它是由药物组合物的制造商提供的方式以及施用的方式所决定的。
[0052] “载体”或媒介优选惰性物质。载体的功能是便于加入其他化合物,以确保更好的剂量和施用或者给予药物组合物粘稠度和形状。因此,载体是这样的物质,它用在药物制剂中,将本发明的药物组合物的组分稀释到特定的体积或重量,或者即便不稀释所述组分,也能够带来更好地剂量或施用,或者给予药物制剂粘稠度和形状。当呈现形式是液体时,药学上可接受载体是稀释剂。
[0053] 此外,赋形剂和载体必须是药学上可接受的,也就是,允许并且评价赋形剂和载体,以使它们对所施用的有机体无害。
[0054] 在另一个更优选的实施方案中,药物组合物进一步包括其他的活性物质。除了需要治疗效果外,其中所述药物组合物可能还需要施用其他的治疗剂,因为额外的根本原因使得极其需要和强烈建议使用本发明的化合物与其他治疗剂的组合。术语“活性成分”是指任意的,不考虑它是人类的、动物的、植物的或者化学来源或其他类型的,能够为组成药物制剂贡献合适活性的物质。
[0055] 在各种情况下,药物产品的呈现形式将适应于所使用的施用类型,因此本发明的组合物能够在治疗有效量下,以溶液形式或者其他临床上所允许的剂量形式呈现。本发明的药物组合物可以制备成固体、半固体、液体或气体形式,例如药片、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、针剂、吸入剂、凝胶、微球或气溶胶。根据本发明更优选的实施方案,本发明的药物组合物以适合口服施用的形式呈现。
[0056] 适合口服施用的形式是指能够允许口服施用的物理条件。所述适合口服施用的形式选自但不限于:滴剂、糖浆、草药茶、酏剂、悬浮液、即时悬浮液、可饮用小瓶、药片、胶囊、颗粒、扁囊剂、药丸、小球、锭剂、片剂或冻干制剂
[0057] 药物组合物的另一个可能是适合于以舌下、鼻、鞘内、支气管、淋巴、直肠、经皮或吸入的方式施用。本发明的菌株、微生物组合,以及从上述菌株、微生物组合中获得的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或任何组合可以与例如但不限于脂质体或胶团相连接。
[0058] 在这个意义上来说,表述“治疗有效量”是指药物组合物中成分的量,这种量是指施用给哺乳动物,优选人类时,足够引起预防和/或治疗如下定义的疾病或哺乳动物,优选人类中的感兴趣的病理条件。随着以任何形式存在的本发明菌株、本发明的微生物组合以及从上述菌株、微生物组合中获得的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或任何组合的活性不同,治疗有效量也是不同的,治疗有效量同样也会随着化合物的代谢稳定性和化合物作用的持久性、患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、施用的方法和时间、排泄率、药物的组合、特定疾病和病理条件的严重程度以及正在接受治疗的受试者的不同而不同,但是这可以根据本领域技术人员的知识和本说明书来确定。
[0059] 本发明另一优选的实施方案涉及组合物,其中所述组合物是营养组合物。本发明更优选的实施方案涉及营养组合物,其中所述组合物是食品、营养品、补充物、益生菌或共生菌。
[0060] 本发明的术语“营养组合物”是指这样的食品,在不考虑食用该食品的受试者的时候,有利地影响有机体中的一种或多种功能,以使它能够提供更好地健康状况和状态。因此,所述营养组合物可以用作预防和/或治疗疾病或疾病导致的因素。因此,本发明的术语“营养组合物”可以是功能性食品或为了特殊营养目的的食品或药物食品的近义词。
[0061] 正如这里所使用的,术语“营养物”是指食品中分离的物质,并以对健康具有有利影响的剂量形式使用。
[0062] 正如这里所使用的,术语“益生菌”是指活的微生物,当它以合适的量提供时,对于宿主有机体的健康会有益。
[0063] 正如这里所使用的,术语“共生菌”是指那些含有益生素和益生菌的混合物的食品。它们通常包含利于生长和/或代谢活性的益生组分,以及总的来说与诸如但不限于双歧杆菌与低聚果糖或低聚半乳糖相组合的益生菌效果。
[0064] 术语“补充剂”,是“膳食补充剂”、“营养补充剂”或“食品补充剂”中任意一个的近义词,是一种“食品成分”,旨在补充饮食。膳食补充剂的一些例子包括但不限于维生素、矿物质、植物产品、氨基酸和食品组分,例如酶、内分泌腺萃取液。它们并不是快餐食品的替代物或作为膳食或饮食的单一组分,而是作为饮食的补充。
[0065] 根据更优选的实施方案,食品选自:乳制品、植物产品、肉类产品、点心、巧克力、饮料或婴儿食品。乳制品选自但不限于:发酵乳产品(例如但不限于酸奶或奶酪)或非发酵乳产品(例如但不限于淇淋、奶油、人造奶油、乳清)。植物产品选自但不限于发酵或不发酵的任何形式的谷物。饮料可以包括但不限于任何果汁或非发酵牛奶。
[0066] 本发明的另一更优选的实施方案涉及如本发明所述的任意组合物,其中所述组合3 14
物含有浓度为每克或每毫升最终组合物中10 至10 菌落形成单位(cfu)的菌株。菌株的浓度是合适的治疗有效量或营养有效量的浓度。营养组合物和药用组合物可以制成,但不限于,固态、半固态、液态或气态的形式,如片剂、胶囊、微胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、糊剂、栓剂、针剂、吸入剂、凝胶、微球或气溶胶。
[0067] 以下的任何组合物可作参考,一般组合物、药物组合物或营养组合物,正如之前用术语“本发明的组合物”或“发明的组合物”所定义的。
[0068] 本发明的另一方面涉及假链状双歧杆菌CECT7765菌株用于制备药物组合物、药物制剂或营养组合物的用途。本发明的另一方面涉及本发明的菌株或本发明的微生物组合或其细胞组分、代谢产物、分泌的分子或任意组合或本发明的组合物在制备营养组合物、药物制剂或营养组合物中的用途。在该段中所定义的任何药物组合物都能够用于制备药物制剂。
[0069] 本发明涉及的药物制剂可以供人类或兽医使用。“人类使用的药物制剂”是指任意的物质或物质组合,它们具有能够治疗或预防人类疾病的特性,或者为了恢复、纠正或修改生理功能或能够建立医学诊断的目的,通过发挥药理学、免疫学或代谢的作用,在人类中使用或施用。“兽医使用的药物制剂”是指任意的物质或物质组合,它们具有能够治疗或预防动物疾病的特性,或者为了恢复、纠正或修改生理功能或能够建立兽医诊断的目的,通过发挥药理学、免疫学或代谢的作用,施用于动物。用于添加到饲料中而制备的“加药饲料的预混合物”同样被认为是“兽医药物制剂”。
[0070] 本发明的另一优选实施方案涉及本发明的假链状双歧杆菌菌株,CECT7765菌株,或本发明的微生物组合,或其细胞组分、代谢产物、分泌的分子或任意组合,或本发明的组合物用于制备药物制剂、营养组合物,用于预防和/或治疗超重,肥胖或治疗和/预防任何与之相关的病理或功能异常(例如免疫系统功能紊乱)的用途。
[0071] 正如这里所能理解的,“治疗”是指控制由受试者(优选哺乳动物,更优选人类)的疾病或病理状况所带来的效应,其包括:
[0072] (i)抑制疾病或病理情况,也就是阻止它的发展;
[0073] (ii)缓解疾病或病理情况,也就是,使疾病或病理情况或其症状学发生复原。
[0074] (iii)稳定疾病或病理情况。
[0075] 正如这里所理解的,术语“预防”包括预防疾病的发生,也就是,预防受试者(优选哺乳动物,更优选人类)发生疾病或病理情况,特别是当所述受试者具有患病的潜在风险。
[0076] 正如这里使用的,术语“超重”指的是这样的病理,其特征在于受试者的体重指数BMI等于或大于25。BMI是个体的体重与身高关系的测量值。BMI的计算公式如下:体重2
(kg)/身高 (m)。超重的特征是25≤BMI<30。
[0077] 当BMI等于或大于30时,受试者就是“肥胖”。肥胖分为不同的等级,而BMI>40的受试者认为是病态肥胖。肥胖是一种临床状态,在人类和其他哺乳动物中,脂肪组织中能量的积累超出了健康的极限。脂肪积累导致不同组织中的脂肪沉积、超重、肥胖以及一系列与上述超重或肥胖相关的病症,例如但不限于2型糖尿病和妊娠期糖尿病、血脂异常(尤其是高脂血症和高胆固醇血症)、心血管疾病、高血压、脂肪肝(尤其是非酒精性脂肪肝或肝性脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化或肝炎)、代谢综合征、癌症、感染等。上述病症和它们与超重或肥胖之间的联系在本领域中是已知的(如WO/2010086454或者WO/2008119110中所述)。因此,使用药物制剂、药物组合物或者营养组合物来预防和/或治疗与肥胖相关的病症是合理的,这是因为已经广泛证实所述联系,因此,正如本领域技术人员所能够预期的那样,使用假链状双歧杆菌菌株或本发明的菌株能够预防由超重和/或肥胖导致的疾病的发生。
[0078] 尽管BMI通常用来确定受试者是否罹患肥胖症,然而,还有其它参数可以达到这个目的。绝对腰围(罹患肥胖症的受试者中,男性>102cm(中度肥胖),女性>88cm)或者腰臀比(罹患肥胖症的受试者中,男性>0.9,女性>0.85)同样用于测量肥胖症。另外一个可选的确定是否罹患肥胖症的方法是测量体脂的比例(罹患肥胖症的受试者中,男性的体脂约为>25%,女性的体脂约为>30%)。中度肥胖(主要是男性型或腰部肥胖,以较高的腰臀比例为特征)是代谢综合症的重要危险因素,其能够强烈使受试者倾向于罹患不限于心血管疾病和2型糖尿病的一系列变化和危险因素。
[0079] 肥胖对于健康的影响被认为是不同细胞和组织中脂肪重量增加的结果,此外进一步还是慢性炎症和免疫系统功能紊乱的结果,它们和代谢紊乱一起是上述不同病症的原因。
[0080] 本发明的另一优选实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株,或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其组合的用途;或者本发明的组合物,用于制备药物制剂或制备营养组合物的用途,以用于减少肥胖或超重受试者中脂肪组织的生长和分化,以及超重或肥胖前期阶段,从而用于预防和/或治疗脂肪细胞肥大。正如实施例4和图5中所证实的,本发明的菌株减小了脂肪细胞的体积,而在生命的某个阶段(尤其在儿童和青年时期)脂肪细胞体积的增大(肥大)尤其会利于成年阶段超重和肥胖以及其他并发症的发生。特别地,向肥胖动物施用CECT7765菌株导致小体积脂肪细胞数目的增多以及大体积脂肪细胞数目的减少(实施例4,图5)。
[0081] 本发明的另一实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株,或本发明的菌株,或本发明的微生物组合、或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其任意组合,或者本发明的组合物,用于制备药物制剂或制备营养组合物的用途,以及用于治疗肝性脂肪变性或脂肪肝的用途。正如本发明实施例4中所证实的,向肥胖动物模型和对照动物(非肥胖)施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株降低了高脂肪积累的肝细胞的数目。总之,这意味着本发明的菌株能够降低肝脏中的脂肪积累。
[0082] 假链状双歧杆菌菌株或本发明的菌株能够用于治疗或预防肝性脂肪变性或脂肪肝,该疾病在前述段中定义为与超重和/或肥胖相关的疾病。本发明还涉及预防和/或治疗与肝性脂肪变性恶化相关的病症,例如但不限于非酒精性肝炎、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、晚期肝疾病或肝癌。此外,假链状双歧杆菌菌株或本发明的菌株能够用于这些或其他的与肝脏的脂肪积累和炎症相关的病症,然而这些并不是肥胖或超重受试者必然具有的,但是是其他疾病所产生的结果。所述疾病包括,例如,但不限于营养障碍(例如但不限于吸收不良、蛋白质卡路里营养不良或肠外营养)、遗传或非遗传性代谢紊乱(例如但不限于2型糖尿病、无β脂蛋白血症,或系统性肉缺乏症)、接触药物引起的疾病(例如但不限于类皮质激素或布洛芬)或毒素(例如但不限于酒精)、由于感染引起的慢性或急性肝炎、肝硬化、肝纤维化、晚期肝疾病、肝癌或腺垂体障碍。特别是,脂肪变性影响约50%的2型糖尿病患者。
[0083] 本发明的另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株,或本发明的菌株,或发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其任意组合,或本发明的组合物,用于制备能够预防和/或治疗由血脂浓度并且优选是作为对照而被用于标准化血液浓度的血甘油三酯的改变所引起的疾病(例如血脂异常)的药物制剂或营养组合物的用途。药物制剂或营养组合物优选用于治疗血脂异常(与血脂异常同义)。血脂异常优选是高甘油三酯血症或高胆固醇血症。血脂异常是一类病理状态,其唯一的共同因素是脂质代谢紊乱,继发血脂和脂蛋白浓度改变。血脂异常可以与或者不与肥胖、高脂肪饮食的消耗以及脂肪吸收的增加有关。反之,在其他的病理中,这些改变又与心血管疾病和糖尿病的高风险相关。如实施例5所证实,在正常受试者和肥胖受试者中,本发明的菌株降低了脂肪吸收和血甘油三酯水平,证明其对于上述的应用是有效的。
[0084] 本发明的另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株,或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其任意组合,或本发明的组合物,用于制备药物制剂或制备营养组合物的用途,与未处理对照相比,减少从饮食中吸收的脂肪的量。
[0085] 如实施例6所示,本发明的菌株减少了肠上皮细胞中乳糜微粒的数量,也就是,它减少了来源于饮食的脂肪,而所述脂肪被吸收了超过50%(实施例6,图7)。乳糜微粒是饮食来源的脂类形式的包装形式,是从肠道向外围组织所使用的淋巴和血液运输的形式,通过这种机制,施用的菌株能够限制它们的吸收以及在有机体中的积累。饮食中脂肪的吸收,除了通过增加脂质在脂肪组织中的积累使之能够成为超重和/或肥胖的原因之外,同样也能引起其他的不造成肥胖的疾病,例如但不限制本发明的范围:动脉粥样硬化,它的特点是动脉粥样斑增厚动脉内膜,其中脂肪积聚和血脂异常,其特点是改变血脂浓度(甘油三酯和/或胆固醇和相关的脂蛋白),与高心血管疾病风险相关的疾病,或其他的由脂质代谢与糖代谢的关系改变造成的病变(例如但不限于胰岛素抗性或糖尿病)。
[0086] 本发明优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株,或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其任意组合,或本发明的组合物,用于制备预防和/治疗由相对于对照的高血糖水平引起的疾病的药物制剂或营养组合物的用途,因此,与未处理对照相比,它能够用来降低受试者的血糖浓度(高血糖)并维持血糖的正常生理水平以及调节餐后血糖反应。
[0087] 无论肥胖还是不肥胖,胰岛素抗性(受试者中虽然产生了足够的胰岛素,然而身体并不能对此进行正常的响应)或由缺乏胰岛素合成能够引起,空腹血糖(高血糖)的增加以及餐后血糖反应的改变,这导致其他的代谢紊乱或与药物的相互作用。本发明的实施例5为该优选实施方案提供了实验支持。术语“由高血糖水平引起的疾病”是指比健康个体中的正常葡萄糖水平更高的血糖浓度所导致的健康的改变,也就是,空腹时,血糖浓度大约为72至110mg/dl或者4-7mmol/l,或者餐后一个半小时的血糖浓度大约是<180mg/dl(或10mmol/l)。所述的值是近似均值,这是因为必须要考虑每个受试者的条件特征所经历的不同。由高血糖水平所引起的疾病包括但不限于:神经病(损伤四肢和/或器官的神经)、视网膜病(损伤眼睛的视网膜),肾病(损伤可导致肾功能衰竭的肾脏)、心血管疾病(例如高血压或心肌梗死)、脑血管疾病(例如,脑血栓症)。
[0088] 本发明另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株、或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其组合,或本发明的组合物,用于制备特异性预防和/治疗糖尿病的药物制剂或营养组合物的用途。更优选的实施例涉及预防和/或治疗2型糖尿病,虽然不是必然的,但该病症还是与超重和/或肥胖有关。
[0089] 2型糖尿病以胰岛素产生和组织中胰岛素敏感性的相对缺乏以及因此产生的缺乏外周葡萄糖的利用为特征。2型糖尿病占糖尿病患者的80%-90%。该疾病通常在成年时期发生并且通常与肥胖有关。然而,一些药物和其他原因可能导致这种类型的糖尿病。例如,糖尿病常常与长期施用类皮质激素有关,常常与未进行治疗的血色病有关,而妊娠期糖尿病未必与肥胖相关。
[0090] 本发明另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株、或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其组合,或本发明的组合物,用于制备药物制剂或营养组合物的用途,以降低肥胖或超重个体中或者超重或肥胖前期脂肪组织的生长和分化,从而用于预防和/或治疗代谢综合症。代谢综合症是指这样一组代谢紊乱,它们一起增加糖尿病和心血管疾病的风险,包括肥胖、血脂异常(例如甘油三酯血症和高胆固醇血症)和高血糖的组合。正如之前的实施例所证实的,本发明的菌株能够用于预防和同时治疗这些疾病,从而预防和治疗代谢综合症。
[0091] 本发明另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株、或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其组合,或本发明的组合物,用于制备药物制剂和营养组合物,以预防和/或治疗相比于对照的,与先天性和适应性免疫系统的改变相关的疾病的用途,因此和对照组相比,它用于改进先天性和适应性免疫系统的功能。这些病症优选超重、肥胖和导致这些免疫功能改变的相关疾病。实施例3提供了这个方面的实验数据。
[0092] 术语“与先天性和适应性免疫应答降低相关的疾病”是指先天性和适应性免疫系统的功能中呈现出免疫抑制的疾病。
[0093] 本发明另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株、或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其组合,或本发明的组合物,用于制备药物制剂或营养组合物,以用于预防和/或治疗相比于对照组,与高水平促炎性蛋白产生相关的疾病的用途。实施例2和3示出了这方面的实验数据。
[0094] 促炎性蛋白的例子包括但不限于:细胞因子、趋化因子和脂肪因子。促炎性蛋白优选选自于IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16、TNF-α或MCP1和瘦素,或者它们的任意组合。促炎性蛋白更优选选自于TNF-α、IL-6、MCP1和瘦素或它们的任意组合。
[0095] 术语“与促炎性蛋白高水平相关的疾病”是指由至少一种参与不同种类组织的炎症反应(促炎症)的蛋白产生引起的疾病。一些与促炎性蛋白高水平相关的疾病也与超重和/或肥胖有关,例如但不限于2型糖尿病、妊娠糖尿病、代谢综合征、脂肪肝、非酒精性肝炎、高血压、血脂异常、心血管疾病、动脉粥样硬化,脂肪性肝炎或癌症。其他与促炎性蛋白高水平相关的疾病并不与超重和/或肥胖相关或者在不肥胖的时候也能出现,例如但不限于前述疾病(例如糖尿病)和其他诸如变应性炎症的疾病。
[0096] 本发明另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株、或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其组合,或本发明的组合物,用于制备药物制剂或营养组合物的用途,相比于未处理对照,能够降低肥胖受试者的瘦素浓度和/或增加非肥胖受试者中所述激素的浓度。在非肥胖受试者中,瘦素的增加导致消耗减少以及能量消耗增加和脂肪氧化。相反,在肥胖受试者中,瘦素浓度的减少导致代谢紊乱正常化并减少炎症。
[0097] 本发明另一优选的实施方案涉及假链状双歧杆菌菌株、或本发明的菌株,或本发明的微生物组合,或其相应的细胞组分、代谢产物、分泌的分子或其组合,或本发明的组合物,用于制备药物制剂或营养组合物的用途,来修复肠道内微生物丛的组成,或者减少肠道内肠杆菌的浓度。在更优选的实施方案中,肠道内微生物丛的组成的修复或者肠道内肠杆菌浓度的减少是在超重受试者、肥胖受试者或患有与之相关的疾病的受试者中实施的。
[0098] 作为一个非限制性例子,与未处理对照相比,肠道内微生物丛的修复可以基于肠道内肠杆菌浓度的减少和双歧杆菌和/或乳杆菌的增加。如实施例3.6中观察的那样,施用本发明的菌株导致结肠中双歧杆菌总浓度增加了至少一个对数单位以及诸如肠杆菌的潜在致炎性细菌降低了至少0.5个对数单位。这也意味着能够从肠道向外周组织(例如肝脏)传送的促炎性信号减少,而这些外周组织在肥胖或非肥胖受试者中会受到不同病症的影响。
[0099] 说明书和权利要求中通篇使用的术语“包括”以及它的变体并不是试图排除其他技术特征、附加物、组分或步骤。对于本领域技术人员来说,本发明的其他目的、优点和特征能部分从说明书以及本发明的实验中推断出来。下述的附图以及实施例是用来做详细的解释而并不是限制本发明。

附图说明

[0100] 图1示出了在肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)中施用假链状双歧杆菌CECT77658
菌株(10cfu/天)7周,对于参与吞噬过程的巨噬细胞呼吸爆发的影响。
[0101] ND,使用标准饮食的对照组动物;HFD,高脂肪饮食;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765。
[0102] 图2示出了相比于不同的刺激(脂多糖[LPS]和粪便),在肥胖C57BL/6小鼠(n=68
只/组)中施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株(10cfu/天)7周,对细胞因子(TNF-α)合成中巨噬细胞功能的影响。
[0103] ND,使用标准饮食的对照组动物;HFD,高脂肪饮食;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765。黑色柱:对照;浅灰:LPS;暗灰:粪便。
[0104] 图3示出了在肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)中施用假链状双歧杆菌CECT77658
菌株(10cfu/天)7周,对树突细胞与T细胞之间相互作用以及它们增殖能力的影响。
[0105] 用施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株(108cfu/天)7周的不同实验组中的肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)的成熟树突细胞(DC)培养CD4+T-细胞(L)。混合物中的细胞比例(L/DC)是1:1、1:2和1:4。
[0106] ND,使用标准饮食的对照组动物;HFD,高脂肪饮食;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765。
[0107] 图4示出了相比于不同的刺激(LPS和粪便),在肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)8
中施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株(10cfu/天)7周,对于细胞因子合成中树突细胞功能的影响。
[0108] ND,使用标准饮食的对照组动物;HFD,高脂肪饮食;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765。
[0109] 图5示出了在肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)中施用假链状双歧杆菌CECT77658
菌株(10cfu/天)7周,对于脂肪细胞发展的影响,脂肪细胞的发展按大小范围进行分类。
[0110] ND,使用标准饮食的对照组动物;HFD,高脂肪饮食;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765。
[0111] 图6示出了在肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)中施用假链状双歧杆菌CECT77658
菌株(10cfu/天)7周,对脂肪变性发展的影响(肝脏中的脂质积累)。
[0112] 根据脂肪在细胞内积累程度的脂肪肝细胞的数目显示在肝组织的组织切片中,其中肝组织用苏木精-伊红染色
[0113] ND,使用标准饮食的对照组动物;HFD,高脂肪饮食;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765。
[0114] 图7示出了在肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)中施用假链状双歧杆菌CECT77658
菌株(10cfu/天)7周,对组织切片中肠上皮细胞里形成的乳糜微粒数目的影响,其中该组织切片用苏木精-伊红进行染色。
[0115] ND,使用标准饮食的对照组动物;HFD,高脂肪饮食;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765。
[0116] 图8示出了在肥胖C57BL/6小鼠(n=6只/组)和对照小鼠中施用假链状双歧杆8
菌CECT7765菌株(10cfu/天)7周,对外周血瘦素浓度的影响。
[0117] L,瘦素以pg/ml表示;HFD,使用高脂肪饮食的动物;HFD+P,高脂肪饮食+假链状双歧杆菌CECT7765;SD,使用标准饮食的动物;SD+P,使用标准饮食的动物+假链状双歧杆菌CECT7765。
[0118] 图9示出了用变性梯度凝胶电泳(DGGE)鉴定本发明的菌株。
[0119] M1栏(column)示出了不同的Bx条带,这些Bx条带对应于下述参考微生物的DNA片段:B1:青春双歧杆菌LMG11037T;B2:角形双歧杆菌LMG11039T;B3:长形双歧杆菌婴儿亚种CECT4551T;B4:假链状双歧杆菌CECT5776;B5:动物双歧杆菌乳酸亚种DSM10140T。
[0120] 在M2栏中,B6是两歧双歧杆菌LMG11041T;B7是长形双歧杆菌长形亚种LMG11043T;B8是链双歧杆菌LMG11043T;B9是齿双歧杆菌CECT687;B10是动物双歧杆菌动物亚种LMG10508T。
[0121] 栏I1中,示出了本发明的CECT7765菌株的条带。具体实施例
[0122] 通过发明人所实施的下述这些分析来解释本发明。本专利文献所提供的这些实施例只是作为本发明精神的解释。这些实施例只用作解释目的而不能理解为对所请求保护的发明的任何限制。因此,所述实施例并不是试图去限制该申请的范围。
[0123] 实施例1:假链状双歧杆菌CECT7765菌株的分离和鉴定
[0124] 假链状双歧杆菌属菌株是从健康的母乳喂养小鼠的粪便中分离得到,这些小鼠在进行分析前至少一个月内没有食用过含有双歧杆菌的食品,也没有使用抗生素处理。样本保藏在4°C,在采集后不到两小时内进行分析。2g样品溶解于含有130mM浓度的NaCl(PBS)的10mM磷酸缓冲液中,使用Lab-Blender400振荡器(stomacher)(Seward Medical,London,UK)均质化3分钟,稀释在蛋白胨水中。不同十进制稀释的0.1ml的等分试样接种在含有0.05%半胱氨酸(Sigma,St.Louis,MO;MRS-C)和80μg/ml莫匹罗星的MRS琼脂(Man Rogose and Sharpe;Scharlau,Barcelona)中。经过在37°C的厌氧条件下(AnaeroGen,Oxoid,UK)培养48小时后,选择分离的菌落,通过革兰氏染色研究其形态,从而确定它们的特性。分离的菌落的特性通过对总DNA中的16SRNA基因进行测序而确定。使用引物27f(5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’:序列号2)和1401r(5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’:序列号3)扩增该片段序列,并且使TM
用GFX PCR商业系统(Amershan,Bioscience,UK)对其进行纯化。进一步利用引物
530f(5’-GTGCCAGCAGCCGCGG-3’: 序 列 号 4) 和 U-968f(5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’:
序 列 号5),根 据 其 他 作 者 描 述 的 方 法 进 行 测 序(Gerhard等 ,2001.Appl.Environ.Microbiol.,67:504-513;Satokari 等 ,2001.Appl.Environ.
Microbiol.67,504-513;Favier等,2002.Appl.Environ.Microbiol.,68:219-22)。测序所使用的是ABI3700自动DNA序列分析仪(Applied Biosystem,Foster City,CA)。
[0125] CECT7765菌株的16S核糖体RNA基因的1.28kb的序列如序列号1所示。可在GenBank数据库中使用BLAST算法搜寻与之高度相关的序列(Altschul等,1990.J.Mol Biol.,215:403-410)。
[0126] 根据序列号1与它的最相近序列进行对比的结果,其他的假链状双歧杆菌(例如假链状双歧杆菌B1279菌株,GenBank登录号NR_037117.1)与之具有99%的同一性。这些结果表明本发明的菌株非常可能属于上述菌种。
[0127] 菌种的鉴定同样可以利用之前研究中所描述的DGGE来进行(Satokari等,2001.Applied and Environmental Microbiology,67,504-513)。 利 用 引 物 Bif164 和Bif662-GC扩增16S rRNA基因(520pbb)的序列,之后使用通用突变检测系统电泳设备(Bio-Rad,Richmond,CA)分离该扩增的片段。在凝胶中建立45-55%的变性梯度,其中100%代表7M的尿素和40%的甲酰胺(vol/vol)。将电泳迁移率与作为参考的其他菌种的菌株进行比较。
[0128] 如图9中所示,本发明菌株的条带的电泳迁移率(凝胶道I1:假链状双歧杆菌CECT7765)与另一相同种类作为参考的菌株相吻合(假链状双歧杆菌CECT5776)。
[0129] 本发明的菌株的 分子特征通过RAPD分析 鉴定,所使用的引物 是M13(5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′:序列号6)和Del(5′-CCGCAGCCAA-3′:序列号7),并且依据上述的方法(Hoffmann等,1998.Zentralbl Bakteriol.288,351-60;Svec等.2010.Antonie Van Leeuwenhoek.98:85-92)。随机扩增DNA片段的结果证明本发明的菌株(假链状双歧杆菌CECT7765)不同于其他相同种类的菌株。
[0130] 实施例2:根据体外调节参与低级慢性炎症的巨噬细胞响应的能力选择假链状双歧杆菌CECT7765菌株
[0131] 2.1肠道细菌培养物和悬浮液的制备
[0132] 将菌株接种 于10ml含有0.05%的1%半胱氨 酸(MRS-C)的MRS发酵 液(Scharlau Chemie S.A.,Barcelona,Spain)中,培养24小时,接着在37°C的厌氧条件(AnaeroGen;Oxoid,Basingstoke,UK)下培养22小时。离心收集细胞(6,000g,15分钟),用PBS(10mM磷酸钠,130mM氯化钠,pH7.4)洗涤两次,随后用含有20%甘油的PBS重悬。这些悬浮液的等分试样,在液氮中冷冻,并且保藏于-80°C。通过在MRSC琼脂平板上培养48小时后确定冷冻-解冻后的活细胞的数目。所有的情况下活力都大于90%。每个等分试样用于单独的实验。为了评估死细菌的效力,将其中一些等分试样进行冷失活(3–20°C的冷冻和解冻循环)和热失活(80°C下30分钟)。用NaOH调节获得的悬浮液的pH值至7.2,过滤除菌(0.22μm孔径,Millipore,Bedford,MA)以除去任何可能存在的活细菌。直到使用前,等分试样都储藏在-80°C。
[0133] 2.2巨噬细胞的培养和刺激
[0134] 从Raw264.7小鼠巨噬细胞系中得到的细胞在补充添加10%胎牛血清(Gibco,Barcelona,Spain),链霉素(100μg/ml,Sigma)和青霉素(100U/ml,Sigma)的杜尔贝克改良伊格尔培养基(DMEM,Sigma,USA)中生长。为实施刺激实验,细胞在24孔平底
6
聚苯乙烯板(Corning,Madrid,Spain)中以10 细胞/ml的浓度,37° C,5%CO2条件下进行
6
培养。1x10 菌落形成单位(cfu)/ml的活系菌和死细菌的悬浮液和150μl体积的上清液作为刺激物。使用1μg/ml的从大肠杆菌O111:B4(Sigma,St.Louis,MO)中纯化的脂多糖(LPS)作为阳性对照。没有受到刺激的PBMCs中产生的细胞因子作为阴性对照。每个实验中,每种类型的刺激都进行两次重复。离心收集培养上清液,分馏,并在-20°C下储藏至等分试样直到检测细胞因子和趋化因子。
[0135] 2.3细胞因子和趋化因子的测定
[0136] 根据制造商的说明书,使用ELISA试剂盒(BD Biosciences,San Diego,CA)测量上清液中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL10和MCP1)的浓度。
[0137] 特别地,本发明的目的菌株选自于乳杆菌属和双歧杆菌属,因为其诱导低浓度促炎性分子(TNF-α和IL-6)和趋化分子(MCP1)的能力,这些分子都参与巨噬细胞向脂肪组织的迁移以及与肥胖相关的慢性炎症,所述肥胖能够导致胰岛素和瘦素的抗性(表1)。CECT7765菌株是能够诱导产生低浓度TNF-α,IL-6的菌株,并且它也是仅有的两个能够诱导低水平MCP1菌株之一(表1)。选择本发明的菌株还因为它能够通过巨噬细胞诱导高浓度的抗炎性和调节性细胞因子的合成(IL-10,表2),这能够降低肥胖情况下的炎症(表2)。
所选择的细菌的免疫性质并不同于其他的任何乳杆菌属和双歧杆菌属的肠道细菌,也不同于相同菌种的其他菌株,因此,这些特征使得该菌株特别适合于治疗和预防超重、肥胖和相关改变,以及前面所讨论的其他疾病。
[0138] TNF-α、IL-6和MCP1的增加与超重、肥胖和相关病症有关,但并不是仅仅与所述疾病相关,它还与由TNF-α、IL-6和MCP1相对于对照的升高所导致的任何疾病相关,正如说明中前述段落所讨论的那样。
[0139] 表1:用不同细菌菌株的活细胞刺激对于由巨噬细胞合成的促炎细胞因子和趋化因子的影响
[0140]
[0141]
[0142] 注:本发明菌株对应的数据用灰色突出显示。
[0143] 表2.用不同细菌菌株的活细胞刺激对于由巨噬细胞合成抗炎性和调节性细胞因子IL-10的影响
[0144]
[0145] 注:本发明菌株的对应的数据用灰色突出显示。
[0146] 实施例3.施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株对于免疫系统细胞的功能、外周血和中枢神经系统的免疫和内分泌参数,以及肠道微生物丛组合和炎性特性的影响[0147] 3.1本发明目的菌株的培养物的制备
[0148] CECT7765 菌 株 在 补 充 有 0.05%(w/v) 半 胱 氨 酸 的 MRS 发 酵 液(Scharlab,SL-Barcelona,Spain)中生长,厌氧条件下在37°C下培养22小时(AnaeroGen;Oxoid,Basingstoke,UK)。离心(6,000g,15分钟)收集细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS、10mM磷酸钠、130mM氯化钠、pH7.4)洗涤,重悬于10%脱脂奶中。在液氮中冷冻上述悬浮液的等分式样,并在使用前保藏在-80°C下。通过在含有0.05%半胱氨酸的MRS琼脂平板上培养48小时后确定活细胞的数目,其约为90%。每个等分式样只解冻一次。
[0149] 3.2肥胖动物模型和抽样
[0150] 使用的是C57BL-6成年雄性小鼠(6–8周;Harlan Laboratories)。在控制的温度(23°C)和40-50%的大气湿度下,12小时明/12小时暗周期饲养小鼠。C57BLACK6小鼠,即C57BL-6或黑6,在人类疾病的研究中,是一种广泛应用的用于基因操控的实验室小鼠的近亲品系。
[0151] 通过喂养高脂肪饮食(HFD)的方式产生肥胖动物组,高脂肪饮食提供脂质(60/脂肪,Harlan Laboratories)形式的60%能量,而非肥胖动物施用常规饮食。小鼠能自由获得水和食物。每周一次监控体重。根据动物伦理委员会标准实施该实验。
[0152] 上述动物随机分为4组(n=6只/组):常规饮食饲养组(对照),施用本发明目标菌株的对照组(对照-菌株),高脂肪饮食(肥胖)饲养组,施用CECT7765菌株(肥胖-菌株)的8
肥胖组。通过胃管以每天10cfu/天的剂量施用该菌株7周。对照和肥胖组以同样方式施用水作为安慰剂。
[0153] 此后,麻醉动物,颈椎脱臼法处死,提取不同的生物样本。使用ELISA确定外周血中的免疫参数(细胞因子、脂肪因子和趋化因子)。测量脑样本上清中的促炎细胞因子(TNF-α)的浓度,之后该脑样本与多稳元件(polytron)一起均质化后可进行如前所述的ELISA实验。同样提取粪便样本,为了确定施用本菌株对于微生物组合物的影响以及其对体外培养的巨噬细胞、树突细胞和T细胞的免疫响应刺激的效果,所述的这些细胞可以通过下述方法得到。
[0154] 3.3评估对于巨噬细胞的影响
[0155] 为了表明施用CECT7765菌株对于改进先天免疫系统细胞应答的影响,通过腹腔无菌注射杜尔贝克改良伊格尔培养基溶液(DMEM)(SigmaTM–St.Louis,MO/USA)获得巨噬细胞,所述培养基还补充有10%胎牛血清、100μg/ml的链霉素和100U/ml的青霉素(Sigma Chemical Co.),该胎牛血清在56°C失活30分钟(Gibco,Barcelona,Spain)。从每个实5
验组小鼠中获得的巨噬细胞,用DMEM培养基调整其浓度为1x10 细胞/ml,在37°C,5%CO2的条件下培养1小时后,用不含血清的DMEM洗涤孔板以除去没有附着的细胞。继续培养附着的细胞24小时,之后,每组小鼠都用粪便(在PBS中稀释1/9)进行刺激,使用1μg/ml的鼠伤寒沙门氏菌LPS(Sigma Chemical Co,Madrid,Spain)作为阳性对照。在平行实验中,评估没有受到刺激的巨噬细胞以获得基准细胞因子产生量。刺激后,收集上清液,用ELISA(Ready SET Go!Kit,BD Bioscience,San Diego,CA,USA)确定下述细胞因子的浓度:
TNF-α、IL6和IL-10。
[0156] 3.4评估对于树突细胞和T-细胞的影响
[0157] 为了证明施用本发明的菌株对于改进树突细胞刺激T细胞响应能力,以及对于适应性免疫影响的影响,确定成熟树突细胞在混合淋巴细胞反应中诱导CD4+T-细胞的增殖性响应的能力。该实验是通过比较从肥胖和对照小鼠中提取的细胞的响应来实施的,所述对照小鼠施用或没有施用过如前所述的本发明的目标菌株。
[0158] 树突细胞从小鼠胫骨和股骨的骨髓中产生。提取每个小鼠的胫骨和股骨,无菌条件下除去周围的组织。切割端部后,使用注射器和直径为0.45mm的针通过PBS冲洗来提取6
骨髓。获得的细胞用PBS洗涤一次,用RPMI稀释成10 细胞的等分式样,RPMI补充添加有抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素),10%FBS以及20ng/ml小鼠GM-CSF,将该等分式样接种于100mm烧瓶中。第3天,加入10ml培养基,第7天,更换新鲜培养基。第8天,通过轻轻移液收集未附着的细胞。用PBS洗涤细胞,再用不含小鼠GM-CSF的培养基重悬。
[0159] 在实施混合淋巴细胞反应之前24小时内,加入LPS(100ng/ml)活化树突细胞(DC)。成熟的DC用于刺激CD4+T-细胞。CD4+T-细胞从7-8周龄的C57BL/6小鼠的脾脏中分离得到。摘除脾脏之后,悬浮于含有FBS的PBS中,并滤过尼龙膜,洗涤所获得的细胞悬浮液一次,重悬于裂解缓冲液中5分钟。用PBS洗涤两次后,根据制造商的说明书,用L3T4-CD4+玻璃细珠(Miltenyi Biotec GmbH,Bergish Gladbach Germany)进行阳性选择,免疫分离CD4+T细胞(CT)。
[0160] 为了实施混合淋巴细胞反应,将DC等分式样分布于96孔板中,做三个重复来进5
行刺激1x10CD4+T-细胞(L),所述T细胞的比例为(L/DC):1:1、1:2、1:4每100μl培养基,在37°C,5%CO2条件下培养72小时。使用或不使用作为促细胞分裂剂的ConA(5μg/ml;Sigma)的DC和CD4+T细胞作为对照。使用ELISA试剂盒(BrdU-colorimetric
assay;Roche,Diagnostic,Germany)测定淋巴细胞的扩增,通过测定440nm的吸光度进行定量。
[0161] 当向由饮食诱导的肥胖受试者体内施用时,本发明的菌株改善了先天性和适应性免疫系统细胞的功能,增加了它们响应感染原、抗原或过敏原的能力。特别地,向高脂肪饮食诱导的肥胖动物模型施用本发明的菌株改进了在吞噬作用和细胞因子合成中巨噬细胞的功能(图1和2)。该菌株的施用增加了响应于外来过敏原或刺激(酵母/病原体)的腹膜巨噬细胞的呼吸爆发,改进了吞噬能力以及免疫防御(图1)。相比非肥胖的对照,肥胖动物的所述能力显著降低(图1)。早期的研究也显示,负责清除病原体的巨噬细胞的呼吸爆发在患有糖尿病的受试者中也发生了改变(Marhoffer等,1992.Diabetes Care,15(2):256-60)。此外,从肥胖和对照动物中所提取的腹膜腹腔巨噬细胞的培养,以及体外用病原体的脂多糖(LPS)进行的刺激显示,施用本发明的目标菌株能够改善负责阻止可能性感染的细胞因子,例如TNF-α(图2)的合成。当体内施用时,本发明的目标菌株也改进了树突细胞和T-细胞的功能。将提取自施用过该菌株的小鼠体内的树突细胞与T-细胞一起,以不同的比例进行培养孵育(1:1、1:2和1:4),能够提高它们的增殖和激活能力,而这些特征在没有施用过所述菌株的肥胖动物中是降低的(图3)。也发现了施用所述菌株的肥胖动物中提取的树突细胞具有最佳的工作状态,这是因为在体外用LPS进行刺激后,它们能够诱导参与病原体应答响应的细胞因子(如TNF-α)的高分泌(图4)。本专利的菌株的这些特性使得它是很合适的,这是因为在肥胖和相关疾病诸如糖尿病中,树突细胞和T-细胞的功能发生了改变。特别地,树突细胞的功能性改变与重量增加增重相关,以它们呈递抗原和刺激同种异体T-细胞的能力下降为特征(Macia等,2006.J Immunol.,177(9):5997-6006;Verwaerde等,2006.Scand J Immunol.,64(5):457-66)。天然( )T-细胞对于刺激源(有丝分裂原或抗原)的促炎性特征增高,能够导致与肥胖相关的低级慢性炎症,相反,在这之前暴露于抗原的T细胞具有增值缺陷,会优选分泌Th2型细胞因子。所有的这些都解释了肥胖受试者个体中感染的高概率以及响应于接种和感染的记忆T-细介导的应答胞-调控响应的缺失(Karlsson等,2010.J Immunol.,184:3127-33)。在糖尿病中T细胞功能缺失,显示出对于降低的响应刺激原的增殖能力以及合成IL-2的能力(Chang and和Shaio.1995.Diabetes Res Clin Pract.,28(2):137-46)。
[0162] 在体内施用本发明的菌株调节细胞因子、趋化因子和脂肪因子的产生,而上述这些因子的合成在肥胖和相关疾病的外周血中是改变的。肥胖和对照动物模型中所诱导的改变包括促炎细胞因子TNF-α浓度的降低。脂肪因子瘦素在肥胖动物中被降低,在肥胖症中增高,并能导致炎症过程。然而,在对照动物中,该菌株诱导瘦素合成,有助于消耗减少,增加能量消耗和脂质氧化,并预防超重和肥胖。
[0163] 3.5评估大脑中对炎性细胞因子浓度的影响
[0164] 本发明的目标菌株还能够显著地降低TNF-α在中枢神经系统中的合成,而TNF-α的合成在肥胖症中是上升的,能够导致胰岛素和瘦素抗性的发生,抑制食欲减退效果(饥饿感的降低)和调节体重与葡萄糖代谢的功能(De Souza等,2005.Endocrinology.,146:4192-9)。
[0165] 3.6评估对于肠道微生物丛组成和炎性特征的影响
[0166] CECT7765菌株修复肠道微生物丛的组成,修复与超重和/或肥胖以及炎性效应相关的变化,以及修复与其他病理条件相关的改变,所述改变不只与超重和/或肥胖有关。施用本发明的菌株增加了乳杆菌和双歧杆菌的数目,并且至少降低了半个对数单位的肠道内肠杆菌的数目。在微生物丛组成中的这些改变额外地降低了促炎性特性和增强了抗炎性特性。和那些没有施用菌株的肥胖动物相比,施用该菌株的肥胖动物中的微生物丛都能诱导巨噬细胞和树突细胞低水平合成促炎细胞因子,例如,TNF-α的合成,以及高水平合成抗炎性细胞因子IL-10(实施例3,图2和4)。肠道微生物丛的改变被认为是能够导致增重、胰岛素抗性、肥胖和糖尿病的可能的炎性刺激之一(Cani and Delzenne2009.Curr Opin Pharmacol.,9(6):737-43),所述的改变还会引起其他类型的病理状态。
[0167] 表3施用菌株对于肥胖动物肠道微生物丛组成的效果的实施例
[0168]
[0169] 1数据用每mg粪便中16S rRNA基因的拷贝数的log no.值表示(中值,四分位数间距)
[0170] 2统计上的显著差异,建立于使用曼-怀二氏检验方法的p-值<0.050。
[0171] 实施例4施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株对肝脏和脂肪组织的影响
[0172] 如实施例3中所述的相同的小鼠和相同的实验组,其中两组施用本发明的目标菌株,随后使用相同的方案。处理时间之后,麻醉动物,颈椎脱臼法处死动物,提取脂肪组织(附睾)和肝组织样品,用生理盐水洗涤,用具有10%福尔林的缓冲液固定,包埋在石蜡中并切成用苏木精-伊红染色的4-5μm小段,脂肪变性(肝脏中脂质的积累)的严重程度通过用明视场光学显微镜(Olympus)分析每个固定片段的10个视场进行确定,根据下述等级进行:1级(无脂肪变性);2级,当肝细胞的脂肪占不到细胞的33%;3级,当肝细胞的脂肪占细胞的34-66%之间;4级,当肝细胞的脂肪占细胞的66%以上。脂肪细胞的体积通过使用NIS ElementsBR2.3软件进行图像分析来确定,在每个实验组和组织类型中评估至少100个细胞。
[0173] 本发明的目菌株系降低了附睾组织中脂肪细胞的体积,而在生命的特定时期(儿童期和青春期),该细胞体积的增大(肥大)会有助于成人期发生超重和肥胖,并且与消耗和能量消耗的失衡有关(Macia等.,2006.Genes Nutr.,1:189-212)。相反,脂肪细胞体积的减小与胰岛素抗性的降低和葡萄糖浓度的降低有关(Varady等,2009.Metabolism58:1096-101)。特别的,在肥胖动物模型体内施用本发明的目标菌株导致大小2
范围在1,000至2000μm 的小体积脂肪细胞的增加,而在没有施用过该菌株的肥胖动物
2
中,大小范围在4000至6000μm 的大体积脂肪细胞增加(图5)。在非肥胖动物中也观察到了相似的结果。
[0174] 脂肪细胞体积的增大也和肝脏中增高的脂肪酸供应相关,增高的脂肪酸供应导致肝性脂肪变性及其并发症,这样菌株也有助于预防或改善这种改变。因此,例如假链状双歧杆菌CECT7765菌株减少了脂肪细胞的体积,即,它对于在此类细胞的发生过程中治疗这种能够导致细胞肥大的改变是有用的,而细胞肥大将会维持很长时间,会引起超重和肥胖以及其他未必与肥胖相关的病症。
[0175] 本发明的目标菌株减少了与高脂肪饮食消耗,肥胖和其他诸如非酒精性肝炎的不同病症相关的脂肪在肝脏中的积累(脂肪变性)(Musso等,2010.Hepatology52:79-104)。特别的,在肥胖动物模型体内施用本发明的菌株导致含有高脂肪积累的4级肝细胞(占据超过细胞的66%)的减少,以及含有相对含量脂肪的3级肝细胞(占据细胞的34-66%)的增加,然而在没有施用该菌株的肥胖动物中,效果恰恰相反。在对照动物中,施用该菌株以减少3级肝细胞为代价,增加了2级肝细胞(脂肪占据不到肝细胞的33%),而没有施用过该菌株的对照动物的情况恰恰相反(图6)。
[0176] 实施例5施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株对于外周血中葡萄糖、胰岛素、甘油三酯和胆固醇浓度的影响
[0177] 如实施例3中所述的相同的小鼠和相同的实验组,其中两组施用本发明的目标菌株,随后使用相同的方案。处理时间之后,麻醉动物,通过颈椎脱臼法处死动物,提取外周血样本,利用比色法(Química Clínica Applicada,SA,Amposta,Spain)以确定葡萄糖,甘油三酯和胆固醇的浓度,利用ELISA方法(BD Bioscience,San Diego,CA,USA)以确定胰岛素的浓度。此外,在处死动物前确定餐后血糖反应或葡萄糖耐受度。禁食一段时间之后,测量基准葡萄糖浓度,然后向每只小鼠以2g/千克体重的剂量施用葡萄糖,每15或30分钟用反应带(Ascensia Esyfill,Bayer)和相应的血糖仪(Ascensia BRIO,Bayer)测量葡萄糖,检测应当在30和550mg/dl之间。
[0178] 体内施用本发明菌株,通过降低肥胖禁食动物的外周血中的葡萄糖浓度来调节葡萄糖代谢,例如,在肥胖小鼠中检测到葡萄糖的高血清浓度492.7(SD18.3)mg/dl,通过施用本发明的菌株使之正常化,达到316.5(SD20.5)mg/dl的值,与胰岛素浓度减少成比例。此外,向肥胖动物施用本发明的目标菌株较少了餐后葡萄糖最大值(411.7[SD49.9]对2
352.0[25.8])并减少了葡萄糖曲线下的面积(5.422对4.779cm)。血浆葡萄糖浓度的增加以及口服施用后持续的高浓度指示了胰岛素合成或胰岛素响应或其他原因的改变,并且这可以被本发明的目标菌株正向调节,降低了胰岛素抗性和糖尿病的发生风险,并改善了治疗。
[0179] 体内施用本发明的菌株能够调节脂类代谢,特别是降低肥胖动物外周血中甘油三酯和胆固醇的浓度;例如,在肥胖小鼠中检测到高血清甘油三酯浓度196.0(SD14.3)mg/dl在施用本发明的菌株后被显著降低至147.5(SD12.5)mg/dl的值,同样的,肥胖动物中的高血清胆固醇浓度146.9(SD12.7)mg/dl在施用本发明的菌株后被显著降低至94.4(SD5.7)mg/dl的值。
[0180] 实施例6施用假链状双歧杆菌CECT7765菌株对于肠道内来自饮食的脂质吸收的影响
[0181] 如实施例3中所述的相同的肥胖模型和相同的实验组,其中两组施用本发明的目标菌株,随后使用相同的方案。处理时间之后,麻醉动物,通过颈椎脱臼法处死动物,分离肠道组织样本,用生理盐水洗涤,并固定于具有10%福尔马林的缓冲液固定,包埋在石蜡中,并切成苏木精-伊红染色的4-5μm的切片。在明视场光学显微镜(Olympus)下对每个固定切片中10个视场范围的每个肠上皮细胞中的乳糜微粒的数目进行计数,以乳糜微粒数目/每个肠上皮细胞来表示。如图7所示,本发明的菌株降低了乳糜微粒的数目,所述乳糜微粒在肠上皮细胞中形成超过50%。这些结果与实施例5中的相一致,这些显示本发明的菌株降低血液甘油三酯浓度。
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