免疫调节剂、免疫调节剂食品和免疫调节剂饲料

本发明涉及外用的含有得自原核生物细胞的DNA的免疫调节 剂、免疫调节剂食品、免疫调节剂饲料、锭剂和药物。

人们认为适度激活人和动物的免疫活性对抗传染病(包括普通感 冒)是重要的，对癌症的初级预防和控制变应性及特应性疾病等也是 重要的。已知得自原核生物细胞的DNA具有免疫强化活性，而得自 真核细胞的DNA无免疫强化活性。然而，体外脱氧核糖核酸酶处理 使DNA的免疫调节活性丧失(S.Yamamoto等，Microbiol.Immunol.， 第36卷(9)，983-997，1992)。迄今为止人们认为，因为人类和动物消 化液酶含有脱氧核糖核酸酶，所以只有通过其注射给予才能发挥DNA 的免疫调节活性。

然而，因为注射给药对所述机体是个损伤，所以不适合反复给 药。为了改善免疫强化所必需的物理条件，实践中相当重要的是通 过每日像摄食食物一样服食DNA或者与皮肤粘膜接触达到上述目 的。

因此本发明的目的是提供免疫调节剂，在该免疫调节剂中DNA 不是通过注射给予，而是例如经口或皮肤给予；或者象食物或饲料 一样每日摄食。

为了解决上述问题进行广泛研究的结果，本发明人发现，经口 或皮肤给予得自例如枯草芽胞杆菌和乳酸菌的原核生物细胞的DNA 意外地显现免疫调节活性。该发现导致完成本发明。

即，本发明将提供含有作为活性成份的原核生物细胞源DNA的 免疫调节剂、免疫调节剂食品或免疫调节剂饲料。

本发明为人类或动物提供调节所述免疫功能的方法，所述方法 通过经口、皮肤或粘膜给予药用有效量的DNA，所述DNA从原核 生物细胞提取获得。

最好是所述DNA是通过以下步骤生产的产品：培养原核生物细 胞，收获所述细胞，用细菌细胞壁消化酶将所述细胞溶于水中，并 向该裂解液加入乙醇以分离DNA产品。所述DNA可以是细菌细胞 的DNA提取制品或乙醇或含水乙醇中的细菌细胞的乙醇不溶性组 分。以约40％(体积/体积)含水乙醇可以很好获得所述产品。

最好是所述DNA含有至少8个碱基并包含至少一个CpG序列。 所述DNA可以是其钠盐。

在本发明中，网状内皮系统被激活。因此，可治疗传染病。

在本发明中，肿瘤生长被抑制。

在本发明中，自身免疫性皮肤病得到治疗。

在本发明中，所述原核生物不必是特殊的细菌。然而，考虑到 安全性问题，可提及枯草芽胞杆菌(杆菌属)、乳酸菌(乳杆菌)、氨基 酸生产菌、大肠杆菌等。其中特别优选纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、 乳酸杆菌和氨基酸生产菌用于生产食品。作为乳酸菌，可优选干酪 乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、 德氏乳杆菌(Lactobacillus del-brueckii)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、长双歧杆菌(Biphidobacterium longum)等。作为氨基酸生 产菌，可优选例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、力士 棒杆菌(Corynebacterium herculis)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)和大肠杆菌。

可以用已知方法从原核生物细胞生产DNA。例如可以在合适培 养基中培养谷氨酸棒杆菌。然后离心收获所述细胞，用0.85％生理盐 水洗涤，之后将其悬浮于生理盐水或纯水。加入诸如溶菌酶的细菌 细胞壁消化酶溶解细胞。向所述溶液逐渐加入已冷的无水乙醇。将 不溶于40％(体积/体积)乙醇浓度的DNA缠绕在玻棒上。用60％v/v 乙醇、70％v/v乙醇和80％(重量)乙醇依次洗涤所获得的DNA，真 空干燥以获得高纯度DNA制品。

所获得的DNA制品本身可以加入到食品、饲料或饮料。也可能 的是将所获得的DNA制品与常规用于药物生产的填料、赋形剂等混 合，然后将所述混合物根据需要模制成合适形状以提供药物制剂或 食品。所述DNA也可以配制成溶液。

所述原核生物DNA的免疫调节活性在化学上是稳定的。如实施 例4和实施例5中所述，即使加入到普通饲料，它既不与饲料成份 发生反应也不会因加热而失活。这表明，在生产含有该DNA的免疫 调节剂食品和免疫调节剂的步骤中，可以随意地进行烹调或加热灭 菌处理。如上所述，得自原核生物的DNA的免疫调节活性是稳定的， 未观察到随时间而发生退变。因此，其活性在本品贮藏和流通中不 会丧失。

在以免疫调节剂的水溶液形式给予DNA的情况下，特别通过超 声处理或限制性内切核酸酶处理使其变为低分子，由此使其粘度降 低而方便饮用。在超声处理中，例如，将纯水加入所述DNA制品使 其浓度为1％，并对其进行超声处理5-10分钟，同时用冰水冷却。已 知得自原核生物细胞的DNA分子显示免疫调节活性，因为其碱基序 列是特征性的，而且原核生物细胞与真核细胞不同，它含有大量CpG 序列(A.M.Krieg等，Nature，第374卷；第546-549页，1995)。因 此，在限制性内切核酸酶处理中，并不特别选择限制性内切核酸酶， 只要它能切断CpG键。可以用常规内切核酸酶处理方法进行所述限 制性内切核酸酶处理。

当将DNA加到食品时，所用食品是不特别受限制的。DNA可 以加入到例如主食，诸如面包、面条和大米；配菜，诸如清煮鱼膏 (蒲)、火腿、香肠、熟沙拉和醋渍疏菜；调味料，诸如豆瓣酱(日本 豆酱)、酱油、汤、沙司和佐料汁；乳制品，诸如奶、可可饮料、奶 油、人造奶油、奶酪和冰激淋；糖食，诸如曲奇饼、饼干、薄酥饼、 糖果和口香糖；加工果品，诸如果汁饮料和果酱；和宠物饲料、渔 业及畜牧业饲料等。

当本发明的DNA作为主要药物应用时，它可以以粉剂、颗粒剂、 分散剂、胶囊剂、糖果、饮料或诸如此类口服应用。除此之外，它 还可以以软膏剂、敷剂、溶液剂或沐浴制品经皮肤应用以及以锭剂、 栓剂或含漱剂经粘膜应用。在经皮肤应用时，优选上述低分子制品。 当本发明免疫调节剂通过口服应用时，标准摄入是0.001-100g/天相 当量的DNA，而且没有具体的上限。经皮肤使用的DNA浓度范围 为0.001-100％，但是它并不特别受限制。

根据本发明，可以提供免疫调节剂，其中的DNA可以经口或皮 肤给予，而不是注射给予，或者其中的DNA可以像食物或饲料一样 每日摄食；本发明还提供免疫调节剂食品或饲料。

                            实施例

通过给出以下实施例更具体地说明本发明。另外，在实施例中 ％和份数均是以重量计的。

实施例1(细胞DNA的提取)

将谷氨酸棒杆菌IAM12435接种到含有10ml营养肉汤的L型 试管，于30℃振摇培养7小时。分别在10个容量为500ml并含有100ml Mimura等的培养基(Hakko Kogaku Zasshi，第41卷，第5期，第275- 281页，1963)的锥形瓶中接种1ml所述培养液，于37℃振摇培养21 小时。将该培养物再加到20升Mimura等的培养基中，在小型发酵 罐中继续培养。然后在对数生长期以0.2单位/ml的浓度加入青霉素 G。离心收获所述细胞以获得约1,000g湿细胞。用生理盐水离心洗 涤所述湿细胞一次。然后，加入5升生理盐水悬浮所述细胞。一边 搅拌一边加入1g卵清溶菌酶。于37℃搅拌2小时后，使温度升至65 ℃以破坏所述细胞。逐渐加入已经冷却至-20℃的无水乙醇。用玻棒 缠绕不溶于40％乙醇浓度的DNA。用60％乙醇、70％乙醇和80％乙 醇依次漂洗所获得的DNA，然后真空干燥，获得DNA制品5g。

实施例2(DNA的超声处理)

将实施例1中获得的DNA制品以10mg/ml浓度溶解于纯水中。 将70ml所述DNA溶液装入超声波仪(Kubota Seisakusho K.K.制造， 201M型超声波仪)容器中，并于90kHz超声处理5分钟，同时于-20 ℃冷却。向该溶液中加入2倍体积-20℃的无水冷乙醇。将所述混合 物于-20℃静置24小时。然后将该沉淀离心，真空干燥，获得700mg 超声处理的DNA制品。

实施例3(DNA的限制性内切核酸酶分解)

将纯水加入到实施例1中制得的DNA制品，使其以10mg/ml浓 度溶解。于1ml该混合物中加入100mM tris盐酸缓冲液(pH 7.5)1ml， 该缓冲液含有10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇和100mM NaCl。此 外，加入10,000单位限制性内切核酸酶EcoRI(Takara Shuzo Co.，Ltd. 生产)，并于37℃进行该反应2小时。加入3M醋酸钠溶液0.2ml， 再加入-20℃冷无水乙醇2.5倍体积。该混合物于-20℃静置24小时， 然后离心所述沉淀。依次用60％、70％和80％乙醇漂洗所述沉淀， 真空干燥，获得限制性内切核酸酶处理的DNA制品8mg。

实施例4(用含细菌DNA的饲料或饮用水激活网状内皮系统)

作为一个免疫调节活性指标，检测细菌DNA对网状内皮系统激 活的影响。因为以饮用水给予需要降低溶液粘度，所以使用超声处 理制品。对一组(5只)6周龄ICR-株雌性小鼠给予含0.1％或1％DNA 制品的含DNA饲料或含DNA饮用水。在持续所述给予7天后，以 8mg/100g体重静脉给予胶态炭(Pelican Ink)。在注射后0、3、6、9、 12和15分钟后，眶后穿刺取血20μl，加到4ml 0.1％碳酸钠中。于675nm 波长检测吸光度。用Kato等的方法(I.Kato等，Microbiol.Immunol.， 第27卷(7)，611-618，1983)计算碳从血液中清除的半衰期(清除率t 1/2)。其结果示于表1。

                                     表1         处理组   动物数   t 1/2±SD min   P   给予含0.1％谷氨酸棒杆菌   IAM 12435 DNA的饲料   5   9.0±1.6   ＜0.05   给予含1％谷氨酸棒杆菌   IAM 12435 DNA的饲料   5   4.9±2.0   ＜0.01   给予含0.1％超声处理的谷氨   酸棒杆菌IAM 12435 DNA   的饮用水   5   8.1±2.3   ＜0.05   给予含1％超声处理的谷氨   酸棒杆菌IAM 12435 DNA   的饮用水   5   4.1±1.5   ＜0.01   给予含1％纳豆芽孢杆菌   DNA的饲料   5   6.6±0.9   ＜0.01   给予含1％超声处理的纳豆   芽孢杆菌DNA的饮用水   5   5.6±1.1   ＜0.01   给予含1％酵母DNA的饲料   5   12.0±0.7   ns   给予含1％超声处理的酵母   DNA的饮用水   5   11.9±2.2   ns   未处理组   5   13.5±1.8

从表1中的结果可清楚看出的是，在得自所述细菌的DNA中观 察到所述网状内皮系统的激活，而在得自真核细胞(酵母)的DNA中 未观察到所述网状内皮系统的激活。

按实施例1产生纳豆芽孢杆菌DNA。关于酵母DNA，在YPD 培养基(2.0％葡萄糖，1％酵母提取物，2.0％细菌用蛋白胨，pH 5.0)中 接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FT-1，并于30℃培养。通过 用10单位/ml酵解酶Zymolase(Seikagaku Kogyo K.K.生产)的含 0.1mM EDTA的Tris盐酸缓冲液pH 7.0处理，使所述细胞经受溶菌 作用。然后，以2％的速率加入SDS以破坏所述酵母细胞核。此外， 按实施例1用冷无水乙醇处理所述产物，以形成酵母DNA制品。

此外，按实施例2生产纳豆芽孢杆菌DNA和酵母DNA的超声 处理制品。

实施例5(用含细菌DNA的饲料或饮用水抑制肿瘤生长)

得自谷氨酸棒杆菌IAM 12435的DNA(实施例1)用作细菌DNA 样品，而实施例4中所述的得自酵母的DNA用作比较和对照。任意 给予雌性BALB/c小鼠饲料和水。含每种所述DNA制品(以90℃的 产物温度热处理20分钟)的饲料的DNA含量为1％，含每种所述DNA 制品(于90℃热处理20分钟)的饮用水的DNA含量为1％。两周后， 以1×106细胞在所述小鼠背部皮下植入所述Meth-A肿瘤。此外， 持续给予含有所述DNA的饲料。在肿瘤植入后的第十五天，取除所 述肿瘤，称其重量。所述结果示于表2。

                           表2   治疗组   动物   数   瘤重   mg±SE   P   给予含细菌DNA的饲料   19   463±61   ＜0.05   给予含超声处理的细菌   DNA的饮用水   20   349±52   ＜0.05   给予含酵母DNA的饲料   10   650±323   ns   给予含超声处理的酵母   DNA的饲料   10   882±223   ns   未处理组   18   769±80

如下进行所述饲料的生产。即，按照以下配方用常规方法生产 混合饲料：20份酪蛋白、10份玉米油、30份矿物质混合物(Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)、2.0份维生素混合物(Oriental Yeast Co.，Ltd.生 产)、49份玉米淀粉、10份糖、5份纤维素和1.0份实施例1中制备 的DNA。

从表2可清楚看出的是，给予得自所述原核生物细胞的DNA使 所述肿瘤的生长被抑制。

实施例6(外用药物的制备)

按照以下配方生产皮肤用制剂。

超声处理的谷氨酸棒杆菌IAM 12435DNA    1.0％

甘油                                  5.0％

丙二醇                                4.0％

油醇                                  0.1％

乙醇                                  5.0％

苯甲酸                                0.05％

纯水                                  84.9％

将超声处理的DNA(实施例2)、甘油和丙二醇加入纯水并溶解。 同时，将油醇和苯甲酸溶在室温下溶解于乙醇。将该溶液加到所述 纯水部分并溶解。该混合物于90℃加热20分钟，过滤，然后灌装。

实施例7(外用药物的制备)

按照以下配方生产皮肤用制剂。

限制性内切核酸酶处理的谷氨酸棒杆菌

IAM 12435 DNA                         1.0％

甘油                                  5.0％

丙二醇                                4.0％

油醇                                  0.1％

乙醇                                  5.0％

苯甲酸                             0.05％

纯水                               84.9％

将限制性内切核酸酶处理的DNA(实施例3)、甘油和丙二醇加 入纯水并溶解。同时，将油醇和苯甲酸溶在室温下溶解于乙醇。该 溶液加到所述纯水部分并溶解。该混合物过滤，然后灌装。

实施例8(锭剂的制备)

按照以下配方生产100片锭剂。

白糖(精制粉)                       100g

阿拉伯胶(精制粉)                   8g

超声处理的DNA                      5g

薄荷醇                             0.6mg

百里酚                             0.6mg

桉叶油                             0.002ml

柠檬油                             0.002ml

水                                 适量

用湿法生产颗粒，并制成锭剂使得一片约1.2g。

实施例9

混合实施例1中制得的谷氨酸棒杆菌IAM 12435 DNA粉 90mg、淀粉30mg和Avicell(纤维素，Asahi ChemicalIndustry Co.，Ltd. 生产)180mg，以常规方法生产片型食品，使得每片为300mg。

实施例10

把纯水加入到实施例1中制得的谷氨酸棒杆菌IAM 12435 DNA 粉0.05份、可可脂10份、砂糖7份、奶7份和乳化剂0.05份，以 将总量调节为100份，用常规方法生产可可饮料。

实施例11

把纯水加入到实施例2中制得的谷氨酸棒杆菌IAM 12435 0.2 份、可可脂10份、砂糖7份、奶7份和乳化剂0.05份，以将总量调 节为100份，用常规方法生产可可饮料。

实施例12

用滚筒型制面机生产含DNA的粗制糊剂。该配方为：低强度面 粉650g、硬质面粉(精制粗粉)350g、蛋白粉10g、蛋黄粉8g、麦醇 溶蛋白15g、乙醇30g、DNA(实施例1)100mg和水280g。

实施例13

加入水500g和DNA(实施例1)300mg，蒸煮生大米500g，所 述大米已经用水清洗并且已经沥干。

在一组12人中，每人每天食两餐所述配方米饭，持续一个冬季 (3个月)，其中仅2人患流感。同时，在未添加DNA的一组(12人) 中，8人患者流感。由此，鉴定了DNA的免疫调节活性。

实施例14

通过均匀地混合以下组分生产粉状配合饲料：65％白鱼粉39份、 大豆饼5份、维生素B1和其它维生素的混合物2份、钙、磷和其它 矿物质2份、羧甲基纤维素2份和实施例1中制得的DNA 0.1份。

实施例15

已知全身性硬皮病为自身免疫性皮肤病，并认为干扰素对其治 疗是有用的。采用用博莱霉素处理的硬皮病小鼠模型，检测实施例6 中制得的外用DNA制剂的治疗效应。

每个实验组为6周龄的雌性BALB/c小鼠6只。给两组小鼠的 背外侧皮下每天以10μg/0.1ml剂量给予博莱霉素4周。在皮下注射 博莱霉素的一组小鼠中局部涂抹所述外用DNA制剂，而皮下注射博 莱霉素的另一组局部涂抹作为对照的实施例6中的不含DNA的制 剂。从博莱霉素处理开始的5周内每天进行所述涂抹步骤一次。在 结束所述涂抹后的当天，测量所述皮肤的厚度。对照组测定值(2倍 皮肤厚度±SE(mm))为5.27±0.66，而所述DNA处理组测定值为4.13 ±0.39。即，在用含DNA制剂处理的组中观察到显著抑制所述硬皮 病。