김치유산균으로 발효된 쌀 및 이의 용도

申请号 KR1020120056298 申请日 2012-05-25 公开(公告)号 KR1020130132140A 公开(公告)日 2013-12-04
申请人 연세대학교 산학협력단; 发明人 윤선; 박혜원; 최혜정; 김정호;
摘要 The present invention relates to a rice fermented by lactic acid bacteria derived from Kimchi, Leuconostoc citreum or Lactobacillus plantarum. The rice according to the present invention, which is fermented by lactic acid bacteria derived from Kimchi, Leuconostoc citreum or Lactobacillus plantarum, inhibits the generation of mold involved in the spoilage of rice and enhances the aging process, thereby improving the storage capability of food.
权利要求
  • 김치유산균 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )으로 발효시킨 쌀.
  • 제 1항에 있어서,
    상기 류코노스톡 시트륨은 미생물 수탁번호 KCTC18204P인 것을 특징으로 하는 발효시킨 쌀.
  • 제 1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸은 미생물 수탁번호 KCTC 3928인 것을 특징으로 하는 발효시킨 쌀.
  • 제 1항에 있어서,
    상기 발효는 24~26℃에서 22~26시간 동안 발효시킨 것을 특징으로 하는 발효시킨 쌀.
  • 김치유산균으로 발효시킨 쌀가루를 포함하는 것을 특징으로 하는 저장성이 향상된 발효 식품.
  • 제 5항에 있어서,
    김치유산균은 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182, 미생물 수탁번호:KCTC18204P) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum , 미생물 수탁번호:KCTC 3928)인 것을 특징으로 하는 저장성이 향상된 발효 식품.
  • 제 5항에 있어서,
    상기 발효시킨 쌀가루는 24~26℃에서 22~26시간 동안 발효시킨 것을 특징으로 하는 저장성이 향상된 발효 식품.
  • 김치유산균으로 쌀가루를 발효시키는 단계; 및
    발효된 상기 쌀가루를 식품에 추가하는 단계를 포함하는 식품의 저장성을 향상시키는 방법.
  • 제 8항에 있어서,
    김치유산균은 바이셀라 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )인 것을 특징으로 하는 식품의 저장성을 향상시키는 방법.
  • 제 8항에 있어서,
    상기 류코노스톡 시트륨은 미생물 수탁번호: KCTC18204P인 것을 특징으로 하는 식품의 저장성을 향상시키는 방법.
  • 제 8항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸은 미생물 수탁번호: KCTC 3928인 것을 특징으로 하는 식품의 저장성을 향상시키는 방법.
  • 제 8항에 있어서,
    상기 쌀가루를 발효시키는 단계는 쌀가루는 24~26℃에서 22~26시간 동안 발효시킨 것을 특징으로 하는 식품의 저장성을 향상시키는 방법.
  • 김치유산균을 쌀가루에 접종하는 단계를 포함하는 식품의 곰팡이 생성을 억제시키는 방법.
  • 제 13항에 있어서,
    김치유산균은 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )인 것을 특징으로 하는 식품의 곰팡이 생성을 억제시키는 방법.
  • 제 13항에 있어서,
    상기 류코노스톡 시트륨은 미생물 수탁번호: KCTC18204P인 것을 특징으로 하는 식품의 곰팡이 생성을 억제시키는 방법.
  • 제 13항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸은 미생물 수탁번호: KCTC 3928인 것을 특징으로 하는 식품의 곰팡이 생성을 억제시키는 방법.
  • 제 13항에 있어서,
    상기 곰팡이는 Penicillium crustosum , Neurospora sp .Cladosporium sp . 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품의 곰팡이 생성을 억제시키는 방법.
  • 제 13항에 있어서,
    쌀가루를 24~26℃에서 22~26시간 동안 발효시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품의 곰팡이 생성을 억제시키는 방법.
  • 김치유산균을 쌀가루에 접종하는 단계를 포함하는 식품의 노화 억제를 증진시키는 방법.
  • 제 19항에 있어서,
    김치유산균은 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )인 것을 특징으로 하는 식품의 노화 억제를 증진시키는 방법.
  • 제 19항에 있어서,
    상기 류코노스톡 시트륨은 미생물 수탁번호: KCTC18204P인 것을 특징으로 하는 식품의 노화 억제를 증진시키는 방법.
  • 제19항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸은 미생물 수탁번호: KCTC 3928인 것을 특징으로 하는 식품의 노화 억제를 증진시키는 방법.
  • 제 19항에 있어서,
    쌀가루를 24~26℃에서 22~26시간 동안 발효시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품의 노화 억제를 증진시키는 방법.
  • 说明书全文

    김치유산균으로 발효된 쌀 및 이의 용도{RICE FERMENTED BY LACTIC ACID BACTERIA DERIVED FROM KIMCHI AND USES THEREOF}

    본 발명은 김치유산균으로 발효된 쌀 및 이의 용도에 관한 것이다.

    김치는 세계적으로 잘 알려진 발효 식품으로서 김치발효에 관여하는 유산균은 항균성, 항바이러스성 등 우수한 기능성이 연구되고 있지만, 김치 유산균을 이용한 기초 연구는 아직 미비한 실정이다. 김치유산균이란 흔히 발효 유제품 등을 만드는데 사용하는 락토바실러스속 유산균과 류코노스톡속과 바이셀라속 유산균들로 분리할 수 있다. 이 중 류코노스톡속과 바이셀라속은 식물성 발효 식품에서 많이 발견되는 데 특히 바이셀라 코렌시스나 류코노스톡 시트륨 등은 김치의 맛을 결정하는 우점종으로 알려져 있다. 이들 김치 유산균은 김치의 맛과 풍미를 증가시킬 수 있는 김치 스타터나 항 AI 효능이 입증되었고 그 연구가 진행되고 있다. 그렇지만 식품에 접목시키는 연구는 미비한 실정이다.

    한편, 떡은 우리나라 고유의 전통음식으로 예전부터 명절음식, 선물용음식, 제사음식 등으로 쓰여지고 있으며 밥을 대용할 수 있는 필수음식으로 자리잡고 있다. 떡은 실온이나 저온에서 저장할 경우 하루만 지나도 딱딱하게 굳어져 제 맛을 잃어버리게 되며 이것은 전분의 노화에 의해 조직감이나 맛이 저하되기 때문이다. 전분의 노화는 전분 분자가 가열을 통해 무정형 상태가 되었다가 온도가 떨어지면 다시 불용성의 결정형 상태로 돌아가는 것을 의미하며, 이는 아밀로오스가 규칙적으로 재배열되면서 분자에 수소결합이 연결되어 거대 결합물을 형성하기 때문에 일어나는 것으로 부분적으로 설명될 수 있다. 호화된 전분이 노화될 때 전분의 종류, 전분 내의 아밀로오스와 아밀로펙틴의 함량비, 분자크기, 온도, pH와 수분함량 및 첨가되는 물질 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받는다. 이런 저장 중 전분의 노화로 인한 경화현상은 떡류에 있어서 가장 큰 문제점이라고 할 수 있다. 빨리 굳는 단점으로 인하여 결과적으로는 품질의 저하를 가져오게 되며 제품을 산업화하는 것에 있어서 큰 제한이 될 수 있다. 따라서 떡의 노화를 지연시키는 연구는 중요한 과제라 할 수 있다.

    이에 본 발명자들은 김치 유산균의 종균을 이용한 새로운 발효식품을 개발하고자 노력한 결과, 김치유산균인 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum ) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )을 이용해 떡을 제조하여, 떡에서 발생하는 곰팡이의 발생을 억제시키고 떡의 저장성을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

    본 발명은 김치유산균인 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )을 쌀가루에 접종하는 단계를 포함하는 저장성이 향상된 쌀 식품을 제조하는 방법을 제공한다.

    상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 구체예에서 김치유산균 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )으로 발효시킨 쌀을 제공한다.

    다른 구체예에서 김치유산균으로 발효시킨 쌀가루를 포함하는 것을 특징으로 하는 저장성이 향상된 발효 식품을 제공한다.

    또 다른 구체예에서 김치유산균으로 쌀가루를 발효시키는 단계; 및 발효된 상기 쌀가루를 식품에 추가하는 단계를 포함하는 식품의 저장성을 향상시키는 방법을 제공한다.

    또 다른 구체예에서 김치유산균을 쌀가루에 접종하는 단계를 포함하는 식품의 곰팡이 생성을 억제시키는 방법을 제공한다.

    또 다른 구체예에서 김치유산균을 쌀가루에 접종하는 단계를 포함하는 식품의 노화 억제를 증진시키는 방법을 제공한다.

    본 발명에 있어서, 상기 김치유산균은 바이셀라 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )인 것을 특징으로 하고, 상기 류코노스톡 시트륨은 미생물 수탁번호:KCTC18204P인 것을 특징으로 하고, 상기 락토바실러스 플란타룸은 미생물 수탁번호:KCTC 3928인 것을 특징으로 한다

    또한, 상기 곰팡이는 Penicillium crustosum , Neurospora sp .Cladosporium sp . 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 ㅇ있고, 상기 발효시킨 쌀가루는 24~26℃에서 22~26시간 동안 발효시킨 것을 특징으로 할 수 있다.

    본 발명에서는 김치에서 분리해낸 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )를 이용하여 발효 쌀가루를 제조하고, 발효 쌀가루를 이용하여 제조한 떡의 조직감을 관찰하여, 유산균이 떡의 저장성에 미치는 영향을 항곰팡이성과 질감 변화를 통하여 확인할 수 있었다. 제조된 떡의 관능평가 결과, 유산균이 발효하면서 생성하는 유기산에 의해 시큼한 향과 맛이 느껴지긴 하지만 pH 5.0에서 발효를 중단하기 때문에 맛에 있어서 그 차이가 크지 않고 시간이 지나도 부드럽게 유지되며, 기호도에 긍정적인 영향을 준다는 것을 확인하였다.

    본 발명에서 '식품의 저장성'은 식품의 품질이 유통기간 동안 얼마나 잘 유지되는가를 나타내는 성질이다. 식품의 저장이란 변패를 억제하는 행위를 말하는데, 유통과정에서의 변패는 병원성 미생물의 증식과 품질(영양소, 향미, 조직감, 색깔)의 변질에서 비롯된다..

    본 발명에서 '유기산'은 유산균의 탄수화물 대사 최종산물로써 젖산, 아세트산이 주요 산물이다. 소수성 비해리 분자 형태로 유해한 미생물의 막을 침투하여 세포질의 pH를 낮추고 대사활동을 정지시킨다. 따라서 유기산은 식품 보존을 위해 사용할 수 있는 안전한 물질이다. 아세트산은 높은 해리상수를 갖기 때문에 항균성에 있어 젖산보다 효율적이나 아세트산 함량이 식품 내에 많아지면 관능 품질의 저하가 예상된다.

    본 발명에서 '식품의 노화'는 일 예로 식품의 굳기 정도가 높아지는 것으로, 전분의 노화는 전분질 재료를 주원료로 하는 모든 제품에 저장상 품질저하를 야기시킨다. 쌀이 주로 함유하는 전분은 아밀로오스와 아밀로펙틴으로 구성되어 있으며 물과 함께 가열 시 분자 간의 결합이 약해지면서 투명한 교질상태를 형성하며 호화가 일어난다. 호화된 전분 내의 아밀로오스와 아밀로펙틴의 노화로 경도가 증가하는 물리적 변화가 일어나 쌀 가공제품의 품질을 저하시키고 관능적 특성에도 영향을 주는 중요한 원인이 된다.

    본 발명에 따른 김치유산균 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum ) 또는 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum )을 이용하여 제조한 발효 떡은 떡의 부패에 관여하는 곰팡이의 생성을 억제하고 경도를 유지시켜 떡의 저장성을 향상시키는 효과가 있다.

    도 1 내지 4는 류코노스톡 시트륨의 항균효과를 나타내는 그래프이다.
    도 5 는 류코노스톡 시트륨을 첨가한 쌀반죽(a)과 무첨가 쌀반죽(b)의 저장 5일 후의 모습이다.
    도 6 내지 8은 락토바실러스 플란타룸의 항균효과를 나타내는 그래프이다.

    이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

    실시예

    실시예 1. 균주의 배양

    1-1: 유산균 배양

    김치에서 분리한 유산균 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182, 미생물 수탁번호:KCTC18204P)을 인하대 생명과학과에서 받아 실험에 사용하였다. 류코노스톡 시트륨을 1%(v/v)을 MRS(difco MRS Broth, Becton, Dickinson and Co., Sparks, USA) 액체배지 10ml에 접종하여 25℃ 인큐베이터에서 24시간 간격으로 2번 활성 시킨 후 최대활성시간 18시간을 배양하여 사용하였다.

    또한, 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum , 미생물 수탁번호:KCTC 3928)은 ㈜셀바이오텍에서 동결건조한 균을 구입하여 사용하였다(제품번호:LPL-CBT-090).

    1-2: 곰팡이 배양

    인하대 생명과학과에서 떡으로부터 분리 동정한 Penicillium crustosum, Neurospora sp. , Cladosporium sp . 세 종류를 본 실험에 사용하였다. 곰팡이의 분리를 위하여, 100 g 쌀가루, 10 g 설탕, 1 g 소금 및 20 ml 수도물을 섞고 20분간 찐 백설기를 상온에서 식힌 후, 랩으로 싸고 10개의 구멍을 낸 후 곰팡이가 자랄 때까지 상온에 보관하였다. 쌀가루는 롤밀(roll mill)을 사용하여 실험실에서 제조하였다. 분리된 곰팡이는 PDA (potato dextrose agar) 배지에서 3번 계대 배양하여 순수 분리되었다. 그 후, 분리된 곰팡이의 동정은 rDNA 서열 및 B-tubulin 유전자 서열을 이용하여 이루어졌다. rDNA 서열 증폭에는 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 및 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-3') 프라이머가 사용되었고, B-tubulin 유전자 증폭에는 Bt2a (5'-GGTAACCAATCGGTGCTGCTTTC-3'), Bt2b (5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3') 프라이머가 사용되었다. 곰팡이는 각각 Cladoporium sp. ( C. sphaerospermum ITS와 99.6% 일치, B-튜불린과는 85% 일치), Penicillium crustosum (rDNA ITS 및 B-tubulin 유전자 모두 100% 일치함) 및 Neurospora sp . ( Neurospora sitophila ITS와 100% 일치; B-tubulin 서열 비교는 가능하지 않음)로 동정되었다.

    각각의 곰팡이를 7일간 PDA 배지에 배양하였고, 10ml의 1% tween 80을 포자 위에 부어준 뒤 포자를 채취하여 멸균된 거즈로 걸러주었다. 걸러진 포자 현탁액은 50% 글리세롤과 8:2의 비율로 섞어 -80℃에 보관하며 사용하였다.

    실시예 2. 쌀반죽의 제조 및 발효

    2-1: 쌀가루의 제조

    쌀은 시중에서 판매하는 추청미(임금님표 이천쌀, 대월농협, 경기도, 한국)를 구매하여 사용하였다. 쌀을 수돗물로 3번 씻어 준 뒤 4시간 동안 상온에서 수침하였다. 이후 30분 동안 가로 세로 0.8mm의 체를 이용해 물기를 빼 주었고 roll mill(쌀가루 분쇄롤러, 삼우떡기계, 한국)로 2 번 분쇄한 후 백설기 자동체(삼우기계, 한국)로 2 번 내려 쌀가루를 제조하였다. 쌀가루는 500g씩 진공포장지(25cm*25cm, 청비화학, 한국)에 담아 80% 진공으로 포장(confezionatrici-packaging machines, tecnovac, italy) 한 뒤에 -20℃ 냉동고 (MICOM control system, woo sung, 한국) 에 보관하며 사용하였다.

    2-2: 쌀반죽의 발효

    상기 실시예 2-1에서 제조한 쌀가루는 사용 전 25℃ 항온기(BOD incubator J-IB03, 제일과학산업, 서울, 한국) 에 3시간 동안 넣어 온도를 일정하게 맞춰주었다. 쌀가루 100g에 대해 10g의 설탕(백설 하얀 설탕, CJ제일제당, 한국), 1g의 소금(백설 꽃소금, CJ제일제당, 한국)과 35g의 수돗물을 첨가하여 쌀반죽을 만들었다. 상기 실시예 1-1의 균주는 원심분리 (8000g, 10min, 4℃)하여 회수하고 쌀 반죽 1g 당 1*10 6 CFU에 해당하는 균 체를 쌀 반죽에 첨가하였다. 접종한 쌀 반죽은 24시간 동안 25℃ 항온기에서 항온 정치시켰다.

    대조군으로는 상기 실시예1-1의 균주를 첨가하지 않고 24시간 동안 자연발효시킨 샘플(대조군 1,2) 과 실시예1-1의 균주를 첨가하지 않고 발효시키지 않은 샘플(대조군 3,4)이 사용되었다. EPS, 수분결합력, 수분용해도, RVA 측정을 위해 쌀반죽을 동결건조하고 분쇄하여 진공포장한 뒤 -20℃에 저장하며 사용하였고, 이중 아가 플레이트(dual agar plate)를 위해 쌀반죽을 증류수로 10배 희석하여 균질화한 뒤에 사용하였다(표 1 참고).

    접종 유산균 발효 형식
    제조예 1 류코노스톡 시트륨( Leuconostoc citreum D2-182, 미생물 수탁번호:KCTC18204P) 유산균 접종 후 발효
    대조군 1 X 자연발효
    대조군 3 X 비발효
    제조예 2 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum , 미생물 수탁번호:KCTC 3928) 유산균 접종 후 발효
    대조군 2 X 자연발효
    대조군 4 X 비발효

    실시예 3. 발효 쌀반죽의 저장성 확인

    3-1: pH 및 산도 측정

    실시예2-2의 발효쌀반죽을 증류수에 10배 희석시킨 후 교반하며 pH와 산도를 측정하였다. pH는 pH 미터를 사용하여 측정하였으며, 적정산도는 0.1N NaOH 표준용액을 이용하여 pH 8.2 가 되는 지점으로 중화 적정하여 측정하였다.

    쌀반죽을 발효하는 동안 pH 및 산도의 변화는 표 2와 같았다.

    최초 pH 최종 pH 최초 산도(%) 최종 산도(%)
    제조예 1 6.68 5.45 0.09 0.25
    대조군 1 6.68 4.61 0.09 0.32
    제조예 2 6.6 5.56 0.23 0.24
    대조군 2 6.6 4.72 0.23 0.35

    두 종류의 유산균을 접종한 쌀반죽의 경우 pH는 6.6~6.7에서 24시간 이후 4.6~4.7까지 떨어져 자연발효군에 비해 더 낮았으며 산도는 0.01~0.23%에서 24시간 이후 0.32~0.36%까지 증가하여 자연발효군에 비해 더 높은 것으로 나타났다.

    3-2. 유기산의 정량

    유기산을 정량하기 위해 실시예2-2의 발효쌀반죽과 증류수를 1:1로 혼합한 뒤 진탕배양기(Model IS-971R, JELO Tech., Seoul, Korea)에서 교반(150rpm, 4℃, 2h)하고 원심분리(8000g, 4℃, 10min)하여 상등액을 회수하였다.

    가. 류코노스톡 시트륨 첨가 쌀반죽

    상등액을 -20℃에 보관하고 실험 시 해동하여 유기산과 당분석의 시료로 사용하였다. 쌀반죽의 D,L-젖산, 아세트산 함량은 kit(Boehringer Mannheim/R-Biopharm, Darmstadt, Germany)를 사용하여 측정하였고 당 농도는 HPLC으로 분석하였다.

    쌀반죽의 젖산 및 아세트산 함량 측정 결과는 표 3과 같다. 발효 0시간 시료는 젖산 및 아세트산 함량이 측정되지 않았다. 자연발효군에 비해 유산균 발효한 시료에서 유기산 함량이 높았다.

    젖산(mM/kg) 아세트산(mM/kg)
    대조군1 8.33±0.16 a 1.00±0.00 a
    제조예1 23.86±1.57 e 4.83±0.71 bc

    값=평균±표준편차

    * FQ : 젖산과 아세트산의 몰비

    각각의 첨자 평균은 통계학적 유의성이 없음 (p<0.05)

    나. 락토바실러스 플란타룸 첨가 쌀반죽

    상등액을 0.45μm Acrodisc syringe filter(Pall Co., Ann Arbor, USA)로 여과한 후 -80℃에 보관하며 시료로 사용하였다. D,L-젖산, 아세트산은 각각을 측정할 수 있는 키트(Boehringer Mannheim/R-Biopharm, Darmstadt, Germany)를 사용하여 측정하였다.

    표 4에서와 같이 대조군에 비해 유산균 발효한 시료에서 유기산 함량이 높았다.

    젖산(mM/kg) 아세트산(mM/kg)
    대조군 2 0.23±0.007 a ND
    제조예 2 26.42 ±0.509 c 2.49 ±0.275 a

    abcd 각각의 첨자는 통계학적 유의성이 없음(p<0.05).

    아세트산은 대조군에서는 검출되지 않았고 유산균발효군에서 2.4~2.6μmol/g 정도 검출되었다.

    상기의 결과로 보아, 제조에 1 및 2의 쌀반죽은 대조군 보다 유기산 함량이 높아 pH를 낮추고 대사활동을 정지시켜 식품 보존을 위해 사용할 수 있을 것이라 판단된다.

    실시예 4. 곰팡이 저해 효과 확인

    4-1. 류코노스톡 시트륨 첨가 쌀반죽 및 배양액

    유산균 배양액을 원심분리(8000g, 4℃, 10min)하여 상층액을 분리하였다. Cladosporium sp ., Penicillium crustosum Neurospora crassa 포자현탁액(10 4 spore/ml)을 10ul 유산균 상층액 190ul에 접종하여 25℃ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양한 후 580nm에서 흡광도를 측정하였다. 유산균이 없는 MRS 액체배지에서 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 control OD 값을 얻고 다음의 식에 대입하여 포자발아율 감소(%)를 계산하였다.

    % inhibition = 100 - [(sample OD / control OD) * 100]

    유산균 배양액에 100℃, pH, 프로테이나제 K 처리를 하여 유산균 배양액의 항균성에 미치는 영향을 알아보았다. 열처리는 유산균 배양액을 100℃에서 10분간 처리하였고, pH에 의한 항균성의 변화는 4M HCl 용액, 4M NaOH 용액에 의해 배양액의 pH를 3.5와 6.0으로 각각 조절하여 포자발아율 억제를 측정하였다. 단백질 분해 효소에 의한 항균성 변화를 알아보기 위해 pH 7.6으로 조절한 유산균 배양액에 프로테이나제 K를 10unit/ml으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 초기 pH으로 조절하였다. 열처리, pH, 프로테이나제 K 처리한 유산균 배양액의 항균성 역시 위의 포자발아율을 측정하는 식으로 계산하였다.

    류코노스톡 시트륨의 배양액은 Cladosporium sp ., Neurospora crassa 에 대해 87% 이상 저해하였으나 Penicillium crustosum 에 대해서는 60% 정도 저해하는 것으로 나타났다(도 1 내지 3 참고). 100℃ 처리군은 Cladosporium sp ., Neurospora crassa 에 대해 무처리군과 유의적으로 동일한 항균력을 지녔으나 Penicillium crustosum 에 대해서는 무처리군보다 낮은 저해성을 나타냈다. 프로테이나제 K 처리에 대해서는 세 종류 곰팡이 모두 무처리군과 유의적으로 동일한 항균력을 나타내어 유산균의 항균성 물질은 단백질이 아닌 것이 확인되었다. 세 종류 곰팡이 모두 pH 6 처리군에서 가장 낮은 항균성을 보였고 pH 3.5에서는 이보다 높은 항균성을 나타냈지만 무처리군 보다 낮게 측정되었다. 상기 류코노스톡 시트륩 배양액 처리군과 무처리군의 곰팡이 저해효과를 도 4에 함께 나타내었다. 역시 유산균 배약액이 첨가된 배지에서 곰팡이가 잘 자리지 못한 것을 알 수 있었다.

    류코노스톡 시트륨을 첨가한 발효반죽에서의 곰팡이 저해효과를 알아보았다. 그 결과는 표 5 및 도5에 나타내었다.

    저장기간(일)
    0-3 4 5 6-7 8-9
    제조예 1 - - - + ++
    대조군 1 - - + ++ +++
    대조군 3 - - + ++ +++
    비교예 1 1) - - + ++ +++

    -: 곰팡이가 관찰되지 않음.

    +: 곰팡이가 쌀반죽 표면의 30% 이하로 관찰됨

    ++: 곰팡이가 쌀반죽 표면의 30-50% 로 관찰됨

    +++: 곰팡이가 쌀반죽 표면의 50% 이상 관찰됨

    1) : 유산균(류코노스톡 시트륨) 접종 ○, 발효 X

    상기 표 5에서 알 수 있듯이 대조군 1, 3 및 비교예 1에 비하여 제조예 1에서 곰팡이의 생성이 더딘 것을 알 수 있었다. 즉, 유산균인 류코노스톡 시트륨의 첨가 및 발효가 함께 이루어진 것이 유산균 첨가만 시행한 것과 발효만 시행한 것, 또는 둘 다 시행하지 않은 것에 비하여 곰팡이 저해효과가 현저하게 나타났다.

    4-2. 락토바실러스 플란타룸 첨가 쌀반죽

    발효반죽에서의 Penicillium crustosum , Neurospora sp .Cladosporium sp. 곰팡이의 성장을 보기 위해 듀얼 아가플레이트 에세이를 실행하였다. 발효반죽 현탁액 150ul을 0.7% agar 를 포함한 MRS 반고체 배지 15ml에 섞어 9cm 플레이트에 부어 굳혀준 뒤 24시간 동안 25℃ 항온기에서 배양하고 클로람페니콜(10mg/ml)과 에리트로마이신(3mg/ml)을 에탄올에 희석시킨 항생제 100ul을 도말하여 유산균이 더 이상 자랄 수 없도록 해주었다. 1시간 동안 말려준 뒤 PDA(Potato Dextrose Agar) 반고체 배지 15ml을 그 위에 덮어주고 굳혀주었다. 그 후 Penicillium crustosum, Neurospora sp . Cladosporium sp . 포자 현탁액을 10 5 spore/ml로 맞추어 5ul를 중앙에 떨어뜨려 흡수되도록 하였다. 결과는 25℃ 항온기에 배양하면서 자라는 곰팡이의 지름을 매일 측정해 그래프로 나타내었다.

    발효 반죽의 항균활성 측정 결과, 세 곰팡이 모두에 대해서 유산균발효군의 경우 10일 이상 100%의 곰팡이 저해효과를 관찰할 수 있었다(도 6 내지 8 ). 대조군 반죽에서는 모든 곰팡이 spore의 성장이 관찰되었고, 시간이 경과하자 플레이트를 가득 메워 10일째 측정을 중단하였다. 그러나 유산균 발효군은 20일이 지나도 곰팡이의 성장이 관찰되지 않았다.

    실시예 5. 노화 억제의 확인

    쌀반죽의 호화점도는 신속점도측정계(AV/RVA-4, Newport scientific, Irvine, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료로는 대조군과 발효군 반죽을 이틀간 동결건조하고 분쇄한 뒤 진공포장을 하여 -20℃에 저장하며 사용하였다. 동결건조한 발효쌀반죽 3g 과 증류수 25ml를 혼합하여 50℃에서 960rpm으로 1.5분간 작동하고 160rpm, 12℃/min의 속도로 95℃까지 올려 2분간 작동한다. 그 다음 12℃/min 속도로 50℃까지 내려 2~6분간 작동하여 쌀반죽의 점도를 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 6과 같다.

    Pasting Temp
    (℃)
    최고점도(Peak Time)
    (min)
    최고점도(Peak 1)
    (cP)
    Trough 1
    (cP)
    최종점도(Final Visc)
    (cP)
    전분입자파괴정도(Breakdown)
    (cP)
    노화정도(Setback)
    (cP)
    대조군 3
    65.68
    ±0.81 cd
    7.09
    ±0.02 d
    2597
    ±4.95 e
    2379
    ±30.41 e
    3353
    ±24.04 d
    233
    ±4.24 a
    747
    ±4.95 b
    제조예 1 62.95
    ±0.57 a
    6.50
    ±0.14 a
    2094
    ±41.01 d
    1490
    ±134.35 cd
    2406
    ±140.01 c
    604
    ±93.34 e
    312
    ±98.99 a
    대조군3 대비 제조예1 96% 92% 81% 63% 72% 259% 42%
    대조군 4 89.33
    ±0.46 a
    7.70
    ±0.04 b
    197.46
    ±1.82 d
    186.42
    ±2.35 d
    253.75±5.06 c 11.05±0.53 ab 67.34±2.71 bc
    제조예 2 89.65
    ±1.06 a
    7.50
    ±0.04 ab
    179.29
    ±10.55 bc
    165.30
    ±9.72 bc
    226.88±7.13 b 14.00±0.82 b 61.59±2.60 ab
    대조군4 대비 제조예2 100% 97% 91% 89% 89% 127% 91%

    Peak time은 최고 점도에 도달하는데 걸리는 시간을 말하는데, 이 값은 유산균접종군이 대조군보다 낮아 유산균을 접종하여 발효했을 때 더 빨리 최고 점도에 도달한다는 것을 알 수 있었다. 유산균발효를 할 경우 모든 군에서 호화 시 최고 점도(Peak 1)가 유의적으로 낮아졌다. Trough 1은 전분입자가 호화되어 팽윤된 다음 95℃에서 유지시킬 때의 점도를 의미하는데 유산균접종군이 대조군보다 유의적으로 낮았다. 한편 Final Viscosity는 대조군에 비해 모든 유산균발효군에서 감소하는 경향을 보였다. Breakdown 값은 Peak 1에서 Trough 1를 뺀 값으로, 호화 중 전분의 열과 전단(shear)에 의한 저항을 나타내는 값이다. 본 실험에서는 대조군에 비해 유산균 접종군이 유의적으로 더 높게 나타났는데 이는 유산균접종군에서의 입자 파괴가 더 많이 일어났다는 것을 의미하기도 한다. Setback은 Final viscosity에서 Trough1을 뺀 값으로 팽윤된 쌀 전분이 식는 동안에 단단해지는 정도를 측정한 값으로 전분의 노화경향을 반영하는데 값이 높을수록 노화가 더 많이 진행되었음을 의미한다. 결과를 보면 모든 유산균접종군에서 대조군에 비해 유의적으로 노화가 지연되었음을 확인할 수 있었다.

    지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

    한국생명공학연구원

    KCTC18204P

    20110315

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