New Leuconostoc shea Torre Umm and this fermented food and compositions used in starter {NovelLeuconostoccitreum, fermentationfoodsandcompositionscomprisingthesame}

本発明は新規のロイコノストック シトレウム菌株及びこれをスタータで使った醗酵食品、及びこれを含む組成物に係り、より具体的には冬季キムチの味品質水準の醗酵風味を年中誘導することができるし、特に夏期の醗酵品質低下を効果的に制御できる新規のロイコノストック シトレウム菌株及びこれをスタータで使った醗酵食品及びこれを含む組成物に関する。

キムチは多様な野菜類を塩漬けにして、混合して、自然醗酵させる我が国の代表的な野菜醗酵食品である。 この中で代表的なキムチはハクサイを主材料でする'漬けたキムチ'で晩秋または初冬に刈り取ったハクサイ、ダイコンを塩漬けにして、ニンニク、ショウガ、ネギなどを副材料で混合して漬けて土に埋めておいて、冬の間食べてきた（非特許文献１）。 このように漬けたキムチは食品保存法中で塩漬けと醗酵法を利用して野菜の生産にならない冬季の間低温で野菜を保存して、炭素源、アミノ酸、ビタミンの供給源で利用してきた低温醗酵貯蔵食品で原料に由来した固有の乳酸菌による醗酵と熟成を通じて豊富な発効風味を持つようになる。

しかし現代にきては品種改良と栽培技術の発達で年中ハクサイをはじめとする原料らが生産、貯蔵されてキムチを漬ける季節以外にもハクサイ キムチの製造が可能になったし、冷蔵庫とキムチ専用冷蔵庫の普及でいつでも冬と同じ低温醗酵貯蔵が可能になって、伝統的な漬けたハクサイキムチとは差がある。

キムチ品質は、基本的には年中出荷されるハクサイを含んだ多様な原料の品質による影響をたくさん受けることになってキムチを商品化する企業立場ではこれによる年中品質の変化は消費者に均一な品質を提供することにおいて大きい障害物になっている。 特に夏期（６月〜８月）に生産されるキムチにおいて冬と同じ醗酵熟成管理をしても原料の品質的な問題と醗酵熟成風味の低下で他の時期との品質偏差が激しくて顧客から品質低下に対する多様なクレームが発生することは関連業界の周知の事実である。

このような問題を解決するために従来の技術を調べれば多様な微生物、主に乳酸菌をスタータ（ｓｔａｒｔｅｒ）で添加することによってキムチの品質を制御しようと思ったことが分かる（特許文献１、特許文献２、特許文献３など）。 しかし既存の方法らは年中発生する品質の変化に対する明確な糾明を通した問題の改善というより単純に品質改善を企てようとスタータを適用したし、官能品質にも明示されなかった非特定時期の全般的な味品質の差だけを確認するなど夏期の品質改善に集中して品質低下の原因を分析して問題点を改善しようとする事例はなかった。

一方キムチ乳酸菌のロイコノストック キムチアイ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｋｉｍｃｈｉｉ）、ロイコノストック シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）、ロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストックック ガシコミタタム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇａｓｉｃｏｍｉｔａｔｕｍ）、ロイコノストック ラクチス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラス プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔ ａｒｕｍ）、ラクトバシラス サケアイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）等が単独または複合で多様な醗酵食品製造に使われてきた。

これらの中ロイコノストック シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）菌株はキムチの熟成に関与して、特に砂糖を利用して高分子粘質物のデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）を生産する能力があると知られていて（特許文献４）、アトピー性皮膚炎の治療および予防に効果があると明らかになったことがある（特許文献５）。 これと関連して特許文献６にデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）を生産するロイコノストック シトレウムＳ５菌株およびこれを利用したデキストラン含有醗酵物の製造方法が開始されていて、特許文献７に６． マンニトル生産陵を持つロイコノストック シトゥリウムおよびこれを利用してマンニトールを生産する方法が開示されている。

これに、本発明者などは年中ハクサイ キムチの醗酵パターンを分析して醗酵品質変化に影響を及ぼす乳酸菌群集の変化と有機酸の変化をモニタリングしたし、これを通じて、年中品質を改善して安定化させるのに冬季おいしい時期に分離する乳酸菌が年中一定の醗酵品質のキムチを製造するのに有効な役割をすることを知ったし、冬季キムチの味品質水準の醗酵風味を年中誘導することができるし、特に夏期の醗酵品質低下を効果的に制御できる新規のロイコノストック属乳酸菌菌株を分離、同定して本発明を完成することになった。

したがって、本発明の目的は、キムチにスタータで利用して冬季キムチの味品質水準の醗酵風味を年中誘導することができるし、特に夏期の醗酵品質低下を効果的に制御できる新規のロイコノストック属乳酸菌菌株を提供することである。

本発明の他の目的は、前記新規のロイコノストック属乳酸菌菌株をスタータで使った醗酵食品を提供することである。

本発明のまた他の目的は、前記新規のロイコノストック属乳酸菌菌株を含む菌体組成物を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＣＪＧＮ３４）（寄託官署：生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、寄託日時：２００６．０７．２７、受託番号：ＫＣＴＣ １０９７４ＢＰ）を提供する。

また、本発明は、前記ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４を有効成分で含有する食品醗酵用スタータ組成物を提供する。

また、本発明は、前記スタータ組成物を使って製造したキムチを含んだ醗酵食品を提供する。

また、本発明は、前記ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４を有効成分で含有する乳酸菌組成物を提供する。

本発明において、“有効成分”というのは内在した薬理作用によって、その医薬品の効能・効果を直接または間接的に発現すると期待される物質または物質郡（薬理学的活性成分などが明らかにならなかった生薬などを含む）として主成分を含むのを意味する。

前で説明した通り、本発明にともなう新規ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、キムチを含んだ醗酵食品にスタータで使う場合全般的な味品質を向上させて、冬季製造方式の伝統的な製法のキムチ固有の複雑な酸味と炭酸味を上昇させて年中醗酵品質を一定に維持して特に味品質が低下する夏期の醗酵品質低下を効果的に制御するのに効果がある。 また本発明にともなう新規ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、菌体組成物を製造して前記のキムチを含んだ醗酵食品に適用してスタータで活用したり、担体または添加剤などを混合して錠剤、カプセルなどの医薬品、食品用生菌剤で活用したり、化粧品に使われる原料に一定量を混合することによって医薬品、食品、飼料、化粧品など多様な分野に当該技術分野で通常の方法により活用することができる。

キムチ製造時期にともなう全般味点数平均を示したグラフである。

キムチ製造時期にともなう醗酵菌総の変化比率を示したグラフである。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明にともなうロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕ ｍ ＣＪＧＮ３４）は、キムチから分離および同定されたロイコノストック シトレウムの新規な菌株であることを特徴とする。 前記菌株は、冬キムチを漬ける季節に製造したハクサイ キムチから分離したが関連菌株の分離範囲がこれに限定されるのではない。

本発明のロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、微生物の同定および分類のための１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列分析結果ロイコノストック シトレウム標準菌株（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＫＣＴＣ ３５２６Ｔ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１１１９４８）と最も高い相同性（９９．７％）を現わして、ロイコノストック シトレウムと最も高い分子系統学的柔軟関係を見せた。 したがって前記微生物をロイコノストック シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）で同定して、ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４で命名したし、生命工学研究院遺伝子銀行に２００６年７月２７日付で寄託した（受託番号ＫＣＴＣ １０９７４ＢＰ）。

本発明のロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、クラム陽性菌であり、好気的条件と嫌気的条件で皆成長が可能な通性嫌気性（ｆａｃｕｌｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｅ）であり、胞子を形成しないで運動性がなくて細胞の形態は単一または双球菌である。 ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４のより具体的な形態および生理学的特性は、当該技術分野の通常の方法によって分析した結果下記の表１と同じであることが明らかになった。

本発明のロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、長期間安定的に保存するためには水にグリセロール成分を一定量混合して作った保管溶液に菌体を解いて−７０℃で保管したり滅菌された１０％脱脂乳に懸濁して凍結乾燥することが望ましい。

また、本発明のロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、自然醗酵したキムチから分離した乳酸菌で人に危害がないＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）菌株に分類されて安全性と関連したゼラチン液化反応検査、フェニルアラニン脱アミン生成検査、アンモニア生成検査、溶血性実験検査などを自主的に遂行した結果ゼラチン液化反応検査、フェニルアラニン脱アミン生成検査よびアンモニア生成検査、溶血性実験検査皆で陰性が確認されて食品に使用できる安全な菌であることが確認された。

本発明にともなうロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、キムチを含んだ醗酵食品にスタータで使う場合全般的な味品質を向上させて、冬季製造方式の伝統的な製法のキムチ固有の複雑な酸味と炭酸味を上昇させて、年中醗酵品質を一定に維持して特に味品質が低下する夏期の醗酵品質低下を効果的に制御するのに助けを与えることができる。 また以上の菌株を含む菌体を培養後回収して菌体組成物を作れるし、このような組成物は、飼料に原料で使われる穀物粉と混合して飼料用生菌剤で活用したり、担体または添加剤などを混合して、精製、カプセルなどの医薬品、食品用生菌剤で活用したり、化粧品に使われる原料に一定量を混合することによって医薬品、食品、飼料、化粧品など多様な分野に当該技術分野で通常の方法により活用することができる。

また本発明にともなうロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、乳酸菌薬学組成物に利用されることができる。 このような場合には、当該技術分野に公知されている通常の薬剤学的剤形で製剤化されることができる。 前記医薬品は好ましく経口剤形製剤化されるし、例えば液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、またはエキス剤のような経口投与用剤形で製剤化されることができる。

前記それぞれの剤形で製剤化時、それぞれの剤形の製造に必要な薬剤学的に許容可能な担体または添加剤を付加して製造することができる。 代表的に経口投与用剤で製剤化時前記担体として希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩解剤、甘味剤、安定剤および防腐剤中で１種以上を選択して使えるし、添加剤では、香料、ビタミン類および抗酸化剤中で１種以上を選択して使うことができる。

前記担体および添加剤は、薬剤学的に許容可能になることは皆可能で、具体的に希釈剤では、乳糖、とうもろこし澱粉、大豆油、微晶質セルロースまたはマンニトール、滑沢剤ではステアリン酸マグネシウムまたはタルク、結合制ではポリビニルピロリジンまたはヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。 また、崩解剤ではカルボキシメチルセルロースカルシウム、澱粉グリコール酸ナトリウム、ポラクリリンカリウムまたはクロスポビドン、甘味剤では白糖、果糖、ソルビットールまたはアスパルテーム、安定剤ではカルボキシメチルセルロースナトリウム、ベータサイクルロデキストリン、白ろうまたはキサンタンガム（Ｘａｎｔｈａｎ Ｇｕｍ）、防腐剤ではパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸カリウムが好ましい。

また、前記成分以外にも公知の添加剤として味覚を向上するために、梅の実香、レモン香、パイナップル香、ハーブ香などの天然香料、天然果汁、クロロフィリン、フラボノイドなどの天然色素、果糖、蜂蜜、糖党アルコール、砂糖と同じ甘味成分またはくえん酸、くえん酸ナトリウムと同じ酸味剤を混合して使うこともできる。

このような製剤化方法および製剤化時必要な担体および添加剤に対してはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

また本発明にともなうロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、乳酸菌食品組成物として利用されることができる。 前記食品組成物は、健康機能食品だけでなく人間が広く通常的に毎日摂取する一般的な食品を含むことである。 健康機能食品として利用される場合食品学的に許容可能な担体または添加剤とともに当該技術分野に公知されている通常的の健康機能食品の剤形で製剤化されることができる。 前記健康機能食品は、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ剤、液剤、エキス剤、茶、ゼリーまたは飲み物などで製造されることができる。 食品学的に許容可能な担体または添加剤は製造しようと思う剤形の製造に当該技術分野で使用可能になることで公知されている任意の担体または添加剤が利用されることができる。

また本発明にともなうロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）という含湿性（ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ）が高いポリマーを含有することがあるので乳酸菌化粧料組成物として利用されることもできる。 前記本発明にともなう化粧料組成物の場合には当該化粧品技術分野に公知されている通常の剤形の多様な化粧品で製造されることができる。 前記それぞれの剤形で製剤化時、それぞれの剤形の製造に必要な化粧品の製造に許容可能な担体または添加剤を付加して製造することができる。

また本発明にともなうロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、乳酸菌飼料添加剤または飼料組成物として利用されることができる。

飼料添加剤として利用される場合、前記組成物は２０ないし９０％高濃縮液だとか粉末または顆粒形態で製造されることができる。 前記飼料添加剤はくえん酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、りんご酸などの有機酸や燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、酸性ピロ燐酸塩、ポリ燐酸塩（重合燐酸塩）等の燐酸塩でも、ポリフェノール、カテキン、アルファ−トコフェロール、ローズマリ抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトーサン、タンニン酸、フィチン酸などの天然抗酸化剤中いずれか一つまたは一つ以上を追加で含むことができる。 飼料として利用される場合、前記組成物は通常の飼料形態で製剤化されるし、通常の飼料成分を共に含むことができる。

前記飼料添加剤および飼料は、穀物、例をあげれば粉砕または破砕された小麦、燕麦、麦、とうもろこしおよび米；植物性蛋白質飼料、例をあげれば油菜、豆およびひまわりを主成分でする飼料；動物性蛋白質飼料、例をあげれば血分、肉粉、骨粉および魚粉；糖分および乳製品、例をあげれば各種粉乳および乳漿粉末で成り立つ乾燥成分などをさらに含めるし、以外にも栄養補充剤、消化および吸収向上剤制、成長促進剤などをさらに含むことができる。

前記飼料添加剤は、動物に単独で投与したり食用担体中で他の飼料添加剤と組み合わせて投与することもできる。 また、前記飼料添加剤は、トップ ドレッシングとしてまたはこれらを動物飼料に直接混合したりまたは飼料と別途の経口剤形で容易に動物に投与することができる。 前記飼料添加剤を動物飼料と別に投与する場合、当該技術分野によく知らされた通り薬剤学的に許容可能な食用担体と組み合わせて直ちに放出または徐放性剤形（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で製造することができる。 このような食用担体は、固体または液体、例えばとうもろこし澱粉、ラクトース、スクロース、豆フレーク、ピーナツ油、オリーブ油、ごま油およびプロピレングリコールでありうる。 固体担体が使われる場合、飼料添加剤は錠剤、カプセル剤、散剤、トローキ（ｔｒｏｃｈｅ）またはロジンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）または未分散性形態のトップ ドレッシングでありうる。 液体担体が使われる場合、飼料添加剤はゼラチン軟質カプセル剤またはシロップ剤や懸濁液、エマルジョン剤または溶液剤の剤形でありうる。

前記飼料は、動物の食餌欲求を充足させるのに通常的に使われる任意の蛋白質−含有有機穀粉を含むことができる。 このような蛋白質−含有穀粉は通常的にとうもろこし、豆穀粉またはとうもろこし／豆穀粉ミックスで主に構成されている。

また、前記飼料添加剤および飼料は補助剤、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進剤などを含有することができる。 前記飼料添加剤は、浸注、噴霧または混合して動物の飼料に添加して利用されることができる。

本発明の飼料または飼料添加剤は、哺乳類、家禽および魚類を含む多数の動物食餌に適用することができる。 前記哺乳類として豚、牛、羊、やぎ、実験用齧歯動物および実験用齧歯動物だけでなく愛玩動物（例：犬、猫）等に使えるし、前記家禽類として鶏、七面鳥、鴨、がちょう、きじおよびうずらなどにも使用できて、前記魚類として鱒などに利用されるが、これに限定されるのではない。

以下、本発明を下記実施例によってより具体的に説明する。 しかし、これら実施例は本発明に対する理解を助けるためのものだけで、どんな意味でも本発明の範囲がこれらによって制限されるのではない。

実施例１：年中キムチ品質変化モニタリングを介した改善ポイント導出およびＧＮ３４菌株の分離
年中キムチの品質変化をモニタリングして品質変化の原因を把握して改善するために年中キムチ品質の変化を確認した。

キムチは、ＣＪ第一製糖の製造方法により製造したキムチを使ったし、３月−５月１５日製造されたキムチを春キムチ、５月１６日−８月に製造されたキムチを夏キムチ、９月−１１月１５日に製造されたキムチを秋キムチ、１１月１６日−２月末に製造されたキムチを冬キムチで区分した。

各時期のキムチの官能品質を５点尺度法を使って分析した味品質の結果を確認した結果他の季節に製造したキムチの全般味が平均３．８−４．０程度が維持されることに比べて、夏キムチで全般味が３．５水準で低下する特徴が確認された。 前記の結果を図１に示した。

前記のような年中味品質の変化に醗酵微生物が及ぼす影響を分析するためにチェなど（Ｃｈｏｉ ｅｔ． ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｏｂｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｋｉｍｃｈｉ、ａ ｆｅ ｒｍｅ ｎｔｅｄ ｃａｂｂａｇｅ、ＦＥＭＳ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｌｅｔｔ．、Ｖｏｌ． ２５７、２００６、ｐａｇｅｓ ２６２−２６７）の方法で１６Ｓ ｒＲＮＡ分析を介して同定をした。 その結果伝統的に越冬用キムチを漬けてきたし、味品質に最も優秀な時期の冬に製造したキムチは絶対異形醗酵（ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｈｅｔｅｒｏ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）をして、糖を利用して、乳酸以外の多様な酸を生成してガスを出すロイコノストック属が８０％以上として検出されたし、冬キムチの複雑な醗酵風味と炭酸味を出すのに主要な役割をすると確認された。 反面醗酵品質低下が発生する夏に製造したキムチでは偏性異形醗酵（ｐａｒｔｉａｌ Ｈｅｔｅｒｏ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）または同形醗酵（Ｈｏｍｏ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、すなわち一般的な環境では糖を利用して乳酸だけを生成してガスを出さないラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のラクトバシラス サケアイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバシラス クルバツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバシラス プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と同じ菌の比率が５０％以上で他時期に製造したキムチに比べて高まることが確認されたし、このような醗酵菌総の変化が夏期キムチの単純な酸味と炭酸味が弱くなるのに影響を及ぼす可能性があることを予想することができた。 前記の結果を図２に示した。

このような醗酵菌総の変化がキムチの醗酵風味に及ぼす影響をより明確にするために前記チェ（Ｃｈｏｉ）などの方法により醗酵が始まった総酸度０．４％以上の微生物分析に使った同じサンプルに対してＨＰＬＣを活用した有機酸分析を遂行した。 有機酸は乳酸菌が糖を消費して生成する主要代謝産物で偏性異形醗酵、同形醗酵の場合は乳酸だけが主に生成されて、絶対異形醗酵の場合は乳酸と共に 酢酸、二酸化炭素などの醗酵産物が生成されることでどんな種類の醗酵が起きるかを確認できる主要指標物質である。 その分析結果を表２に示した。

表２のように乳酸と酢酸のモール濃度の比率を計算した結果年中１．３−１．６程度の割合で酢酸対比乳酸の比率が維持されるのに比べて夏に製造したキムチは２．２−２．８まで乳酸の比率が高まることを確認することができた。 これは醗酵乳酸菌の変化によって特に夏に同形醗酵の比率が高まる醗酵特性の差が現れてこのような特徴が夏期の品質低下の原因であることを確認することができた。

以上の結果を通じて、本発明者などは冬季おいしい時期に分離する乳酸菌をスタータで適用して年中一定の醗酵品質のキムチを製造して特に夏期の醗酵品質低下を効果的に制御しようと冬季に製造したキムチから約５００余菌株を分離したし、この中で絶対異形醗酵菌であり、冬キムチの優占種の菌中で目的に符合する新規した乳酸菌を分離することになった。

実施例２：微生物ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４菌株の分離および同定
前記実施例１と同じように年中キムチ品質変化の原因分析とこれを通じて冬に製造しておいしく良く熟したキムチで分離した乳酸菌菌株をＣＪＧＮ３４で菌株名を定めて前記の菌株を１．５％寒天（ａｇａｒ）が含まれたＭＲＳ固体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に塗抹して３０℃で２４時間培養した後純粋分離したことが確認された集落をループ（ｌｏｏｐ）で取ってＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）で３０℃１８−２４時間培養した。

その次に、ＣＪＧＮ３４菌株の形態および生理学的特性をキムなど（Ｋｉｍ ｅｔ．ａｌ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｉｎｈａｅ ｓｐ． ｎｏｖ．、ａ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｋｉｍ ｃｈｉ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ５３、Ｊｕｌｙ ２００３、ｐａｇｅｓ １１２３−１１２６）の方法とＡＰＩ５０ＣＨおよびＡＰＩ５０ＣＨＬキット（バイオメリオ社製品）を使って決めた。 その結果確認されたＣＪＧＮ３４菌株の形態および生理学的特性を前記表１に整理した。

また、乳酸菌同定および分類のための１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を分析した。 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定および分析はキムなど（Ｋｉｍ ｅｔ ．ａｌ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｋｉｍｃｈｉｉ ｓｐ． ｎｏｖ．、ａ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｒｏｍ ｋｉｍｃｈｉ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ５０、Ｓｅｐｔ ｅｍｂｅｒ ２０００、ｐａｇｅｓ １９１５−１９１９）の方法を使った。

本発明にともなうロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４菌株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列分析結果ロイコノストック シトレウム標準菌株（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＫＣＴＣ ３５２６Ｔ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１１１９４８）と最も高い相同性（９９．７％）を現わしてロイコノストック シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）で同定して、ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４で命名したし、生命工学研究院遺伝子銀行に２００６年７月２７日付で寄託した（受託番号ＫＣＴＣ １０９７４ＢＰ）。

実施例３：ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４菌株の安全性評価
前記実施例１で分離した菌株の安全性を評価するために韓国バイオベンチャー協会団体標準（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）で提示した安全性評価試験法により溶血現象検査、ゼラチン液化反応検査、有害代謝産物（アンモニア）生成確認、フェニルアラニン脱アミン検査を遂行した。 その結果を下記表３に示した。

前記結果によれば、ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔ ｒｅｕｍ ＣＪＧＮ３４）は、ゼラチン液化反応、有害代謝産物（アンモニア）生成、フェニルアラニン脱アミン生成、溶血現象検査皆で陰性で確認された。 したがってロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４は、人体に投与できる安全な菌株だと確認された。

実施例４：ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４菌株をスタータで製造したキムチの特徴
本発明のロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４菌株をスタータで適用するために菌株の培養液または菌体組成物を製造したし、培養液と菌体組成物は、次のように製造されることができる。

培養液は、葡萄糖１０ｇ、酵母抽出物５ｇとクエン酸アンモニウム（ｄｉａｍｍｏｎｉ ｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ） ５ｇを水に溶かして、滅菌後菌を接種して２５−３７℃の温度で８−２４時間培養して準備した。 菌体組成物は、菌の生産のためにＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ）をアンモニア ガスでｐＨを５．５−７．０で調節して３０℃で約１８時間培養をして遠心分離を遂行して菌体を回収した。 回収した菌体はデキストラン５％と脱脂牛乳１０％を凍結保護剤で使って−４０℃以下で凍結後３０−３７℃で乾燥した後菌体をミキサーで砕いて粉体化した。 粉体化した生菌は目標にする菌数に合わせて保管をするために適当量の葡萄糖、乳糖、脱脂牛乳などと同じ賦形剤と混合して密封されるアルミニウムパウチに入れて包装した。

このように製造した培養液または菌体組成物は、キムチ全体重量に対し０．００１％−３％かなりキムチ製造時に添加して使った。 キムチはＣＪ第一製糖の製造法により製造醗酵したし、同じ材料と配合比で製造してＣＪＧＮ３４をスタータで添加して製造後醗酵したキムチと、添加しないで自然醗酵したキムチの官能品質および理化学的特性分析を進行した。 キムチの官能品質および理化学的特性は、熟成度により差が発生することがあるので総酸度を基準として０−０．０５％内で熟成程度を合わせて調査を進行した。 以上のように製造したキムチの官能品質を分析した結果を下記表４に示した。

表４に現れた通り自然醗酵キムチの全般味嗜好度が製造時期により夏キムチ３．５９で冬キムチ４．０１まで味品質の偏差が大きく発生することに比べてＣＪＧＮ３４をスタータで使った場合夏キムチ３．８５で冬キムチ４．０５まで味品質の偏差が減るのを確認できて目的とした年中均一な醗酵品質のキムチを製造するのに有効な役割をすることが分かった。 特に夏期に製造した自然醗酵キムチでは酸味嗜好度、炭酸感嗜好度、後味嗜好度が落ちて全般味嗜好度が３．５程度で落ちることに反してＣＪＧＮ３４スタータキムチの場合は酸味嗜好度、後味嗜好度は９５％有意水準、炭酸感嗜好度は９０％有意水準の差を見せて全般味嗜好度にも９５％有意水準の差を現わして目的とした夏期の醗酵品質低下を効果的に制御する可能性があることを確認することができた。

また異形醗酵と同形醗酵中どんな種類の醗酵が起きたかを確認できる主要指標物質の乳酸と酢酸のモール濃度比率を確認した結果夏キムチで高まった乳酸の生成比率が低くなることを確認できたし、これはＣＪＧＮ３４スタータが正常に優点して夏期味品質を低下させる形醗酵または編成異形醗酵乳酸菌の生長を抑制してキムチの醗酵品質を効果的に制御することを今一度確認することができるようにした。

以上のような各製造時期のキムチの有機酸分析結果を下記表５に示した。

実施例５：ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４菌株をスタータで製造した醗酵食品および塩漬け食品
本発明のロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４菌株をキムチ以外の醗酵食品のスタータで適用するために実施例４と同じ方法で菌株の培養液または菌体組成物を製造したし、これをスタータとして醗酵食品を製造した。 醗酵食品はきゅうり、だいこん、にんじん、たまねぎ、にんにく、唐辛子、はくさいなど多様な原料を活用して製造することができるし、たくあんのような塩漬け食品に適用して醗酵たくあんを製造することができる。

実施例６：ロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４を含む菌体組成物の製造および活用
前記実施例１で同定されたロイコノストック シトレウムＣＪＧＮ３４（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏ ｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＣＪＧＮ３４）を医薬品、食品、飼料、飼料添加剤または化粧品の原料で適用するために大量生産して実施例４と同じ方法で菌体組成物を製造した。

このように製造された菌体組成物は、飼料に原料で使われる穀物粉と混合して飼料用生菌剤で活用したり、担体または添加剤などを混合して錠剤、カプセルなどの医薬品、食品用生菌剤で活用したり、化粧品に使われる原料に一定量を混合することによって医薬品、食品、飼料、化粧品など多様な分野に当該技術分野で通常の方法により活用することができる。

ＫＣＴＣ １０９７４ＢＰ