결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선, 치료 또는 예방용 조성물

결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선, 치료 또는 예방용 조성물{Composition for improving, treating or preventing constipation comprising Cassia fermented by lactic acid bacteria as an active ingredient}

본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품, 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 변의 수분 함량 및 중량을 증가시키는 결명자 유산균 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

변비(Constipation)는 의학적으로 일주일에 3회 이하의 배변이거나, 하루 배변량이 30 g이하일 때 변비라고 정의한다. 정상적인 상태에서는 음식물을 섭취한 후 24시간이면 대변이 되어 배설되나, 변비가 있는 사람은 며칠에 한 번 변을 보거나 매일 보더라도 그 양이 적어 결과적으로 섭취한 음식물의 장내 체류시간이 길어지는 것이다.

변비의 원인으로는 아침식사를 거름으로 인한 대장연동운동의 저하, 식생활의 서구화로 인한 식이섬유의 부족, 운동부족으로 인한 기초체력 및 복근력 저하, 다이어트, 과다한 약물 복용으로 인한 약물 중독 등 여러 가지가 있다.

예로부터 만병의 근원으로까지 일컬어지고 있는 변비는 식욕이 없고 늘 복부가 팽만한 상태에 있을 뿐 아니라 배설되지 못한 변의 독소가 장을 통하여 혈액에 흡수됨으로써 피부노화를 촉진시키고 두통이나 여드름, 피부 발진 등이 나타나며, 변비가 심하면 배변시 치열의 파손과 치액의 탈출 등 치질의 원인이 되고, 변속에 있는 독소에 의해 대장암까지 발생된다. 또한 변비가 지속되면 체외로 배출되어야 할 콜레스테롤이나 지방이 몸 속에 남아있어서 동맥 경화 또는 담석증을 유발할 수 있으며, 더 나아가서는 고혈압과 심장비대를 일으켜 심장병으로 악화될 수 있다. 이 외에도 뇌졸중, 면역결핍, 시력장애, 정신질환(우울증) 등 다양하고 심각한 2차 질환의 원인이 되므로 변비는 적극적인 예방과 치료가 필요한 중요한 질환이다.

이에 현재까지 변비 치료 또는 개선을 위한 다양한 의약품과 건강기능식품이 판매되고 있으나 의약품의 경우 대부분 센나, 대황 등의 안트라퀴논 유도체 성분이 함유된 자극성 약제를 사용함으로써 복통, 설사 등의 부작용과 함께 임신 중 복용이나 지속적인 복용에 문제가 있으며, 건강기능식품의 경우도 과학적으로 그 효과가 충분히 입증되지 못한 것이 대부분이어서 변비 개선의 근본문제를 해결하지 못하고 있어 제품의 신뢰성이 떨어지고 있는 실정이다.

결명자는 콩과에 속하는 한해살이 초본으로 초결명자( Cassia obtusifolia L.)와 결명자( Cassia tora L.)의 두 품종이 알려져 있다. 결명자는 초결명, 긴강남차라고도 한다. 초결명자는 중앙아메리카 원산으로 일본 등지에서 결명자는 열대 아시아산으로 중국, 우리나라 등지에서 재배된다.

열매의 모양은 불규칙한 육각주상으로 한쪽은 뾰족하다. 외면의 색깔은 황갈 내지 흑갈색이고, 길이 3 내지 6 mm, 지름 2 내지 3.5 mm이다. 종피는 견고하고 윤택하며, 좌우 양측에 광택이 있는 폭이 좁은 한줄의 패어진 무늬가 있고, 약간 특이한 냄새가 난다. C. obtusifolia 는 종자가 대립이고, C. tora 는 소립이다.

결명자는 한방에서 청열명목 작용에 의하여 급성결막염, 안구출혈, 이물질이나 통증을 느끼고, 눈물을 흘리는 경우, 노인의 눈에 발생하는 각막 혼탁현상, 즉 만성진행성질환, 시신경, 망막위축에 기인하는 급속한 시력감퇴, 비만, 혈압이 높고, 정신적 스트레스에 의한 두통, 이명, 눈의 종양을 치료하고, 강압작용으로는 고혈압증 치료, 관상동맥 확장으로 혈유의 저항을 줄여 혈압을 낮추어 주며, 뇌졸중에 의한 반신불수, 경미한 설사작용, 만성질환을 치료하고, 콜레스테롤 저감작용으로는 심혈관질환, 즉 콜레스테롤치가 정상범위를 넘었을 경우나 관상동맥 경화에 의한 협심증을 치료하며, 변비치료는 노인성 변비증, 노인성 고혈압증, 진액부족으로 인한 입이 마르고, 변비 기미에 의한 복부 팽만감, 상습성 변비증 등을 치료하는 것으로 알려져 있다.

한국공개특허 제1999-0084271호에서는 결명자 또는 결명자엽과 다른 생약재를 혼합하고 단순 분쇄 및 배전하여 제조한 티백차가 변비개선에 효과가 있음을 설명하고 있고, 한국공개특허 제2003-0062493호는 결명자를 먼저 추출, 농축 후 분무건조하여 제조한 결명자 추출물 분말과 카스카라사그라다 추출분말 등을 혼합하여제조한 혼합침출차가 기호성이 우수하고 변비증상 개선 효과가 있음을 설명하고 있고, 상기 특허들은 결명자를 단순 분쇄하여 배전하거나, 추출 및 농축하여 건조한 것이거나, 또는 이들과 다른 변비 개선 효과가 있는 생약재와 혼합하는 것에 불과하였다.

그러나 본 발명자들은 전통적으로 오랫동안 사용되어 그 안전성을 검증받은 생약인 결명자를 유산균으로 발효시켜 얻은 결명자 유산균 발효물이 결명자 추출물에 비하여 변의 개수, 변의 수분 함량 또는 변의 중량을 증가시켜 변비를 개선하거나 치료하는 효과가 현저히 증진됨을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 오랫동안 사용되어 안전성이 높고 생약으로서 부작용 발생가능성이 적은 결명자를 활용하여 변의 수분 함량 및 중량을 증가시키는 효과가 현저히 증진된 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 오랫동안 사용되어 안전성이 높고 생약으로서 부작용 발생가능성이 적은 결명자를 활용하여 변의 수분 함량 및 중량을 증가시키는 효과가 현저히 증진된 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 오랫동안 사용되어 안전성이 높고 생약으로서 부작용 발생가능성이 적은 결명자를 활용하여 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 효과가 현저히 증진된 결명자 유산균 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품을 제공한다.

상기 결명자 유산균 발효물은 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시켜 얻은 것일 수 있다.

상기 결명자 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물일 수 있다.

상기 유산균은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 유산균 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유산균일 수 있다.

상기 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 제제일 수 있다.

또한 본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

상기 결명자 유산균 발효물은 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시켜 얻은 것일 수 있다.

상기 결명자 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물일 수 있다.

상기 유산균은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 유산균 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유산균일 수 있다.

또한 본 발명은 결명자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 결명자 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 결명자 유산균 발효물은 오랫동안 사용되어 안전성이 높고 생약으로서 부작용 발생가능성이 적으면서도, 부작용 문제로 건강기능식품에 사용이 금지된 자극성 변비 치료제인 센노사이드, 또는 비사코딜 및 도큐세이트나트륨을 유효성분으로 하는 상용화된 둘코락스에스와 동등한 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 효과를 나타내므로, 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품으로 활용될 수 있다.

도 1은 실험예 1에서 용매를 달리한 결명자 추출물을 각각 다른 유산균으로 발효시켰을 때 발효시간 36 시간 및 72 시간에 측정한 pH의 변화를 통해 유산균 발효의 진행을 확인한 그래프로서, 도 1a는 제조예 1의 추출물, 도 1b는 제조예 2의 추출물, 도 1c는 제조예 3의 희석액을 각각 발효시킨 것이다.
도 2는 실험예 2의 다.에서 각 실험군의 변의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 2의 다.에서 각 실험군의 변의 중량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 2의 라.에서 각 실험군의 실험동물을 희생시킨 후, 대장을 적출하여 수세한 후의 사진이고, 각각의 대장 사진 아래 표시한 점은 Carmine이 이동한 거리를 표시한 것이다.
도 5는 도 4의 Carmine 이동 거리를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 실험예 3에서 제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물의 HPLC-IT/TOP MS 패턴을 나타낸 것이고, 도 6b는 실험예 3에서 제조예 4의 결명자 유산균 발효물의 HPLC-IT/TOP MS 패턴을 나타낸 것이다.

본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품에 관한 것이고, 또한 본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이며, 또한 본 발명은 결명자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 결명자 유산균 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 결명자는 초결명자( Cassia obtusifolia L.) 또는 결명자( Cassia tora L.)이고, 바람직하게는 한국에서 재배되는 결명자( Cassia tora L.)이다.

상기 결명자 유산균 발효물은 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시켜 얻은 것일 수 있다.

상기 추출물은 추출 원재료에 추출 용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 조추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 결명자 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다. 상기 추출물은 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.

상기 결명자 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물로서, 추출방법은 특별히 한정할 필요가 없다.

용매로 물을 사용하는 경우 열수추출이 바람직하다. 예를 들어, 80 내지 105 ℃, 바람직하게는 90 내지 100 ℃의 물에서 0.5 내지 24 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간 추출할 수 있다. 용매로 열수를 사용하지 않더라도, 즉 결명자 분말을 냉수 또는 실온의 물에 희석하여 혼합한 희석액에서 결명자의 성분이 추출될 수 있다. 냉수 또는 실온의 물을 이용하여 결명자 성분을 추추ㅎ하는 경우 발효와 별도로 추출할 수도 있고, 유산균 접종하여 발효되는 과정에서 결명자로부터 결명자의 성분이 용출되도록 할 수도 있다.

상기 탄소수 1 내지 4의 알코올 수용액에 의한 추출물이 사용될 수 있다. 예를들어, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 등의 알코올 수용액, 바람직하게는 20 내지 80 중량%의 알코올 수용액, 더욱 바람직하게는 50 내지 70 중량%의 알코올 수용액으로 추출한다. 알코올 추출물을 사용하는 경우 유산균을 접종하기 전 먼저 알코올 추출물의 알코올을 기화시켜 알코올 함량을 낮춘 농축액 또는 알코올 추출물을 농축 및 건조시킨 후 물에 용해한 후 사용한다.

또한, 본 발명에서 결명자 추출물은 넓은 의미로는 결명자 분말을 물에 희석한 희석액을 포함한다. 본 발명의 실험예에서 결명자 열수 추출물 또는 결명자 에탄올수용액 추출물을 유산균 발효시킨 유산균 발효물에 비하여, 결명자 물 희석액을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효물의 변비 개선, 치료 또는 예방 효과가 다소 낮지만, 유산균 발효시키지 않은 결명자 추출물에 비해서는 그 효과가 유의적으로 증대되었음을 확인할 수 있었다.

상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하기 전에 유산균 생육을 증진시키기 위하여 단백질원, 탄수화물원, 비타민 또는 무기질 등의 유산균 영양원을 추가로 혼합할 수 있다. 상기 유산균 영양원은 시중에 판매되는 배지를 이용하거나 또는 필요한 영양원만을 개별적으로 첨가할 수 있다.

또한 상기 결명자 추출물, 또는 결명자 추출물과 유산균 영양원의 혼합물은 유산균을 접종하기 전에 가열살균할 수 있다.

상기 결명자 추출물의 고형분 함량은 특별히 한정할 필요는 없으나 추출 후 다른 농축 과정이 없을 경우 1 내지 15 중량%이고, 이를 바로 사용할 수도 있고, 농축하여 사용할 수도 있으며, 농축 또는 건조한 후 희석하여 사용할 수도 있다.

상기 유산균은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 유산균 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유산균일 수 있다. 바람직하게 상기 유산균은 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 애시도필러스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브레비스, 류코노스톡 메센테로이데스, 페디오코터스 펜토사세우스, 엔테로코커스 페칼리스이다.

상기 발효 조건은 일반적인 유산균 발효와 동일하므로 특별히 한정할 필요는 없으나, 25 내지 40 ℃에서 24 내지 96 시간 수행될 수 있다.

상기 결명자 유산균 발효물은 유산균 균체를 포함하는 발효물일 수 있고, 유산균 균체가 제거된 발효물일 수도 있다. 유산균 균체가 제거된 발효물은 발효물을 멸균하여 사균체를 포함하게 할 수도 있고, 여과 또는 원심분리를 통해 균체를 제거한 여액 또는 원심분리 상등액일 수 있다. 본 발명의 변비의 개선, 치료 또는 예방 효과는 결명자 추출물에 포함된 성분을 유산균이 증식하면서 생체 내에서 이용하기 용이한 성분으로 생물전환시키거나, 변비의 개선, 치료 또는 예방 효과를 갖는 신규의 활성 성분이 생성되기 때문으로 예상되며, 단순한 유산균 자체가 부가되어 얻을 수 있는 효과보다 현저히 상승된 것이다. 상기 결명자 유산균 발효물은 액상의 발효물을 그 자체로 사용할 수도 있고, 이를 건조하여 분말화할 수도 있다.

본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 결명자 유산균 발효물의 변비 개선, 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품이란, 상기 결명자 유산균 발효물을 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태로 제제화 한 것일 수 있고, 또는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

상기 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 결명자 유산균 발효물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.

상기 건강기능식품은 유효성분으로서 결명자 유산균 발효물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 건강기능식품이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 홍경천 발효물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

또한 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비의 치료 또는 예방용 약학 조성물에서, 결명자 유산균 발효물은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 결명자 유산균 발효물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 결명자 유산균 발효물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

상기 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10g/㎏이다.

상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 결명자 열수 추출물의 제조

결명자는 전남생약농업협동조합(화순군)에서 구입한 국내산 결명자( Cassia tora L.)를 정선, 수세 후 분쇄기로 균일하게 분쇄하여 평균입자크기 300 ㎛의 결명자 분말을 제조하여 냉장보관하면서 이용하였다.

상기 분쇄된 결명자 중량의 10 배의 증류수를 환류추출기에 넣고 100 ℃, 3시간 동안 2회 추출한 후, 방냉하고 여과한 다음 감압농축기로 농축하여 동결건조하여 결명자 열수 추출물 분말을 얻었다. 수율은 2.2 %이었다.

제조예 2: 결명자 에탄올수용액 추출물의 제조

상기 제조예 1의 분쇄된 결명자 중량의 4 배의 50 중량% 주정에탄올 수용액을 첨가하여 3일 동안 실온에서 추출한 후, 여과한 다음 감압농축기로 농축하여 동결건조하여 결명자 에탄올수용액 추출물 분말을 얻었다. 수율은 9.8 %이었다.

제조예 3: 결명자 물 희석액의 제조

상기 제조예 1의 분쇄된 결명자를 7 중량%가 되도록 물을 혼합하여 결명자 물 희석액을 제조하였다.

제조예 4: 결명자 유산균 발효물 의 제조

상기 제조예 1 또는 2의 결명자 추출물 분말을 증류수에 5 중량%로 희석한 결명자 추출물 , 또는 제조예 3의 결명자 물 희석액을 121 ℃, 1.5기압, 15분간 멸균한 다음, 표 1의 유산균을 각각 MRS broth와 GAM broth를 이용하여 24시간, 37 ℃에서 정치 배양하여 활성화시킨 후, 유산균을 배양액 5 중량%(1×10 ⁷ CFU/㎖)를 상기 결명자 추출물에 각각 접종하여 37 ℃에서 72시간 동안, 150 rpm으로 교반하면서 배양하여 얻은 배양액을 얻었다.

상기 배양액을 4 ℃에서 6,000 rpm에서 15 분 원심분리하여 균체가 제거된 상등액을 농축 및 동결건조하여 결명자 유산균 발효물 분말을 제조하였다.

실험예 1: 결명자 유산균 발효물의 발효특성 확인

제조예 4의 결명자 유산균 발효물의 발효특성을 확인하기 위하여, 접종 후 36 및 72시간째에 발효물의 pH 및 생균수의 변화를 확인하였다.

생균수는 생균수는 시료 1ml를 멸균 생리식염수 9ml에 희석하고 잘 섞은 후 단계별로 희석한 다음 0.1ml을 취하여 Lactobacillus속, Pediococcus속은 MRS agar에 도말하고, Bifidobacterium속은 5%의 horse blood를 함유한 BL agar에 도말하여 anaerobic jar (BBL Gas Pak Anaerobic System)를 이용하여 최대한 혐기적인 상태로 보관하여 37 ℃에서 24-48시간 배양한 후 생성된 집락수를 계측하고, 그 평균 집락 수에 희석배수를 곱하여 배양액 당 colony를 산출하였다.

가. pH 변화

유산균의 종류 및 배양시간에 따른 pH 변화를 도 1a, 도 1b 및 도 1c에 나타내었다. 도 1a는 제조예 1의 추출물, 도 1b는 제조예 2의 추출물, 도 1c는 제조예 3의 희석액을 각각 발효시킨 것이다.

초기 pH는 6.4 이었으며, 36 시간째에 5.2 내지 5.8로 감소하였고, 72 시간째에 4.9 내지 5.5로 감소하였다.

유산균별로 pH의 변화를 비교하면 Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 및 Lactobacillus paracasei (L2)가 Lactobacillus acidophillus 128(L3) , Lactobacillus plantarum 144(L4), Bifidiobacterium longum(B1) , Pediococcus pentosaceus (P1) 보다 상대적으로 큰 폭으로 감소하였다.

유산균이 동일할 경우 기질로 제조예 1의 결명자 열수 추출물, 제조예 2의 결명자 에탄올 추출물, 제조예 3의 결명자 물 희석액을 사용하는 배양액의 pH에는 거의 차이가 없었고, 제조예 3 경우 나머지에 비해 36 시간째 및 72 시간째의 pH가 다소 높았다.

나. 생균수 변화

유산균 6종 중에서 pH 변화가 상대적으로 크게 나타났던 유산균 2종(L1 및 L2)을 다시 전 배양하고 균주의 성장능을 알아보기 위하여 고형분 함량 6 중량%의 결명자 추출물에 유산균을 각각 1 중량%씩 접종하고 37 ℃에서 24 시간 발효한 후 생균수를 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에 나타낸 바와 같이 기질로 제조예 1의 결명자 열수 추출물을 사용한 것과 제조예 2의 에탄올수용액 추출물을 사용한 것에서 거의 차이가 없었으나, 제조예 3의 결명자 물 희석액을 사용한 것에서는 발효 후 생균수가 제조예 1 및 2의 생균수의 절반에 조금 못 미치는 수준이었다.

Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 균주를 사용하여 제조한 배양액의 생균수가 Lactobacillus paracasei (L2) 균주를 사용하여 제조한 배양액의 생균수 보다 3 배 정도 많음을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 동물실험을 통한 효과 확인

가. 실험동물 및 실험군

실험동물은 SD(Sprague Dawley) 래트 4주령 수컷을 다물사이언스(대전)에서 구입하여 사용하였으며, 온도 20±2 ℃, 습도 55±5 %, 12 시간 명암조건에서 사육하였다. 실험동물은 구입 후 1주일 동안 순화한 다음, 각 군당 5마리씩을 배치하여 표 3과 같이 실험군을 설정하였다.

정상 대조군(NOR), 음성 대조군(LOP) 및 실시예 5를 제외한 각 실험군은 로페라미드 투여 전에 각각의 양성 대조군 약물이나 비교예 및 실시예의 시료를 5 일동안 경구 투여하였다.

정상 대조군(NOR)을 제외한 음성 대조군(LOP), 양성 대조군(CON1, CON2) 및 실시예 5를 제외한 모든 실시예들은 로페라미드를 5일 동안 피하투여하여 변비를 유발하였고, 로페라미드 투여개시일로부터 6 일째 실험동물을 희생시켰다.

실시예 5는 음성 대조군(LOP)과 동일하게 로페라미드를 5일 동안 피하투여하여 변비를 유발시킨 후, 실시예 2-2와 동일한 제조예2 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 5일 경구투여후, 마직막 발효물 투입 다음날 실험동물을 희생시켰다.

나. 체중, 사료 섭취량 및 음수량

실시예 5를 제외한 모든 실험군은 로페라미드 투여개시일부터 실험동물 희생시킬 때까지, 실시예 5는 로페라미드 발효물 투여개시일부터 실험동물을 희생시킬 때까지의 실험동물의 체중변화량(g), 사료 섭취량(g) 및 음수량(mL)을 표 4에 나타내었다.

상기 실험기간 동안 사료섭취량 및 음수량에는 유의적인 차이가 없었고, 체중증가량에 있어서도 유의적인 차이를 보이지 않았다.

다. 변의 개수 및 중량

실시예 5는 발효물 투여개시일로부터 4일째, 나머지는 로페라미드 투여개시일부터 4일째에 케이지 안의 변을 제거하고 베드를 갈아준 후 1일 동안 변을 수거하여 변의 개수 및 변의 중량을 측정하여 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.

변의 개수는 정상 대조군(NOR)이 47.2 ± 5.8 개인 것에 비해, 로페라미드 투여 음성 대조군(LOP)가 23.1 ± 3.6 개로 감소되어, 로페라미드에 의한 변비 유발이 확인되었고, 센노사이드(CON1)가 둘코락스에스(CON2)보다 변의 개수 증가 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

비교예 1 및 2의 결명자 물 추출물 및 결명자 에탄올수용액 추출물 투여군은 변의 개수 증가 효과가 거의 나타나지 않았고, 비교예 1 및 2와 동일하게 200 mg/kg 투여한 실시예 1-2, 2-2 및 4-2에서는 센노사이드(CON1)과 동등한 변의 개수 증가 효과를 나타내었다. 실시예 3-2에서는 센노사이드보다는 다소 낮지만 둘코락스에스와 동등한 변의 개수 증가 효과를 나타내었다.

실시예 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-1, 3-2, 4-1 및 4-2는 용량 의존적으로 변의 개수 증가 효과가 증가하였고, L1 균주를 이용하여 발효시킨 실시예 2-1 및 2-2에서 변의 개수 증가 효과가 더 높았고, 동일하게 L1 균주로 발효시킨 경우에도 결명자 에탄올수용액 추출물을 발효시킨 실시예 2-1 및 2-2가 실시예 1-1 및 1-2 보다 변의 개수 증가 효과가 더 뛰어남을 확인하였다.

변비를 유발한 후 제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물의 L1 균주 발효물을 투여한 실시예 5에서는 변의 개수가 26.2 ± 3.1 개로 음성 대조군(LOP)에 비해 유의적으로 다시 증가하였다.

변의 중량 또한 정상 대조군(NOR)이 4.8 ± 0.89 개인 것에 비해, 로페라미드 투여 음성 대조군(LOP)가 2.6 ± 0.32 개로 감소되어, 로페라미드에 의한 변비 유발이 확인되었고, 센노사이드(CON1)와 둘코락스에스(CON2)의 변의 중량에는 유의적인 차이는 없었다.

비교예 1의 결명자 물 추출물 투여군은 변의 중량 증가 효과가 나타나지 않았으나, 비교예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물 투여군은 변의 중량 증가 효과가 나타났다.

비교예 2와 동일하게 200 mg/kg 투여한 실시예 1-2 및 2-2에서는 비교예 2에 비해서 유의적으로 변의 중량이 증가하였고, 실시예 4-2에서는 비교예 2와는 유의적인 차이가 없었으나 비교예 1에 비해서는 유의적으로 변의 중량이 증가하였다. 실시예 3-2에서는 센노사이드 및 둘코락스에스와 동등한 변의 중량 효과를 나타내었다.

실시예 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-1, 3-2, 4-1 및 4-2는 용량 의존적으로 변의 중량 증가 효과가 증가하였고, 동일하게 L1 균주로 발효시킨 경우에도 결명자 에탄올수용액 추출물을 발효시킨 실시예 2-1 및 2-2가 실시예 1-1 및 1-2 보다 변의 중량 증가 효과가 더 뛰어났으며, L1 균주를 이용하여 발효시킨 실시예 2-1 및 2-2에서 L2 균주를 이용하여 발효시킨 실시예 4-1 및 4-2보다 변의 중량 증가 효과가 더 높게 나타났다.

변비를 유발한 후 제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물의 L1 균주 발효물을 투여한 실시예 5에서는 변의 중량이 3.18 ± 0.28 개로 음성 대조군(LOP)에 비해 유의적으로 다시 증가하였다.

라. Carmine 색소 장 이동 거리

Carmine 색소 장 이동 거리는 carmine 색소를 생리식염수에 1.5% (w/v)농도로 하여 6일째에 3mL 경구투여 하였으며, 경구투여 20분 후에 실험동물을 희생시킨 후, 대장은 맹장 이후 부분부터 직장까지 부위의 양쪽을 결찰하여 적출하여, PBS로 장기를 수세한 후의 사진을 도 4에 나타내었고, 도 4에서 표시한 Carmine 색소가 이동한 거리를 측정하여 도 5에 나타내었다.

Carmine 색소의 장 이동 거리는 정상 대조군(NOR)이 13.4 ± 0.94 cm인 것에 비해, 로페라미드 투여 음성 대조군(LOP)가 6.6 ± 0.75 cm로 감소되어, 로페라미드에 의한 변비 유발이 확인되었고, 센노사이드(CON1)와 둘코락스에스(CON2)는 장 이동 거리가 음성 대조군(LOP)에 비하여 현저히 증가하였다.

비교예 1은 장 이동 거리에서 음성 대조군(LOP)와 유의차가 없었으나, 비교예 2는 음성 대조군(LOP)에 비해서 유의적으로 장 이동 거리가 증가하였다.

실시예 3-1 및 2-1에서는 비교예 2의 1/2 양으로 투여했음에도 비교예 2와 유사한 장 이동 거리를 나타내었고, 비교예 1 및 2와 동일 양을 투여한 실시예 3-2 및 2-2는 비교예 2에 비해서 현저히 장 이동 거리가 늘어남을 확인하였다.

실시예 3-2 및 2-2는 양성대조군인 센노사이드 및 둘코락스에스와 동등하거나 그 이상의 장 이동 거리를 나타내었으며, 특히 L1 균주로 발효시킨 실시예 2-2는 정상 대조군(NOR)과 동등한 장 이동 거리를 나타내었다.

실험예 3: 발효 전 후 HPLC - IT / TOP MS 패턴비교

제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물 분말과 제조예 2의 결명자 에탄올 수용액 추출물 분말을 L1 균주로 발효시킨 제조예 3의 결명자 유산균 발효물 분말을 동일 농도로 HPLC-IT/TOP MS 기기(Shimadzu, 일본)를 이용하여 HPLC-IT/TOP MS를 실시하여 패턴을 비교하였다. Acquity UPLC C-18, 1.7m 2.1x100mm 컬럼으로, 유속 0.3 mL/min, 아세토니트릴 10% 수용액에서 70% 수용액으로 그래디언트로 측정하였다.

제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물의 패턴을 도 6a에 제조예 3의 결명자 유산균 발효물의 패턴은 도 6b에 나타내었다. 상기 패턴 비교를 통해 제조예 2의 결명자 에탄올 수용액 추출물 패턴에서 다수의 피크가 발효를 통해 함량이 낮아지거나 사라지고, 대신 새로운 피크가 생성됨을 확인하였다.