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两歧双歧杆菌WBBJ01的新应用
申请号	CN201710544725.0	申请日	2017-07-06	公开(公告)号	CN107485625A	公开(公告)日	2017-12-19
申请人	南昌大学;			发明人	万翠香; 魏华; 夏慧玲; 许恒毅; 徐峰; 王圆圆;
摘要	本发明公开了两歧双歧杆菌WBBJ01的新应用，所述两歧双歧杆菌WBBJ01具有能够TNBS诱导的小鼠克莱恩病，改善炎症表观症状，调节氧化应激，调控炎症因子的表达，达到有效防治DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎。
权利要求	1.两歧双歧杆菌WBBJ01在制备防治溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品中的应用，所述两歧双歧杆菌WBBJ01于2017年2月24日保存于湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2017063。 2.一种治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其特征是，其活性成分包括有两歧双歧杆菌WBBJ01，所述两歧双歧杆菌WBBJ01的保藏号为CCTCC M2017063。 3.根据权利要求2所述的治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其特征是，所述食品为饮料、酸奶、果冻、益生菌粉。 4.根据权利要求2所述的治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其特征是，所述两歧双歧杆菌菌剂剂量为1×1010cfu/kg。 5.一种治疗结肠炎的两歧双歧杆菌菌剂的制备方法，其特征是，包括如下步骤： 1)两歧双歧杆菌WBBJ01加有0.3％半胱氨酸MRS液体培养基37±1℃厌氧培养48±2h，得到达到稳定期的菌体，所述两歧双歧杆菌WBBJ01的保藏号为M2017063； 2)离心收集步骤1)中菌体，用无菌1×PBS洗涤2-4次； 3)用无菌1×PBS调整步骤2)所得菌体浓度到1-2×109cfu/mL； 4)向上述所得菌体中加入适宜辅料制成的药物或食物或保健品。
说明书全文	两歧双歧杆菌WBBJ01的新应用技术领域 [0001] 本发明属微生物领域，具体是涉及一种两歧双歧杆菌WBBJ01的新应用。背景技术 [0002] 结肠炎(inflammatory bowel disease,IBD)分为溃疡性结肠炎(ulecrative colitis,UC)和克莱恩病(Crohn’s disease,CD)两种类型。随着近年来发病率和死亡率不断上升，结肠炎已成为严重威胁人类生命健康的一类恶性疾病。被世界卫生组织列为现代难治疗病症之一。其常见临床表现为体重下降、腹泻、血便，有癌变的倾向，反复性强。研究证明，目前用于治疗结肠炎的药物主要有氨基水杨酸、糖皮质激素以及免疫调节剂等，药价高，且副作用不可控。 [0003] 双歧杆菌作为人体重要的益生菌，可调节肠道菌群平衡，抑制有害菌的生长，在肠道免疫作用中占有重要地位,具有抑制肿瘤的功能。 [0004] 本发明的申请人之前分离到的两歧双歧杆菌WBBJ01于2017年2月24日保存于湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2017063。并发现该两歧双歧杆菌WBBJ01 具有高粘附的特性，能在胃肠液中保持较高的存活率，并能抑制食源性致病菌的增长，具有抗氧化的功能。此外，还能因为能调节肠道菌群多样性，达到改善宿主胃肠道健康。但是，鉴于胃肠道疾病的复杂性和多样性，所述两歧双歧杆菌WBBJ01在具体胃肠道疾病的治疗功能还一无所知。发明内容 [0005] 本发明的目的之一是提供两歧双歧杆菌WBBJ01的新应用。 [0006] 为实现以上目的，本发明提供了已下技术方案： [0007] 两歧双歧杆菌WBBJ01在制备防治溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品中的应用，所述两歧双歧杆菌WBBJ01于2017年2月24日保存于湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2017063。 [0008] 本发明的另一目的是提供一种治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品。 [0009] 实现上述目的的技术方案如下： [0010] 一种治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品或食品，其活性成分包括有两歧双歧杆菌 WBBJ01，所述两歧双歧杆菌WBBJ01的保藏号为CCTCC M2017063。 [0011] 优选的，所述食品为饮料、酸奶、果冻、益生菌粉等多种乳杆菌可生存的食品，只要双歧杆菌可生存的食品中都可以，具体根据实际需要。 [0012] 优选的，本发明所用的治疗溃疡性结肠炎的双歧杆菌菌剂剂量为1×1010cfu/kg，根据具体情况计算使用，即每kg动物、人体所用菌剂中含两歧双歧杆菌WBBJ01达1010cfu。 [0013] 本发明公开了一种用于治疗溃疡性结肠炎的益生菌菌剂，由两歧双歧杆菌WBBJ01制备而成，以一种处于稳定期的新鲜活菌菌体形式存在。 [0014] 本发明采用的两歧双歧杆菌WBBJ01于2017年2月24保存于湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2017063。 [0015] 本发明进一步公开了治疗结肠炎的双歧杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤： [0016] 1)两歧双歧杆菌WBBJ01加有0.3％半胱氨酸MRS液体培养基37±1℃厌氧培养48±2h，得到达到稳定期的菌体，所述两歧双歧杆菌WBBJ01的保藏号为CCTCC M2017063； [0017] 2)离心收集步骤1)中菌体，用无菌1×PBS洗涤2-4次； [0018] 3)用无菌1×PBS调整步骤2)所得菌体浓度到1-2×109cfu/mL； [0019] 4)向上述所得菌体中加入适宜辅料制成的药物或食物或保健品。 [0020] 本发明的发明人对之前所获得的两歧双歧杆菌WBBJ01经过大量的研究，发现所述两歧双歧杆菌WBBJ01具有能够缓解TNBS诱导的小鼠克莱恩病的功能，可改善炎症表观症状，调节氧化应激，调控炎症因子的表达，达到有效防治DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的目的。附图说明 [0021] 图1不同组小鼠体重变化。 [0022] 图2不同组小鼠结肠组织HE染色切片。 [0023] 图3不同组溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数评分(DAI)。 [0024] 图4不同组小鼠血清抗氧化酶活性变化。 [0025] 图5不同组克莱恩病小鼠炎症因子的表达。具体实施方式 [0026] 以下结合实例对本发明做进一步解释，但实施例仅具范例性，不能以任何形式对本发明的应用范围造成限制。本领域工作人员在不偏离本发明的精神和范围下可对本发明的实施细节进行修改替换，但这些改动均属于本发明的保护范围。 [0027] 实施例1 [0028] 菌体的活化： [0029] 将保存于甘油中的两歧双歧杆菌WBBJ01旋涡混匀后吸取10μL涂布于加有0.3％半胱氨酸MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取单菌落接种于4mL液体含半胱氨酸MRS培养基中，37℃厌氧培养48h，按1％接种量接种于10mL含半胱氨酸MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，达到稳定期。 [0030] 含半胱氨酸MRS培养基配制：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁 0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-801ml/L，半胱氨酸0.3％，pH 7.0±0.1，121℃、15分钟灭菌[0031] 实施例2 [0032] 双歧杆菌菌剂的制备： [0033] 将活化好的处于稳定期的两歧双歧杆菌WBBJ01离心，收集新鲜菌体，用无菌1×PBS 洗涤3次，用无菌1×PBS调菌体浓度到109cfu/mL，制成实验所需菌剂，备用。 [0034] 实施例3 [0035] 溃疡性结肠炎小鼠模型的构建及实验设计： [0036] 配制DSS蒸馏水溶液，待BALB/c小鼠适应环境后自由饮用7天，构建溃疡性结肠炎模型，通过表观性状判断造模是否成功。待小鼠体重下降至10％时，开始灌胃两歧双歧杆菌 WBBJ01，按10mL/Kg，每天给药1次，连续给药5天。对结肠炎空白组小鼠灌胃PBS，治疗结束后，摘眼球取血并处死小鼠，剖取回肠末段及全结肠。生理盐水迅速冲干净。标本于10％福尔马林溶液浸泡，做HE染色。剩余部分结肠保存至RNA保护液，-80℃保存备用。实验结果： [0037] (1)本发明明显改善小鼠体重 [0038] 经过灌胃两歧双歧杆菌WBBJ01菌剂治疗5天后，治疗组小鼠较结肠炎组小鼠体重有明显的改善，如图1所示，治疗结束后，益生菌菌剂治疗组小鼠基本可恢复至初始体重。说明本发明可有效缓解结肠炎导致的体重下降情况，改善小鼠的体重。 [0039] (2)本发明显著改善小鼠病理学情况 [0040] 将不同组小鼠结肠组织制成病理学切片，结肠炎组小鼠结肠组织与自然对照组进行对比，从图2可以看出，结肠炎组结肠杯状细胞严重损伤，部分丢失，炎性细胞浸润，在粘膜下层呈连续分布，固有层发生病变，本发明组(双歧杆菌菌剂治疗组)结肠形态较为完整，炎症细胞部分浸润。说明了本发明菌剂可有效缓解结肠炎小鼠的结肠组织炎症情况，具有修复肠粘膜损伤的功效。 [0041] (3)本发明菌剂显著改善溃疡性结肠炎小鼠的疾病活动指数 [0042] 根据小鼠体重变化，粪便状态以及出血状况进行评分，DAI得分越高，说明患病越严重。从图3可以看出，结肠炎组DAI值较自然组明显升高，经过灌胃双歧杆菌后，本发明组DAI值显著下降。说明了本发明菌剂可有效缓解结肠炎临床表现。 [0043] (4)本发明菌剂提高了溃疡性结肠炎小鼠血清中抗氧化酶的活性 [0044] 取血离心后取上清，根据抗氧化酶活性检测试剂盒的操作要求，检测小鼠血清中总长氧化歧化酶(T-SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-PX)的活性变化。从图4可以看出，结肠炎组小鼠血清抗氧化酶活性较自然组偏低，本发明组小鼠血清中抗氧化酶活性得到有效改善。说明了本发明菌剂可提高结肠炎的抗氧化酶活性，从而达到抗氧化的目的。 [0045] 实施例4 [0046] 克莱恩病模型小鼠的构建及实验设计： [0047] 配制TNBS的乙醇溶液，采用的BALB/c小鼠待适应环境后禁食24h，9号直灌胃针进行灌肠，建立急性克莱恩病模型。待小鼠体重下降至10％时，开始灌胃两歧双歧杆菌WBBJ01 菌剂，按10mL/Kg，每天给药1次，连续给药8天。治疗结束后，选取结肠段，保存至RNA 保护液，-80℃冻存备用。 [0048] 实验结果：本发明显著调节克莱恩病结肠炎的炎症因子表达 [0049] 将保存于-80℃的结肠组织通过液氮研磨，利用RNA提取试剂盒进行RNA提取，将RNA 反转录成cDNA，通过RT-qPCR方法检测炎症因子TNF-α的表达水平。由图5可以看出，本发明组小鼠较克莱恩病结肠炎组小鼠炎症因子表达水平得到显著调节，下调了促炎症因子 TNF-α表达水平。说明了本发明菌剂可通过调节细胞因子表达水平，从而达到保护机体抗炎症的目的。 [0050] 以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。

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