[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高品质发酵莲藕的制备方法。技术背景

[0002] 藕是一种组织脆嫩、含水量高的水生蔬菜。藕肉味甜，营养丰富，有健脾干胃，养血生肌，祛冷护肝之功效。莲藕集营养与药用价值为一体，是一种药食同源的食品，具有独特的保健功能，备受国内外消费者欢迎。

[0003] 在莲藕旺季，即便价格低廉，仍有大量的莲藕得不到充分利用。新鲜莲藕采后易失水、软化、褐变甚至腐烂变质，阻碍了莲藕产品的生产和流通。另外莲藕的时令性强，上市季节短，不利于产品的大规模生产推广。

[0004] 目前我国莲藕产业仍以初级加工制品为主并且加工的比例较低。主要是藕汁饮料、藕粉、糖渍藕、盐渍藕及一些经初加工处理的鲜莲藕制品，国内主要是以鲜食莲藕、藕粉为主，国外则对莲藕的食用较少，主要以盐渍藕和莲藕净菜为主。将莲藕进行发酵制成莲藕泡菜可以在保证原有营养的基础上，通过微生物发酵来提高产品的营养价值和其他附加价值，减少采后损失，延长贮存时间，这对于莲藕产品的多样化发展和产业进一步提升有重要的意义。

[0005] 未来莲藕产业进一步发展趋势是加强莲藕泡菜、藕茶、休闲藕片、藕脯、即食罐头以及莲藕保健品的开发，对莲藕进行深度加工，形成多样化、特色化、系列化产品，以绿色、健康、功能性的产品形象拓宽国内外市场。

[0006] 本发明目的在于提供一种新型发酵莲藕泡菜的制备方法，通过该方法制备的莲藕泡菜酸爽可口，开胃生津，且食盐、亚硝酸盐、生物胺含量较低，食用安全性高。

[0007] 本发明是通过以下技术方案进行的：一种新型发酵莲藕制备方法将莲藕清洗干净后，切片或整段，添加天然添加物，利用混合乳酸菌发酵剂，按常规发酵方法制备制得产品。

[0008] 具体制备方法是：盐浓度2％-4％(w/w)，乳清粉添加量2％-4％(w/w)，香料添加量为2‰-4‰(w/w)，辣椒添加量为1％-2％(w/w)，并接种5％-15％的混合乳酸菌发酵剂，20℃条件下发酵7d制备而成。

[0009] 本发明所述混合乳酸菌发酵剂中的菌株包括：植物乳杆菌grx15(Lactobacillus plantarum grx15)，保藏号是CGMCC NO.7.199；发酵乳杆菌grx07(Lactobacillus fermentum grx07)，保藏号是CGMCC NO.8874；鼠李糖乳杆菌grx19(Lactobacillus rhamnosus grx19)，保藏号是CGMCC NO.5519。

[0010] 进一步地，所述混合乳酸菌发酵剂的菌株由植物乳杆菌grx15、发酵乳杆菌grx07和鼠李糖乳杆菌grx19组成，其混合比例为1:1:1(v/v)。

[0011] 本发明在莲藕泡菜发酵过程中添加乳清粉，乳清是生产干酪的副产品，含有乳清蛋白、乳糖、维生素和矿物质等多种营养成分，价格低廉，能够促进泡菜发酵过程中乳酸菌的增殖。

[0012] 本发明制备的发酵莲藕泡菜，硬度、色度较好，总酸含量较高，感官得分较高，绿色健康，食用安全。

[0013] 本发明对制备的新型纯种发酵莲藕泡菜与自然发酵泡菜进行分析比较，可以发现纯种发酵莲藕的总酸、VC含量、挥发性氨基氮显著高于自然发酵组(P<0.05)，灰分不差异显著(P>0.05)，而水分、淀粉、蛋白质、总糖、PPO和POD酶活、食盐浓度均小于自然发酵(P<0.05)。两种发酵方式的泡菜品质接近，纯种发酵莲藕营养成分略优于自然发酵，而亚硝酸盐和生物胺等对人体有害的物质含量较低，说明本发明的新型纯种发酵泡菜制备方法，可在一定程度上提高产品质量，食用安全性高。

[0014] 本发明在莲藕泡菜杀菌条件的研究中，发现杀菌温度85℃，杀菌时间15min最为适合，即达到了杀菌的目的，又保持了莲藕泡菜原有的风昧。该产品在常温保藏30d内品质基本稳定，pH和总酸略微有波动，但是基本稳定在2.9％-3.0％之间和0.9％-1.0％之间；盐度维持在1.872％左右；亚硝酸盐含量先上升后下降，30d时含量为0.43mg/kg，远远小于国标要求。大肠杆菌<30MPN·(100g)-1，其他致病菌未检出，符合商业化生产的需求。

[0015] 本发明涉及的植物乳杆菌grx15，于2016年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏号：CGMCC NO.7.199。附图说明

[0016] 图1纯种发酵莲藕泡菜工艺流程图；

[0017] 图2～图4为莲藕泡菜pH、总酸、色度和硬度随温度和时间的变化；

[0018] 图5～图7为莲藕泡菜pH、总酸、色度和硬度随盐浓度和时间的变化；

[0019] 图8～图10为莲藕泡菜pH、总酸、色度和硬度随接种量和时间的影响；

[0020] 图11为硬化剂添加对莲藕泡菜硬度的影响；

[0021] 图12～图16为不同乳清粉添加量对泡菜pH、总酸、色度、硬度和感官的影响；

[0022] 图17～图21为不同辅料添加量对泡菜pH、总酸、色度、硬度和感官的影响；

[0023] 图22～图26为不同香料添加量对泡菜pH、总酸、色度、硬度和感官的影响；

[0024] 图27为香料添加量和乳清粉添加量及其交互作用对溶解度影响的响应面曲线和等高线；

[0025] 图28为辣椒添加量和乳清粉添加量及其交互作用对溶解度影响的响应面曲线和等高线；

[0026] 图29为辣椒添加量和香料添加量及其交互作用对溶解度影响的响应面曲线和等高线；

[0027] 图30～图33为莲藕泡菜在保藏期内pH、酸度、盐度、亚硝酸盐和感官的变化。

[0028] 本研究通过单菌和混菌接种试验，以质构、pH、总酸、色度和感官为指标，确定最佳菌种配比。通过单因素试验研究了发酵条件和辅料添加对莲藕质构和风味的影响。以温度、盐浓度和接种量为因子，总酸、硬度和感官评分作为评价指标，进行三因素三水平正交试验，确定最佳发酵条件。通过响曲面法，以感官评价为响应值，确定辅料添加的最佳配方，制备风味醇香、绿色健康安全的高品质的莲藕泡菜。

[0029] 1 莲藕发酵工艺

[0030] 1.1 原材料的处理

[0031] 选用市售肉质白、根头粗壮、完整无损伤、品种一致的新鲜莲藕，洗去泥土，置于5℃冷库中过夜，次日用不锈钢刀去皮，切除藕节，切分为厚0.5cm左右的薄片。

[0032] 1.2 发酵料液的制备

[0033] 分别按2％和2％(w/w)的量在水中加入乳清粉和食盐溶解，121℃灭菌15min，备用。

[0034] 1.3 加工工艺流程

[0035] 如图1所示。

[0036] 1.4 生产操作要点

[0037] (1)藕的选择和处理

[0038] ①选料选取成熟度高，无腐烂变质无机械损伤和虫害斑点的莲藕，按藕径适当分级。

[0039] ②清洗用流动水洗净附着在上面的杂质。

[0040] ③用不锈钢刀去皮、切片(0.5cm)、再用清水冲洗干净，

[0041] (2)泡制

[0042] 菜水比为1:1。在发酵液内加人大蒜、生姜、辣椒、以及香料(荷叶、八角、花椒)，投入预处理过后的莲藕，接种10％发酵剂，最后水封、定期检查坛内pH变化。

[0043] (3)调味包装

[0044] 泡菜水pH达3.5左右，盐水、菜盐浓度一致时泡菜成熟。出坛调味。调味后包装成约500g的小袋。然后真空密封。

[0045] (4)杀菌、冷却、检验

[0046] 不同温度下巴氏杀菌，后冷却迅速冷却。并按GB/T 5009.54-2003酱腌菜卫生标准的分析方法进行理化和细菌指标的检验。

[0047] (5)感官评定

[0048] 产品应有愉快的色泽，无变色发暗现象，香气柔和，质地脆嫩，酸咸适度。

[0049] (6)保温检验

[0050] 将成品于28℃作保温检验，验其保质期。

[0051] 2.菌株组合对莲藕发酵质构和风味的影响

[0052] 将菌株按不同比例混合(见表1)接种于莲藕进行发酵，接种量10％，温度20℃，盐浓度2％，乳清粉添加量为2％，发酵7d，测定莲藕质构、色度、感官以及总酸含量和pH值，结果如表1所示。

[0053] 表1 不同菌株配比设计

[0054]

[0055] 表2 不同菌株组合发酵泡菜的品质评定

[0056]

[0057] 根据表2可得，在pH和总酸方面，各组pH均达到4.0以下，1号pH最高为3.85，15号最低达到3.37，其他各组在3.4-3.6之间，差异性不显著。5号、7号、9号、12号、14号和15号总酸含量较高，达到1％以上，其中14号总酸含量最高，达到1.28％，显著高于其他组别(P<0.05)。

[0058] 在色度方面，各组均高于空白对照1号组。其中6号、13号、14号色度均高于75，莲藕颜色较白，其中14号色度显著高于其他组(P<0.05)。

[0059] 在质构方面，5号、6号、14号、16号和17号较好。其中，5号、6号、7号、9号、13号、14号和17号硬度较大，显著高于其他菌株组合(P<0.05)，4号、5号、6号和14号粘附性显著低于其他组别(P<0.05)；6号、9号、10号、11号、14号、15号和16号弹性较大，其中6号显著高于其他组合(P<0.05)；另外6号、14号、16号和17号的咀嚼性显著高于其他组合(P<0.05)。

[0060] 在感官评分方面，5号、7号和14号感官分值较高，总分14号最高，显著高于其他组合(P<0.05)。

[0061] 综合以上因素，确定14号为最佳菌种配比，即grx15：grx07：grx19＝1：1：1。

[0062] 3 最佳发酵条件的研究

[0063] 3.1 温度对莲藕泡菜质构和风味的影响

[0064] 按筛选出的优良发酵剂组合接入到莲藕中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃条件下发酵，乳清粉添加量为2％、盐水浓度为2％，发酵剂接种量为10％，每隔1d测定莲藕pH、总酸含量、质构和色度，结果如图2～图4所示。

[0065] 由图2可知，随着发酵时间的增加，莲藕的酸度逐渐上升，环境温度越高，最终酸度越高，30℃发酵终点酸度为1.24％。并且，30℃时的产酸速度也较快。发酵初始，温度对pH有较大影响，20℃、25℃和30℃条件下pH下降较快，第3d开始25℃和30℃条件下pH相近，30℃时发酵最终仅为3.14，过酸。15℃和20℃发酵过程中pH下降速度相对较慢，平衡后稳定在3.4左右。

[0066] 由图3可知，随着发酵时间的延长，莲藕的色度降低，略微变黄，但是总体上颜色较白L*维持在70以上。20℃条件下，色度维持最好，发酵7d后仍保持在78左右。

[0067] 由图4可以发现，发酵莲藕的硬度一开始下降较快，第3d后，15℃和30℃温度条件下的硬度相近；第5d后，所有温度条件下莲藕的硬度几乎维持在同一水平。发酵后期15℃条件下莲藕的硬度下降更快，而其他三个温度条件下硬度维持在较好水平，发酵7d，硬度在42N以上。

[0068] 综上所述，温度过低时，泡菜产酸速度较慢，发酵周期长；而温度过高时，菌株生长活力增强，可能会使泡菜过酸，另外温度较高可能会破坏莲藕的质构，加速莲藕的褐变。综合以上分析，发酵温度为20℃，莲藕泡菜的状态较好，选其作为最适因素进行下一步研究。

[0069] 3.2 盐浓度对莲藕泡菜质构和风味的影响

[0070] 调盐水浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％，乳清粉添加量为2％，发酵剂接种量为10％，每隔1d测定莲藕pH、总酸含量、质构和色度，结果如图5～图7所示。

[0071] 图5显示出，盐浓度越大，pH值降低的越慢。盐浓度为1％时，发酵液pH值在第1d迅速降低，5d后达到平衡，且平衡后pH值低于其它各组，pH降到最低为3.41，一般泡菜成熟指标为3.5左右。盐浓度为4％、5％时，菌株产酸受到了较大的影响，pH下降相对较缓慢。

[0072] 另外从图中也可以看出，1％和2％盐浓度时产酸速度较快，总酸增加较多，最终维持在0.92％左右；5％盐浓度时，总酸含量增加较慢，发酵第7d仅为0.74％。

[0073] 由图6可知，随着发酵时间的延长，莲藕的色度降低，但是总体上L*维持在70以上，盐添加量为2％时，亮度最大，发酵7d后仍保持在80左右。

[0074] 采用不同食盐添加量腌制泡菜，发酵过程中微生物生长情况以及酸性环境有差异，莲藕细胞的渗透压、色素物质和参与美拉德反应的糖类等物质的不同，所以对色泽的影响不尽相同。也有研究表明，低盐浓度能抑制褐变，盐浓度过高会抑制乳酸菌的生长，影响其抗氧化能力，使莲藕褐变速度加快。基于对消费者感官的考虑，选择2％的食盐浓度较为适宜。

[0075] 由图7可以看出，发酵7d后，3％食盐浓度泡制莲藕硬度损失较少，2％食盐浓度的泡菜次之。这可能是此食盐浓度下的相关微生物数量少，其产生分解细胞结构的酶量降低，且这些酶在较高浓度的NaCl中其活性也会受到影响，使得组织结构遭到破坏的程度降低，减少硬度损失。而盐浓度过高，Na+可以通过置换莲藕细胞多糖分子中的Ca2+，破坏细胞结构中多糖分子间的氢键导致分子的分散性增加，也可能导致其硬度降低。

[0076] 食盐浓度是影响泡菜发酵速度和品质的一个重要因素。食盐浓度过低，腐败微生物容易生长，泡菜质量难以保证，且产品风味欠佳；食盐浓度过高，抑制乳酸菌生长，发酵速度较慢，发酵周期长，且风味难以被广大人群接受。综上所述，食盐添加量为2％时，发酵莲藕的风味、状态较好，选其作为最适因素进行下一步研究。

[0077] 3.3 接种量对莲藕泡菜质构和风味的影响

[0078] 乳清粉添加量为2％，盐水浓度为2％，发酵剂接种量分别为5％、10％、15％、20％，20℃下发酵莲藕，每隔1d测定莲藕pH、总酸含量、质构和色度，结果如图8～图10所示。

[0079] 由图8可以看出，接种量对发酵产酸有较大影响，接种量越大，pH值降低速度越快。在发酵初始阶段pH值下降较快，第3d开始，10％、15％和20％的接种量pH变化基本一致，到第7d时pH分别为3.28、3.27和3.14。随着发酵的进行，总酸含量不断增加，而且接种量越多产酸速度越快，当乳酸菌接种量为20％时，在发酵第7d总酸含量最高，达到0.97％，接种量为5％时，发酵7d总酸仅为0.78％。

[0080] 由图9可知，在5-15％范围内菌株添加量越大，色度变化越小，发酵7d后能够维持在75以上。添加量为20％时，色度下降较快，最终只有73左右。这可能是由于，在一定范围内乳酸菌添加量越多，抗氧化能力越强，PPO酶和POD酶活被抑制。乳酸菌超过一定量，可能导致环境营养缺少，菌株生长繁殖被抑制，抗氧化活性下降，藕片在发酵过程中易褐变。

[0081] 由图10可以看出，5％接种量泡菜硬度损失较少，这可能是由于微生物数量较少，其产生分解细胞结构的酶量降低，组织结构遭到破坏的程度减少，从而硬度损失较低。

[0082] 综上所述，接种量过大会引起溶氧不足，从而影响产物合成，并且还会产生过多代谢废物，对感官品质产生不良影响，而接种量过小会又影响发酵效率，延长发酵时间。当混合菌株添加量为10％时，莲藕发酵产酸速率较快，发酵莲藕的色度、硬度状态较好，因此选其作为最适因素进行下一步研究。

[0083] 3.4 正交试验优化发酵条件

[0084] 在单因素试验基础上，选取对发酵莲藕泡菜影响较大的三个因素，即接种量(A)、温度(B)、盐浓度(C)进行L9正交优化实验，以酸度、硬度和感官评价为指标，确定发酵豆乳的最佳工艺条件。发酵莲藕泡菜工艺正交试验结果见表3。

[0085] 表3 发酵工艺正交试验结果表

[0086]

[0087]

[0088] 从极差分析结果可以看出，泡菜发酵产酸的最佳组合为A2B2C3，温度和接种量对总酸的影响较大，盐浓度的影响较小，这三个因素对于总酸的影响都达到显著水平。硬度方面，温度和盐浓度是亚硝酸盐含量的重要影响因素，各因素影响大小为：C(盐浓度)>B(温度)>A(接种量)，最佳组合为A2B2C2。从感官评分上来看，温度和盐浓度对感官品质影响较大，各因素影响大小为：B＝C>A，最佳组合为A2B2C2。

[0089] 因此，综合考虑各因素指标，选择最佳发酵条件为：A2B2C2，即接种量10％，温度20℃，盐浓度2％，此时莲藕泡菜的总酸为1.017％，硬度为42.5N，感官得分为85。

[0090] 4.辅料添加对莲藕泡菜品质的影响

[0091] 4.1 硬化剂添加对莲藕泡菜的影响

[0092] 选用硬化剂0.1％CaCl2、0.1％MgCl2、6％乳糖和1％葡萄糖浸泡洗净切片的莲藕，测定莲藕浸泡前后质构变化，结果如图10，用CaCl2浸泡效果最佳，硬度显著高于其他硬化剂效果(P<0.05)。这可能是因为氯化钙具有凝固性，它可以使可溶性果胶凝固为凝胶状不溶性果胶酸钙，保持果蔬加工制品的脆度和硬度。并且钙盐能一定程度上抑制果胶甲酯酶等水解酶的活力，这些酶的水解作用使中胶层溶解，纤维分解，导致细胞壁发生明显的变化，结构松散失去黏结性，此外果胶结构的变化使果蔬质地变软、脆度降低。此外，钙是人体内重要的无机成分，以盐的形式存在于人体的各个组织内，具有多种生理功能，如调节神经心肌，参与肌肉收缩，细胞分泌，凝血过程等，故氯化钙也可以作为一种食品强化剂。，[0093] 4.2 乳清粉添加添加对莲藕泡菜的影响

[0094] 乳清粉添加量分别为1％、2％、3％、4％，盐浓度为2％，发酵剂接种量为10％，20℃条件下接种发酵并且在相同条件下培养。发酵7d后测定莲藕pH、总酸含量、质构和色度，并进行感官评价，结果见图12～图16。

[0095] 由图12和13可以看出，随着乳清粉添加量的增加，pH先下降后上升，总酸含量先上升后下降。添加适量的乳清粉(2％、3％)情况下，其pH值更低，总酸更高，而且降速也更快。经差异性分析得出，乳清粉添加量为3％，pH显著低于其他浓度(P<0.05)。乳清粉添加量为
2％和3％时，总酸含量显著高于其他组(P<0.05)。

[0096] 这可能是由于乳清粉的添加能够为乳酸菌发酵提供营养因子，提高其产酸速度和产酸量。当乳清粉浓度较高时，泡菜水呈黏稠状，感官品质较差，而且过高的乳清粉浓度产生的高渗透压还会抑制乳酸菌的发酵。

[0097] 由图14可以看出，2％加乳清粉量发酵莲藕泡菜的色度明显著高于其他组别(P<0.05)，一可能是由于过高的乳清粉添加量会使发酵液颜色变黄，引起非酶褐变使莲藕泛黄，二是抑制了乳酸菌的生长使抗氧化活性下降，酶促褐变加强。

[0098] 由图15可以看出，添加1％-2％乳清粉时，硬度增加，超过2％，硬度随着乳清粉浓度的提高而降低。

[0099] 根据图16可以得出，乳清粉添加量在2％和3％范围内感官品质较好，感官评分维持在80分以上，显著高于其他浓度水平(P<0.05)。

[0100] 乳清粉添加量少，乳酸菌所需的营养物质少不利于生长繁殖；乳清粉添加量过多会影响泡菜的风味，并且从养生保健的角度上也不推荐。因此，综合考虑不同乳清粉添加量对发酵莲藕pH值、总酸、色度、硬度以及感官评定结果，选择2％为乳清粉添加水平用于后续的响应面设计实验。

[0101] 4.3 辣椒、大蒜、生姜添加对莲藕泡菜的影响

[0102] 腌制泡菜时加入辣椒、大蒜和生姜，可以提升泡菜的风味。辣椒洗净后直接添加，大蒜、生姜经清洗、削皮、切条或切片后添加。在莲藕泡菜发酵时，分别添加1％、2％、3％、4％、5％的大蒜、辣椒和生姜，乳清粉添加量添加量为2％，发酵剂接种量为10％，20℃条件下接种发酵并且在相同条件下培养。发酵7d后测定相关指标。结果见图17～图22。

[0103] 图17和图18显示，辣椒添加量为2％时产酸最多，pH最低。当添加量大于3％，pH升高、总酸降低。大蒜添加量为2％和3％时pH显著低于其他组别(P<0.05)，酸度显著高于其他组别(P<0.05)。生姜添加量为3％时pH最低，酸度显著高于其他组别(P<0.05)。

[0104] 由图可以看出，辣椒添加量为1-3％时，色度随着添加量的增加而增加，添加量为3％时，色度显著高于其他组别(P<0.05)，超过3％则降低，可能是由于辣椒本身色素溶出。
辣椒中的辣椒素具有抗炎及抗氧化作用，能抑制莲藕的褐变。

[0105] 大蒜的添加量为2％和3％时，色度显著高于其他组别(P<0.05)。蒜氨酸及其分解产物是大蒜及其制品发挥抗氧化作用的重要成分。另外大蒜里的含硒化合物具有很强的抗氧化作用,可以减少自由基的破坏，具有一定的防癌、抗癌功效。

[0106] 生姜添加量为2％时色度显著高于其他组(P<0.05)。生姜中含有姜醇、姜酌、姜酮等活性物质，这些物质具有较好抗氧化功能，从而抑制莲藕的褐变。

[0107] 由图20可以看出，辣椒添加量为2％时，硬度为51.4N，显著高于其他组(P<0.05)。大蒜添加量为3％时，硬度为53.7N，显著高于其他组(P<0.05)。生姜添加量为2％时，硬度为
47.1N，显著高于其他组(P<0.05)。

[0108] 从图21中可以看出辣椒添加量在3％及以下为宜，大蒜添加量在2％和3％时感官评分较高，生姜添加量在2％和3％为宜，过量则会降低泡菜品质，影响感官。

[0109] 在泡菜腌制过程中，辣椒起调和诸味、增加鲜味的作用。大蒜能够为泡菜提香，刺激人们的食欲，适量的生姜也可抑菌、去除异味以及赋予泡菜良好风味。但是，辣椒添加量过多，会使泡菜过辣，影响食用愉悦性。大蒜添加量过多，会使泡菜刺激性蒜辣味过大，掩盖了泡菜本身的发酵香味和莲藕的清香。

[0110] 综合上述指标，选取辣椒添加量2％、大蒜添加量3％以及生姜添加量2％作为最适添加量进行下一步试验。

[0111] 4.4 香料添加对莲藕泡菜的影响

[0112] 花椒：荷叶：八角＝2：1：1，分别按2‰、4‰、6‰、8‰直接添加，乳清粉添加量为2％，盐浓度为2％，发酵剂接种量为10％，20℃条件下接种发酵并且在相同条件下培养，发酵7d后测定相关指标，结果见图22～图26。

[0113] 由图22可知，香料添加量为4‰时，pH显著低于其他组(P<0.05)。添加量为6‰时，酸度显著高于其他组(P<0.05)。研究表明，添加花椒能显著促进乳酸菌生长。

[0114] 从图24可以看出，添加2‰和4‰的香料莲藕泡菜色度显著高于其他组(P<0.05)。这可能是由于花椒中主要活性成分生物碱、挥发油、多糖、黄酮均有不同程度的抗氧化及酪氨酸酶抑制活性，其中生物碱的酪氨酸酶抑制活性最强。八角和荷叶提取物也都具有抗氧化功能，可以抑制褐变引发酶活性。所以适量的添加香料能抑制莲藕的褐变。

[0115] 从图25可以看出，香料添加2‰，硬度显著高于其他组(P<0.05)。添加过多香料可以使发酵液中的渗透压升高，蔬菜中的营养物质溶出，加快了微生物繁殖，可能使溶解细胞壁的酶含量身高，破坏细胞结构，使莲藕泡菜硬度降低。

[0116] 从图26可以看出，香料添加量为4‰时，感官得分显著高于其他组(P<0.05)，超过4‰，感官评分下降。泡菜生产中加入不同比例的天然物质，可以增进泡菜的风味。香料在泡菜盐水中起增香、除异、去腥的功效，甚至还可以可以保持泡菜色鲜。但是香料添加过多会使刺激性气味掩盖泡菜原本的风味，也会使发酵液发黄浑浊，对产品产生不良影响。

[0117] 综上所述，香料添加量为4‰时对泡菜总酸、色度、硬度影响较好，感官得分较高。

[0118] 4.5 响应面优化辅料添加比例

[0119] 4.5.1 辅料添加PB试验

[0120] 在前期试验基础上，采用部分因子试验设计方法对乳清粉、硬化剂、辣椒、生姜、大蒜和香料等六个因素进行筛选，从中筛选出对莲藕发酵影响较大的因素，结果如表6和表7所示。

[0121] 表6 Plackett-Burman设计表及实验结果

[0122]

[0123] 表7 Plackett-Burman实验各因素的效应表

[0124]

[0125] 6个因素中对响应值影响的显著性如表7所示，因此，以感官得分为响应值则应选乳清粉添加量、辣椒添加量以及香料添加量作为后续试验的主要研究因素。

[0126] 4.5.2 Box-Behnken实验设计

[0127] 在上述已经选取的3个单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选择乳清粉添加量(A)、辣椒添加量(B)和香料添加量(C)作为响应面优化的考察因素，以产品感宫评价为响应值，设计三因素三水平试验，试验结果见表8。

[0128] 表8 BBD实验设计及实验结果

[0129]

[0130] 4.5.3 各因素对发酵莲藕感官评价的响应面分析

[0131] 用Design-Expert对表8中的试验数据进行多元回归拟合，感官评价Y对乳清粉添加量(A)、香料添加量(B)和辣椒添加量(C)三个因素的二次多项式回归模型分析结果为：Y＝78.20+0.63A+0.50B-0.38C+1.50AB-2.25AC+0.000B C-1.98A2-2.23B2-3.97C2

[0132] 对Y回归模型分别进行方差分析和显著性试验，结果见表9。由表9数据可知，该模型极显著(P＝0.0034<0.05)。失拟项(P＝0.7065>0.05)不显著，说明该二次模型能够拟合真实的试验结果，试验误差较小，能充分表明各因素之间的关系。

[0133] 在所研究的各因素水平范围内，C2表现极显著，说明辣椒添加量对感官的影响最大，选择合适的辣椒添加量对于控制最终产品风味具有非常重要的作用。其次是香料和乳清粉添加量。因此，对感官的影响依次为C>B>A，即辣椒添加量>香料添加量>乳清粉添加量。

[0134] 从图26～图29中看出各因素之间的交互作用对发酵莲藕感官的影响并不是简单的线性关系。葡萄乳清粉添加量和辣椒交互作用的等高线图也为楠圆，说明A与C交互作用显著，对发酵莲藕感官的而影响很大。其次是乳清粉添加量和香料添加量次之，香料添加量和辣椒添加量交互作用最小。C.V表示实验本身的精确度，其值越小，表明实验的可靠性越高，本实验中C.V较低，为1.76％，说明实验的操作可信度高，可用于预测发酵产品的感官品质，因此此模型具有一定的实践指导意义。

[0135] 表9 二次多项模型及各项的方差分析

[0136]

[0137] 为检验响应面曲线法所得结果的可靠性，进一步确定最佳条件，在模型浓度范围内选择为基础，按照模型使用快速上升法进行优化，发酵莲藕得到最高感官评价分值的配方组合为：乳清粉添加量2.32％，香料添加量为4.44‰，辣椒添加量为1.86％，根据之前实验确定的CaCl2添加0.1％、生姜添加3％以及大蒜添加3％，盐2％，温度20℃，由此配方制成的莲藕泡菜感官得分较好为78.38分。

[0138] 4.6 验证试验

[0139] 按优化后的莲藕发酵条件和辅料添加量进行3次平行试验，发酵7d后测定各项指标。结果显示，接种发酵莲藕的各项指标值为硬度46.16N，色度77.65，pH为3.49，总酸1.09％，感官评分为77.5分，结果与预测值非常接近。因此说明优化结果准确可靠，响应面法对莲藕发酵条件的优化是可行的，具有一定的实际应用价值。

[0140] 5 莲藕自然和纯种发酵理化指标的分析比较

[0141] 纯种发酵组采用最佳工艺条件和辅料添加比例，自然发酵组除不接种发酵剂之外其余条件均相同，以新鲜莲藕为对照，发酵7d检测莲藕泡菜的主要成分，包括：pH值、总酸、色度、质构、食盐含量、亚硝酸盐含量、VC含量及氨基态氮含量等，结果如表10所示。

[0142] 表10 自然和纯种发酵过程中主要成分的差异

[0143]

[0144] 由表10可知，从水分来看，自然发酵的莲藕泡菜水分显著高于纯种发酵，但是低于新鲜莲藕(P<0.05)；从淀粉含量来看，纯种发酵显著低于自然发酵和新鲜莲藕，可能是由于乳酸菌分解淀粉能力较强。从蛋白质含量来看，纯种发酵同样显著低于自然发酵和新鲜莲藕，可能是由于乳酸菌细胞内蛋白酶活力较强，能直接分解和利用蛋白质。纯种发酵的总糖含量显著低于其他两组，可能是因为乳酸菌糖代谢较强。三种莲藕的灰分含量几乎相同，差异性不显著(P>0.05)。纯种发酵的总酸含量显著高于其他两组(P<0.05)，乳酸菌是发酵过程中的优势菌，产生大量乳酸。两种发酵方式的莲藕VC含量都显著低于新鲜莲藕(P<0.05)，这可能是由于VC不仅渗透到了泡菜液中，也可能被微生物分解利用。多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，能催化果蔬原料中的内源性多酚物质氧化生成黑色素，严重影响制品的营养，风味及外观品质。过氧化物酶也能催化酚类、类黄酮的氧化和聚合，导致组织褐变。纯种发酵的PPO酶和POD酶活力均小于自然发酵(P<0.05)，可能是由于乳酸菌的抗氧化活性较高。

[0145] 从盐度来看，发酵过程中，自然发酵的泡菜吸收的盐较多，纯种发酵的泡菜的含盐量较少。低盐泡菜符合现代食品工业低盐绿色健康的趋势。无论是自然或是纯种发酵，泡菜总氨基氮含量都显著低于新鲜莲藕(P<0.05)，这是因为泡菜发酵过程中氨基氮会不断溶出以及作为氮源被微生物生长繁殖所利用，发酵7d后，纯种发酵泡菜总氨基氮含量高于自然发酵组，维持在0.1％左右。

[0146] 从亚硝酸盐来看，发酵7d后，纯种发酵泡菜亚硝酸盐含量仅为0.68mg/kg显著低于自然发酵泡菜的1.55(P<0.05)，这可能与体系的pH值降低和总酸度增加有关。两种发酵方式泡菜样品中生物胺的总量为201.74和266.02mg/kg，按FDA规定，两种发酵方式的泡菜样品生物胺总量均在安全范围内，纯种发酵泡菜含量较少，安全性较高。

[0147] 综上所述，从莲藕的主要成分来看，纯种发酵优于自然发酵。

[0148] 6 莲藕泡菜杀菌条件的确定

[0149] 微生物的活动会引起低盐泡菜腐败，导致储藏时间短。因此，要延长泡菜的保质期必须在加工过程中控制微生物的数量。高温杀菌可杀死绝大部分微生物，但温度过高也会使泡菜脆度降低、组织软化甚至风味变劣。本试验具体的杀菌条件分别为：A：65℃，30min；B：75℃，20min；C：85℃，15min；D：95℃，10min；E：100℃，5min。每个样品经过杀菌后，冷却至室温，对样品进行活菌计数以及感官评价，选定最佳的巴氏杀菌条件，结果如表11所示。

[0150] 表11 不同杀菌条件对酸菜的影响

[0151]

[0152] 从表11可以看出，不同杀菌条件对莲藕泡菜的影响比较大，C组的杀菌条件最为适合，即达到了杀菌的目的，又保持了莲藕泡菜原有的风昧。温度在65℃-75℃之间，仍可以从样品中检测到活菌，未达到杀菌的目的，这会对常温下保存的莲藕泡菜产生影响；而温度过高时(>85℃)，虽然达到了一个很好的杀菌效果，但是会对莲藕泡菜的品质产生影响，使得泡菜的质地变软、色泽变暗。因此选择C组作为莲藕泡菜的杀菌条件，即杀菌温度为85℃，杀菌时间15min。

[0153] 7 莲藕泡菜成品贮藏试验

[0154] 将巴氏灭菌的莲藕泡菜常温保存5d、10d、15d、20d、25d、30d，分别测定理化指标和微生物指标。结果如图30～图33所示。

[0155] 由图30可以看出，巴氏杀菌后的莲藕泡菜在30d内，pH和酸度呈波动变化，pH维持在2.9-3.0之间，酸度在0.9％-1.0％之间，符合商业化生产的需求。

[0156] 由图31可以看出，接种发酵莲藕泡菜盐度在常温储藏15d后基本保持稳定，盐度较低维持在1.872％左右，低盐泡菜绿色健康，对身体有益，符合现代食品工业的发展趋势。

[0157] 由图32可以看出莲藕泡菜在常温下保藏15d时出现了亚硝峰，之后亚硝酸盐含量下降，逐渐稳定。在30d时仅为0.43mg/kg，远远小于国标要求，说明发酵莲藕泡菜常温下贮藏安全性较高。

[0158] 由图33可以看看出泡菜的感官变化，莲藕泡菜在一个月内能保持较好的品质，仅滋味略有变化，质地稍微发软，其他方面并没有明显的变化，仍然保持了泡菜的独特良好风味。此外，同时对泡菜进行了微生物检测，大肠杆菌﹤30MPN·(100g)-1，沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等其他致病菌未检出。因此，本试验制备的新型莲藕泡菜在常温下保藏品质基本稳定，安全性较好。

[0159] 实施例1

[0160] 选取成熟度高，无腐烂变质无机械损伤和虫害斑点的莲藕100.0kg，经流动水洗净附着在上面的杂质，用自动切片机去皮、切片(0.3cm-0.8cm)，再用清水冲洗干净。

[0161] 在泡菜坛内加人大蒜3kg、生姜2kg、辣椒1.86kg、以及香料0.44kg(花椒：荷叶：八角＝2:1:1)，投入预处理过的莲藕片，加入90升溶有食盐2kg、乳清粉2.3kg的凉开水，接种10升的植物乳杆菌grx15混合发酵剂，水封。当莲藕泡菜pH达3.5左右，泡菜卤和泡菜的盐浓度一致时取出调味，包装成约500g的小袋，真空密封。采用巴氏灭菌法，在85℃水浴中加热
15min，取出后迅速用冷水冷却，即得到莲藕泡菜成品。

[0162] 实施例2

[0163] 选取细长脆嫩、无机械损伤和虫害斑点的藕带100.0kg，经流动水洗净附着在上面的杂质，用自动切片机去皮、切段(10cm)，再用清水冲洗干净。

[0164] 在泡菜坛内加人大蒜2kg、生姜2kg、辣椒2kg、以及香料0.2kg(花椒：荷叶：八角＝2:1:1)，投入预处理过的藕带，加入90升溶有食盐2kg、乳清粉2kg的凉开水，接种10升的植物乳杆菌grx15混合发酵剂，水封。当藕带泡菜pH达3.5左右，泡菜卤和泡菜的盐浓度一致时取出调味，包装成约500g的小袋，真空密封。采用巴氏灭菌法，在85℃水浴中加热15min，取出后迅速用冷水冷却，即得到藕带泡菜成品。