[0001]本发明属于天然药物领域，涉及一种天然药物的提取，尤其涉及一种蛤蜊肽的提取方法。

[0002] 蛤蜊是山东半岛普遍的一种海鲜，被称为“天下第一鲜”，其肉质鲜美，同时营养也很全面，内含蛋白质、脂肪、碳水化合物、铁、钙、磷、碘、硒、维生素、烟酸、氨基酸和牛磺酸等多种成分。蛤蜊的营养特点是高蛋白、高微量元素、高铁、高钙、少脂肪。

[0003] 蛤蜊具有滋阴明目、润五脏、止消渴、开胃、解酒毒、消水肿、利水、化痰等功效。而蛤蜊的提取物蛤蜊肽可以抑制胆固醇在肝脏的合成和加速排泄胆固醇的作用，使体内胆固醇下降。药效比常用的降胆固醇的谷固醇等药物更好。另外，生物体在正常的代谢过程中会形成很多活性物质，比如超氧阴离子自由基、羟基自由基、脂氧自由基、过氧化氢等。过量的活性物质会产生破坏行为，改变细胞膜的结构及通透性、导致蛋白质变性，从而使细胞内正常功能无法进行。并且自由基还会攻击DNA 分子，造成基因突变。同时，动脉硬化、脑卒中、肥胖、白内障、心血管等疾病也与过多的活性物质有着密切的关系。而蛤蜊的提取物蛤蜊肽是一种具有抗氧化功能活性且易于吸收的蛋白多肽，对于人体的健康有着重要的意义。因此，如何高效的提取蛤蜊肽引起很多学者及专家的关注。现有技术在提取蛤蜊肽时普遍生产成本高、周期长且通常都只适用于实验室内的制备，真正用于规模化制备的很少，大多都不适于产业化生产。在申请号为201010253745.0的申请文件中公开了菲律宾蛤仔酶解多肽及其制备方法，其主要使用酶解法，依次用酶解、离心、过滤取上层清夜、超滤、阴离子交换柱洗脱、磷酸缓冲液和氯化钠冲洗。反应过程复杂，大规模生产成本高且中间加入其他如磷酸缓冲液等化学物质。

[0004] 本发明的目的是提供一种蛤蜊肽的提取方法，其适用原料不仅可以是新鲜的蛤蜊也可以是蛤蜊干，本生产工艺不添加任何有机溶剂、成本低、周期短、所得蛤蜊肽粉末含水量少、含盐量低、分子量小、溶解性强、生物活性高、纯度高、便于储存和运输。

[0005] 本发明的技术方案是：一种蛤蜊肽的提取方法，主要包括以下步骤，（1）混合：选取新鲜的蛤蜊，去掉外壳并绞碎作为原料，加入纯水搅拌均匀后用食品级氢氧化钠调节PH，然后加入碱性蛋白酶并混合均匀；
（2）萃取：将混合物放入超临界萃取机，调节温度、压力进行提取；
（3）灭酶：将提取后所得的提取液升温使其灭酶；
（4）离心：用离心机将提取液离心得到蛤蜊提取液，离心机转速为18000转/分钟；
（5）过滤吸附：蛤蜊提取液经离子过滤器过滤吸附；所述离子为阴阳离子，所述阴阳离子为树脂，孔径为2-4nm,主要吸附铅砷等重金属；
（6）分离：将滤液经纳滤分离装置进行分离、浓缩；
（7）干燥：将浓缩液干燥。

[0006] 优选的，所述纯水的加入量为蛤蜊碎肉的1-1.2倍，用食品级氢氧化钠调节后的PH为7.8-8.5，碱性蛋白酶的浓度为20U/mg，加入量为蛤蜊碎肉重量的1-2%。

[0007] 优选的，所述碱性蛋白酶为外切蛋白酶，包含胶原蛋白酶、脂肪酶、糖元酶、核酸酶等。

[0008] 优选的，所述超临界萃取的压力为30-50MPa，温度为48-58℃，萃取时间为60-80min。

[0009] 优选的，所述灭酶的温度为90-95℃，时间为10-15min。

[0010] 优选的，所述纳滤分离装置所用膜孔径为1纳米。

[0011] 优选的，所述干燥为喷雾干燥。

[0012] 在本发明中，超临界萃取可以有效提取所需的物质且过程中具有清洁、无毒、无污染、条件温和、提取时间短等特点，并且超临界萃取技术能把高沸点、低挥发性、易热解的物质在远低于其沸点温度下萃取出来，使其能很好的和酶充分结合，从而酶可以更好更快的剪切蛤蜊的分子链。超临界萃取使得萃取和分离的步骤合二为一，提取时间比普通酶解法缩短了33%，并且全程没有使用有机溶剂，因此萃取物绝无残留的溶剂物质，从而防止了有机溶剂的存在给人体健康和环境带来的伤害，保证了产品100%的天然性。

[0013] 在超临界萃取过程中压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数，即通过改变温度和压力来达到萃取的目的，而本工艺既可同时调节温度与压力，也可固定一个参数只调节另外一个参数即可以保持温度不变调节压力或者保持压力不变调节温度来达到萃取的目的，使得工艺简单容易掌握且萃取速度快。升温灭酶使酶失去活性以便后续蛤蜊液的提纯；离心过程脱去提取液中的脂肪和固形物，产品达到零脂肪。

[0014] 本发明中，离子过滤器所用树脂为羟基阴阳大孔树脂，经过离子过滤不但能脱去腥味，而且能很好的吸附重金属，能使产品口感更好，且更好的保证产品的质量安全，满足食品和保健品原料的需求。经纳滤膜分离装置的分离过程可脱去提取液中的盐并将其浓缩且整个过程均在常温下操作、无相态变化、不产生污染，本发明中纳滤膜优选膜孔径为1纳米的纳滤膜，不但能更好的脱去分子量小于100道尔顿的盐类物质，使产品品质纯正而且能使滤液浓缩节省后续工序的浓缩时间、降低能耗。本发明的提取方法整体反应条件温和、操作简便且安全性能高、周期短、成本低、不产生任何有毒有害物质。

[0015] 而本发明涉及的提取方法所得的蛤蜊肽中肽分子量为300~1000道尔顿的肽含量达到95%以上，且分子量不小于1000道尔顿的肽含量在5%以内，能很好的被人体吸收，同时本发明生产的蛤蜊肽烟酸、砷的含量高，产品口感好、无异味、无苦味，可广泛应用于食品、保健品和药品等领域。

[0016] 实施例一选取新鲜的蛤蜊若干，去掉外壳，用绞肉机绞碎称重为1000g，加入1000ml纯水搅拌均匀后加入食品级氢氧化钠调节PH至7.8，再加入20U/mg的碱性蛋白酶10g，然后将其放入超临界萃取机，升温至48℃，压力调节为30MPa，萃取60min。萃取完成后将提取液升温至90℃，持续10min，使提取液灭酶。将提取液用离心机脱去脂肪和固形物后再经过过滤吸附装置脱去腥味和重金属，然后再经过膜孔径为1纳米的纳滤分离装置进行分离，使其脱盐并浓缩。
将浓缩液喷雾干燥后即得蛤蜊肽精品。表1为实施例1所得产品的检测报告
表1：实施例1所得产品的检测报告
检测项目 国家标准规定（100g） 检测结果
形态 粉末状，无结块现象 粉末状，无结块
杂质 无正常视力可见外来杂质 无杂质
肽（分子量300-1000道尔顿）含量 ≥75.0%  95.8%
pH值（10wt%水溶液） 7.0-8.0 7.3
水分 ≤7.0% 3.55%
灰分 ≤10.0% 1.00%
烟酸   5.8mg
硒   0.6mg
砷含量（以As元素计） ≤0.5mg/kg 0.01mg/kg
铅含量（以Pb元素计） ≤0.5mg/kg 0.02mg/kg
细菌总数 ≤30000cfu/g 1000cfu/g
大肠菌群 ≤40MPN/100g ＜20MPN/100g
霉菌和酵母 ≤50cfu/g ＜20cfu/g
致病菌 不得检出 未检出
由表1的检测报告可知：本工艺所得的蛤蜊肽产品无一般产品的腥味，作为食品口感好、分子量小，几乎全为短肽产品，而且其他指标也都高于国家标准，特别是烟酸、硒的含量比较高而且几乎不含重金属。

[0017] 实施例二选取新鲜的蛤蜊若干，去掉外壳，用绞肉机绞碎称重为2000g，加入2200ml纯水搅拌均匀后加入食品级氢氧化钠调节PH至8.2，再加入20U/mg的碱性蛋白酶40g，然后将其放入超临界萃取机，升温至58℃，压力调节为50MPa，萃取80min。萃取完成后将提取液升温至95℃，持续15min，使提取液灭酶。将提取液用离心机脱去脂肪和固形物后再经过过滤吸附装置脱去腥味和重金属，然后再经过膜孔径为1纳米的纳滤分离装置进行分离，使其脱盐并浓缩。
将浓缩液喷雾干燥后即得蛤蜊肽精品。表2为实施例2所得产品的检测报告。

[0018] 表2：实施例2所得产品的检测报告检测项目 国家标准规定（100g） 检测结果
形态 粉末状，无结块现象 粉末状，无结块
杂质 无正常视力可见外来杂质 无杂质
肽（分子量300-1000道尔顿）含量 ≥75.0%  97.8%
pH值（10wt%水溶液） 7.0-8.0 7.0
水分 ≤7.0% 1.50%
灰分 ≤10.0% 0.08%
烟酸   5.8mg
亮氨酸   0.5mg
砷含量（以As元素计） ≤0.5mg/kg 0.01mg/kg
铅含量（以Pb元素计） ≤0.5mg/kg 0.01mg/kg
细菌总数 ≤30000cfu/g 1000cfu/g
大肠菌群 ≤40MPN/100g ＜10MPN/100g
霉菌和酵母 ≤50cfu/g ＜10cfu/g
致病菌 不得检出 未检出
由表1的检测报告可知：本工艺所得的蛤蜊肽产品无一般产品的腥味，作为食品口感好、分子量小，几乎全为短肽产品，而且其他指标也都高于国家标准，特别是烟酸、硒的含量比较高而且几乎不含重金属。

[0019] 实施例三选取新鲜的蛤蜊若干，去掉外壳，用绞肉机绞碎称重为100kg，加入1200l纯水搅拌均匀后加入食品级氢氧化钠调节PH至8.5，再加入20U/mg的碱性蛋白酶1.5kg，然后将其放入超临界萃取机，升温至50℃，压力调节为40MPa，萃取80min。萃取完成后将提取液升温至93℃，持续13min，使提取液灭酶。将提取液用离心机脱去脂肪和固形物后再经过过滤吸附装置脱去腥味和重金属，然后再经过膜孔径为1纳米的纳滤分离装置进行分离，使其脱盐并浓缩。
将浓缩液喷雾干燥后即得蛤蜊肽精品。表3为实施例3所得产品的检测报告。

[0020] 表3：实施例3所得产品的检测报告检测项目 国家标准规定（100g） 检测结果
形态 粉末状，无结块现象 粉末状，无结块
杂质 无正常视力可见外来杂质 无杂质
肽（分子量300-1000道尔顿）含量 ≥75.0%  97.6%
pH值（10wt%水溶液） 7.0-8.0 7.4
水分 ≤7.0% 1.15%
灰分 ≤10.0% 0.07%
烟酸   6.9mg
硒   0.8mg
砷含量（以As元素计） ≤0.5mg/kg 0.01mg/kg
铅含量（以Pb元素计） ≤0.5mg/kg 0.01mg/kg
细菌总数 ≤30000cfu/g 1000cfu/g
大肠菌群 ≤40MPN/100g ＜10MPN/100g
霉菌和酵母 ≤50cfu/g ＜10cfu/g
致病菌 不得检出 未检出
由表1的检测报告可知：本工艺所得的蛤蜊肽产品无一般产品的腥味，作为食品口感好、分子量小，几乎全为短肽产品，而且其他指标也都高于国家标准，特别是烟酸、硒的含量比较高而且几乎不含重金属。

[0021] 以上所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是，凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明的保护范围。