一种复合酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物的制备方法 |
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| 申请号 | CN201610308451.0 | 申请日 | 2016-05-11 | 公开(公告)号 | CN105918611A | 公开(公告)日 | 2016-09-07 |
| 申请人 | 东北农业大学; | 发明人 | 于国萍; 姚宇秀; 岳崇慧; 郭佩佩; 藏小丹; 陈媛; 范美婧; 王艳菲; 陈超; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种复合酶改性 乳清 蛋白制备可溶性 聚合物 的制备方法，属于蛋白制备的技术领域。本发明要解决现有酶改性诱导的凝胶随着冷藏时间的延长， 粘度 变化不显著或增速慢，胶凝能 力 差导致不适合应用的技术问题。本发明的方法：将乳清蛋白溶液搅拌预热，添加蛋白酶 水 解 ，水解之后用保鲜膜封口，立即加热使酶失活，用水冷却至50℃，加入mTGase 5.0U/g，反应1h，之后85℃、5min使酶灭活，样品冷却至室温，得到可溶性聚合物。本发明方法所生产的乳清蛋白可溶性聚合物表观透明，粘度适宜易于应用，稳定且具有高凝胶性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种复合酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物的制备方法，其特征在于该制备方法是由下述步骤完成的： |
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| 说明书全文 | 一种复合酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物的制备方法技术领域[0001] 本发明属于蛋白制备的技术领域；具体涉及一种复合酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物的制备方法。 背景技术[0002] 乳清蛋白占牛奶蛋白总量的20％，是生产干酪时所得的一种天然副产品。随着新的科学技术的不断研发，具有多种功能的乳清浓缩蛋白和乳清分离蛋白已经成为普及使用的功能性高蛋白食品配料。乳清蛋白的应用不仅改善产品的质地结构等性质状态，还因乳清蛋白是一种营养价值较高的优质蛋白，具有高消化吸收率、其必需氨基酸种类满足人体所需，且必需氨基酸与非必需氨基酸之间平衡良好，并且含有多种生物活性多肽，所以能提高产品的生理保健功能。乳清蛋白突出的功能特性有：成胶性、搅打起泡性、新型乳化性、涂层性、微胶束化等。 [0003] 利用酶法改性乳清蛋白的研究很多，从上世纪八十年代起就开始研究乳清蛋白限制性酶解，一般情况下，由于分子量的降低，酶改性诱导的凝胶的弹性和硬度较低。 发明内容[0005] 本发明利用复合酶法改性乳清蛋白制备可溶性聚合物，通过复合酶(蛋白水解酶和谷氨酰胺转氨酶)对乳清蛋白改性，即先利用蛋白水解酶：Alcalase2.4L、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、菠萝蛋白酶(bromelain)，作为谷氨酰胺转氨酶交联蛋白的预处理条件，制备具有适当粘性、高凝胶性稳定型的可溶性聚合物。制备出了以乳清蛋白为原料的具有稳定增稠高凝胶性的食品添加剂，提高乳清蛋白的应用价值。 [0006] 为解决上述技术问题，本发明中一种复合酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物的制备方法是由下述步骤完成的： [0007] 步骤一、将乳清蛋白溶液搅拌预热，用浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节pH值为7.0～8.25； [0008] 步骤二、然后添加蛋白水解酶进行水解反应，水解过程中滴加0.1mol/L NaOH维持pH值不变，水解完毕后用保鲜膜封口使酶失活； [0009] 步骤三、用水冷却至50℃，加入谷氨酰胺转氨酶mTGase 5.0U/g，反应1h； [0010] 步骤四、升温至(60～90)℃，反应5min使酶灭活，冷却至室温，得到可溶性聚合物。 [0011] 步骤一中所乳清蛋白溶液在50℃条件下搅拌预热5min。 [0012] 步骤一中用NaOH溶液调节pH值为8.0。 [0013] 步骤二所述的蛋白水解酶为Alcalase 2.4L、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜蛋白酶(papain)或菠萝蛋白酶(bromelain)；优选为胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)。 [0014] 步骤一中所乳清蛋白溶液的质量分数为8％～12％。 [0015] 步骤二中每100mL乳清蛋白溶液添加(2～30)μL蛋白水解酶；优选：步骤二中每100mL乳清蛋白溶液添加10μL蛋白水解酶。 [0016] 步骤二中所述的酶灭活温度为85℃，酶灭活时间为5min。 [0017] 本发明方法制备得到的可溶性聚合物表观透明，粘度适宜易于应用，稳定且具有高凝胶性；而且所制备的可溶性聚合物随着冷藏时间延长，粘度也随之增大且增速较快，形成的凝胶速度慢，更适合应用。当Chymotrypsin在极低水解度(乳清蛋白溶液的质量分数为10％，步骤二中每100mL乳清蛋白溶液添加10μL蛋白水解酶)时，形成聚合物粘度较大，胶着性高，弹性好，相同的冷藏时间粘度增速较快。 附图说明 [0018] 图1是水解过程中不同蛋白酶水解乳清蛋白水解度随时间的变化； [0019] 图2是不同水解酶改性WPI在各个水解度时浊度的变化； [0020] 图3是不同蛋白水解酶(DH0.01％)制得聚合物在冷藏0h和24h时粘度对比分析； [0021] 图4是在-4℃冷藏0、2、4、6和24h下pH值对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响； [0022] 图5是在-4℃冷藏0h下pH值对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响； [0023] 图6是在-4℃冷藏0、2、4和6h下酶灭活温度对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响； [0024] 图7是在-4℃冷藏0h下酶灭活温度对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响； [0025] 图8是在-4℃下冷藏0、2、4和6h下加酶量对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响； [0026] 图9是在-4℃下冷藏0h加酶量对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响。 具体实施方式[0027] 具体实施方式一：本实施方式中一种复合酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物的制备方法是由下述步骤完成的： [0028] 步骤一、将100mL质量分数为10％的乳清蛋白溶液在50℃条件下搅拌预热5min，用浓度为1.0mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.0； [0029] 步骤二、然后添加10μL胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)进行在50℃条件下水解反应30s，水解过程中滴加0.1mol/L NaOH维持pH值不变，反应完毕后立即于85℃加热5min使酶失活； [0030] 步骤三、用水冷却至50℃，加入谷氨酰胺转氨酶mTGase 5.0U/g，反应1h； [0031] 步骤四、升温至85℃，反应5min使酶灭活，冷却至室温，得到可溶性聚合物。 [0032] 本实施方式的Chymotrypsin水解度极低，制备的聚合物的粘度较大，胶着性高，弹性好，相同的冷藏时间粘度增速较快。 [0033] 采用下述实验验证发明效果： [0034] 一、复合酶改性乳清蛋白溶液的制备 [0035] 从Alcalase2.4L、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中筛选出与mTGase复合的酶，形成粘性适中稳定的可溶性聚合物。具体实验操作如下： [0036] 乳清蛋白溶液50℃预热并搅拌5min，用1.0mol/L NaOH调节pH至7.5，添加适量蛋白酶，酶底比分别为：Alcalase 2.4L 0.25％(体积)、胰蛋白酶0.2％(体积)、胰凝乳蛋白酶0.2％(体积)、木瓜蛋白酶0.2％(体积)、菠萝蛋白酶0.4％(体积)。温度为50℃，水解过程中滴加0.1mol/L NaOH维持pH不变。水解之后用保鲜膜封口，立即于85℃加热5min，使酶失活。 样品用水冷却至50℃，加入mTGase 5.0U/g，反应1h，之后85℃，5min使酶灭活，样品冷却至室温。 [0037] 二、蛋白酶的筛选 [0038] 对蛋白水解酶的活力、水解度、粘度、浊度分别进行测定。 [0039] 1、五种蛋白酶的活力比较 [0040] 利用福林酚法测定蛋白酶活力，如表1。 [0041] 表1五种蛋白水解酶的酶活力 [0042] Tab.3-5 The enzyme activity of proteases [0043] [0044] 2、五种蛋白酶水解度比较 [0045] 利用pH-stat法对水解度进行连续监测，水解过程中用0.1mol/L NaOH溶液保持pH的恒定，每隔1min记录消耗的NaOH体积(mL)，根据消耗的碱液体积得出反应中释放的质子含量。测定结果如图1所示，可知随着水解的进行，水解度不断增大。比较五种蛋白酶的水解效果，Alcalase2.4L和胰蛋白酶表现较为突出，其水解度显著高于其他三种蛋白酶，且上升速度也较快(水解曲线的斜率大)。其次为胰凝乳蛋白酶，水解速率较快。水解最缓慢的是菠萝蛋白酶，初始反应非常缓慢。 [0046] 3、不同水解酶和mTGase复合改性WPI对可溶性聚合物的粘度的影响 [0047] 制备的可溶性聚合物冷却至室温，利用旋转粘度计(NDJ-5S)测定其粘度，即为0h粘度，之后将样品置于4℃冰箱冷藏，测定聚合物冷藏2、4、6、24h的粘度。1min之内，每隔20s计数，三个数值取平均值。 [0048] Alcalase 2.4L和mTGase改性对可溶性聚合物粘度的影响如表2所示。 [0049] 表2水解度和冷藏时间对Alcalase 2.4L和mTGase改性WPI制得聚合物粘度的影响[0050] [0051] [0052] Trypsin和mTGase改性对可溶性聚合物粘度的影响如表3所示。 [0053] 表3水解度和冷藏时间对Trypsin和mTGase改性WPI制得聚合物粘度的影响[0054] [0055] Chymotrypsin和mTGase改性对可溶性聚合物粘度的影响如表4所示。 [0056] 表4水解度和冷藏时间对Chymotrypsin和mTGase改性WPI制得聚合物粘度的影响[0057] [0058] Papain和mTGase改性对可溶性聚合物粘度的影响如表5所示。 [0059] 表5水解度和冷藏时间对Papain和mTGase改性WPI制得聚合物粘度的影响[0060] [0061] Bromelain和mTGase改性对可溶性聚合物粘度的影响如表6所示。 [0062] 表6水解度和冷藏时间对bromelain和mTGase改性WPI制得聚合物粘度的影响[0063] [0064] 4、不同水解酶和mTGase复合改性WPI对聚合物浊度的影响 [0065] 样品测定完粘度之后，立即测定其浊度值，根据David spellman的方法，略有改动。样品原液测定，不用稀释，通过紫外分光光度计，在波长420nm下测定OD值，用去离子水进行调零。OD值即为浊度值。以未改性的乳清蛋白溶液为对照，每个样品测定三次。不同水解酶和mTGase复合改性WPI对聚合物浊度的影响如图2。 [0066] 5、酶筛选的结果 [0067] 选取五种酶Alcalase2.4L、Trypsin、Chymotrypsin、Papain和bromelain限制性水解乳清蛋白进行筛选，结果表明在偏碱性条件下(pH7.5)，Chymotrypsin和Trypsin在极低水解度时，形成聚合物粘度较大，胶着性高，弹性好，以冷藏0h和24h的粘度分析，这两种酶的粘度增速较快(图3)，且Chymotrypsin优于Trypsin。而Alcalase2.4L水解WPI再用mTGase交联，削弱了WPI的聚集能力。Alcalase2.4L和TG酶复合改性WPI，所形成聚合物的粘度低，呈渣状，随着冷藏时间的延长，粘度变化不显著，胶凝能力差，所以Alcalase2.4L改性WPI不易形成高凝胶稳定型聚合物。Papain改性制得聚合物粘度大于Trypsin，但是在冷藏时，粘度增速低，凝胶能力弱。所以筛选出Chymotrypsin与mTGase复合改性乳清蛋白制备可溶性聚合物。 [0068] 三、Chymotrypsin和mTGase复合改性条件优化 [0069] 乳清蛋白溶液50℃预热并搅拌5min，用1.0mol/L NaOH调节至相应的pH，添加适量胰凝乳蛋白酶，反应30s，水解之后用保鲜膜封口，立即在相应温度下使酶失活。样品用水冷却至50℃，加入mTGase 5.0U/g，反应1h，之后85℃，5min使酶灭活，样品冷却至室温，测其粘度及浊度。 [0070] 1、pH对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响 [0071] 根据上述步骤，pH分别调至为7.0、7.25、7.5、7.75、8.0和8.25。图4和5表明在不同pH条件下，复合酶改性制得聚合物在不同冷藏时间下的粘度。随着冷藏时间的延长，聚合物在各个pH条件下粘度逐渐增大，但在pH7-7.25的条件下，初始的粘度在10mPa.s，随着冷藏时间的延长，聚合物粘度不增大。随着冷藏时间的延长，pH为8时，粘度增速最快，冷藏6h时粘度超过100000mPa·s，所以本发明选择pH值调成8.0。 [0072] 2、酶灭活温度对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响[0073] 根据上述步骤，取100mL10％的乳清蛋白溶液，加入配制好的胰凝乳蛋白酶液。胰凝乳蛋白酶0.01g用去离子水配制成1mL的酶液，酶添加量分别为0、2、6、10、30、50、70和90μL。 [0074] 图7表示不同酶灭活温度，在冷藏0h时聚合物粘度的变化。酶灭活时间均为5min。随着温度的升高，乳清蛋白变性程度越大，分子结构被打开，继而聚合，聚合物的粘度一直升高。图6表示不同灭活温度，在不同冷藏时间下聚合物粘度的变化。酶灭活的温度低于70℃时，聚合物的粘度几乎不变化；温度高于85℃时，粘度随着冷藏时间的延长而迅速增大，本发明选择酶灭活温度85℃，5min。 [0075] 3、加酶量对Chymotrypsin和mTGase改性制备可溶性聚合物粘度的影响[0076] 根据上述步骤，胰凝乳蛋白酶酶灭活温度分别为60℃、70℃、80℃、85℃和90℃。图8表明了Chymotrypsin加酶量0、2、4、6、10、30、50、70和90μL和冷藏时间0、2和4h对聚合物粘度的影响，当冷藏时间达到6h，部分聚合物的粘度超过10万，所以数据未给出。从9图可以看出，未经冷藏的聚合物(0h)的粘度随着加酶量的增加，先增大后减小。当加酶量为10μL时，粘度最大，显著高于单独mTGase改性制备可溶性聚合物的粘度，且随着冷藏时间的延长，粘度增速最快。所以Chymotrypsin的加酶量为10μL。 |
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