一种提高大米蛋白溶解度的方法 |
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| 申请号 | CN201610237735.5 | 申请日 | 2016-04-15 | 公开(公告)号 | CN105876072A | 公开(公告)日 | 2016-08-24 |
| 申请人 | 中国农业科学院农产品加工研究所; | 发明人 | 王强; 石爱民; 刘红芝; 盛晓静; 刘丽; 胡晖; 杨颖; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及大米蛋白的提取，具体公开了提高大米蛋白 溶解度 的方法。所述方法为将大米蛋白进行 超 声波 细胞 粉碎 后，利用中性蛋白酶进行酶解，提高大米蛋白的溶解度。本发明通过大量客观实验对物理处理方法和蛋白酶的种类进行筛选，并在该筛选 基础 上，进行了多因素的优化，最终确定了能够显著提高大米蛋白溶解度的技术方案。本发明所述方法操作简单、条件温和、处理时间短、溶解度提高快。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白的溶解度可由0.62％提高至79.30％。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种提高大米蛋白溶解度的方法，其特征在于，所述方法为将大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，利用中性蛋白酶进行酶解，提高大米蛋白的溶解度。 |
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| 说明书全文 | 一种提高大米蛋白溶解度的方法技术领域[0001] 本发明涉及大米蛋白的提取，具体地说，涉及提高大米蛋白溶解度的方法。 背景技术[0002] 大米蛋白是一种公认的优质蛋白质。它具有生物效价高、消化率高、过敏性低的优点，常用作婴幼儿产品的基料。其蛋白质组成主要为谷蛋白与球蛋白，清蛋白与醇溶蛋白含量较低。谷蛋白分子内与分子之间存在大量巯基和二硫键，这些结构特性使得大米蛋白溶解性较差；致使多数大米蛋白用于饲料生产；这导致了优质蛋白未得到充分利用，造成浪费；因此有必要对其溶解性进行探究，以提高大米蛋白的利用率。 [0003] 目前提高大米蛋白溶解性的方法有高压处理、高压微射流处理、高温蒸煮处理等物理方法改变大米蛋白分子结构，酶法处理改善大米蛋白溶解性及化学改性等方法。单纯的物理方法不能使溶解性得到显著提高，蛋白酶是具有生物催化功能的生物大分子，通过酶解使蛋白质分子肽链断裂，改善蛋白质的溶解性。通过对多种蛋白酶的对比分析可知，碱性蛋白酶的水解效果好于其它蛋白酶，但正交试验结果表明，即使在优化条件下水解，单一的碱性酶水解所得大米蛋白溶解性最高达到43.12％。若先用碱性蛋白酶水解再用复合蛋白酶水解则蛋白溶解性最高达到71.46％，而碱性蛋白酶与其它酶的联合应用效果略差；若先使用复合蛋白酶后使用碱性酶则蛋白溶解性只有54.73％(酶水解法提高大米蛋白溶解性的研究，王章存等，《食品科学》2006年12期)。现虽存在提高大米蛋白溶解度的方法，但仍在耗时长，步骤繁琐，溶解度不能显著提高的问题。 发明内容[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种能够显著提高大米蛋白溶解性的方法。 [0005] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下： [0006] 第一方面，本发明提供一种提高大米蛋白溶解度的方法，所述方法为将大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，利用中性蛋白酶进行酶解，提高大米蛋白的溶解度。本发明通过对不同的物理处理方法对大米蛋白溶解度的影响进行考察，筛选得到最佳的物理处理方法为超声细胞粉碎。此外，本发明还考察了不同蛋白酶对大米蛋白溶解度的影响，筛选得到利用中性蛋白酶配合超声波细胞粉碎处理，能够显著提高大米蛋白的溶解度。 [0007] 作为优选，所述中性蛋白酶是由枯草芽抱杆菌经发酵产生的，例如经液体深层发酵，浓缩提取精制而制得；属于单一酶类，无特异性酶切位点。所述中性蛋白酶可按现有技术方法制备，也可外购商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：Z8030，酶活为6×104U/g。 [0008] 进一步地，所述大米蛋白的蛋白含量不低于75％，脂肪含量不高于1％。本发明所述方法对符合该条件的大米蛋白效果格外显著。 [0009] 进一步地，本发明还考察了不同超声波细胞粉碎时间对大米蛋白溶解度的影响，筛选到最佳的超声波细胞粉碎处理方式为：将大米蛋白溶解于蒸馏水中，得到质量浓度不低于1％(优选1％)的大米蛋白溶液，将大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，工作时间5s，间隙时间4s，全程时间5-7min，优选6min。 [0010] 进一步地，本发明还考察了不同酶解温度和不同酶解时间对大米蛋白溶解度的影响，筛选得到最佳的酶解反应条件为：向超声波细胞粉碎后的大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶，在45-50℃的恒温水浴振荡器中反应60-75min。作为优选，在50℃的恒温水浴振荡器中反应60min。 [0011] 进一步地，本发明综合上述优选条件后，还考察了中性蛋白酶用量对大米蛋白溶解度的影响，确定所述中性蛋白酶的加入量为5500-6000U/g大米蛋白，优选5600U/g大米蛋白时，对提高大米蛋白溶解度的效果最为明显。本发明对中性蛋白酶酶活定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。 [0012] 更进一步地，本发明提供一个最佳的具体实施方式，包括如下步骤： [0013] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液。 [0014] 第二步：将所述大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，工作时间5s，间隙时间4s，全程时间6min。 [0015] 第三步：向超声波细胞粉碎后的大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶5600U/g蛋白，在50℃水浴中进行酶解反应60min。 [0016] 第四步：酶解完成后，将中性蛋白酶灭活。例如，放入90-95℃恒温水浴中保持10-20min，使蛋白酶失活。然后可在4000-4500r/min条件下离心20-30min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0017] 作为优选，超声波细胞粉碎的强度或功率为200-400W。 [0018] 第二方面，本发明还提供了所述方法在提高大米蛋白溶解度方面的应用。 [0019] 进一步地，对谷蛋白溶解度的提高尤为明显。 [0020] 本发明的有益效果在于： [0021] 本发明提供了一种显著提高大米蛋白溶解度的方法，该方法操作简单、条件温和、处理时间短、溶解度提高快。应用该方法对大米蛋白进行处理，大米蛋白的溶解度可由0.62％提高至79.30％。 附图说明 [0022] 图1为本发明实验例1中不同物理处理方法对大米蛋白溶解度的影响； [0023] 图2为本发明实验例2中不同超声波细胞粉碎时间对大米蛋白溶解度的影响； [0024] 图3为本发明实验例3中不同蛋白酶对大米蛋白溶解度的影响； [0025] 图4为本发明实验例4中不同酶解温度对大米蛋白溶解度的影响； [0026] 图5为本发明实验例5中不同酶解时间对大米蛋白溶解度的影响； [0027] 图6为本发明实验例6中中性蛋白酶用量对大米蛋白溶解度的影响。 具体实施方式[0028] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。 [0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0031] 下述实施例中所采用的中性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：Z8030，酶活为6×104U/g。 [0032] 下述实施例中所采用的大米蛋白，其蛋白含量为70％，脂肪含量为1％。 [0033] 下述实施例中可溶性氮的测定：Folin-酚法； [0034] 溶解度＝N1/N0×100％； [0035] 式中，溶解度，％；N1指处理后溶液中可溶性氮含量，mg；N0指原料中总氮，mg。 [0036] 实施例1 [0037] 一种提高大米蛋白溶解度的方法，包括以下步骤： [0038] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液； [0039] 第二步：将该大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，工作时间5s，间隙时间4s，全程时间6min，使大米蛋白紧密的结构松散，暴露出分子内部的酶作用位点，为下步做准备； [0040] 第三步：第二步大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，溶液中加入中性蛋白酶(Neutrase)5600U/g蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应60min； [0041] 第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0042] 采用上述方法提高大米蛋白溶解度，最终溶解度达到79.30％。 [0043] 实施例2 [0045] 采用上述方法提高大米蛋白溶解度，最终溶解度由0.62％提高至45.30％。 [0046] 实施例3 [0047] 提高大米蛋白溶解度的方法，与实施例1的区别仅在于：第三步中中性蛋白酶酶用量为5000U/g蛋白，反应时间50min。 [0048] 采用上述方法提高大米蛋白溶解度，最终溶解度由0.62％提高至66.42％。 [0049] 实验例1 考察不同物理处理方法对大米蛋白溶解度的影响 [0050] 将实施例1方法中第二步中的超声波细胞粉碎处理分别替换成超声波处理、超高压处理、微波处理、胶体磨处理等，考察不同物理处理方法对大米蛋白溶解度的影响。 [0051] 具体实验方案为： [0052] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液； [0053] 第二步：将该大米蛋白溶液用不同的物理处理方法使大米蛋白紧密的结构松散，暴露出分子内部的酶作用位点，为下步做准备； [0054] 第三步：第二步大米蛋白经物理处理后，溶液中加入中性蛋白酶(Neutrase)5600U/g蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应60min； [0055] 第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0056] 不同物理处理方法所对应的大米蛋白溶解度如图1。由图1可以看出：相较于其他方法(微波处理、超声波处理、超高温处理、胶体磨处理)采用超声波细胞粉碎处理方法提高大米蛋白溶解度具有显著的优势。其中，经过超声波细胞粉碎处理的大米蛋白比未经过任何物理方法处理的大米蛋白，其溶解度显著升高，由33.56％提高至 [0057] 79.30％。 [0058] 实验例2 考察不同超声波细胞粉碎时间对大米蛋白溶解度的影响 [0059] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液； [0060] 第二步：将该大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，粉碎全程时间为(3/4/5/6/7min)，使大米蛋白紧密的结构松散，暴露出分子内部的酶作用位点，为下步做准备； [0061] 第三步：第二步大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，溶液中加入中性蛋白酶(Neutrase)5600U/g蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应60min； [0062] 第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0063] 不同超声波细胞粉碎时间对大米蛋白溶解度的结果，如图2。由图2可以看出：在3-6min内大米蛋白溶解度显著升高，由61.12％升高至79.30％，这是由于随着处理时间的增多，大米蛋白紧密的结构逐渐变松散，使得更多的酶切位点暴露出来，从而大米蛋白溶解度升高；但6min后大米蛋白溶解度上升趋于平缓，这是由于在超声波细胞粉碎一定的处理时间内大米蛋白结构松散程度基本达到最高。所以选择6min时为超声波细胞粉碎最佳处理时间。 [0064] 实验例3 考察不同蛋白酶对大米蛋白溶解度的影响 [0065] 本实验例用于比较不同蛋白酶对大米蛋白溶解度的影响，由于碱性蛋白酶作用后需要进行脱盐处理，步骤复杂，不利于工业生产，不适宜本发明技术方案。 [0067] 具体实验方案为： [0068] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液； [0069] 第二步：将该大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，工作时间5s，间隙时间4s，全程时间6min，使大米蛋白紧密的结构松散，暴露出分子内部的酶作用位点，为下步做准备； [0070] 第三步：第二步大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，溶液中加入不同蛋白酶处理； [0071] 第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0072] 不同蛋白酶对大米蛋白溶解度的结果，如图3。由图3可以看出：在各种蛋白酶的推荐使用条件下(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶的酶解条件为：温度50℃，加酶量3000U/g蛋白，酶解时间60min)，中性蛋白酶酶解后大米蛋白溶解度显著高于其他实验组，所以选择中性蛋白酶作为最佳效果酶。 [0073] 实验例4 考察不同酶解温度对大米蛋白溶解度的影响 [0074] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液； [0075] 第二步：将该大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，工作时间5s，间隙时间4s，全程时间6min，使大米蛋白紧密的结构松散，暴露出分子内部的酶作用位点，为下步做准备； [0076] 第三步：第二步大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，溶液中加入中性蛋白酶(Neutrase)5600U/g蛋白，在恒温水浴振荡器中反应60min，反应温度分别控制在40/45/50/55/60℃； [0077] 第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0078] 不同酶解温度对大米蛋白溶解度的结果，如图4。由图4可以看出：酶的作用效果受到温度影响较大。一般情况下，在酶的适用温度范围内，增加反应体系的温度，则酶解的速度加快。在40-45℃温度范围内，大米蛋白溶解度显著升高，45-50℃内呈平缓趋势，50℃后随着温度的升高溶解度显著降低。因此，选择45-50℃作为酶解温度，50℃为最佳酶解温度。 [0079] 实验例5 考察不同酶解时间对大米蛋白溶解度的影响 [0080] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液； [0081] 第二步：将该大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，工作时间5s，间隙时间4s，全程时间6min，使大米蛋白紧密的结构松散，暴露出分子内部的酶作用位点，为下步做准备； [0082] 第三步：第二步大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，溶液中加入中性蛋白酶(Neutrase)5600U/g蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应，反应时间为30min/60min/90min/120min/150min； [0083] 第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0084] 不同酶解时间对大米蛋白溶解度的结果，如图5。由图5可以看出：在30-60min内，溶解度随酶解时间的延长显著升高，在60min后，溶解度上升不明显。这可能是由于在该种处理方法下，酶与底物充分反应，大米蛋白溶解度已经达到最高。因此，选择60min作为最佳反应时间。 [0085] 实验例6 考察中性蛋白酶用量对大米蛋白溶解度的影响 [0086] 第一步：取大米蛋白，加入蒸馏水，得到质量浓度1％的大米蛋白溶液； [0087] 第二步：将该大米蛋白溶液置于超声波细胞粉碎机中，工作时间5s，间隙时间4s，全程时间6min，使大米蛋白紧密的结构松散，暴露出分子内部的酶作用位点，为下步做准备； [0088] 第三步：第二步大米蛋白进行超声波细胞粉碎后，溶液中加入中性蛋白酶(Neutrase)，在45℃的恒温水浴振荡器中反应60min，中性蛋白酶加入量为(3200-6400U/g蛋白) [0089] 第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min，取上清液利用福林酚法测定可溶性氮含量。 [0090] 中性蛋白酶用量对大米蛋白溶解度的结果，如图6。如图6所示：在3200-5600U/g蛋白间，随着加酶量增大，酶的水解作用加强，溶解度显著升高；在5600U/g蛋白后，酶作用完全，溶解度呈平缓趋势。所以选择5600U/g蛋白为中性蛋白酶最佳酶用量。 [0091] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 |
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