[0001] 本发明涉及肠营养组合物领域。更具体地，本发明涉及每IOOml组合物中含有6到20g胶束酪蛋白且其pH约为6到8的水性胶束酪蛋白组合物；本发明还涉及含有大量胶束酪蛋白的肠营养组合物以及(独立地）控制这种组合物的粘度、透明度和磷酸盐水平的问题。

[0002] 优选地，医用乳制品具有高度浓缩的营养素，特别是蛋白质和矿物质，以满足营养不良患者的营养素的日常摄入。这些患者可以是患有晚期AIDS、癌症或癌症治疗、严重的肺部疾病如COPD (慢性阻塞性肺病)、结核病和其他传染病的恶病质患者或人，或者是经历过 大外科手术或创伤如烧伤的人。另外，患有咽喉或口腔障碍例如食道癌或口炎的人和具有吞咽问题如吞咽困难的人需要特殊的液态小体积营养物。还有，刚患有食欲减低或味觉丧失的人也会从小体积优选液态的食物中受益。这些患者还可以是老年人，特别是虚弱的老年人或者是具有变为虚弱的危险的老年人。就此而言，虽然老年人的能量需要可能减少，但他们摄取产品的能力也可能减小。例如，他们可能会由于例如吞咽困难或由于需要摄取太大量的产品以满足营养素的日常摄入而具有摄取产品的困难。因此，顺应性不是最佳的，并且通常摄入不是最适宜的，导致不是最适宜的营养，最终导致营养不良。

[0003] 上述患者群体可能对食物稠度和产品的感官特性例如粘度、口感、口味、气味和色泽极其敏感。并且，患者例如恶病质患者通常极其虚弱，这通常会妨碍他们直立坐着并且会妨碍他们从盒中饮用食物，或者甚至会妨碍他们从吸管吸取食物。这些患者从具有高含量营养素特别是蛋白质的液态小体积肠组合物中获益很多。

[0004] 但是，由于蛋白质-矿物质平衡的偏移，大量的蛋白质和矿物质可增加加工和储存过程产品中的整体粘度。但是，低粘度液体产品通常受患者青睐，这引起了大家配制这种广品的兴趣。

[0005] 因此，本发明的基础问题是提供一种液体的肠组合物，作为添加物或者作为完全营养物用于提供营养，其在最小体积的液体中含有高含量的完整蛋白特别是胶束酪蛋白作为主要蛋白质来源，并且其在上述不同的患者群体尤其是老年人或生病患者中维持营养和健康。

[0006] 浓缩乳中的酪蛋白胶束比牛乳中的酪蛋白胶束的彼此相互作用更频繁，原因是胶束间的距离更小。因此，浓缩乳的表现类似于剪切稀化的非牛顿流体，这意味着粘度依赖于剪切速率（Karlsson et al.，2005)。一般而言，胶体体系的粘度依赖于连续相的粘度、颗粒的形状和尺寸分布，并且依赖于它们的相互作用和对于粘度如何随体积分数而变化的假设。所述酪蛋白胶束的体积分数（Φ)是一个无维的数字，定义为所述颗粒占总体积的分数。其可以通过测量溶液的粘度U)确定。Eilers (1945)提出式⑴用于估计浓缩乳体系的粘度。[0007]

[0008] η。代表连续相的粘度，是ImPa «S。Φ_代表所述粘度倾向于变得无穷大时的最大包装体积分数。在具有相似尺寸球体的溶液中Φ_通常使用的数值是O. 74(Eilers, 1945)，但是对于其中颗粒具有多种尺寸的浓缩乳，应该使用的数值是O. 79。该公式延伸自描述在极稀体系中分散体粘度的爱因斯坦关系式（Einstein relation),其中所述颗粒是球形，不会因为彼此的存在而变形或受影响（Dewan et al.，1972;Eilers, 1945;Karlsson etal. , 2005)。

[0009] 容积度定义为I克蛋白质所占的总体积，与溶液中蛋白质的体积分数Φ相关(Eilers，1941)。所述酪蛋白胶束的容积度是溶液粘度的一个决定因素。当胶束变得含水更多(例如由于钙耗竭）时酪蛋白胶束容积度增加，这会引起具体的酪蛋白从所述胶束中释放以及所述胶束的扩充和膨胀。具体的酪蛋白释放的顺序依赖于磷酸丝氨酸残基的量，因此依赖于对钙离子的特定敏感性。当胶束变得更加钙衰竭时，更多的酪蛋白从酪蛋白胶束中释放出来。结果，解离的顺序是β_酪蛋白> as「酪蛋白〉as2-酪蛋白（Holt, 1997)。虽然K-酪蛋白具有O或I个磷酸丝氨酸残基，但是由于疏水性相互作用，其可能会保持堆叠加在酪蛋白胶束中。例如，随着温度和钙离子含量的降低，离开酪蛋白胶束的酪蛋白的量增加。酪蛋白胶束尺寸的增加是由酪蛋白胶束的扩充和膨胀引起的，酪蛋白胶束的扩充和膨胀分别是由于胶束中连续相的静电排斥和渗透性增加引起的（Leviton andPallansch, 1962)。另外，连续相中游离钙离子可减小酪蛋白胶束中的静电排斥，这使得所述胶束更加紧密。

[0010] 浓缩乳中酪蛋白胶束之间的相互作用受到例如离子强度、矿物质含量和组成、pH和温度的很大影响（Karlsson et al.，2005)。磷酸盐和柠檬酸盐，其为通常加入药物营养物、经处理的乳酪或(浓缩的）UHT乳中矿物质，通过结合钙离子或直接结合到酪蛋白胶束而与酪蛋白胶束相互作用(Kocak and Zadow, 1985;Mizuno and Lucey, 2005;Vujicic etal.，1968)。一般来说，它们的钙结合能力可以下列顺序排序：长链磷酸盐 > 三聚磷酸盐>焦磷酸盐 > 柠檬酸盐 > 正磷酸盐（Zittle，1966)。

[0011] 现有技术

[0012] 虽然有大量的现有技术文献可利用（本申请中所引用的，如果合适)，但只有少数出版物涉及含有6到20g/100ml组合物范围的大量胶束酪蛋白的液体肠营养组合物。

[0013] 磷酸盐和柠檬酸盐对乳溶液物理改变的效应主要在脱脂乳体系中被研究，所述脱脂乳中约20%的蛋白质是乳清，具有低浓缩因子（最大约6. 5%w/v蛋白质）和相对低的磷酸盐和朽1檬酸盐水平。这些研究中的几个研究集中于乳胶（Mizuno&Lucey, 2007)或陈化胶凝作用（Harwalkar, 1982; Kocak&Zadow, 1985; Leviton&Pallansch, 1962)。

[0014] US 5，683，984公开了具有天然胶束酪蛋白组分的肠管饲喂组合物。TO2009/072885中确定并处理（tackled) 了粘性问题，其中公开了含有胶束酪蛋白和酪蛋白酸盐以及可选的少量乳清的高能量和高蛋白的液体营养肠组合物。

[0015] 另外，大量出版物涉及所添加的磷酸盐对乳制品例如脱脂乳的浑浊度影响，但是没有出版物描述这些盐对含有大量胶束酪蛋白（6到20g/100ml范围内）的液体肠营养组合物的粘度的影响。[0016] Liang et al. (Nippon Nogei Kagaku Kaishi (1974)，48 (I)，49-56)描述了甘油憐酸盐对酪蛋白胶束的胶凝作用和脱脂乳（含有约3g酪蛋白胶束/IOOml)的浑浊度的影响。

[0017] WO 01/72135A1 (澳大利亚食品工业科学中心)和US 6. 455. 082B1 (Nestec)涉及将磷酸盐加入乳中以稳定所述乳(含有约3g酪蛋白胶束/100ml)。虽然他们公开了对粘度的影响，但是没有教导对透明度的影响，当然也没有涉及在高蛋白体系中，其在粘度和透明度表现方面比低蛋白体系例如乳更重要。

[0018] 本发明人现已发现，通过使用一种或多种选自磷酸、柠檬酸、可溶性磷酸盐、可溶性柠檬酸盐或其混合物的螯合剂，可以彼此独立地控制含有6到20g胶束酪蛋白/IOOml且pH约6到8的水性胶束酪蛋白组合物的粘度和透明度。使用螯合剂来独立地控制水性胶束组合物的粘度和透明度不是本领域已知的。

[0019] 在一个实施方案中，所述组合物含有一种或多种选自磷酸、柠檬酸、可溶性磷酸盐、可溶性柠檬酸盐或其混合物的螯合剂，条件是排除柠檬酸、可溶性柠檬酸盐或其混合物作为仅有的螯合剂。

[0020] 在一个实施方案中，所述组合物含有一种或多种选自磷酸、可溶性磷酸盐或其混合物的螯合剂。[0021 ] 在一个实施方案中，所述水性胶束酪蛋白组合物不含或基本上不含脂肪、消化性和非消化性碳水化合物中任一种。“基本上不含”是指基于组合物中总的干物质，这些组分的含量优选少于5重量％。

[0022] 优选地，所述使用通过向所述水性胶束酪蛋白组合物中加入螯合剂而实现。

[0023] 词语“独立地”是指所述粘度和透明度可以，彼此独立地，通过选择具有适当浓度的适当螯合剂或超过一种的具有适当浓度的适当螯合剂的任意组合，设定为任何值。以此方式，可能获得透明的且非常粘的组合物，并且还可获得非常乳状的且非常液态的组合物。后一组特性对于营养组合物的开发，特别是对于基于乳品的药物营养物的开发，是非常有意义和非常重要的，所述组合物含有大量的胶束酪蛋白，尤其是含有6到20g胶束酪蛋白/100ml。

[0024] “可溶性”是指在pH 6 - 8的水中可溶解的盐。

[0025] 优选地，本发明的水性胶束酪蛋白组合物每IOOml组合物含有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或 19g，最多 20g，胶束酪蛋白，优选 ll_18g/100ml，更优选12-18g/100ml，最优选 14_18g/100ml。

[0026] 所述水性胶束酪蛋白组合物的pH应该介于约6-8。所述pH是在水性胶束酪蛋白组合物中测定的，其可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行，例如使用可商购的PH计量装置。

[0027] 另外，通过依据本发明选择适合的螯合剂，可以独立于粘度和透明度，向含有6-20g胶束酪蛋白/IOOml且pH约6到8的水性胶束酪蛋白组合物中加入多份含磷化合物(如磷酸或磷酸盐)。

[0028] 在本申请的含义中，术语“透明度”是术语“浑浊度”的反义词。浑浊度是实验中测量的参数的名称。本领域技术人员熟悉使用分光光度法处理酪蛋白的浑浊度（例如在700nm 下)的概念(Philippe et al.，2003)。

[0029] 胶束酪蛋白，有时也称作“天然”胶束酪蛋白，是指胶束形式的酪蛋白，其是乳中酪蛋白的天然形式。它是高质量的乳蛋白，以约2. 6g/100ml的浓度天然存在于乳中（DairyScience and Technology, Walstra et al. , CRC Press, 2006)。它是通过不使酪蛋白变性或者基本上不使酪蛋白变性的方法进行浓缩，作为胶束酪蛋白分离物（MCI)来销售的。以与用于浓缩乳清蛋白的大致相同的方法，将新鲜的脱脂乳进行微孔过滤，以产生纯的、基本上未变性的具有其天然结构的乳蛋白。所得到的材料含有基于干物质的90重量％至95重量％，优选超过95重量％的胶束酪蛋白，其余的主要为乳清蛋白和其他非蛋白氮以及其他组分，例如乳糖和无机盐，尤其是磷酸钙。通常，所述酪蛋白胶束的流体力学半径为40到400nm，分子量为IO6到IO9道尔顿，钙：磷的重量比为I. 4到2. 4，钙含量非常高，约为25g/kg蛋白质的水平。它具有固有的低粘度，因此含有所述MCI的液体组合物容易被饮用。单价金属离子特别是Na和K的量是非常低的，通常在约I到2g/kg蛋白质的范围内。

[0030] 相反地，如本发明上下文中所使用的酪蛋白是指已经失去天然胶束结构的凝乳形式的酪蛋白。它与金属例如钠、钾、钙和镁结合，通常被称为酪蛋白酸盐。

[0031] 在本发明的范围内，可以理解的是胶束酪蛋白还可以通过其他的乳蛋白来源提供，例如基本上保持酪蛋白与乳清的80 :20天然比例的来源，例如乳蛋白浓缩物（MPC)，其是通常通过超滤制备的平均蛋白含量约为80重量％的粉末产品；乳蛋白分离物（MPI)，其是通常通过沉淀制备的平均蛋白含量超过85重量％的粉末产品；以及脱脂浓缩乳。所述胶束酪蛋白还可以以液体形式通过超滤或微孔过滤而提供。

[0032] 依据一个实施方案，所述磷酸选自尿苷单磷酸、胞苷单磷酸、正磷酸、肌醇六磷酸、六偏磷酸或其混合物，所述磷酸盐选自尿苷单磷酸盐、胞苷单磷酸盐、正磷酸盐、肌醇六磷 酸盐、六偏磷酸盐或其混合物。

[0033] 依据另一个实施方案，所述可溶性盐是单价盐，优选钠盐、钾盐或其混合物。这些盐优选用于开发营养组合物，因为他们引入金属作为反荷离子(例如钠或钾)，其是正常饮食中必需的。

[0034] 依据另一个实施方案，所述反荷离子(例如钠或钾）存在的量小于或等于所述酸的等摩尔量。例如，一分子肌醇六磷酸盐可以含有I到12个反荷离子，因此产品肌醇六磷酸盐可以含有具有不同数目的反荷离子的分子，以使得产品中的反荷离子的总当量少于或等于肌醇六磷酸盐的总当量。

[0035] 依据另一个实施方案，所述磷酸盐选自尿苷单磷酸二钠（Na2UMP, —种有机正磷酸盐）、胞苷单磷酸二钠（Na2CMP, —种有机正磷酸盐）、磷酸氢二钠（Na2HPO4, —种无机正磷酸盐）、肌醇六磷酸钠也称为肌醇六磷酸十二钠（SP，一种有机聚磷酸盐）和六偏磷酸(六）钠(SHMP，一种无机聚磷酸盐）。优选地，所述柠檬酸盐是柠檬酸三钠（TSC)。可以理解的是，在实践中，产品并不总是含有与所述酸等摩尔量的金属反荷离子，但所述产品是如此命名的。这些产品也包含在本发明的磷酸盐和柠檬酸盐的定义中。

[0036] 优选地，所述一种或多种螯合剂选自磷酸、可溶性磷酸盐或其混合物。

[0037] 最优选地，所述磷酸盐是尿苷单磷酸二钠或胞苷单磷酸二钠，优选为尿苷单磷酸二钠。使用这种盐，获得透明度和粘度基本上不受影响的但是为营养组合物中提供了必须的磷和反荷离子的液体胶束酪蛋白组合物。[0038] 本发明的盐的钙结合能力是基于它们的电荷数目。它们的钙结合能力降序为SP>SHMP>TSC=Na2HP04>Na2UMP=Na2CMP0另外，这些磷酸盐中的几种具有与所述酪蛋白胶束相互作用的能力。游离的钙和磷酸根离子、磷酸钙复合物以及纳入所述酪蛋白胶束中的钙和磷酸根离子在乳品体系中是互相平衡的（图I)。本发明的螯合剂的加入将使这些平衡偏移，因为它们会螯合钙离子。结果，这将影响酪蛋白胶束的容积度，因为所述胶束变得更加钙衰竭，所述胶束可能离解，并且特定酪蛋白从酪蛋白胶束中释放。

[0039] 加入例如钙离子后，所述容积度也可能降低，因为它们将被纳入所述酪蛋白胶束中（Walstra et al.，2006)。容积度的这些改变同时影响UHT条件下乳体系的粘度和热稳定性。例如，正磷酸盐是作为胶体状磷酸钙（CCP)天然存在于酪蛋白胶束中的。向乳中加入Na2HPO4会引起所述磷酸根离子与所述钙离子的结合以及磷酸钙微晶形成。将会发生胶束结构的重组织和容积度的改变，因为复合物例如Ca3(PO4)2将被整合进入所述酪蛋白胶束(Guo et al. , 2003) „ Na2UMP具有弱的钙结合能力(deKort et al. , 2009)并且仅略微影响所述酪蛋白胶束的容积度。Na2CMP显示出类似的表现。没有关于Na2UMP和Na2CMP与酪蛋白胶束相互作用的信息可用。聚磷酸盐，例如SHMP和SP，是高度带阴离子 电荷的，这使得它们可能结合至所述酪蛋白残基或CCP的带正电的氨基酸（Mizuno andLucey, 2007;Vujicic et al.，1968;Zittle, 1966)。在(浓缩）乳中，磷酸盐与酪蛋白胶束在中性PH下的相互作用会在所述胶束产生额外的净负电荷，这会引起所述酪蛋白胶束的扩充（Leviton andPallansch, 1962)。SHMP会增加酪蛋白体系的粘度或者甚至引起胶凝作用，因为SHMP具有通过与CCP或酰胺基相互作用而交联酪蛋白胶束的能力（Kocak andZadow, 1985;Mizuno and Lucey, 2007; Vujicic et al.，1968)。朽1 樣酸盐不结合或交联酪蛋白（Mizuno and Lucey, 2005),但是会螯合结合到所述酪蛋白胶束的I丐离子。朽1檬酸盐和形成的柠檬酸钙复合物在血清相中保持作为稳定的、可溶性复合物（Mizuno andLucey, 2007;Morr, 1967; Vujicic et al.，1968)，或者在储存过程中形成不溶的朽1檬酸隹丐晶体。加入柠檬酸盐会导致酪蛋白胶束水合作用的增加，所述胶束的膨胀测量为所述溶液的粘度和透明度的增加（Morr，1967)。透明度可以通过用分光光度计测量所述溶液的浑浊度而测定。这是建立离子、蛋白质和水分布的改变与所述溶液的理化性质(更具体地酪蛋白胶束的理化性质）的关系的一个重要工具（Philippe et al.，2003)。例如，当所述酪蛋白胶束收缩、离解或膨胀时，其密度和折射率将改变。

[0040] 已经对正磷酸盐、聚磷酸盐和柠檬酸盐对正常或浓缩的脱脂乳的物理性质的影响进行了研究（Mizuno and Lucey, 2007 ;Morr, 1967; Vujicicet al.，1968),但是这些体系含有乳清蛋白和相对低的蛋白质浓度（最大约6.5重量％酪蛋白酸盐）。此外，研究集中于用磷酸盐制备乳凝胶（Mizuno and Lucey, 2007)或者集中于加入磷酸盐或朽1檬酸盐后加速或延迟陈化胶凝作用（Harwalkar, 1982;Kocak and Zadow, 1985;LevitonandPallansch, 1962)。还有，在这些研究中使用了较低的磷酸盐和柠檬酸盐浓度。

[0041] 螯合剂的量应该依据本发明进行选择，但是已显示加入I到120mEq. Γ1的所述螯合剂，优选5到IOOmEq. ΐΛ更优选10到80mEq. ΐΛ最优选20到60mEq. Γ1的所述螯合剂足以获得所要求保护的效果。

[0042] 通过使用本发明的螯合剂，可以产生三种类型的组合物（图3与图8结合）。已发现加入肌醇六磷酸盐(例如SP)、柠檬酸盐(例如TSC)或者无机正磷酸盐(例如Na2HPO4)后组合物变得更加粘稠，并且所述粘度依赖于磷酸盐和柠檬酸盐的浓度和类型。加入六偏磷酸盐（例如SHMP)可产生高粘度和透明度的组合物，甚至形成凝胶。相反地，可加入高浓度的尿苷单磷酸盐（例如Na2UMP)而不显著影响所述粘度，也几乎不改变所述组合物的初始透明度。

[0043] 通过使用本发明的两种或多种螯合剂，可以产生具有任意所需的粘度、透明度和磷含量的任何类型的组合物。

[0044] 营养组合物

[0045] 在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种每IOOml组合物中含有9到20g蛋白质且PH值约为6到8的营养组合物，其中全部或大部分所述蛋白质含有胶束酪蛋白，所述胶束酪蛋白含有选自磷酸、柠檬酸、可溶性磷酸盐、可溶性柠檬酸盐或其混合物的一种或多种螯合剂，以及涉及随附的权利要求书中所要求保护的多个优选实施方案。螯合剂的量可以依据本发明进行选择；所述组合物优选含有I到120mEq. Γ1的所述螯合剂，优选5到 IOOmEq. Γ1，更优选10到80mEq. Γ1，最优选20到60mEq. Γ1的所述螯合剂。

[0046] 在一个优选的实施方案中，所述组合物含有选自磷酸、柠檬酸、可溶性磷酸盐、可溶性柠檬酸盐或其混合物的一种或多种螯合剂，前提是排除柠檬酸、可溶性柠檬酸盐或其混合物作为仅有的螯合剂。

[0047] 在一个优选的实施方案中，所述营养组合物含有选自磷酸、可溶性磷酸盐或其混合物的一种或多种螯合剂。

[0048] 优选地，本发明的营养组合物每IOOml组合物含有至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19g，最多20g，蛋白质，优选11到18g/100ml，更优选12到18g/100ml，最优选14到18g/100ml，其中全部或大部分的所述蛋白质含有胶束酪蛋白。

[0049] 在本申请的上下文中，与胶束酪蛋白有关的术语“全部或大部分”应当解释为范围为70到100%总蛋白的胶束酪蛋白量。

[0050] 依据本发明的另一个实施方案，基于所述蛋白质的总重量，本发明的营养组合物可选地含有最多30重量％的酪蛋白酸盐。

[0051] 依据本发明的另一个实施方案，所述蛋白质可提供所述组合物总能量含量的10%到100%，优选20%到80%，更优选30%到70%，最优选30%到60%。高水平的蛋白质对于身体不能接受大体积的患者例如流体限制的患者是有益的。可以给予这种患者减少体积的流体，但是每天仍然能够接受所需量的营养供应。所述组合物可以用作完全营养物，除常规的食物摄取之外或者作为常规食物摄取的替代品。当较少关注脂肪和碳水化合物摄取时，所述组合物还可以用作除常规食物摄取之外的补充物。

[0052] 依据本发明的另一个实施方案，所述营养组合物的能量密度至少为O. 36kcal/ml组合物，更优选至少I. Okcal/ml组合物，特别地至少I. 5kcal/ml组合物，更特别地至少2. Okcal/ml 组合物。

[0053] 虽然所述组合物具有高能量密度，但通过依据本发明选择适合的螯合剂，所述组合物也可以具有足够低的粘度以使其可以被可能具有吞咽产品困难的人或者被管饲的人摄取。因此，在一个实施方案中，所述营养组合物是液体，优选其粘度为小于200mPa. s,优选小于80mPa. s,优选小于70mPa. s,更优选小于50mPa. s,仍更优选小于40mPa. s,最优选等于约 20mPa. S。[0054] 在本发明的一个实施方案中，本发明的营养组合物中胶束酪蛋白的量是所述营养组合物中存在的总蛋白的至少70重量％，优选至少80重量％，更优选至少90重量％，更优选至少95重量％，至多100重量％。

[0055] 如上所述，本发明的营养组合物不应该含有大量的除胶束酪蛋白之外的蛋白质，依据一个实施方案，任选最多30重量％的酪蛋白酸盐。在本发明的另一个实施方案中，所述营养组合物可以含有最多约15重量％的乳清，优选少于或等于10重量％的乳清，更优选为所述营养组合物中存在的总蛋白的ι-ίο重量％ ;在一个实施方案中，所述组合物含有少于或等于所述营养组合物中存在的总蛋白的5重量％的乳清。

[0056] 在本发明的一个实施方案中，胶束酪蛋白与酪蛋白酸盐的重量比范围为约100:0到约70:30。优选地，胶束酪蛋白与酪蛋白酸盐的重量比范围为约80:20到约100:0。

[0057] 本发明的营养组合物是设计用于补充人的饮食或者用于提供完全的营养支持。因此，本发明的组合物可以进一步含有至少脂肪和/或碳水化合物和/或维生素、矿物质、微 量元素的来源和/或难消化碳水化合物的来源。优选地，本发明的组合物是具有完全营养的组合物。

[0058] 在一个实施方案中，本发明涉及一种对需要其的人提供营养的方法，其包括对所述人给予本发明的营养组合物的步骤。所述人优选为老年人、处于疾病状态的人、正从疾病状态恢复的人、营养不良的人或者健康人例如男性运动员或女性运动员或者有活力的老年人。从这个方面来说，应建议，本申请上下文中，老年人是年龄为50或更高的人，特别地年龄为55或更高，更特别地年龄为60或更高，更特别地年龄为65或更高的人。

[0059] 脂肪

[0060] 在一个实施方案中，本发明的肠营养组合物进一步含有脂肪。脂肪的量相对于所述组合物的总能量含量可介于5和95%之间，优选介于10和70%之间，更优选介于20和40%之间的范围。

[0061] 对于脂肪的类型，可以有广泛的选择，只要所述脂肪具有食品质量。所述脂肪可以是动物脂肪或植物脂肪或者是二者。虽然动物脂肪例如猪油或黄油具有基本相等的卡路里和营养价值并可以互换使用，但是植物油由于其容易获得、易于配制、不含胆固醇且饱和脂肪酸浓度低而在本发明的实践中为高度优选的。在一个实施方案中，本发明的组合物含有菜籽油、玉米油和/或葵花籽油。

[0062] 所述脂肪可以包括中链脂肪酸的来源例如中链甘油三酯（MCT，主要为8到10个碳原子长度）、长链脂肪酸的来源例如长链甘油三酯（LCT)和磷脂结合的脂肪酸例如磷脂结合的EPA或DHA，或两种类型来源的任意组合。MCT是有益的，因为它们在代谢胁迫的患者中容易被吸收和代谢。另外，使用MCT将降低营养物吸收不良的风险。LCT来源例如芥花油（canola oil)、菜籽油、葵花籽油、大豆油、橄榄油、椰子油、棕榈油、亚麻子油、海产油(marine oil)或玉米油是有益的，因为已知LCT可以调节人体的免疫应答。

[0063] 在一个具体的实施方案中，基于所述组合物的总脂肪计，所述脂肪含有30到60重量％的动物脂肪、藻类脂肪或真菌脂肪，40到70重量％的植物脂肪以及任选O到20重量％的MCT。基于总脂肪计，所述动物脂肪优选含有少量的乳脂肪，也就是低于6重量％，特别是低于3重量％。特别地，使用玉米油、卵油和/或芥花油以及特定量海产油的混合物。卵油、鱼油和藻油是非植物脂肪的优选来源。特别是对于将被口服摄取的组合物，为防止形成异臭和减少鱼腥味余味，推荐选择二十二碳六烯酸（DHA)含量相对低的成分，也就是基于总脂肪的少于6重量％，优选少于4重量％。基于总脂肪计，含有DHA的海产油优选存在于本发明的组合物中的量低于25重量％，优选低于15重量％。另一方面，为获得最大的健康效果，非常期望含有二十碳五烯酸（EPA)。因此，在另一个实施方案中，基于总脂肪计，EPA的量可以介于4重量％和15重量％之间，更优选介于8重量％和13重量％之间的范围。EPA = DHA的重量比有利地是至少6:4，例如介于2:1和10:1之间。在又一个实施方案中，EPA的量非常低，例如基于总脂肪的O. I到I重量％,优选为O. 3重量％或O. 6重量％。

[0064] 另外，本发明的营养组合物可以有益地含有乳化剂。可以使用通常已知的乳化剂，一般来说所述乳化剂有助于所述组合物中脂肪的能量含量。

[0065] 消化性碳水化合物

[0066] 在本发明的一个实施方案中，本发明的营养组合物进一步包括消化性碳水化合物。优选地，所述消化性碳水化合物可提供本发明所述组合物总能量含量的30到60%。所述消化性碳水化合物可包含简单碳水化合物或复合碳水化合物或其任意混合物。适合用于本发明的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、帕拉金糖（palatinose)、玉米糖浆、麦芽、麦·芽糖、异麦芽糖、部分水解的玉米淀粉、麦芽糖糊精、低聚葡萄糖和多聚葡萄糖。

[0067] 优选使得所述消化性碳水化合物的组合物避免高粘度、过甜、过度褐化(麦拉德反应（Maillard reaction))和摩尔渗透压浓度过高。通过调节消化性碳水化合物的平均链长(平均聚合度，DP)至I. 5和6之间，优选介于I. 8和4之间，可以获得可接受的粘度和摩尔渗透压浓度。为避免过甜，葡萄糖和果糖的总水平优选低于所述碳水化合物特别是消化性碳水化合物的重量的60%，更优选低于52%，更优选低于40%。长链消化性碳水化合物例如淀粉、淀粉级分和轻度淀粉水解产物（DE>1，DE〈20)，也可能存在，优选其量小于所述消化性碳水化合物的25重量％，特别地小于15重量％，并且小于6g/100ml本发明的总肠组合物，优选小于4g/100ml本发明的总肠组合物。

[0068] 在本发明的一个实施方案中，所述消化性碳水化合物包括具有高DE (葡萄糖当量）的麦芽葡萄糖（maltodextrose)。在一个实施方案中,所述消化性碳水化合物包括具有DE>10，优选DE>20，更优选>30或者甚至>40，例如DE为约47，的麦芽葡萄糖。在本发明的一个实施方案中，所述消化性碳水化合物包括蔗糖和具有DE>10的麦芽葡萄糖。

[0069] 令人意外地，使用麦芽葡萄糖会导致加热时很少或没有麦拉德反应产物。不囿于任何解释，该效应可能归因于所述胶束酪蛋白的紧密胶束结构为麦拉德反应提供了很少的赖氨酸反应位点。在本发明的一个实施方案中，所述消化性碳水化合物包括所述消化性碳水化合物总重量的至少35重量％,优选至少50重量％,优选至少65重量％,优选至少90重量％的量、具有高DE的麦芽葡萄糖。在本发明的一个实施方案中，所述消化性碳水化合物包括具有2到20的低DE的麦芽葡萄糖。在本发明的一个实施方案中，所述消化性碳水化合物包括具有2到10的低DE的麦芽葡萄糖，优选具有约为2的低DE的麦芽葡萄糖。在本发明的一个实施方案中，所述消化性碳水化合物包括所述消化性碳水化合物的小于35重量％，优选小于20重量％，优选小于10重量％的量、具有低DE的麦芽葡萄糖。具有低DE的麦芽葡萄糖还可以被称为麦芽糖糊精（maltodextrine)。在本发明的另一个实施方案中,所述消化性碳水化合物包括具有高DE的麦芽葡萄糖，优选DE>20，优选DE>30或者甚至DE>40，最优选DE为约47的麦芽葡萄糖，与具有低DE的麦芽葡萄糖组合，其优选2到20的低DE，更优选2到10的低DE，最优选具有约为2的低DE的麦芽葡萄糖。已知的，具有低DE的麦芽葡萄糖，例如DE约为2的麦芽葡萄糖，会产生高粘度。具有高DE的麦芽葡萄糖，例如DE约为47的麦芽葡萄糖，会产生低粘度，但是非常甜。两种麦芽葡萄糖的组合优化了甜度和粘度之间的平衡。在本发明的一个实施方案中，基于消化性碳水化合物总重量计，所述消化性碳水化合物包括至少65重量％，优选至少90重量％的DEMO优选DE约为47的麦芽葡萄糖，和O到10重量％的DE为2到10，优选DE约为2，的麦芽葡萄糖。

[0070] 在本发明的另一个实施方案中，所述消化性碳水化合物包括海藻糖。本发明的一个主要目的是提供具有低粘度的营养组合物。蔗糖非常适合这一目的，但是其产生非常甜的组合物，这通常是消费者不喜欢的。具有低DE约为2，的麦芽葡萄糖不会产生过甜的缺陷，但是会产生高粘度。具有高DE，例如DE约为47，的麦芽葡萄糖会产生低粘度，但是也是非常甜的，并且进一步还会产生不期望的麦拉德反应。海藻糖是一种优选的碳水化合物，因为其产生低粘度、没有不期望的麦拉德反应、并且其甜度约为蔗糖的一半。在本发明的一个实施方案中，所述消化性碳水化合物含有海藻糖的量为所述碳水化合物重量的20%到60%，为所述消化性碳水化合物重量的20%到45%，更优选25%到45%。

[0071] 维生素、矿物质和微量元素

[0072] 本发明的组合物可以含有多种维生素、矿物质和微量元素。

[0073] 在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物可提供所有必需的维生素、大多数矿物质和微量元素。例如，本发明的组合物每IOOml组合物优选提供6mg锌,这对康复患者的组织修复是有益的。优选地,本发明的组合物每IOOml组合物(还)提供25mg维生素C以帮助具有更严重的康复需求的患者。此外，优选地，本发明的组合物每IOOml组合物(还)提供2. 25mg铁。铁在保持体液和老年患者的循环系统功能中是有益的。

[0074] 本发明显示，本发明的组合物可以含有在FSMP(用于特定医疗目的的食物）规定水平之外的钠和/或钾水平。

[0075] 非消化性碳水化合物

[0076] 本发明的肠营养组合物可任选地用非消化性碳水化合物(膳食纤维）例如低聚果糖或菊粉来强化。在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物含有O. 5g到6g非消化性碳水化合物/100ml。所述膳食纤维包括DP为2到20，优选为2到10，的非消化性低聚糖。更优选地，这些低聚糖基本上不含有大量（小于5重量％)的在这些DP范围之外的糖类，并且它们是可溶的。这些低聚糖可以含有低聚果糖（FOS)、反式低聚半乳糖（!OS)、低聚木糖（XOS)、大豆低聚糖等。任选地，也可以将更高分子量化合物例如菊粉、大豆多糖、阿拉伯胶多糖（阿拉伯胶纤维或阿拉伯树胶）、纤维素、抗性淀粉等加入本发明的组合物。不溶纤维例如纤维素的量优选低于本发明的组合物中膳食纤维级分的20重量％，并/或低于O. 6g/100ml。增稠多糖例如角叉菜聚糖、黄原胶、果胶、半乳甘露聚糖和其他高分子量（DP>50)非消化性多糖的量优选是低的，即小于所述纤维级分重量的20%，或者小于lg/100ml。可替代地，可以有利地包含水解的多糖，例如水解的果胶和半乳甘露聚糖。too??] 优选的纤维组分是链长（DP)为2到10的非消化性低聚糖，例如Fibersol® (抗性低聚葡萄糖），特别是氢化的Fibersol®，或者是DP为2到10的低聚糖例如低聚果糖或低聚半乳糖的混合物，其还可以含有少量更高级糖（例如DP为11到20的糖）。这种低聚糖优选地包含所述纤维级分的50重量％到90重量％,或者O. 5g到3g/100ml本发明的组合物。其他适合的纤维组分包括只具有部分消化性的糖类。

[0078] 在一个具体的实施方案中，本发明的组合物含有低聚果糖、菊粉、阿拉伯胶多糖、大豆多糖、纤维素和抗性淀粉中的一种或多种。

[0079] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物可以包含如W02005/039597 (N.V. Nutricia)中公开的中性和酸性低聚糖的混合物，W02005/039597在此以引用方式全文纳入本文。更具体地，所述酸性低聚糖的聚合度（DP)介于I和5000之间，优选介于I和1000之间，更优选介于2和250之间，甚至更优选介于2和50之间，最优选介于2和10之间。如果使用具有不同聚合度的酸性低聚糖的混合物，则所述酸性低聚糖混合物的平均DP优选介于2和1000之间，更优选介于3和250之间，甚至更优选介于3和50之间。所述酸性低聚糖可以是同质的或者异质的碳水化合物。所述酸性低聚糖可以由果胶、果胶酸盐、藻酸盐、软骨素（chondroitine)、透明质酸、肝素、类肝素（heparane)、细菌碳水化合物、唾液聚糖（Sialoglycan)、岩藻多糖、低聚岩藻糖或角叉菜聚糖制备，优选由果胶和藻酸盐制备。所述酸性低聚糖可以通过WO 01/60378中所述的方法制备，其在此以引用的方式纳入 本文。所述酸性低聚糖优选由高甲氧基化的果胶制备，所述甲氧基化果胶的特征是其甲氧基化程度超过50%。本文中所用的“甲氧基化程度”（也称为DE或“酯化度”)用于表示多聚半乳糖醛酸链中所含的游离羧酸基团被酯化(例如被甲基化)的程度。所述酸性低聚糖优选的特征是其甲氧基化程度超过20%，优选超过50%，甚至更优选超过70%。优选地，所述酸性低聚糖的甲基化程度超过20%，优选超过50%，甚至更优选超过70%。优选地，所述酸性低聚糖的每天给予量介于IOmg和IOOg之间,优选的每天给予量介于IOOmg和50g之间,甚至更优选的每天给予量介于O. 5g和20g之间。

[0080] 本发明中所用的术语中性低聚糖是指单糖单元的聚合度超过2、更优选超过3、甚至更优选超过4、最优选超过10的糖，其在肠内不会通过人上消化道（小肠和胃）中存在的酸或消化酶作用而消化或者只有部分被消化，但是其可以被人肠道菌群发酵，并且优选缺少酸性基团。所述中性低聚糖在结构上(化学上)与所述酸性低聚糖不同。本发明所用的术语中性低聚糖优选是指所述低聚糖的聚合度低于60个单糖单元、优选低于40、甚至更优选低于20、最优选低于10个单糖单元的糖。术语单糖单元是指具有封闭环结构的单元，优选为己糖例如吡喃糖或呋喃糖形式。所述中性低聚糖优选地包含基于其所含单糖单元总数计的至少90%、更优选地至少95%的选自以下的单糖单元：甘露糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、口 -D-呋喃型半乳糖、核糖、葡萄糖、木糖和其衍生物。适合的中性低聚糖优选可被消化道菌群发酵。优选地，所述低聚糖选自纤维二糖（4-0-β-D-吡喃葡糖基-D-葡萄糖）、纤维糊精（(4-0-β-D-卩比喃匍糖基）n_D_匍萄糖）、Β_环糊精（α-1-4-连接的D-匍萄糖的环状分子、α -环糊精六聚体、β -环糊精七聚体和Y -环糊精八聚体）、非消化性糊精、低聚龙胆糖（β-1-6连接的葡萄糖残基的混合物，一些残基为1-4连接）、低聚葡萄糖(a -D-葡萄糖的混合物）、低聚异麦芽糖（直链α -1-6连接的葡萄糖残基，一些残基为1_4连接）、异麦芽糖（6-0- a -D-卩比喃匍糖基-D-匍萄糖）、异麦芽二糖（6-0- a -D-卩比喃匍糖基-(1-6) - a -D-吡喃葡糖基-D-葡萄糖）、潘糖（6-0- a -D-吡喃葡糖基-(1_6) - a -D-吡喃葡糖基-(1-4)-D-葡萄糖）、麦白糖（leucrose) (5-0- a -D-吡喃葡糖基-D-吡喃果糖苷）、帕拉金糖或异麦芽酮糖（6-0- a -D-卩比喃葡糖基-D-果糖）、theanderose (O- a -D-批喃葡糖基-(1-6) -O- a -D-吡喃葡糖基-(1-2) -B-D-呋喃果糖苷）、D_塔格糖（D-agatose)、D-万寿菊糖（D-Lyxo-hexulose)、乳鹿糖（Iactosucrose) (O- β -D-卩比喃半乳糖基-(1-4) -O- a -D-卩比喃匍糖基-(1-2) - β -D-呋喃果糖苷)、包括棉子糖、水苏糖和其他大豆低聚糖的α-低聚半乳糖（O-a-D-吡喃半乳糖基-(1-6)-a-D-吡喃葡糖基-β-D-呋喃果糖苷）、β_低聚半乳糖或反式低聚半乳糖（β-D-吡喃半乳糖基-(l-6)-[i3_D-吡喃葡糖基]n-(l_4) α-D葡萄糖）、乳果糖（4-0-i3_D-吡喃半乳糖基-D-果糖）、4’ -半乳糖基乳糖（4’ -galatosy I lactose) (0_D_卩比喃半乳糖基-(1_4)-0_β -D-卩比喃葡糖基-(1-4)_D-卩比喃葡萄糖)、合成低聚半乳糖（新半乳二糖（neogalactobiose)、异半乳二糖、半乳鹿糖（galsucrose)、异乳糖1、11和III)、果聚糖型果聚糖（β -D-(2 — 6)-呋喃果糖基）n a -D-吡喃葡萄糖苷）、菊粉型果聚糖（β -D- ((2 — I)-呋喃果糖基）η a -D-吡喃葡萄糖苷）、If- β -呋喃果糖基蔗果四糖（β -D- ((2 — I)-呋喃果糖基）n B-D-呋喃果糖苷）、低聚木糖（B-D-((l — 4)-木糖）n、lafinose、乳鹿糖和低聚阿拉伯糖。

[0081] 依据另一个优选的实施方案，所述中性低聚糖选自果聚糖、低聚果糖、非消化性糊精低聚半乳糖（包括反式低聚半乳糖）、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、低聚葡萄糖、低聚甘露糖、低聚果糖和其混合物。最优选地，所述中性低聚糖选自低聚果糖、低聚半乳糖和反式低聚半乳糖。

[0082] 适合的低聚糖及它们的生产方法在Laere K. J. M. (Laere, K. J. M. , Degradationof structurally different non-digestible oligosaccharides byintestinalbacteria:glycosylhydrolases of Bi. adolescentis. PhD-thesis(2000), WageningenAgricultural University, ffageningen, TheNetherlands)中有进一步描述，其在此以引用方式全文纳入本文。例如，反式低聚半乳糖（TOS)以商标Vivinal™(Borculo DomoIngredients, Netherlands)进行销售。非消化性糊精,可以通过高温分解玉米淀粉产生,含有天然淀粉中存在的α (1 — 4)和α (1 — 6)糖苷键，并且含有I — 2和I — 3连接和左旋葡聚糖。由于这些结构特征，非消化性糊精含有通过人消化酶部分水解的健全支化颗粒。非消化性低聚糖的多种其他的商业来源是容易可得的，并且是本领域技术人员已知的。例如，反式低聚半乳糖可从日本东京Yakult Honsha Co.获得。大豆低聚糖可从CalpisCorporation获得（由 Ajinomoto U. S. A. Inc. , Teaneck, N. J 提供）。

[0083] 在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物含有DP介于2和250之间的酸性低聚糖，其由果胶和藻酸盐及其混合物制备；还含有选自果聚糖、低聚果糖、非消化性糊精、低聚半乳糖包括反式低聚半乳糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、低聚葡萄糖、低聚甘露糖、低聚岩藻糖和其混合物的中性低聚糖。

[0084] 在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物含有两种化学上不同的中性低聚糖。已发现，将酸性低聚糖与两种化学上不同的中性低聚糖组合给予会提供最佳的协同免疫刺激效应。

[0085] 优选地，本发明的组合物包含：

[0086]-上述定义的酸性低聚糖；

[0087]-基于半乳糖的中性低聚糖（其中超过50%的单糖单元是半乳糖单元），优选选自低聚半乳糖和反式低聚半乳糖；和

[0088]-基于果糖和/或葡萄糖的中性低聚糖(其中超过50%的单糖单元是果糖和/或葡萄糖，优选果糖单元)，优选菊粉、果聚糖和/或低聚果糖，最优选为长链低聚果糖（平均DP为10到60)。

[0089] 所述酸性低聚糖和中性低聚糖的混合物优选每天给予量介于IOmg和IOOg之间，优选每天给予量介于IOOmg和25g之间，甚至更优选地每天给予量介于O. 5g和20g之间。

[0090] 粘度和摩尔渗透压浓度

[0091] 在本发明的上下文中，粘度是在旋转流变仪中在20° C以剪切速率50s—1用杯-轮几何体（cup-and-bob geometry)测量的。

[0092] 在本发明的一个实施方案中，所述肠营养组合物的粘度小于200mPa. S，更优选小于150mPa. s,更优选小于120mPa. s,更优选小于IOOmPa. s,更优选小于80mPa. s,并且最优选为50mPa. s。低粘度对于口服给予本发明的液体肠营养组合物是理想的，因为人可以容易摄取具有如本发明所述的低粘度的食物。这对于管饲的单位剂量也是理想的。 [0093] 在本发明的另一个实施方案中，所述肠营养组合物的粘度超过200mPa. S，更优选超过400mPa. s,更优选超过600mPa. S。高粘度对于生产布丁、凝胶、或者半固态或半液态组合物是理想的。这对于可以匙取的单位剂量也是理想的。

[0094] 在本发明的一个实施方案中，所述组合物的摩尔渗透压浓度优选低于1200m0sm/I，更优选低于900m0sm/l,更优选低于800m0sm/l,最优选低于700m0sm/l。

[0095] 剂量单位

[0096] 本发明的肠营养组合物可具有完全食物的形式，也就是说其可以满足使用者所有的营养需求。因此，其优选每日剂量中含有1200到2500kcal。所述日剂量是依据向体重为70kg的健康成年人每日供应2000kcal的能量确定的。对于不同状况和不同体重的人，该水平应相应地调整。可以理解的是，所述平均每日能量摄入优选是约2000kcal。所述完全食物可以是多个剂量单位的形式，例如每天4(250ml/单位）到40 (20ml/单位）个剂量单位，用于使用2. Okcal/ml的本发明肠营养组合物进行2000kcal/天的能量供应。

[0097] 所述肠营养组合物也可以是食品补充物，例如用于添加到非医疗食品中。优选作为补充物，所述肠营养组合物含有的日剂量小于1500kcal，特别地，作为补充物，所述肠营养组合物每日剂量含有400到lOOOkcal。所述食品补充物可以多个剂量单位的形式，例如每天2 (250ml/单位）到10 (50ml/单位）个剂量单位，用于使用2. Okcal/ml的本发明肠营养组合物进行IOOOkcal/天的能量供应。

[0098] 在本发明的一个实施方案中，单位剂量含有的本发明的肠营养组合物为介于IOml和250ml之间的任意量(含该范围的两个端值)，优选介于25ml和200ml之间的任意量(含该范围的两个端值)，更优选介于50ml和150ml之间的任意量(含该范围的两个端值)，最优选约为125ml。例如，接受50ml单位剂量的人每天可以给予10个单位剂量，以使用2. Okcal/ml的本发明肠营养组合物提供能量支持。或者，接受125ml单位剂量的人每天可以给予4、5、6、7或8个单位剂量，以使用2. Okcal/ml的本发明肠营养组合物提供能量支持。优选这种小的剂量单位，因为其具有更好的顺应性。

[0099] 在本发明的一个实施方案中，所述组合物是以可即用的形式提供，在使用前不需要复原或者混合。本发明的组合物可以被管饲或者口服给予。例如，本发明的组合物可以在罐中、在针状物上（on spike)和在悬挂袋中提供。但是，组合物可以粉末形式提供给需要的人，所述粉末形式适于用水性溶液或水复原以产生本发明的组合物。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物是以粉末的形式，附有在水性组合物或水中溶解或复原以获得本发明的肠营养组合物的说明书。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的肠营养组合物可以通过将粉末溶解或复原获得，优选在水性组合物中，特别优选在水中溶解或复原。

[0100] 在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物可以用作制备半固体营养组合物例如乳酪、布丁、蛋奶糕、汤、冰淇淋或果冻的基材。为此，将本发明的组合物进行处理，以将本发明的低粘度组合物变得更固化或者更粘稠，例如通过加入增稠剂或胶凝剂，并且进一步将所述混合物加工成为最终产品。增稠剂和/或胶凝剂也可以在该加工的更早阶段出现在制剂中，或者甚至在该加工起始时与所述营养物一起溶解。

[0101] 在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物是包装的。所述包装可以是任意适合的形式，例如封闭成型的纸盒，例如可以用吸管吸空的纸盒、具有可揭开的盖子的纸盒或塑料杯、小尺寸的瓶子例如80ml到200ml范围的瓶子、以及杯子例如IOml到30ml范围的杯子。另一种适合的包装形式是将小体积（例如IOml到20ml)的所述组合物包裹在可食用的固体或半固体外壳或胶囊中，例如胶质状的遮盖物中。另一种适合的包装形式是在容器例如药囊中的粉末，优选具有在水性组合物或水中溶解或复原的说明书。

[0102] 实验

[0103] 下述用于证明本发明的观点。但是，本发明不应理解为被下述用于解释所观测到的现象的任何理论和假设所限制。

[0104] 应用简化的浓缩乳体系代替完全的药学营养处方（即含有高浓度单价离子和二价离子、碳水化合物和脂肪的体系）是确定磷酸盐和柠檬酸盐对酪蛋白胶束容积度的影响的有效方式。我们选择了一种称为胶束酪蛋白分离物（MCI)的市售蛋白质来源，其含有可忽略量的乳清蛋白，并且是加入大的浓度范围的磷酸盐和柠檬酸盐的制备的9%w/v的高蛋白溶液。在本申请中，发明人公开了正磷酸盐、聚磷酸盐和柠檬酸盐对酪蛋白胶束容积度的影响。进行了粘度和超速离心测量，以研究所述酪蛋白胶束的总溶液和容积度变化，而进行了浑浊度和钙离子活性测量，以研究酪蛋白胶束内的变化。在本说明书中，当讨论酪蛋白胶束容积度改变时仅使用了术语胶束的膨胀或收缩或解离并没有使用具体酪蛋白的释放，因为本研究中未测定具体酪蛋白的释放。

[0105] 材料和方法

[0106] 样本制备

[0107] 为制备9%w/v胶束酪蛋白分离物溶液，将MCI (Nutripro™, DairyGold FoodIngredients, Cork, Ireland)蛋白质粉末在环境温度下溶解于80%的完全去离子水中，同时用实验揽拌器（RW 20. n, IKALabortechnik, Staufen, Germany)以 600rpm 揽拌。9%w/V MCI 溶液含有约 8. 5mmol · L-1 钠、4. 2mmol · L-1 钾、2. 5mmol · L-1 氯、59. 8mmol · L-1 隹丐、43. 5mmol *L_1磷和3. Immol *L_1镁。所述蛋白质溶液在350+50bar下用实验室高压均质仪(NS2006L, GEA Niro Soari S. P. A.，Parma, Italy)均质化，以获得具有用含有hydro 2000G水浴器的 Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, Worcestershire, England)测定的直径D[4，3]为O. 15 μ m的单一酪蛋白胶束。在均质化后，所述蛋白质溶液的温度是40°C。

[0108] 随后，加入浓度范围为0_105mEq · L—1的尿苷单磷酸二钠(YamasaCorporation, Chiba, Japan)、憐酸氢二钠(Merck&Co. Inc, Darmstadt, Germany)、六偏磷酸钠（VWR International Ltd, Poole, England)、肌醇六磷酸十二钠盐水合物(Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany)或朽1 樣酸三钠盐(Gadot BiochemicalIndustries Ltd. , Haifa Bay, Israel)。浓度是基于所述磷酸盐和朽1檬酸盐的毫当量以向所述样本中加入近似量的电荷。只使用了钠源，因为反荷离子的类型也可影响蛋白质-矿物质的相互作用（Fox, Harper, Holsinger&Pallansch, 1965)。在搅拌30分钟后，所述样本的 pH 用 Imol · L-1 氢氧化钠(Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germany)或 Imol · L-1 盐酸(Merck&Co. Inc, Darmstadt, Germany)调整到7. 0±0. 05。最后，所述样本用去离子水复原到最终蛋白浓度为9%w/v。样本在20°C过夜储存约17小时。如果储存过程中产生偏差，则在第二天早晨将所述样本的pH调整到7. 0±0. 05。储存过程中产生的偏差是小的，并且样本没有显示任何明显的变质。分析样本的最终pH、钙离子活性、浑浊度和粘度，重复两次。将所述样本进行超速离心，并将片状沉淀和上清液进行收集、称重并分析其蛋白质含量。

[0109] 钙离子活性

[0110] 1丐离子活性用 Mettler Toledo Seven Multi™(带有 Inlab® ExpertPropH-meter) I丐测量装置（Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)使用 Orion 9300BH 电极和Orion 900100参比电极进行测量。电极校准、样本测量和I丐离子活性计算如De Kortet al. (2009)所述。

[0111] 浑浊度

[0112]浑池度用分光光度计（4053Kinetics, LKB Biochrom, Midland, Canada)测量。使用光径为Icm的塑料比色皿。在环境温度下用700nm波长进行测量。将样本稀释至的10%的起始干物质在去离子水中的浓度，以使其在分光光度计的检测限度之内。

[0113] 粘度

[0114]样本在 20°C 用 MCR 300 流变仪(Anton Paar Physica, Graz, Austria)应用杯(CC27圆筒）或轮（bob)几何体进行分析。在剪切速率为Is—1到lOOOs—1条件下测量所述粘度。大多数样本的表现接近于牛顿流体。

[0115] 超速离心

[0116]用 Centrikon T-1080A 超速离心机（Kontron Instruments Ltd. , Milano, Italy)使用固定角度钛转子（TFT 45. 94型）进行超速离心。样本在20°C在150000g下超速离心60分钟。将上清液和片状沉淀物级分分离、称重、并分析其蛋白质含量。

[0117] 蛋白质含量

[0118] 测定了超速离心的片状沉淀、上清液和总样本中的蛋白质含量。用杜马斯法(Dumas method)使用 NA 2100 氮和蛋白质分析仪(CEInstruments, Milan, Italy)测定样本中的氮含量。使用转换因子6.38将氮转换为蛋白质含量。大约IOOmg样本在锡杯中进行称量。所述样本在70°C在恒温箱中干燥2. 5小时。其后，加入25mg吸收抗原(82009101, Interscience B. V. , Breda, The Netherlands)并将所述杯封闭。将所述杯放入自动采样器中并分析其氮含量。

[0119] 容积度

[0120] 所述胶束的容积度用如下两种方法计算：根据粘度测量和根据超速离心法测量。将所述粘度值代入Eilers’方程式（Eilers，1941)中以计算所述溶液中所述胶束的体积分数。根据体积分数计算所述胶束的容积度。选择在剪切速率为50s—1时测量的所述粘度，因为该剪切速率相当于饮用过程中器官感觉的剪切。在容积度计算中使用的最大包装体积分数（maximum packing volume fraction) (Φmax)为 0· 79 (Snoeren et al.，1982)。背景电解质的粘度（rU)设定为ImPa. S。

[0121] 还根据超速离心数据通过用总片状沉淀体积（mL. g-1)除以片状沉淀中的蛋白质量（g. g4)进行计算。总片状沉淀体积的计算如VanHooydonk, Hagedoorn&Boerrigter (1986)所述。片状沉淀中矿物质所占的体积是可以忽略的，因为蛋白质在所述片状沉淀体积中占大部分。容积度以mLg-1表示。

[0122] 已经证明，通过粘度测量所计算的胶束的容积度与通过超速离心法获得的容积度相一致。以下所标绘的结果是基于粘度测量的结果。

[0123] 附图列表

[0124] 图I :乳体系中游离钙离子、钙螯合剂复合物与酪蛋白胶束之间的盐平衡。本研究中的螯合剂是 Na2UMP、Na2HPO4、SHMP、SP 和 TSC。

[0125] 图2:9%w/v MCI溶液的钙离子活性与磷酸盐和柠檬酸盐浓度的函数。符号代表： (· ) Na2UMP ； ( ♦ ) Na2HPO4 ； ( ■ ) SHMP ( ▲ ) SP ; (x) TSC。

[0126] 图3 ：9%w/v MCI溶液在剪切速率为50s—1下的粘度与磷酸盐和柠檬酸盐浓度的函数。符号代表：(· ) Na2UMP; ( ♦ ) Na2HPO4; ( ■ ) SHMP ( ▲ ) SP; (x) TSC。

[0127] 图4 ：9%w/v MCI溶液在剪切速率为50s—1下用Eilers方程计算的容积度与磷酸盐和柠檬酸盐浓度的函数。符号代表：(· ) Na2UMP; ( ♦ ) Na2HPO4; ( ■ ) SHMP ( ▲ ) SP; (x)TSC。

[0128] 图5:9%w/v MCI溶液超速离心的片状沉淀的量与磷酸盐和柠檬酸盐浓度的函数。符号代表：（·）Na2UMP; ( ♦ ) Na2HPO4; ( ■ ) SHMP ( ▲ ) SP; (x) TSC。

[0129] 图6:9%w/v MCI溶液超速离心的片状沉淀中蛋白质的量与磷酸盐和柠檬酸盐浓度的函数。符号代表：（·）Na2UMP; ( ♦ ) Na2HPO4; ( ■ ) SHMP (A)SP; (x) TSC。

[0130] 图7 :基于粘度的容积度和超速离心法测量的容积度之间的相关性。符号代表：(· )Na2UMP; ( ♦ )Na2HPO4; ( ■ ) SHMP( A ) SP; (x)TSC; (― )x=y。

[0131] 图8 ：9%w/v MCI溶液稀释至10%的初始干物质在去离子水中的浓度时的浑浊度与磷酸盐和柠檬酸盐浓度的函数。符号代表：(· )Na2UMP; ( ♦ )Na2HPO4; ( ■ )SHMP( ▲)SP; (X)TSC。

[0132] 结果和讨论

[0133] 加入所述磷酸盐和柠檬酸盐时钙离子活性降低（图2)，因为钙离子被从血清相和酪蛋白胶束中螯合。测量了对于SHMP、SP、TSC和Na2HPO4的钙离子活性的相当程度的降低。加入SP、TSC和Na2HPO4后，粘度增加到相当的程度（图3)。测得SHMP样本的粘度增加最大，这是由于SHMP交联酪蛋白的能力（Kocak&Zadow, 1985;Mizuno&Lucey, 2007;Vujicic etal.，1968)。这导致了加入超过45mEq · T1SHMP时形成凝胶。加入Na2UMP后钙离子活性只有少许降低，因为Na2UMP是弱的钙结合剂（De Kort et al.，2009)。因此，所述粘度受到可忽略的影响。

[0134] 将所述粘度值（剪切速率为50s—1下）代入Eilers方程中，以计算所述酪蛋白胶束的容积度。当测量更高的粘度时，所述溶液在更高的螯合剂浓度（SP、TSC和Na2HPO4的浓度彡75mEq · L—1，SHMP的浓度彡45mEq · L—1)下剪切稀化。这看似通过50s—1下的粘度进行解释是有歧义的。但是，在高粘度区域，由Eilers’方程计算的体积分数对实际粘度值的灵敏度是低的：体积分数接近于最大包装的值Φ_。图4中的结果显示，在9%w/v MCI溶液中的酪蛋白胶束的容积度是4. 5mL· g' Walstra etal. (2006)测量了乳中酪蛋白胶束的容积度是4mL · g—1。加入Na2UMP对酪蛋白胶束的容积度具有可以忽略的影响。SHMP样本比其他磷酸盐和柠檬酸盐样本计算得出更高的体积分数，因为SHMP样本具有胶凝作用。因此，对于SHMP样本，不能从通过Eilers’方程得出的粘度推算出所述酪蛋白胶束的容积度，因为所述胶束之间的相互作用不再只有流体力学性质。SP、TSC和Na2HPO4对粘度的影响和因此所得出的容积度是相当的。加入105mEq · L—1 SP、TSC或Na2HPO4时，所述酪蛋白胶束的容积度从4. 5mL · δ^(Φ=0. 41)增加到约7. 5mL · δ^(Φ=0. 69)。在所研究的浓度范围内，加入SP、TSC和Na2HPO4既不交联酪蛋白胶束又不导致胶凝化，这与TSC在乳中的表现一致(Mizuno&Lucey, 2005)。

[0135] 所述酪蛋白胶束的容积度也可以通过用总片状沉淀体积除以片状沉淀中蛋白质的量从超速离心级分推算出。超速离心后所述片状沉淀的量和片状沉淀中蛋白质的量分别示于图5和图6中。超速离心的片状沉淀的量受到离心时间和加速度、所述溶液的密度和粘度以及所述酪蛋白胶束的密度和尺寸的影响。胶束中存在的CCP、酪蛋白和水的量决定了所述胶束的密度（Lin et al.，1972):在(完整的）酪蛋白胶束中存在的CCP和酪蛋白越 多，粘度越低，所述胶束越容易沉淀到所述片状沉淀中。9%w/v MCI超速离心I小时形成约30w/w%的片状沉淀，该片状沉淀含有7. 5w/w%的蛋白质。加入TSC、SP和SHMP时，片状沉淀的量和所述片状沉淀中蛋白质的量下降，但是加入Na2HPO4和Na2UMP时，片状沉淀的量增加，所述片状沉淀中蛋白质的量略微减少。

[0136] 图7显示了由粘度计算的容积度和由超速离心测量结果计算的容积度之间的相关性。一般来说，从超速离心获得的容积度低估了从粘度获得的容积度，因为所述片状沉淀中胶束的“毛状”外层的压缩。Dewanet al. (1972)和Van Hooydonk et al. (1986)也观察到了该现象。TSC、SP、Na2HPO4和Na2UMP样本的容积度互相关联。对于SHMP样本，它们互相关联最高达15mEq · L—1的SHMP，但是在更高SHMP浓度下开始偏离。这是由于在SHMP样本中所测量的高粘度。SHMP样本中通过粘度测量计算的所述酪蛋白胶束的容积度是被高估的，因为所述酪蛋白是交联的。在较高粘度下，超速离心的片状沉淀的量也会较低。因此，在SHMP样本中所述酪蛋白胶束的容积度既不能通过粘度计算也不能通过超速离心计算。

[0137] I丐螯合剂还影响乳溶液的浑池度（Odagiri&Nickerson, 1964)。加入磷酸盐和朽1檬酸盐时，所述9%w/v胶束酪蛋白溶液的浑浊度以SHMP>SP>TSC>Na2HP04>Na2UMP的顺序降低（图8)。Mizuno&Lucey (2005)也观察到了在pH 5. 8时由乳蛋白浓缩剂制备的样本中的浑浊度以SHMP>TSC>Na2HP04的顺序降低。加入45mEq · L^1SP或SHMP后所述浑浊度降低到相当的程度，但是测得这些样本的粘度有很大不同。这意味着SHMP在该浓度范围内具有交联酪蛋白的能力，但是SP不具有此能力。发明人假设这是由于所述分子周围的排列（form)和电荷分布。SHMP在其分子周围具有六个均匀分布的负电荷，而SP在其分子周围具有成对聚集的12个负电荷。这种均匀电荷分布使得SHMP可以同时与阳离子和酪蛋白相互作用。SP可比SHMP更难接近所述酪蛋白，这是由于SP分子周围的电荷分布，并且以此方式抑制交联。SP还是很强的钙螯合剂，并且可以迅速螯合游离的钙离子以至于不再有电荷或钙离子可用于交联所述酪蛋白。这是根据SP比SHMP产生更强的钙离子活性降低而测量的（图2)。Mizuno和Lucey (2007)研究了乳蛋白浓缩溶液中焦磷酸四钠（TSPP)的交联能力。他们提出，焦磷酸钙复合物可交联酪蛋白或者降低酪蛋白之间的静电排斥，这促进了疏水缔合。TSPP可能比SHMP更容易交联所述酪蛋白，由于其在其分子周围只有四个均匀分布的电荷。但是，需要进一步的研究以阐明由不同的聚磷酸盐交联酪蛋白的确切机制。

[0138] 值得注意的是，SP、TSC和Na2HPO4显示大致相当的粘度和容积度的增加以及钙离子活性的降低，但是这些螯合剂对于浑浊度和超速离心的片状沉淀（中的蛋白质）具有不同的影响。所述酪蛋白胶束中的钙离子可结合到磷酸丝氨酸残基或者是CCP复合物的一部分。加入的螯合剂与所述磷酸丝氨酸残基和所述酪蛋白胶束中的CCP竞争钙离子。由于 SP、TSC 和 Na2HPO4 对I丐离子亲和力的不同(De Kort et al. , 2009;Mekmene, LeGraet&Gaucheron, 2009;Turner, Paphazy, Haygarth&Mckelvie, 2002;Upreti, Buhlmann&Metzger, 2006)，所述螯合剂能够从所述胶束中释放不同量的CCP。这不一定会影响所述胶束结构的完整性，因为当CCP被溶解时CCP簇周围的酪蛋白之间的疏水相互作用阻碍了所述胶束的完全离解（Mcmahon&Oommen, 2007;Munyua&Larsson-Raznikiewicz, 1980)。

[0139] 一般来说，颗粒的散射是由其浓度、颗粒大小和相对于所述溶液的折射率测定的(Van De Hulst, 1957) 0所述酪蛋白和CCP主要负责所述酪蛋白胶束的光散射特性（Munyu a&Larsson-Raznikiewicz, 1980)。从所述胶束除去CCP可降低所述酪蛋白胶束的折射率,其测量为所述乳溶液的浑池度的降低。Smiddy, Martin, Kelly, &De Kruif (2006)对于内部交联的酪蛋白胶束的研究显示，向脱脂乳中加入50mmol -T1柠檬酸盐（150mEq -171)后，测得光散射降低约50%。这些作者提出在该浓度下所有CCP (酪蛋白胶束干重的7%)从所述交联的胶束中除去，但是所述胶束的结构保持完整。发明人测得，将105mEq · Γ1螯合剂加入至9w/v%MCI溶液时，SHMP和SP的浑浊度降低97%、TSC的浑浊度降低87%、Na2HPO4的浑浊度降低60%(图8)。因此，这些浑浊度的降低不能仅归因于CCP从所述胶束中的释放。从所述胶束中除去钙和CCP时，一些特定的酪蛋白也可以从所述酪蛋白胶束中释放。测得Na2HPO4样本的片状沉淀中蛋白质的量仅少许降低（图6)，而测得SP和TSC样本的片状沉淀中蛋白质的量极大地降低。但是，Na2HPO4样本的粘度增加到与SP和TSC样本的粘度大致相当的程度。这说明，SP、TSC和Na2HPO4样本的浑浊度降低的差异不能由仅CCP和一些特定酪蛋白从所述胶束中释放来解释。因此，折射率和颗粒浓度的改变不足以引起强的浑浊度降低。瑞利散射（Rayleigh scattering)显示,散射光的强度随颗粒尺寸的六次方而改变（Van DeHulst, 1957)，因此颗粒尺寸对所述溶液浑浊度的改变起主要作用。当所述胶束膨胀或离解成较小的结构时，所述酪蛋白胶束的颗粒尺寸受到影响。Huppertz (2007)描述了向内部交联的酪蛋白胶束中加入6mol ·Ι^尿素可诱导所述胶束膨胀，这测量为浑浊度降低40%。发明人MCI样本的浑浊度的降低太大以至于不能仅仅归因于所述酪蛋白胶束的膨胀。对于所述酪蛋白胶束膨胀的进一步解释将在下文描述。主要的浑浊度降低最可能是由于所述酪蛋白胶束离解为较小的结构。在超速离心过程中，离解的胶束将比完整的酪蛋白胶束更难沉淀，因为所述离解的胶束的片段比完整的酪蛋白胶束更小且更轻。基于这些现象，所述浑浊度和超速离心结果表明，由于加入SHMP和SP，随后加入TSC，最后加入Na2HPO4，胶束离解发生至最大程度。胶束离解最有可能不在Na2UMP样本中发生。

[0140] 但是，由于在含有离解的或完整的酪蛋白胶束的溶液中加入SP、TSC或Na2HPO4，可以推算出大致相当的容积度，因为每克蛋白质的总体积未改变。这表明，例如Na2HPO4溶液中完整胶束的容积度与SP溶液中离解的胶束的容积度相当，只要所述钙离子活性在两种溶液中大致相当。结果，测得SP、TSC和Na2HPO4样本的所述酪蛋白胶束的粘度和容积度的增加是大致相当的。例如Lin et al. (1972) >Griffin et al. (1988) >Panouilleet al. (2005)和Pitkowski et al. (2009)曾经介绍了在加入聚磷酸盐或EDTA时含有完整酪蛋白胶束和离解的酪蛋白胶束的乳溶液的这种现象。

[0141] 如上所述，加入钙螯合剂时所述酪蛋白胶束还会膨胀。图2显示出加入SHMP、SP、TSC和Na2HPO4时，钙离子活性降低到大致相当的程度。所述酪蛋白胶束中的静电排斥增加，因为所述连续相中的游离钙离子减少。结果，所述酪蛋白胶束变得含水更多和更加膨胀，这测量为MCI溶液粘度的增加（图3)和所述酪蛋白胶束容积度的增加（图4和7)。所述酪蛋白胶束的膨胀现象可以由Na2HPO4样本中超速离心的片状沉淀得出（图5)。在这些样本中，在较高螯合剂浓度下片状沉淀体积增加，但是在SHMP、SP或TSC样本中片状沉淀体积减少。所述酪蛋白胶束的密度、分子量和尺寸对于得到的超速离心的片状沉淀的量是重要的，是由所述酪蛋白胶束中存在的酪蛋白、CCP和水的量决定的（Walstra et al. , 2006) Gaucheret al. (2007)和Guo et al. (2003)观察到，所述酪蛋白胶束中正磷酸盐与钙一起沉淀。例如,加入60mEq · L^1Na2HPO4时可形成大约3g Ca3(PO4)2,其中大部分I丐离子已经是所述酪蛋白胶束的一部分。与观察到的片状沉淀量的增加相比，分子量的增加是可忽略不计的。这种增加被归于所述酪蛋白的膨胀。图5还显示，加入Na2UMP时所述酪蛋白胶束略微地膨胀，因 为这些样本中片状沉淀的量也有所增加。Lin et al. (1972)和Pitkowski et al. (2009)没有观察到加入EDTA时所述胶束膨胀的结果。两者都描述，在特定EDTA浓度下只有部分胶束离解，但是剩余酪蛋白胶束的流体力学半径保持恒定。但是，Sood&Gaind(1979)已经对Lin et al. (1972)观察到的完整胶束将保持恒定的半径提出了质疑，因为他们测得加入EDTA时容积度会增加。因此，他们得出的结论是，当所述酪蛋白胶束的钙含量改变时，所述胶束应该能够膨胀或收缩。此外,Huppertz et al. (2007)通过三光散射方法显示,加入朽1檬酸盐或尿素时，甚至内部交联的酪蛋白胶束也能够膨胀，其测量为颗粒尺寸的增加和浑浊度的降低。这些结果与我们观察到的加入钙螯合剂会诱导完整酪蛋白胶束的膨胀和一部分所述胶束的离解相符合。这还表明，除了在CCP复合物中的强结合的钙以外，松散结合的钙，即结合到带负电荷的氨基酸侧链和磷酸盐基团，存在于所述酪蛋白胶束中。松散结合的钙具有结构功能，其释放与所述胶束的膨胀有关，这测量为粘度的增加。强结合的钙的释放与所述酪蛋白胶束的离解有关，这测量为超速离心片状沉淀的浑浊度和含量的降低。在所述酪蛋白胶束中存在两种类型的I丐相互作用的假设是由Munyua&Larsson-Raznikiewicz (I980)提出的。总之，看起来钙离子活性对于所观察到的粘度和容积度是很好的指示器，但是当所述酪蛋白胶束开始离解时其不是好的指示器。

[0142] 结论

[0143] 钙螯合剂通过影响所述酪蛋白胶束的微结构而诱导浓缩的胶束酪蛋白溶液的物理变化。加入Na2HP04、TSC和SP引起了所述MCI溶液粘度大致相当的增加，而浑浊度以SP>TSC>Na2HP04的顺序降低。加入SP或SHMP引起浑浊度大致相当的降低，但是SHMP样本的粘度要高很多。这是由于SHMP交联酪蛋白胶束的能力。加入SHMP、SP、TSC或Na2HPO4时，钙离子活性降低到大致相当的程度，这诱导所述酪蛋白胶束的膨胀。

[0144] 对于加入SP、TSC、Na2HP04和Na2UMP,所述酪蛋白胶束的容积度（即膨胀）可以由粘度和超速离心测量进行计算。由所述两种计算方法得出的容积度对于这些样本是相互关联的。因为所述酪蛋白之间形成的交联，SHMP样本中所述酪蛋白胶束的容积度不能由粘度和超速离心结果得出。弱的钙螯合剂Na2UMP对所述MCI溶液的粘度和浑浊度具有可忽略不计的影响，并且仅稍微地降低所述钙离子活性。在所述胶束开始离解之前，钙离子活性的降低是粘度增加和所述胶束的相关膨胀的前兆。这证实了在所述酪蛋白胶束中存在两种类型的钙相互作用的假设。胶束离解的程度依赖于所加入的钙螯合剂的类型和浓度。

[0145] 参考文献

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