分离方法 |
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| 申请号 | CN201080041821.X | 申请日 | 2010-09-17 | 公开(公告)号 | CN102510896B | 公开(公告)日 | 2014-04-23 |
| 申请人 | HOYA技术外科株式会社; | 发明人 | 菅生健; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的分离方法涉及，从含有磷脂的样品溶液中选择性地分离上述磷脂的方法，其特征在于，其具有以下工序： 吸附 钙 离子于至少表面由 磷酸 钙类化合物构成的填充剂的钙离子吸附工序；和，向至少一部分填充空间中填充有上述填充剂构成的装置内，供给上述样品溶液的供给工序；和，向上述装置内，供给 有机 溶剂 类的洗脱液，并以每个确定的量分级分离从上述装置内流出的 洗出 液，在该被分级分离的各分离组分的洗出液中，分级分离上述磷脂的分级分离工序。根据本发明，能够以简单的操作，从含有磷脂的样品溶液中选择性地分离磷脂。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种分离方法，其为从含有磷脂的样品溶液中选择性地分离上述磷脂，其特征在于，所述分离方法具有以下工序： |
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| 说明书全文 | 分离方法技术领域[0001] 本发明涉及从样品溶液中选择性地分离磷脂的方法。 背景技术[0003] 因而，利用其相关的性质，已经有人研究将磷脂用于补充剂以及化妆品的有效成分，或药物传递系统(DDS)，其使用用途正在扩大。 [0004] 这样的磷脂在卵黄或大豆等中含量很多。近年，在寻求一种更有效地从其中分离/精制磷脂的方法。作为其分离方法，柱色谱法被关注。例如，尝试使用硅胶色谱法分离/精制磷脂(例如，参见非专利文献1)。 [0005] 然而，在硅胶色谱法中，硅胶载体表面的官能团、以及载体表面残留的硅醇基可能对磷脂的吸附/洗脱产生不好的影响。另外，通常使用的洗脱液是氯仿、甲醇以及己烷等的混合物，其制备复杂。而且，由于磷脂对硅胶载体的吸附强，为了除去吸附的磷脂而洗净柱有困难。因而，具有硅胶载体重复使用困难的问题。 [0006] 所以，作为硅胶色谱法的取代方法，也研究了使用羟磷灰石色谱法。可是，实际上对使磷脂吸附于由羟磷灰石构成的填充剂(载体)的方法、使吸附的磷脂洗脱于洗出液中的方法、进一步地，检测出洗出液中洗脱的磷脂的方法等还没有被充分地进行研究。 [0007] 现有技术文献 [0008] 非专利文献 [0009] 非专利文献1：伊原博隆，「高分子被覆シリカの機能設計と高選択性の発現」，第14回吸着シンポジウム，熊本。 发明内容[0010] 发明概要 [0011] 发明要解决的课题 [0012] 本发明的目的是提供通过简单的操作，从含有磷脂的样品溶液中选择性地分离得到磷脂的分离方法。 [0013] 解决课题的方法 [0014] 通过下述的(1)-(11)记载的本发明实现这样的目的。 [0015] (1)从含有磷脂的样品溶液中选择性地分离上述磷脂的分离方法，其特征在于所述分离方法具有以下工序： [0016] 使钙离子吸附于至少表面由磷酸钙类化合物构成的填充剂上的钙离子吸附工序；和 [0019] 以每个确定的量分级分离上述洗出液，在该被分级分离的各分离组分的上述洗出液中，分离上述磷脂的分级分离工序。 [0020] 由此，能够通过简单地操作，从含有磷脂的样品溶液中选择性地分离磷脂。 [0021] (2)根据上述(1)中所述的分离方法，其中通过含有上述钙离子的钙含有液与上述填充剂接触进行上述钙离子吸附工序。 [0022] 根据相关的方法，通过向上述装置内供给钙含有液的简单地操作，能够确实地使钙离子吸附于填充剂。 [0024] 由此，对磷酸钙类化合物没有不好的影响，能够确实地使钙离子吸附。 [0025] (4)根据上述(1)至(3)任一项所述的分离方法，其中上述磷脂含有形成脂质体的磷脂脂质体。 [0026] 由此，在向上述装置内供给样品溶液时，由于磷脂所具有的磷酸基成为露出于脂质体外侧的状态，因此作为磷脂脂质体存在的磷脂能够被确实地吸附于填充剂。 [0027] (5)根据上述(1)至(4)任一项所述的分离方法，其中获得上述洗出液的工序中，上述洗脱液含有异丙醇。 [0028] 由此，在能够确实地从填充剂洗脱出填充剂上吸附的磷脂的同时，还能够确实地使磷脂以与其以外的杂质呈分离的状态被洗脱至各分级分离组分内。 [0029] (6)根据上述(5)中所述的分离方法，其中在获得上述洗出液的工序中，上述洗脱液是上述异丙醇的含量从0至80％增加的线性梯度溶液。 [0030] 由此，能够将磷脂以与磷脂以外的杂质呈分离的状态更加确实地洗脱至各分级分离组分内。 [0031] (7)根据上述(1)至(4)任一项所述的分离方法，其中获得上述洗出液的工序中，上述洗脱液的流速是0.1至10mL/分钟。 [0032] 通过以这样的流速，进行磷脂的分离，分离操作中不需要长的时间，而能够确实地分离作为目标的磷脂，即，能够得到高纯度的磷脂。 [0033] (8)根据上述(1)至(7)任一项所述的分离方法，其中在上述分级分离工序中，通过观察上述各分离组分的190至230nm波长的吸光度检测出上述磷脂。 [0034] 由于相关范围的波长是能够识别磷脂中所含磷酸基引起的吸收的范围，通过观察相关范围的波长中的吸光度，能够确实地检测出洗出液中的磷脂。 [0035] (9)根据上述(8)中所述的分离方法，其进一步具有预先获得上述洗脱液的吸光度的工序，在上述分级分离工序中，从观察到的上述各分离组分的吸光度中减去上述预先获得的上述洗脱液的上述吸光度而检测出上述磷脂。 [0036] 由此，可以抵消由洗脱液引起的吸光度。即，由于可以去除由洗脱液引起的干扰，因此能够以较高的灵敏度检测出洗出液中的磷脂。 [0037] (10)根据上述(1)至(9)任一项所述的分离方法，其中上述磷酸钙类化合物是以羟磷灰石为主要成分的物质。 [0038] 由于羟磷灰石，特别地与构成生物体的成分接近，因此在吸附、分离磷脂时，可适当地防止此磷脂变质(变性)。 [0039] (11)根据上述(1)至(10)任一项所述的分离方法，其进一步具有预先制备上述装置的工序。 [0040] 发明效果 [0041] 根据本发明，将样品溶液中含有的磷脂吸附于填充剂，进一步，由于能够选择性地将吸附的磷脂洗脱于洗出液中，因此能够从含有磷脂的样品溶液中高纯度地分离磷脂。 [0043] 图1是表示本发明中使用的吸附装置的一个例子的纵剖面图。 [0044] 图2表示卵磷脂脂质体含有液中包含的卵磷脂脂质体的粒度分布的频率分布曲线。 [0045] 图3是向吸附装置供给含有磷脂的样品溶液后，使用其洗出液得到的吸光度曲线。 [0046] 图4是向吸附装置供给含有磷脂的样品溶液后，使用其洗出液得到的吸光度曲线。 [0047] 图5是表示使用具有吸附磷脂脂质体的填充剂的吸附装置，使4STD样品中含有的蛋白质处于分离状态的吸光度曲线。 [0048] 图6是表示使用具有用各种溶剂洗涤后的填充剂的吸附装置，使4STD试料中含有的蛋白质处于分离状态的吸光度曲线。 [0049] 图7是表示用各种溶剂洗涤后在填充剂中残留的残留有机物的量的图。 [0050] 图8是表示使用吸附装置，使样品溶液中含有的卵磷脂处于分离状态的吸光度曲线。 [0051] 图9是表示使用吸附装置，使样品溶液中含有的卵磷脂处于分离状态的吸光度曲线。 [0052] 图10是表示使用吸附装置，使样品溶液中含有的卵黄来源的磷脂处于分离状态的吸光度曲线。 [0053] 图11是表示使用吸附装置，使样品溶液中含有的红细胞膜来源的磷脂处于分离状态的吸光度曲线。 [0054] 图12是表示使用吸附装置，使样品溶液中含有的内毒素处于分离状态的吸光度曲线。 具体实施方式[0055] 下面，根据附图中表示的优选的实施方式详细地说明本发明的分离方法。 [0057] 图1是表示本发明中使用的吸附装置的一个例子的纵剖面图。另外，在以下的说明中，图1中的上侧称为[流入侧]、下侧称为[流出侧]。 [0058] 此处，流入侧为在分离(精制)目标磷脂时，向吸附装置内供给例如，样品溶液(含有样品的液体)、有机溶剂类的洗脱液等液体的一侧。另一方面，流出侧为与上述流入侧相反的一侧，即，上述液体作为洗出液从吸附装置内流出的一侧。 [0059] 另外，下面，说明使用吸附装置1，从来源于卵黄的样品中选择性地分离其中所含的磷脂的情况。 [0060] 图1所示的从样品溶液中分离磷脂的吸附装置1具有柱2、粒状填充剂(吸附剂)3、以及2张过滤构件4、5。 [0061] 柱2由柱本体21、分别安装在柱本体21的流入侧端及流出侧端上的盖(盖体)22和23构成。 [0062] 柱本体21例如由圆筒状的构件构成。构成含有柱本体21的柱2的各个部分(各个构件)的构成材料例举为，例如各种玻璃材料、各种树脂材料、各种金属材料、各种陶瓷材料等。 [0063] 在柱本体21中，为了分别塞住其流入侧开口和流出侧开口，配置了过滤构件4、5，在此状态下，在其流入侧端和流出侧端分别通过螺钉安装了盖22和23。 [0064] 在这样构成的柱2中，通过柱本体21和各个过滤构件4、5划分出填充剂的填充空间20。于是，此填充剂的填充空间20的至少一部分(本实施方式中基本上全部)填充填充剂3。 [0065] 根据样品溶液的体积适当地设定填充剂的填充空间20的容积，尽管没有特别的限定，但是相对于1mL样品溶液，优选为大约0.1～100mL，更优选为大约1～50mL。 [0066] 如上所述设定填充剂的填充空间20的尺寸，且根据如下所述设定后面所述的填充剂3的尺寸，根据以上设定可以从样品溶液中选择性地分离(精制)目标磷脂。即，可以确实地将磷脂与样品溶液中所含的磷脂以外的杂质分离。 [0067] 而且，在柱本体21中安装有各个盖22和23的状态下，为了保证其之间的液体密闭性而构成柱2。 [0068] 在这些盖22和23的基本上中间，分别液体密封地固定有流入管24和流出管25。经由此流入管24以及过滤构件4向填充剂3中供给上述样品溶液(液体)。而且，向填充剂3供给的样品溶液流经填充剂3的填充剂间(间隙)，经由过滤构件5和流出管25，向柱 2外流出。此时，如后面详述，根据其对吸附有钙离子的填充剂3的吸附性的不同以及其对有机溶剂类洗脱液的亲和性的不同，分离样品溶液(样品)中含有的磷脂与磷脂以外的杂质。 [0069] 各过滤构件4和5是分别具有防止填充剂3从填充剂的填充空间20流出的功能的物质。这些过滤构件4和5分别由例如以下物质构成，聚氨酯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚醚聚酰胺、聚对苯二甲酸乙酯、聚对苯二甲酸丁酯等合成树脂形成的无纺纤维、膨胀体(具有连通孔的海绵状多孔体)、针织纤维、网等。 [0070] 填充剂3，至少其表面由磷酸钙类化合物构成。如后面详述，相关的填充剂3中吸附钙离子。吸附此钙离子的填充剂3中，磷脂由其固有的吸附(负载)力被特异地吸附。于是，根据磷脂的吸附力与磷脂以外的杂质的吸附力的差异，将磷脂与磷脂以外的杂质分离、精制。 [0071] 作为磷酸钙类化合物，没有特别地限制，可以举例为，例如羟磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)、TCP(Ca3(PO4)2)、Ca2P2O7、Ca(PO3)2、DCPD(CaHPO4·2H2O)、Ca4O(PO4)2、或其一部分被其他原子或原子团置换的物质等，这些物质中的一种或2种以上可以组合使用。 [0072] 其中，磷酸钙类化合物优选以羟磷灰石为主要成分。特别地，由于羟磷灰石与构成生物体的成分接近，在吸附、分离磷脂时，能够适当地防止该磷脂变质(变性)。 [0073] 另外，如图1所示，上述填充剂3的形态(形状)，虽然优选为粒状(颗粒状)、但也可以是其他形状，如小球状(小块状)、块状(例如，相邻空孔之间互相联通的多孔体、蜂巢形状)等。另外，通过使填充剂3形成粒状，能够增加其表面积，能够谋求磷脂的分离特性的提高。 [0074] 粒状填充剂3的平均粒径，没有特别地限制，优选大约0.5～150μm、更优选大约10～80μm。通过使用这样的平均粒径的填充剂3，将确实地防止上述过滤构件5的网眼堵塞，同时能够充分地确保填充剂3的表面积。 [0075] 另外，填充剂3可以是其全部均由磷酸钙类化合物构成，也可以是载体(基体)的表面由磷酸钙类化合物覆盖，但是，优选其全部均由磷酸钙类化合物构成。由此，能够进一步提高填充剂3的强度，能够得到分离大量磷脂的合适的柱2。 [0076] 另外，其全部均由磷酸钙类化合物构成的填充剂3，可以通过如下方式得到，例如，使用湿式合成法或干式合成法，得到磷酸钙类化合物粒子(初级粒子)，通过干燥或造粒含有相关磷酸钙类化合物粒子的浆体，得到干燥粒子，进一步，烧制干燥粒子等。 [0077] 另一方面，可通过例如，向树脂等构成的载体上，冲击(杂合)上述干燥粒子等方法，得到载体表面被覆磷酸钙类化合物的填充剂3。 [0078] 另外，如本实施方式，在向填充剂的填充空间20基本上全部地填充填充剂3的情况下，优选在填充剂的填充空间20的各部分中，填充剂3基本上由同样的组成构成。由此，吸附装置1的磷脂分离(精制)能力特别地出色。 [0079] 另外，也可以在填充剂的填充空间20的一部分(例如流入管24侧的一部分)中填充填充剂3，在其他部分中填充其他的填充剂。 [0080] 下面，说明使用这样的吸附装置1的磷脂的分离方法(本发明的分离方法)。 [0081] [1]样品溶液的制备工序 [0082] 首先，准备作为样品的卵黄，例如，制备提取该卵黄中含有的总脂质的样品溶液。 [0083] 作为从卵黄提取总脂质的方法，没有特别的限制，适当地可以使用应用有机溶剂的各种提取方法，例如，举例为使用氯仿和甲醇的Bligh-Dyer法或Folch法等。 [0084] 此处，总脂质中含有单纯脂质和复合脂质，进一步，复合脂质中含有磷脂和糖脂。 [0085] 那么，在本实施方式中准备的卵黄中，作为磷脂，包含磷脂酰胆碱(卵磷脂)、溶血磷脂胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酰肌醇、缩醛磷脂等。通过使用吸附装置1的磷脂的分离方法，从含有总脂质的样品溶液中分离(分離)这些磷脂。 [0086] 另外，虽然向吸附装置1供给的样品溶液，只要包含从卵黄提取的磷脂，无论怎样生成都可以，但本发明样品溶液中的磷脂优选含有形成脂质体的磷脂脂质体。由此，在后面的工序[3]中，在向吸附装置1中供给样品溶液时，磷脂所具有的磷酸基处于向脂质体外侧暴露的状态。即，磷脂所具有的疏水性脂肪酸酯部位相互集合形成球状的集合体，磷脂所具有的亲水性磷酸基处于暴露的状态。因此，使作为磷脂脂质体存在的磷脂能够确实地吸附于填充剂3。 [0087] 可以通过例如，向含有从卵黄提取的总脂质的提取液中添加水、并剧烈地搅拌而得到含有这样的磷脂脂质体的样品溶液。 [0088] 另外，样品溶液中包含的磷脂脂质体的平均粒径，没有特别的限制，优选大约10～1000nm、更优选大约50～200nm。在向吸附装置1内供给样品溶液时，平均粒径在上述范围内的磷脂脂质体能够确实地吸附于填充剂3而得到的物质。 [0089] [2]钙离子吸附工序 [0090] 下面，使填充剂3上吸附钙离子。 [0091] 此处，磷脂具有甘油或神经鞘氨醇作为中心骨架，具有在这些骨架上结合脂肪酸和磷酸的结构。而且，在磷酸中具有醇与酯结合的结构。在相关构造的磷脂中，磷酸的3个羟基中的2个分别与中心骨架及醇结合，剩余的1个通过电离形成带负电的磷酸位点。 [0092] 另外，填充剂3的磷酸钙类化合物使用以Ca10(PO4)3X2表示的，Ca/P的比值为1.0～2.0的物质。此磷酸钙类化合物具有带正电的钙离子(钙位点)和带负电的磷酸基(磷酸位点)高密度规则地排列的结构，具有基于作为两性离子交换体的静电相互作用的吸附能力。因此，磷酸钙类化合物基于钙位点中的静电相互作用，对具有磷酸位点的磷脂发挥吸附能力。另一方面，对于磷酸位点，由于磷脂的磷酸位点和磷酸钙类化合物的磷酸位点都带有负电，发生相互排斥。 [0093] 这样，磷酸钙类化合物吸附带负电的磷脂时，由于该磷酸钙类化合物基于其作为带有正电和负电两者的两性离子交换体的静电相互作用而具有吸附能力，所以磷脂不能被填充剂3充分吸附。 [0094] 对此，在本发明中，由于填充剂3中吸附了钙离子，磷酸钙类化合物具有的磷酸位点与钙离子结合。因为如此，在填充剂3中钙位点增加，且，磷酸位点减少。其结果，带负电的磷脂的填充剂3的吸附能力更加增加。 [0095] 另外，虽然磷酸钙类化合物优选实质上所有的磷酸位点上结合钙离子，但至少填充剂3的外表面的磷酸位点上结合钙离子也可以。填充剂3外表面上磷酸位点与钙离子结合的比率，优选大约5～100％、更优选大约10～100％、进一步优选大约20～100％。填充磷酸钙类化合物的吸附装置1的填充剂的填充空间20中，流出磷酸位点中吸附的蛋白质，可通过此蛋白质的吸附量判断钙离子对磷酸位点的结合比率。磷酸位点中钙离子100％结合的情况中，磷酸位点中吸附的蛋白质顺利通过填充剂的充填空间20而没有停顿。 [0096] 作为填充剂3中吸附钙离子的方法，没有特别的限定，但是例如，可举例为使含有钙离子的钙含有液与填充剂3接触的方法。通过相关的方法，使钙含有液与填充剂3接触，即，通过向吸附装置1供给钙含有液的简单的操作，能够确实地使填充剂3吸附钙离子。 [0097] 另外，作为钙含有液，没有特别的限定，但是例如，可举例为氯化钙水溶液、乳酸钙水溶液以及硝酸钙水溶液等，其中，优选氯化钙水溶液。如果使用上述水溶液，则对磷酸钙类化合物没有不好的影响，能够将钙离子确实地吸附于磷酸钙化合物的磷酸位点。 [0098] 在氯化钙水溶液中的氯化钙含量没有特别的限定，但是优选大约0.5～10mM，更优选大约1～3mM。 [0099] 另外，氯化钙水溶液的pH值没有特别的限定，但是优选大约5.0～9.0、更优选大约6.0～8.0。 [0100] 如果根据上面所述的设定氯化钙水溶液的条件，则能够被确实地将氯化钙水溶液中含有的钙离子吸附于填充剂3。 [0101] [3]供给工序 [0102] 接下来，将上述工序[1]中制备的样品溶液经由流入管24及过滤构件4供给于填充剂的填充空间20的填充剂3。于是，通过使样品溶液通过柱2(吸附装置1)内，使其与在上述工序[2]中吸附钙离子的填充剂3接触。 [0103] 此处，本发明中，如上述工序[2]所说明的，由于填充剂3上吸附了钙离子，对吸附钙离子的填充剂3具有高吸附能力的磷脂、或吸附能力比较高的磷脂以外的杂质(例如，单纯脂质或糖脂)，保留于柱2内。于是，对填充剂3的吸附能力低的杂质，经由过滤构件5和流出管25从柱2内流出。 [0104] [4]分级分离工序 [0105] 接下来，从流入管24向柱2内供给为了洗脱磷脂的有机溶剂类的洗脱液。之后，以每个确定的量分级分离(采集)从柱2经由流出管25流出的洗出液。 [0106] 这样，在本发明中，作为使磷脂洗脱的洗脱液，使用有机溶剂类的洗脱液。如果使用上述有机溶剂类的溶剂，通过本发明人的研究，知道能够确实地使对吸附钙离子的填充剂3以高吸附能力吸附的磷脂洗脱于洗脱液中而获得。 [0107] 因此，通过适当地设定有机溶剂类洗脱液的种类、洗脱液中有机溶剂的含量等，根据这些化合物(磷脂或杂质)分别具有的对填充剂3的吸附能力的差别，能够在各个分离组分中回收(分离)填充剂3上吸附的来源于卵黄的磷脂以及其以外的杂质。 [0108] 作为有机溶剂类的洗脱液，适合地使用含有水溶性有机溶剂的水溶液。另外，作为水溶性的有机溶剂，没有特别的限定，例如，可举例为，异丙醇、丁醇、乙腈、吡啶以及N，N-二甲基甲酰胺等，可以使用其中的1种或2种以上的组合。其中，优选使用异丙醇。由此，可以从填充剂3确实地洗脱出填充剂3上吸附的磷脂，同时，能够确实地在各个分级分离组分中洗脱出与磷脂以外的杂质处于分离状态的磷脂。 [0109] 另外，作为水溶性的有机溶剂，使用异丙醇的情况下，作为洗脱液，优选使用洗脱液中的异丙醇含量递增的线性梯度溶液。此种情况下，优选使用异丙醇含量从0至80％增加的线性梯度溶液。由此，能够在各个分级分离组分内更确实地以与磷脂外杂质呈分离状态洗脱出磷脂。 [0110] 洗脱液的pH值没有特别的限定，优选大约6～8，更优选大约6.5～7.5。由此，能够防止分离磷脂的变质(变成)，并能够防止其特性改变。另外，可以适当地防止填充剂3的变质(溶解等)，能够防止吸附装置1分离能力的变化。 [0112] 从而，通过使用上述pH范围和温度范围的洗脱液，能够谋求目标磷脂的回收率的增加。 [0113] 而且，洗脱液的流速优选大约0.1～10mL/分，更优选大约1～5mL/分。在这样的流速下，通过进行磷脂的分离，分离操作中不需要长的时间，而能够确实地分离目标磷脂。即，能够得到高纯度的磷脂。 [0114] 另外，哪一个分级分离组分中洗脱出磷脂的验证，即，各分级分离组分中磷脂的检测可以使用任何方法，但优选通过观察各分级分离组分中的洗出液的吸光度进行。由此，通过经时观察各分级分离组分中洗出液的吸光度的比较简单操作，能够知道哪一个分级分离组分中洗脱出了磷脂。 [0115] 在通过观察各分级分离组分中洗出液的吸光度进行各分级分离组分中磷脂的检测的情况下，检测波长优选为大约190～230nm、更优选为200～210nm。由于上述范围的波长是能够确认磷脂中含有的磷酸基引起的吸收的范围，因此通过在上述范围的波长下观察吸光度，能够确实地检测出洗出液中的磷脂。 [0116] 而且，这种情况下，优选，事先测定洗脱液(空白)的吸光度，从被观察的各分级分离组分中洗出液的吸光度，减去测定的洗脱液(空白)的吸光度，观察各分级分离组分的吸光度。由此，能够抵消洗脱液引起的吸光度。即，由于能够排除洗脱液引起的吸光度的干扰，能够以较高灵敏度检测出洗出液中的磷脂。 [0117] 如上所述，根据本发明，使钙离子吸附于由磷酸钙类化合物构成的填充剂，使含有磷脂的样品溶液与该填充剂接触后，通过供给有机溶剂类的洗脱液的比较简单的操作，能够在确定的分离组分中，高纯度地分离(回收)卵黄来源的磷脂。 [0118] 在以上的说明中，是以从总脂质中提取卵黄来源的磷脂的情况作为一个例子说明的，本发明并不限定于上述情况。根据本发明，也可以容易地并高纯度的分离例如，如大豆的豆类、红细胞、如革兰氏阴性菌的各种细胞以及病毒等含有的磷脂。 [0119] 以上说明了本发明的分离方法，可是，本发明并不限定于此。例如，可以根据任何目的，追加1个以上的工序。 [0120] 实施例 [0121] 下面，说明本发明的具体实施例。 [0122] 1、制备磷脂脂质体 [0123] (卵磷脂脂质体含有液) [0124] -1A-首先，准备卵黄来源的卵磷脂(和光纯药工业社制造、LotNo.126-00812)，搅拌。之后，将60μL该卵磷脂加入1.94mL乙醇中，得到卵磷脂/乙醇添加物。然后，使用旋转器(TAITEC社制造，[RT-50])，在30rpm×15分钟(室温)的条件下，搅拌该卵磷脂/乙醇添加物。 [0125] -2A-然后，在8000rpm×5分钟(室温)的条件下离心分离搅拌后的卵磷脂/乙醇添加物，得到上清液。 [0126] -3A-然后，一边搅拌30mL水，一边使用色谱注射用500μL微注射器(Ito社制造、[MS-R500])分3次快速向其中注入上述工序-2A-得到的上清液(乙醇可溶性的分级分离组分)1.5mL，得到混合液。然后，搅拌该混合液大约3分钟左右，制备卵磷脂脂质体含有液。 [0127] 对于如上得到的卵磷脂脂质体含有液，使用动态散射颗粒性分布装置(Beckmancoulter社制造、[N5])、共3次测定卵磷脂脂质体含有液中含有的卵磷脂脂质体的大小。 [0128] 其结果在图2以及表1中表示。 [0129] [表1] [0130] [0131] 如图2以及表1所表明的，通过向搅拌状态的水中快速注入乙醇可溶性的分级分离组分，能够制得水中的卵磷脂脂质体。推测在该卵磷脂脂质体中，含有粒径大约100nm的卵磷脂脂质体和此卵磷脂脂质体凝聚或者形成的大单层脂质体粒径大约500nm的卵磷脂脂质体。 [0132] 2、对磷脂脂质体填充剂的吸附 [0133] (利用磷酸钠缓冲液的研究) [0135] -2B-然后，作为磷脂吸附用的缓冲液，准备1mM的磷酸钠缓冲液(以下，简称为[NaPB]；pH 6.8)和400mM的NaPB(pH 6.8)。 [0136] -3B-然后，用1mM NaPB(初期缓冲液)置换(平衡)柱内后，将上述1中制备的磷酸脂质体100μL作为样品溶液供给于柱(加样)。 [0137] -4B-然后，以1mL/min的流速向柱供给1mM NaPB 1分钟。然后，使其容积比为400mM NaPB的0％-100％的容积连续变化地，以1mL/min的流速，向柱供给1mM NaPB和 400mM NaPB的混合液3分钟。然后，以1mL/min的流速，向柱供给400mM NaPB 3分钟、每 1mL分级分离从柱流出的洗出液。为得到分级分离的洗出液中含有的磷脂的吸光度，将分级分离的洗出液置于UV检测器中。 [0138] 其结果在图3中表示。 [0139] 如图3所表明的，说明使用不吸附钙离子的羟磷灰石小珠作为填充剂的情况下，磷脂脂质体不吸附于填充剂而在洗出液中被洗脱出来。 [0140] 另外，上述工序-3B-中，作为初期缓冲液使用纯水，柱内除了用纯水平衡以外，进行与上述1B～4B同样的研究。即使是这种情况，也得到磷脂脂质体不吸附于填充剂，而被洗脱于洗出液中的结果。 [0141] (利用氯化钙水溶液的研究) [0142] 除了对上述工序-3B-以及上述工序-4B-进行以下的改变外，与利用上述磷酸钠缓冲液的研究一样，尝试了对填充剂的磷脂脂质体的吸附。 [0143] -3B’-用5mM MES缓冲液与3mM CaCl2水溶液(pH 6.8)的混合液平衡柱内后，将上述1制备的磷脂脂质体100μL作为样品溶液向柱供给(加样)。 [0144] -4B’-然后，以1mL/min的流速向柱供给5mM MES缓冲液与3mM CaCl2水溶液的混合液5分钟。然后，以1mL/min的流速向柱供给纯水5分钟后，进一步以1mL/min的流速，使其容积比为400mM NaPB的0％～100％的容积连续变化地，向柱供给纯水与400mMNaPB的混合液3分钟。其后，以1mL/min的流速向柱供给400mMNaPB 5分钟，每1mL分级分离从柱流出的洗出液。为了获得分级分离洗出液中含有的磷脂的吸光度，将分级分离的洗出液置于UV检测器中。 [0145] 其结果在图4中表示。 [0146] 如图4所表明的，向柱供给5mM MES缓冲液与3mM CaCl2水溶液的混合液后，观察到的磷脂脂质体的洗脱仅有很少。由此可以推断，通过使5mM MES缓冲液与3mM CaCl2水溶液的混合液接触填充剂，填充剂吸附钙离子，其结果，吸附钙离子的羟磷灰石小珠上，吸附了磷脂脂质体。 [0147] 3、填充剂上吸附的磷脂脂质体的洗脱 [0148] (吸附磷脂脂质体的柱的蛋白质分离能力的评估) [0149] [吸附磷脂脂质体的柱的制造] [0151] -2C-然后，以1mL/min的流速向柱内供给400mM的NaPB(pH 6.8)10分钟，然后，通过在相同的条件下供给纯水，洗涤填充剂。 [0152] -3C-然后，通过以1mL/min的流速向柱内供给5mM MES缓冲液与3mMCaCl2水溶液的混合液(以下简写为“MES-Ca缓冲液”，pH6.8)20分钟，使钙离子吸附于填充剂。 [0153] -4C-然后，一边以1mL/min的流速向柱内供给MES-Ca缓冲液，一边以每次2分钟的间隔共15次向柱供给(加样)上述1中制备的磷脂脂质体100μL。其后，用纯水洗涤柱内的填充剂5分钟。 [0154] -5C-然后，以1mL/min的流速用400mM的NaPB(pH 6.8)洗涤柱内10分钟，然后，通过以1mL/min的流速用10mM的NaPB(pH 6.8)洗涤柱内20分钟，用10mM的NaPB(pH 6.8)平衡柱内。 [0155] 经过上述的工序，获得具有吸附磷脂脂质体填充剂的柱(吸附装置)。 [0156] [使用吸附磷脂脂质体的柱的蛋白质的分离] [0157] -1D-首先，准备在4×10mm不锈钢管中填充羟磷灰石小珠(CHT II型、平均粒径40μm、HOYA社制造)的柱(吸附装置)。 [0158] -2D-然后，以1mL/min的流速，用400mM的NaPB(pH 6.8)洗涤柱内10分钟，其后，通过以1mL/min的流速，用10mM的NaPB(pH 6.8)洗涤柱内20分钟，用10mM的NaPB(pH6.8)平衡柱内。 [0159] -3D-然后，向上述工序-2D-中得到的柱中，供给1mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中溶解下述蛋白质的样品50μL(下面称为[4STD样品])，以组成0.5mg/mL的肌红蛋白、1mg/mL的白蛋白、0.5mg/mL的α-糜蛋白酶原A、0.5mg/mL的细胞色素C。 [0160] -4D-然后，以1mL/min的流速向柱供给10mM NaPB 1分钟。接着，使其容积比为400mM NaPB的0％～75％的容积连续变化地，以1mL/min的流速向柱供给10mM NaPB与 400mM NaPB的混合液3分钟。其后，以1mL/min的流速，向柱供给400mM NaPB 5分钟，每 1mL分级分离从柱流出的洗出液。为了得到分级分离的洗出液中含有的蛋白质的吸光度，将分级分离的洗出液置于UV检测器中。 [0161] -5D-然后，与上述工序-3D-同样地，向上述工序-5C-中获得的具有吸附磷脂脂质体填充剂的柱供给50μL 4STD样品。 [0162] -6D-然后，与上述-4D-同样地，每1mL分级分离从柱流出的洗出液。为了得到分级分离的洗出液中含有的蛋白质的吸光度，将分级分离的洗出液置于UV检测器中。 [0163] 在图5中表示在上述工序-4D-和上述工序-6D-中分别分级分离的洗出液中含有的蛋白质在280nm下的吸光度。 [0164] 如图5所表明的，说明与吸附磷脂脂质体前的填充剂(原始)相比，发现通过将磷脂脂质体吸附于填充剂(脂质体饱和后)4STD的分离能力发生变化。 [0165] [溶剂洗涤对吸附磷脂脂质体的柱的影响] [0167] -2E-然后，以1mL/min的流速，分别向用各种溶剂洗涤填充剂的3个柱供给400mM NaPB(pH 6.8)10分钟，其后，通过以1mL/min的流速供给10mM NaPB(pH 6.8)20分钟，用10mMNaPB(pH 6.8)平衡柱内。 [0168] -3E-然后，分别向用各种溶剂洗涤填充剂的3个柱供给50μL 4STD样品。 [0169] -4E-然后，以1mL/min的流速向被供给了50μL 4STD样品的各个柱供给10mM NaPB 1分钟。接着，使其容积比为400mM NaPB的0％～75％的容积连续变化地，以1mL/min的流速向柱供给10mMNaPB与400mMNaPB的混合液3分钟。然后，以1mL/min的流速向柱供给400mMNaPB 5分钟，每1mL分级分离从柱流出的洗出液。为了得到分级分离洗出液中含有的蛋白质的吸光度，将分级分离洗出液置于UV检测器中。 [0170] 在图6中表示其结果。另外，在图6(a)表示使用从乙腈洗涤填充剂的柱流出的洗出液测定的蛋白质的吸光度，图6(b)表示使用从异丙醇洗涤填充剂的柱流出的洗出液测定的蛋白质的吸光度，以及、图6(c)表示使用从氢氧化钠洗涤填充剂的柱流出的洗出液测定的蛋白质的吸光度。 [0171] 如比较图5与图6(a)～(c)所表明的，说明通过用各种溶剂洗涤吸附磷脂脂质体的填充剂，其4STD的分离能力与吸附磷脂脂质体前的填充剂中的4STD的分离能力接近。由此，说明通过用各种溶剂洗涤填充剂，可以从填充剂洗脱出(解析)磷脂脂质体。说明使用有机溶剂类的物质作为溶剂时(图6(a)及图6(b))显著观察到这样的趋势，特别是，使用异丙醇作为溶剂时(图6(b))更加显著地观察到此趋势。 [0172] -5E-另外，分别取出用各种溶剂洗涤填充剂的柱以及用溶剂洗涤填充剂前的柱的填充剂，于37℃干燥1天。 [0173] -6E-然后，使用热重量/微差热同时分析仪(岛图制造所社制、[DTG60H])，测定10mg干燥的填充剂的热重量的变化值。而且，测定条件以温度比率5℃/min、目标温度1200℃，设定为26.17～400℃。 [0174] 其结果在图7中表示。另外，从上述干燥填充剂中残留有机物的量中减去羟磷灰石小珠CHT II型中残留有机物的量，从得到的值和热重量变化的值算出图7中表示的图纵轴的残留有机物的量。 [0175] 如图7所表明的，说明通过用各种溶剂洗涤吸附磷脂脂质体的填充剂，填充剂上吸附的残留有机物减少。由此，说明通过各种溶剂洗涤填充剂，从填充剂上洗脱并得到磷脂脂质体。说明在使用有机溶剂类的物质作为溶剂时(图6(a)以及图6(b))显著地确认，特别是，在使用异丙醇做溶剂时(图6(b))，更显著地确认这样的趋势。 [0176] 4、使用磷脂脂质体填充剂的分离 [0177] (卵磷脂的检测：实施例1) [0178] -1F-首先，准备在4×10mm的不锈钢管中填充羟磷灰石小珠(CHT II型、平均粒径40μm、HOYA社制)的柱(吸附装置)。 [0179] -2F-然后，通过以1mL/min的流速，向柱内供给MES-Ca缓冲液20分钟，使钙离子吸附于填充剂。 [0180] -3F-然后，用MES-Ca缓冲液置换(平衡)柱内后，作为样品溶液向柱供给(加样)上述1中制备的磷脂脂质体100μL。 [0181] -4F-然后，以1mL/min的流速向柱供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液1分钟。接着，使其容积比为含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的0％～100％的容积连续变化地，以 1mL/min的流速向柱供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液与含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的混合液3分钟。而后，以1mL/min的流速向柱供给含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液3分钟，每1mL分级分离从柱内流出的洗出液。另外，通过测定202nm的吸光度，检测出从柱流出的洗出液中的磷脂。 [0182] 在图8(a)中以吸光度曲线表示其结果。 [0183] -5F-然后，作为空白样品向柱供给5％的乙醇水溶液。其后，通过向柱供给与上述工序-4F-同样的洗脱液，测定在202nm处洗脱液引起的吸光度。 [0184] 在图8(b)中以吸光度曲线表示其结果。 [0185] -6F-然后，从在上述工序-4F-中得到的吸光度曲线的各个吸光度减去上述工序-5F-得到的吸光度曲线的各个吸光度。 [0186] 在图9中以吸光度曲线表示其结果。 [0187] 如图9中所表明的，说明在卵磷脂最大吸收附近的202nm波长下，测定含有磷脂的洗脱液的吸光度，进而，测定含有异丙醇的洗脱液的吸光度，通过二者的差，能够高灵敏度地观察到大约3.5分钟后和5分钟后卵磷脂来源的峰。 [0188] (来自卵黄的磷脂的分离：实施例2) [0189] -1G-首先，一边搅拌5g卵黄(朝雾高原鸡蛋)，一边依次向卵黄内添加18mL甲醇和9mL氯仿，得到第1混合液。其后，将此第1混合液放置30分钟。 [0190] -2G-然后，一边搅拌此第1混合液，一边依次向第1混合液中添加10.8mL纯水和9mL氯仿，得到第2混合液。其后，通过使用离心分离装置(KUBOTA社制、[5930])，在3000rpm×10分钟(4℃)的条件下，离心分离第2混合液，将第2混合液分离为上层(水层)、中间层(变性蛋白质等形成的层)、以及下层(氯仿层)。 [0191] -3G-而后，通过用注射器回收下层，回收全部量为15mL的下层。 [0192] -4G-然后，将15mL下层移至茄形瓶，使用蒸发器(东京理化社制、[N-1000])将其减压干燥。其后，将茄形瓶放入干燥器中，通过吸收干燥被减压干燥的下层1小时，提取大约1.5g卵黄来源的总脂质。 [0195] -7G-然后，通过用纯水将得到的卵黄来源的总脂质脂质体稀释20倍，制备供给柱的样品溶液。 [0196] -8G-然后，准备在4×10nm的不锈钢管中填充羟磷灰石小珠(CHT II型、平均粒径40μm、HOYA社制)的柱(吸附装置)。 [0197] -9G-然后，通过以1mL/min的流速，向柱内供给MES-Ca缓冲液20分钟，使钙离子吸附于填充剂。 [0198] -10G-然后，用MES-Ca缓冲液置换(平衡)柱内后，向柱供给(加样)上述工序-7G-中制备的样品溶液。 [0199] -11G-然后，以1mL/min的流速向柱供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液1分钟。接着，使其容积比为含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的0％～100％的容积内连续变化地，以1mL/min的流速，向柱供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液与含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的混合液3分钟。其后，以1mL/min的流速，向柱供给100％异丙醇3分钟，每1mL分级分离从柱内流出的洗出液。另外，通过测定202nm的吸光度检测出从柱流出的洗出液中磷脂。 [0200] 在图10(a)中以吸光度曲线表示其结果。 [0201] -12G-然后，作为空白样品向柱供给纯水。其后，通过向柱供给与上述工序-11G-同样的洗脱液，测定洗脱液引起的202nm处的吸光度。 [0202] 在图10(b)中以吸光度曲线表示其结果。 [0203] -13G-然后，从在上述工序-11G-中得到的吸光度曲线的各吸光度减去上述工序-12G-中得到的吸光度曲线的各吸光度。 [0204] 在图10(c)中以吸光度曲线表示其结果。 [0205] 如图10中所表明的，在磷脂最大吸收附近的202nm波长下，测定含有磷脂的洗脱液的吸光度，进一步，测定含有异丙醇的洗脱液的吸光度部分，通过其吸光度的差，确认大约3.5分钟后来自磷脂的峰。由此，可知符合该峰的分离组分中分离出卵黄来源的磷脂。 [0206] (从红细胞膜分离磷脂：实施例3) [0207] -1H-首先，一边搅拌4g鹅血细胞(日本BIOTEST)，一边通过向鹅血细胞中添加100mL纯水，得到第1混合液，使鹅血细胞中含有的红细胞溶血。 [0208] -2H-然后，一边搅拌此第1混合液，同时用离心分离装置(KUBOTA社制、[5930])，在3500rpm×30min(4℃)的条件下，通过离心分离第1混合液，使上层与下层分离。 [0209] -3H-重复进行三次上述工序-1H-和上述工序-2H-，每一次回收下层。 [0210] -4H-然后，一边搅拌回收的下层，一边依次添加8mL PBS、20mL甲醇和10mL氯仿，得到第2混合液。其后，将第2混合液放置30分钟。 [0211] -5H-然后，一边搅拌此第2混合液，一边依次添加10mL氯仿和10mL纯水得到第3混合液。其后，用离心分离装置(KUBOTA社制、[5930])，在3000rpm×10分钟(4℃)的条件下，通过离心分离第3混合液，使上层(水层)、中间层(变性蛋白质等组成的层)和下层(氯仿层)分离。 [0212] -6H-然后，通过用注射器回收下层，回收全部量为15mL的下层。 [0213] -7H-然后，将15mL下层移至茄形瓶，使用蒸发器(东京理化社制、[N-1000])将其减压干燥。其后，将茄形瓶放入干燥器，通过吸收干燥被减压干燥的下层1小时，提取大约15mg红细胞来源的总脂质。 [0214] -8H-然后，向茄形瓶中添加10mL纯水。其后，使用涡旋振荡器(vortex)一边搅拌纯水，一边通过热水浴加热纯水至总脂质的相转移温度以上，得到脂质悬浊液。 [0215] -9H-此处，推测脂质悬浊液中含有的脂质形成多层脂质体，因而通过使用超声波发生装置(TOMY精工社制、[UR-20P])处理脂质悬浊液1分钟，破碎多层而得到红细胞来源的总脂质脂质体。 [0216] -10H-然后，通过用纯水将得到的红细胞膜来源的总脂质脂质体稀释2倍，制备向柱供给的样品溶液。 [0217] -11H-然后，准备在4×10mm的不锈钢管中充填羟磷灰石小珠(CHT II型、平均粒径40μm、HOYA社制)的柱(吸附装置)。 [0218] -12H-然后，通过以1mL/min的流速向柱供给MES-Ca缓冲液20分钟，使钙离子吸附于填充剂。 [0219] -13H-然后，用MES-Ca缓冲液置换(平衡)柱内后，向柱供给(加样)上述工序-10H-中制备的样品溶液100μL。 [0220] -14H-然后，以1mL/min的流速供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液1分钟。接着，使其容积比为含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的0％～100％的容积连续变化地，以1mL/min的流速，向柱供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液与含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的混合液3分钟。其后，以1mL/min的流速，向柱供给含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液3分钟，每1mL分级分离从柱内流出的洗出液。另外，通过测定202nm的吸光度检测出从柱内流出的洗出液中磷脂。 [0221] 在图11(a)中以吸光度曲线表示其结果。 [0222] -15H-然后，作为空白样品向柱供给纯水。其后，通过向柱供给与上述工序-13H-同样的洗脱液，测定洗脱液引起的202nm处的吸光度。 [0223] 在图11(b)中以吸光度曲线表示其结果。 [0224] -16H-然后，从上述工序-14H-得到的吸光度曲线的各吸光度，减去上述工序-15H-得到的吸光度曲线的各吸光度。 [0225] 在图11(c)中以吸光度曲线表示其结果。 [0226] 如图11所表明的，确认了大约3.5分钟后的磷脂来源的峰。从而，通过本发明，说明也能够选择性地分离来自红细胞膜的磷脂。 [0227] (内毒素的检测：实施例4) [0228] -1I-首先，准备对照标准内毒素(Control Standard Endotoxin)(下面称为[内毒素]；和光纯药工业社制)。向500ng此内毒素中加入2.6mL纯水，得到内毒素水溶液。使用旋转器(TAITEC社制、[RT-50])，在30rpm×15min(室温)的条件下，搅拌内毒素水溶液。其后，通过超声波处理内毒素水溶液，得到含有内毒素的样品溶液。 [0229] -2I-然后，准备在4×10mm的不锈钢管中充填羟磷灰石小珠(CHT II型、平均粒径40μm、HOYA社制)的柱(吸附装置)。 [0230] -3I-然后，以1mL/min的流速，通过向柱供给MES-Ca缓冲液20分钟，使钙离子吸附于填充剂。 [0231] -4I-然后，用MES-Ca缓冲液置换(平衡)柱内后，向柱供给(加样)上述工序-1I-中制备的样品溶液100μL。 [0232] -5I-然后，以1mL/min的流速向柱供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液1分钟。接着，使其容积比为含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的0％～100％的容积连续变化地，以 1mL/min的流速，向柱供给含有5％异丙醇的MES-Ca缓冲液与含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液的混合液3分钟。其后，以1mL/min的流速，向柱供给含有80％异丙醇的MES-Ca缓冲液3分钟，每1mL分级分离从柱内流出的洗出液。另外，通过测定202nm的吸光度检测出从柱内流出的洗出液中的内毒素(磷脂)。 [0233] 在图12(a)中以吸光度曲线表示其结果。 [0234] -6I-作为空白样品向柱供给纯水。其后，通过向柱供给与上述工序-5I-同样的洗脱液，测定洗脱液引起的202nm处的吸光度。 [0235] 在图12(b)中以吸光度曲线表示其结果。 [0236] -7I-然后，从上述工序-5I-得到的吸光度曲线的各吸光度减去上述工序-6I-得到的吸光度曲线的各吸光度。 [0237] 另外，由于洗脱液中含有的内毒素的量是微量的，通过测定洗出液中的吸光度，没有检测出内毒素。因此，通过测定洗出液中内毒素的活性进行洗出液中的内毒素的检测。 [0238] 在图12(c)中以吸光度曲线表示其结果。 [0239] 如图12所表明的，大约0.5分钟后以及大约3分钟后确认到杂质来源的峰。进一步，大约4分钟后确认到内毒素(磷脂)来源的峰。从而，通过本发明，说明也能够从样品溶液中分离内毒素。 [0240] 产业上的可利用性 [0241] 本发明的分离方法涉及，使样品溶液中含有的磷脂吸附于填充剂，进一步，通过选择性地从洗出液中洗脱被吸附的磷脂，能够从含有磷脂的样品溶液中高纯度地分离磷脂。从而，本发明的分离方法具有产业上的可利用性。 |
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