[0001] 提及序列表

[0002] 本申请含有计算机可读形式的序列表。通过提及而将该计算机可读形式收入本文。发明领域

[0003] 本发明涉及一种生产经修饰的大豆产品，诸如经修饰的大豆粉(soybean meal)的方法，包括使用蛋白水解酶。本发明进一步涉及蛋白水解酶在生产饲料或饲料添加剂产品中的用途。

[0004] 发明背景

[0005] 大豆主要是一种为了油和蛋白质而栽培的工业作物。尽管种子相对低的油含量(按无水分计为约20％)，大豆是食用油的最大单一来源，并且占世界总油料种子产量的约50％。随着每吨粗制大豆油，产生约4.5顿具有约44％蛋白质含量的大豆粉。对于加工的每吨大豆，获得的粉的商业价值通常超过油的商业价值。如此，大豆粉远远不仅是油生产的副产物。在动物饲料中使用大批大豆粉。

[0006] 然而，已经发现了天然存在于大豆中的数种蛋白质发挥特定的生理学效应，诸如抑制动物和人的消化道中的蛋白酶。大豆含有两类所谓的胰蛋白酶抑制剂。它们分别称为Kunitz胰蛋白酶抑制剂(其具有在20,000范围的分子量)和Bowman-Birk抑制剂，其是在8,000道尔顿范围的小得多的多肽。这两类都由许多可区分的蛋白质组成。已经阐明了这些蛋白质的氨基酸序列和空间结构。

[0007] 胰蛋白酶抑制剂的摄取具有数种生理学效应，包括对胰蛋白酶的抑制，接着是升高的胰分泌。这导致蛋白质向消化管的内部损失及胰肥大。因此，使这些蛋白质失活以改善消化率是高度期望的。

[0008] 可以通过热处理大豆来降低胰蛋白酶抑制剂的活性。然而，此类加热也可能破坏或降低某些热敏感性氨基酸的利用度，并降低大豆蛋白质的营养价值。此外，在存在某些碳水化合物的情况中加热蛋白质时，糖会与游离的氨基基团复合，导致称作麦拉德反应(其出于数个原因是不期望的)的一系列反应。因此，正寻找降低胰蛋白酶抑制剂活性并且如此改善大豆营养价值的其它方法。

[0009] 在WO01/58276中，表明对纯的Bowman-Birk和Kunitz胰蛋白酶抑制剂的蛋白水解降解。在WO98/56260和WO03/041510中，描述了蛋白水解处理大豆蛋白质材料以降解胰蛋白酶抑制剂或使胰蛋白酶抑制剂失活。这些公开中例示的蛋白水解酶是相当非特异的，并且WO98/56260提及宽特异性是蛋白水解酶能够降解此类抗营养因子的最重要参数之一。

[0010] US4512973显示了使用海星胰蛋白酶1和补充的蛋白水解酶来使大豆胰蛋白酶抑制剂失活。显示了仅用海星胰蛋白酶水解未使大豆胰蛋白酶抑制剂失活。失活需要至少一种别的蛋白水解酶，诸如羧肽酶B。

[0011] 本发明人的一个目的是提供用于使大豆胰蛋白酶抑制剂失活的新方法。在没有过度热处理的情况中进行失活提供了独特的营养上的优点，直接导致经济益处。

[0012] 发明概述

[0013] 令人惊讶地，本发明人发现了在将非烘烤大豆薄片(non-toasted soybean flake)诸如白色薄片(white flake)在水体系中与真菌胰蛋白酶样蛋白酶一起温育时有效降解抗营养大豆胰蛋白酶抑制剂。可以在大豆薄片的天然pH，即在没有任何pH调节的情况中进行蛋白水解处理。因此，本发明提供了一种经济且可行的方法，其可以容易地得到工业采用。已经依照本发明进行酶修饰的大豆产品诸如大豆粉特别可用作饲料或饲料添加剂产品。

[0014] 因此，本发明提供了一种生产经酶修饰的大豆产品的方法，包括[0015] a)获得大豆薄片；

[0016] b)任选地研磨所述大豆薄片；并

[0017] c)用具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性的微生物蛋白水解酶处理所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的含水浆料。

[0018] 在一个优选的方面，本发明提供了一种生产经酶修饰的大豆粉的方法，包括[0019] a)获得大豆薄片；

[0020] b)通过溶剂提取来使所述大豆薄片脱脂；

[0021] c)将经脱脂的大豆薄片研磨成大豆粉；并

[0022] d)用具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性的微生物蛋白水解酶处理所述经脱脂的大豆薄片或所述大豆粉的含水浆料；

[0023] 其中在步骤d)之前或之后进行步骤c)。

[0024] 在另一方面，本发明提供了一种大豆粉，其：

[0025] a)在水溶液中具有6-7的pH，

[0026] b)包含占总干物质至少20％的碳水化合物，

[0027] c)具有在150微米以上的平均颗粒大小，

[0028] d)在pH 6.5具有至少50％的氮溶解度指数，并

[0029] e)具有0.2-3％的水解程度。

[0030] 在另一方面，本发明提供了这样的大豆粉作为饲料或饲料添加剂的用途。

[0031] 在又一方面，本发明提供了至少一种蛋白水解酶在生产饲料或饲料添加剂产品中的用途，其中所述蛋白水解酶与SEQ ID NO：1的氨基酸25-248具有至少70％的同一性。

[0032] 发明详述

[0033] 生产经酶修饰的大豆产品的方法

[0034] 在第一方面，本发明提供了一种生产经酶修饰的大豆产品的方法，包括[0035] a)获得大豆薄片；

[0036] b)任选地研磨所述大豆薄片；并

[0037] c)用具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性的微生物蛋白水解酶处理所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的含水浆料。

[0038] 大豆薄片

[0039] 因为大豆薄片构成用于自大豆提取油的一种非常好的起始材料，将完整的大豆加工成大豆薄片是广泛进行的，例如在大豆研磨产业中。此类油提取可以以机械提取进行，在该情况中，轧胚(flaking)通过缩短油达到颗粒表面会必须经过的距离来促进压制中油的释放。或者，它可以以溶剂提取实施，在该情况中，轧胚增加油料种子组织与溶剂间的接触面积，而且还缩短溶剂和提取物在提取过程中会必须经过的距离。还认为轧胚以某种程度破坏油料种子细胞，并且如此使油滴更可用于溶剂提取。

[0040] 虽然通过在油提取前将固体大豆颗粒的大小降低获得很多，但是在提取前将大豆研磨成细粉是不可行的。在溶剂提取方法中，这会损害颗粒周围的溶剂流动，并且会使油与废固体(spent solid)的分离变得非常困难。还有在机械提取方法中，细磨会降低油产量，并且生成具有高含量的细固体颗粒的粗制油。取而代之，通过使用所谓的膨化器(expander)将油料种子轧成薄的薄片，其通常可以具有范围为0.2至0.35毫米的厚度。如此，大豆薄片是一种在大豆工业中广泛可用的物质，并且提高其营养价值(例如，用于动物饲料)会产生很大的经济益处。

[0041] 在依照本发明的生产经酶修饰的大豆产品的方法中，大豆薄片作为起始材料使用。此类大豆薄片用具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性的微生物蛋白水解酶进行处理。可以在尚未进行油提取的情况中用酶处理大豆薄片，在该情况中，它们可以称为全脂大豆薄片。或者，可以已经对它们进行了油的至少部分的提取，在该情况中，它们可以称为废大豆薄片、部分脱脂的大豆薄片或脱脂的大豆薄片。在一个优选的方面，大豆薄片是白色薄片(white flake)。在本发明的上下文中，白色薄片意指具有最小蛋白质变性的废大豆薄片。白色薄片在大豆工业中作为用于生产大豆蛋白质分离物、大多数浓缩物和组织化产品(texturized product)的起始材料广泛应用。

[0042] 在轧胚前，粗制大豆可以已经进行了选自下组的一个或多个步骤：干燥、调和(tempering)、清洁、分类、裂开、脱壳和条件化。

[0043] 在步骤c)前，任选地，可以将大豆薄片研磨成更细的颗粒。若对废大豆薄片(即，在通过溶剂或机械提取方法至少部分除去油后保留的薄片)进行这种研磨，则研磨的薄片可以称为大豆粉。大豆粉通常没有像大豆面粉(soybean flour)那么细地经过研磨，所述大豆粉通常定义为具有一定的大小，使得颗粒可以通过No.100目(美国标准)筛，或者其可以甚至已经经过非常细地研磨，从而在300目(美国标准)筛上保留少于1％的粉。

[0044] 在依照本发明的生产经酶修饰的大豆产品的方法中，还可以是在依照步骤c)的酶处理前研磨全脂大豆薄片。而且在此情况中，全脂大豆薄片不需要像在生产全脂大豆面粉中那样细地研磨。

[0045] 然而，在依照本发明的生产经酶修饰的大豆产品的方法中，也可以对尚未研磨的大豆薄片进行酶处理。在所述情况中，任选地，可以在酶处理后将薄片研磨。此外，即使在酶处理前研磨薄片，它们可以在后来的阶段进一步研磨。

[0046] 在依照本发明的一个优选的方面，要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的至少50％(w/w)会保留在No.100目(美国标准)筛中。在另一个优选的方面，要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的至少50％(w/w)具有在150微米以上的平均颗粒大小。

[0047] 在一方面，在酶处理前将所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片进行脱脂。在另一方面，在酶处理后将所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片进行脱脂。在本发明的上下文中，脱脂意指分离(提取)油的至少一部分。优选地，在任选的研磨前将大豆薄片进行脱脂。

[0048] 在一方面，在酶处理前通过溶剂提取来对所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片进行脱脂。在另一方面，在酶处理后通过溶剂提取来将所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片进行脱脂。优选地，在任选的研磨前通过溶剂提取来将所述大豆薄片进行脱脂。优选地，使用非极性溶剂进行提取。在一个优选的方面，在溶剂提取中使用己烷作为溶剂。

[0049] 在任选的油提取后，可以将剩余的溶剂去除，并且潜在地自废薄片回收。目前，组合的除溶剂化和烘烤在生产供动物饲养用的大豆粉中广泛应用。此方法是油厂实践中的最关键的操作之一，因为它很大程度上决定废薄片的质量。使用烘烤(其是经常牵涉直接蒸汽的热处理)等来使天然存在于大豆中的胰蛋白酶抑制剂失活。然而，如上文所讨论的，过度加热，特别是在高水分含量时过度加热也降低大豆蛋白质的营养价值。

[0050] 在依照本发明的各方面(其包括在酶处理前通过溶剂提取来使所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片脱脂)，优选地，不在存在直接蒸汽的情况中过度热处理，使废薄片脱溶剂化。以最小的蛋白质变性脱溶剂化的一种优选的方法是快速脱溶剂化。在此方法中，在过热溶剂蒸汽流中使自提取器出来的充满溶剂的废薄片流体化。蒸汽的过热为自薄片蒸发溶剂提供能量。薄片-蒸汽流动的湍流性质容许非常快速的热量和物质传递。主要由于加热时间短而使蛋白质变性最小化。优选地，快速脱溶剂化继之以快速冷却以进一步阻止过度的蛋白质变性。

[0051] 在依照本发明的一个优选的方面，生产经酶修饰的大豆产品的方法包括在酶处理前通过溶剂提取来使大豆薄片脱脂，其中不在步骤c)前将大豆薄片进行烘烤。在另一个优选的方面，生产经酶修饰的大豆产品的方法包括在酶处理前通过溶剂提取来使大豆薄片脱脂，其中在步骤c)前通过快速脱溶剂化使大豆薄片脱溶剂化。

[0052] 在依照本发明的生产经酶修饰的大豆产品的方法的一个优选的方面，尚未在存在多于20％(w/w)水的情况中将要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片加热至70℃或以上的温度。在一个更优选的方面，尚未在存在多于20％(w/w)水的情况中将要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片加热至68℃或以上，优选地65℃或以上的温度。在一个甚至更优选的方面，尚未在存在多于20％(w/w)水的情况中将要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片加热至60℃或以上的温度。

[0053] 在另一个优选的方面，所述大豆薄片或所述经研磨的大豆薄片在依照步骤c)的所述酶处理前具有一定的胰蛋白酶抑制剂活性含量，其在残余胰蛋白酶抑制剂测定法(RIA)中测试时在0.02％大豆薄片浓度，优选在0.01％大豆薄片浓度，更优选在0.005％大豆薄片浓度导致对胰蛋白酶活性的至少50％抑制。可以如本申请的实施例1中所描述的进行残余胰蛋白酶抑制剂测定法。

[0054] 在一个更优选的方面，所述大豆薄片或所述经研磨的大豆薄片在依照步骤c)的所述酶处理前具有一定的胰蛋白酶抑制剂活性含量，其在实施例1中所描述的残余胰蛋白酶抑制剂测定法(RIA)中测试时在0.02％大豆薄片浓度，优选在0.01％大豆薄片浓度，更优选在0.005％大豆薄片浓度导致对胰蛋白酶活性的至少50％抑制。例如，在与或不与酶一起温育前在本申请的实施例1中所使用的白色薄片具有一定的胰蛋白酶抑制剂活性含量，其在实施例1中所描述的残余胰蛋白酶抑制剂测定法(RIA)中测试时在0.002％大豆薄片浓度导致对胰蛋白酶活性的至少50％抑制。

[0055] 在另一个更优选的方面，所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片在依照步骤c)的所述酶处理前具有一定的胰蛋白酶抑制剂活性含量，其在如下的胰蛋白酶抑制剂测定法中测试时在0.02％大豆薄片浓度，优选在0.01％大豆薄片浓度，更优选在0.005％大豆薄片浓度导致对胰蛋白酶活性的至少50％抑制：

[0056] (i)将样品在缓冲液(25mM，0.02％Brij 35，pH 6.5)中稀释。此稀释后的浓度是上文提及的大豆薄片浓度。

[0057] (ii)将100μl每种稀释物在微量滴定板的孔中与50μl 0.001mg/ml猪胰蛋白酶混合，并预温育10分钟。

[0058] (iii)将150μl胰蛋白酶底物(在25mM MES，0.02％Brij，pH 8中的0.2mg/ml Boc VLGR-pNA)添加至每种样品，并在混合后，每10秒读取405nm的吸光度达3分钟。

[0059] (iv)对于每种样品，自405nm的吸光度的初始增加斜率通过线性回归计算胰蛋白酶活性A。

[0060] (v)包括具有不含大豆薄片的100μl缓冲液的样品以给出没有抑制剂情况中的胰蛋白酶活性Amax，并且包括代替胰蛋白酶添加水的另一种样品以给出背景活性Amin。

[0061] (vi)然后通过以下计算对胰蛋白酶活性的抑制：

[0062] 抑制＝(Amax-A)/(Amax-Amin)*100％

[0063] 在另一个优选的方面，要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的蛋白质分散性指数在30％以上，优选40％以上或50％以上，更优选60％以上，且甚至更优选70％以上。可以依照Marsman等，1995，Journal of Food Engineering，26，第13页-第28页来测定蛋白质分散性指数。

[0064] 在另一个优选的方面，要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的氮溶解度指数(NSI)在30％以上，优选40％以上或50％以上，更优选60％以上，且甚至更优选70％以上。可以依照美国油化学家学会官方标准与推荐准则(Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists’Society)，D.Firestone编，美国油化学家学会，1985，Method Ba 11-65来测定氮溶解度指数。

[0065] 大豆含有脲酶，即将尿素转化成氨的酶。通过加热破坏大豆中的脲酶与破坏胰蛋白酶抑制剂相关联。因此，经常使用脲酶活性作为大豆加工程度的指示物。通常认为具有约0.2个pH单位的脲酶活性的用于饲料的经加工的大豆材料是加工不足的，而可以认为具有约0.01的脲酶活性的经加工的大豆材料是过度加工的。

[0066] 在依照本发明的生产经酶修饰的大豆产品的方法的另一个优选的方面，要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的脲酶活性在0.4以上，优选0.5以上，更优选1以上，且甚至更优选地在1.5以上，pH单位。技术人员会知道如何测量脲酶活性。它可以依照AOCS(1984)，Official Method Ba 9-58测定。

[0067] 在另一个优选的方面，要依照步骤c)用酶处理的所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片中的至少50％Kunitz胰蛋白酶抑制剂和/或Bowman-Birk抑制剂基本上是非变性的。

[0068] 蛋白水解酶

[0069] 本发明的方法牵涉用具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性的微生物蛋白水解酶处理。要依照本发明使用的这种微生物蛋白水解酶是内肽酶。

[0070] “针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性”意指蛋白水解酶在精氨酸或赖氨酸中任一的羧基端一侧的切割比在任何其它氨基酸的羧基端一侧的切割具有更高特异性。在一方面，蛋白水解酶在精氨酸的羧基端一侧特异性切割，意味着蛋白水解酶在精氨酸的羧基端一侧的切割比在任何其它氨基酸的羧基端一侧的切割具有更高特异性。在另一方面，蛋白水解酶在赖氨酸的羧基端一侧特异性切割，意味着蛋白水解酶在赖氨酸的羧基端一侧的切割比在任何其它氨基酸的羧基端一侧的切割具有更高特异性。

[0071] 通常，蛋白水解酶在约6.0至约11.0的pH，优选地在约8至约10的pH，且于约40℃至约70℃的温度，优选地于约45℃至约60℃或约45℃至约55℃的温度具有最佳的蛋白水解活性。

[0072] 要在本发明方法中使用的蛋白水解酶是微生物来源的。使用微生物酶，而不是动物或植物酶的有利之处在于微生物酶展现出广谱的特征(最佳pH、温度等)，并且可以以相对较大量一贯地获得。

[0073] 优选地，蛋白水解酶是微生物来源的胰蛋白酶样内肽酶。在本发明的上下文中，胰蛋白酶样内肽酶是一种具有类似于胰蛋白酶的特异性的内肽酶。

[0074] 在一方面，蛋白水解酶是细菌内肽酶。

[0075] 在另一方面，蛋白水解酶是真菌内肽酶。在一个优选的方面，蛋白水解酶来自镰孢属(Fusarium)菌株，优选地，来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)，例如具有本申请的SEQ ID NO：1的成熟多肽的氨基酸序列(SWISSPROT No.P35049)。先前已经描述了来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶，其具有如SEQ ID NO：1的氨基酸25-248所示的氨基酸序列(US5,288,627；US5,693,520)。

[0076] 在一方面，蛋白水解酶是来自腐皮镰孢(Fusarium solani)的胰蛋白酶样内肽酶，例如具有本申请的SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸序列(GENESEQP：ADZ80577)的AP977S。在另一方面，所述蛋白水解酶是来自镰孢属菌种的胰蛋白酶样内肽酶，例如具有本申请的SEQ ID NO：3的成熟多肽的氨基酸序列的AP971。

[0077] 在本发明方法的一个优选的方面，所述蛋白水解酶选自下组：

[0078] i)多肽，其具有与如下的(A)或(B)至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％相同的氨基酸序列：(A)SEQ ID NO：1、2、或3之任一项，或(B)这些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段；和

[0079] ii)多肽，其具有通过在如下的(A)或(B)中取代、缺失、和/或插入一个或几个氨基酸而修饰的氨基酸序列：(A)SEQ ID NO：1、2、或3之任一项，或(B)这些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段。

[0080] 氨基酸序列中具有蛋白酶活性的片段可以是活性酶的氨基酸序列，例如在加工后，诸如在切除了任何信号肽和/或前肽后。优选的片段是SEQ ID NO：1的氨基酸25-248、SEQ ID NO：2的氨基酸26-251、或SEQ ID NO：3的氨基酸18-250。

[0081] 在本发明方法的一个优选的方面，蛋白水解酶具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1的氨基酸25-248至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％相同。

[0082] 就本发明而言，可以通过使用来自EMBOSS软件包(Rice，P.，Longden，I.and Bleasby，A.(2000)EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite.Trends in Genetics 16，(6)276-277页；http://emboss.org)第2.8.0版的Needle程序来确定两个氨基酸序列的比对。Needle程序执行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所描述的全局比对算法。所使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口打开罚分是10，而缺口延伸罚分是0.5。

[0083] 两个氨基酸序列间的同一性程度以两个序列比对中的精确匹配的数目除以两个序列中最短序列的长度来计算。结果以百分比同一性表示。精确匹配在两个序列在重叠的相同位置中具有相同氨基酸残基时发生。序列的长度是该序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO：1的长度是248个氨基酸)。

[0084] 用蛋白水解酶处理

[0085] 在本发明的方法中，用具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性的微生物蛋白水解酶处理大豆薄片或经研磨的大豆薄片的含水浆料。

[0086] 在一方面，所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的含水浆料具有至少10％，优选地至少15％或至少20％，且更优选地至少25％或至少30％的干物质含量。在另一方面，所述大豆薄片或经研磨的大豆薄片的含水浆料具有至少35％，诸如至少40％的干物质含量。

[0087] 应当理解，术语含水浆料包括含有高干物质含量的浆料，其也可以称作含水糊料(aqueous paste)。

[0088] 可以将蛋白水解酶添加至含水浆料以开始酶处理，或者可以通过混合酶与水，并将这添加到大豆薄片或经研磨的大豆薄片来制备含水浆料。

[0089] 添加到大豆薄片或经研磨的大豆薄片的蛋白水解酶量范围可以为每千克干物质约1mg至约5000mg酶蛋白，优选地每千克干物质10mg至约1000mg酶蛋白，更优选地每千克干物质约50mg至约1000mg酶蛋白，且甚至更优选地每千克干物质约50mg至约500mg酶蛋白。

[0090] 酶处理于蛋白水解酶有活性的温度进行；技术人员会知道选择哪种温度。优选地，酶处理于50℃-70℃的温度，更优选地于55℃-65℃的温度进行。

[0091] 优选地，酶处理在大豆薄片含水浆料的天然pH，即在没有任何pH调节的情况中进行。在一个优选的方面，酶处理在pH 6和pH 7之间进行。

[0092] 如熟练技术人员应当领会的，酶处理的持续时间可以并且会存在变化。一般而言，酶处理的持续时间范围可以为几分钟至多个小时，诸如约10分钟至约5小时。一方面，酶处理进行30分钟-2小时。一般地，进行较短时间的酶处理可能是优选的，但是这需要针对要添加的酶量平衡。

[0093] 在一个优选的方面，与没有进行用蛋白水解酶的处理的相似方法相比，酶处理导致经酶修饰的大豆产品中的Kunitz胰蛋白酶抑制剂和/或Bowman-Birk抑制剂的至少50％失活。

[0094] 在完成酶处理后，可以使蛋白水解酶失活。技术人员会知道如何使酶失活。

[0095] 在一方面，与微生物蛋白水解酶同时或者在不同处理步骤中添加一种或多种其它酶。技术人员会知道用一种或多种其它酶的这种处理优选地在与用微生物蛋白水解酶处理同时还是作为不同步骤，例如在不同温度或在不同pH进行。这种其它酶可以选自水解酶，诸如例如果胶分解酶、纤维素分解酶、半纤维素分解酶、磷酸水解酶(phosphorolytic enzyme)、其它蛋白水解酶、或其组合。典型的有用的磷酸水解酶是肌醇六磷酸酶。例如，有用的果胶分解酶可以是内-半乳聚糖酶或β-半乳糖苷酶。例如，典型的果胶分解酶可以是商业产品Viscozyme (Novozymes A/S)。在一个优选的方面，所述其它酶是糖基水解酶。在一个更优选的方面，这种其它酶是α-半乳糖苷酶。

[0096] 经酶修饰的大豆产品

[0097] 本发明提供了一种生产经酶修饰的大豆产品的方法。

[0098] 在一个优选的方面，依照本发明方法生产的经酶修饰的大豆产品包含占总干物质至少20％，优选地至少25％或至少30％，且更优选地至少35％的碳水化合物(w/w)。

[0099] 依照本发明生产的经酶修饰的大豆产品中的蛋白质不是广泛水解的(extensively hydrolysed)。在一方面，蛋白质具有这样的大小分布，其中多于20％的蛋白质(w/w)比约10kDa大，如通过凝胶电泳所测量的。

[0100] 在另一个优选的方面，依照本发明方法生产的经酶修饰的大豆产品中的蛋白质具有5％以下，优选地4％以下且更优选地3％以下的水解程度。

[0101] 水解程度(DH)表示通过所述方法获得的蛋白质水解的程度。在本发明的上下文中，水解程度(DH)定义如下：

[0102] DH＝(切割的肽键数/肽键总数)x 100％

[0103] 技术人员会知道如何测量DH。例如，它可以使用如记载于Adler-Nissen，J.，1986，Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins，第5章，第122页-第124页的方法来完成。

[0104] 在另一个优选的方面，经酶修饰的大豆产品的蛋白质分散性指数在30％以上，优选地40％以上或50％以上，更优选地60％以上，且甚至更优选地70％以上。

[0105] 在另一个优选的方面，经酶修饰的大豆产品的氮溶解度指数(NSI)在30％以上，优选地40％以上或50％以上，更优选地60％以上，且甚至更优选地70％以上。

[0106] 在另一个优选的方面，经酶修饰的大豆产品具有比通过没有添加蛋白水解酶的相似方法生产的大豆产品低至少30％的残余胰蛋白酶抑制剂活性。优选地，经酶修饰的大豆产品具有比通过没有添加蛋白水解酶的相似方法生产的大豆产品低至少40％，更优选地低至少50％，且甚至更优选地低至少60％的残余胰蛋白酶抑制剂活性。

[0107] 在又一个优选的方面，通过本发明方法生产的经酶修饰的大豆产品是饲料或饲料添加剂。

[0108] 因此，本发明还提供了通过本发明方法生产的经酶修饰的大豆产品作为饲料或饲料添加剂的用途。

[0109] 例如，它可以用于水产养殖或牛肉产业中的饲料，或者用于饲养奶牛、马、家禽、绵羊、和/或猪。

[0110] 生产经酶修饰的大豆粉的方法

[0111] 在依照本发明的方法的一个优选的方面，在酶处理前通过溶剂提取来将大豆薄片进行脱脂，并且在酶处理之前或之后将废薄片研磨成大豆粉。所得的经酶修饰的大豆产品可以称为经酶修饰的大豆粉。如此，在一个优选的方面，本发明提供了一种生产经酶修饰的大豆粉的方法，包括

[0112] a)获得大豆薄片；

[0113] b)通过溶剂提取来使所述大豆薄片脱脂；

[0114] c)将经脱脂的大豆薄片研磨成大豆粉；并

[0115] d)用具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性的微生物蛋白水解酶处理所述经脱脂的大豆薄片或所述大豆粉的含水浆料；

[0116] 其中在步骤d)之前或之后进行步骤c)。

[0117] 大豆粉

[0118] 在另一方面，本发明提供了可以通过本发明的方法获得的大豆粉。如此，本发明提供了一种大豆粉，其：

[0119] a)在水溶液中具有6-7的pH，

[0120] b)包含占总干物质至少20％的碳水化合物，

[0121] c)具有在150微米以上的平均颗粒大小，

[0122] d)在pH 6.5具有至少50％的氮溶解度指数，并

[0123] e)具有0.2-3％的水解程度。

[0124] 在一个优选的方面，所述大豆粉具有0.2以下，优选地0.1以下，更优选地0.05以下，pH单位的脲酶活性。

[0125] 在另一个优选的方面，所述大豆粉包含占总干物质至少25％，优选地至少30％，且更优选地至少35％的碳水化合物(w/w)。

[0126] 在另一个优选的方面，所述大豆粉的氮溶解度指数(NSI)为60％以上，优选地70％以上。

[0127] 蛋白水解酶在生产饲料中的用途

[0128] 在第三方面，本发明提供了至少一种蛋白水解酶在生产饲料或饲料添加剂产品中的用途，其中所述蛋白水解酶与SEQ ID NO：1的氨基酸25-248具有至少70％的同一性。

[0129] 在一个优选的方面，这种蛋白水解酶是微生物蛋白水解酶，优选地真菌蛋白水解酶。在一个更优选的方面，此类蛋白水解酶来自镰孢属菌株，优选地，来自尖镰孢菌株。

[0130] 在一个优选的方面，这种蛋白水解酶具有针对精氨酸和/或赖氨酸的特异性。在另一个优选的方面，这种蛋白水解酶是胰蛋白酶样内肽酶。

[0131] 在一个优选的方面，这种蛋白水解酶在约6.0至约11.0的pH，优选地在约8至约10的pH，且于约40℃至约70℃的温度，优选地于约45℃至约60℃或约45℃至约55℃的温度具有最佳的蛋白水解活性。

[0132] 在一个优选的方面，这种蛋白水解酶具有与SEQ ID NO：1的氨基酸25-248至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，且最优选地至少98％相同的氨基酸序列。
实施例

[0133] 实施例1

[0134] 对用来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶(Prot1)处理的白色薄片(WF)的残余胰蛋白酶抑制剂分析(RIA)

[0135] 将分别与终浓度100、250、500和1000mg ep/kg白色薄片对应的酶(来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶)分别混合到19.2ml和63.5ml milli-Q水中：将酶混合物添加到25g白色薄片。干物质(dm)白色薄片的终浓度分别是50％和25％w/w。通过用匙手工混合来将25％w/w dm白色薄片浆料进一步混合，50％浆料出于实际原因通过使用搅拌器(Braun Multiquick专业MR 5550BC-HC)进一步混合。每种处理包括没有添加的酶的对照。不进行pH调节。

[0136] 将样品在55、60和65℃的水浴中温育60分钟。

[0137] 将大豆样品转移到塑料管中，并在制冷器中保持，用于后来的残余胰蛋白酶抑制剂分析。

[0138] 材料：

[0139] 所使用的酶是来自尖镰孢的成熟的真菌胰蛋白酶样内肽酶Prot1。所述内肽酶的氨基酸序列(翻译产物)以本申请的SEQ ID NO：1显示。

[0140] 白色薄片，未热处理的；11.5％水分，约50％蛋白质含量，约30％碳水化合物。

[0141] RIA分析：

[0142] 为了测定残余胰蛋白酶抑制剂活性，用缓冲液(25mM MES、0.02％Brij，pH 6.5)将大豆悬浮液稀释(500x、1000x和2000x)。然后，将100μl稀释物在微量滴定板的孔中与50μl猪胰蛋白酶(0.001mg/ml)混合。10分钟的预温育后(以确保猪胰蛋白酶与大豆胰蛋白酶抑制剂间的平衡结合)，添加150μl胰蛋白酶底物(储液：在DMSO中的50mg/ml Boc-VLGR-pNA。底物溶液：每ml缓冲液(0.1M Tris、0.02％Brij 35，pH 8.0)4μl储液)，并在混合后，在Spectramax Plus分光光度计中每10秒读取405nm的吸光度达3分钟。通过线性回归自405nm吸光度的初始增加斜率计算胰蛋白酶活性。还包括具有代替大豆稀释物的100μl缓冲液的孔以给出没有抑制剂情况中的胰蛋白酶活性。

[0143] 已经证实，Prot1对测量的胰蛋白酶活性的贡献可忽略。

[0144] 将作为大豆浓度函数的测量的胰蛋白酶活性拟合到表达式：

[0145] A＝(Amax-Amin)/(1+(log(I50)/log(C))^斜率)+Amin

[0146] 其中A是测量的活性，Amax是由没有添加大豆的孔给出的最大活性，Amin是在不添加胰蛋白酶时的背景活性，I50是将胰蛋白酶活性抑制50％的大豆浓度，且C是大豆浓度。使用最小二乘法拟合对每种样品计算I50，并自以下计算残余抑制剂活性(RIA)水平：

[0147] RIA＝I50(样品)/I50(参照)*100％

[0148] 其中I50(样品)是对样品计算的I50，而I50(参照)是对没有添加蛋白酶的大豆样品计算的I50。

[0149] 结果/结论：

[0150] 表1：作为酶添加、干物质含量(dm)、温度的函数的残余抑制剂活性[0151]酶剂量 ％w/w dm WF 温度℃ 反应时间 ％RIA
WF(对照) 50 55 60分钟 100
100mg ep/kg 50 55 60分钟 88
250mg ep/kg 50 55 60分钟 77
500mg ep/kg 50 55 60分钟 80
1000mg ep/kg 50 55 60分钟 79
WF(对照) 25 55 60分钟 100
100mg ep/kg 25 55 60分钟 65
250mg ep/kg 25 55 60分钟 54
500mg ep/kg 25 55 60分钟 62
1000mg ep/kg 25 55 60分钟 60
WF(对照) 50 60 60分钟 100
100mg ep/kg 50 60 60分钟 85
250mg ep/kg 50 60 60分钟 73
500mg ep/kg 50 60 60分钟 80
1000mg ep/kg 50 60 60分钟 55
WF(对照) 25 60 60分钟 100
100mg ep/kg 25 60 60分钟 47
250mg ep/kg 25 60 60分钟 47
500mg ep/kg 25 60 60分钟 34
1000mg ep/kg 25 60 60分钟 26
WF(对照) 50 65 60分钟 100
100mg ep/kg 50 65 60分钟 90
250mg ep/kg 50 65 60分钟 73
500mg ep/kg 50 65 60分钟 70
1000mg ep/kg 50 65 60分钟 61
WF(对照) 25 65 60分钟 100
100mg ep/kg 25 65 60分钟 100
250mg ep/kg 25 65 60分钟 59
500mg ep/kg 25 65 60分钟 37
1000mg ep/kg 25 65 60分钟 n.d.

[0152]

[0153] 如可以自表1推出的，对包含酶的所有处理观察到白色薄片的蛋白酶处理对RIA的影响。RIA值取决于酶浓度、白色薄片浓度和温度。于60℃和25％dm白色薄片，在所有酶剂量获得50％以上的RIA降低，而高白色薄片含量或60℃以上或以下的温度影响酶的效率。

[0154] 实施例2

[0155] 对用来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶(Prot1)和α-半乳糖苷酶的组合处理的白色薄片(WF)的残余胰蛋白酶抑制剂分(RIA)

[0156] 分别将与终浓度1000mg内肽酶ep/kg白色薄片和47mg α-半乳糖苷酶ep/kg白色薄片对应的酶混合到77和254g milli-Q水中：将酶混合物添加到100g白色薄片。通过用匙手工混合来将浆料进一步混合。每种处理包括没有添加酶的对照。不进行pH调节。干物质白色薄片的终浓度分别是50％和25％w/w。

[0157] 分别将样品在50、60和65℃的水浴中温育60分钟和120分钟。

[0158] 将大豆样品转移到塑料管中，并在制冷器中保持，用于后来的残余胰蛋白酶抑制剂分析。

[0159] 材料：

[0160] EP692024B1中所描述的来自黑曲霉(Aspergillus niger)的α-半乳糖苷酶[0161] 来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶Prot1(与实施例1中相同)

[0162] 白色薄片，未热处理的；11.5％水分，约50％蛋白质含量，约30％碳水化合物。

[0163] RIA分析：

[0164] 如实施例1中那样实施RIA分析。

[0165] 结果/结论：

[0166] 表2：作为酶添加、干物质含量(dm)、温度和时间的函数的残余抑制剂活性[0167]酶剂量 ％w/w dm WF 温度℃ 反应时间 ％RIA
WF(对照) 50 50 60分钟 100
Prot1/A-gal 50 50 60分钟 84
WF(对照) 25 50 60分钟 100
Prot1/A-gal 25 50 60分钟 53
WF(对照) 50 60 60分钟 100
Prot1/A-gal 50 60 60分钟 60
WF(对照) 25 60 60分钟 100
Prot1/A-gal 25 60 60分钟 52
WF(对照) 50 65 60分钟 100
Prot1/A-gal 50 65 60分钟 59
WF(对照) 25 65 60分钟 100
Prot1/A-gal 25 65 60分钟 33
WF(对照) 50 50 120分钟 100
Prot1/A-gal 50 50 120分钟 78
WF(对照) 25 50 120分钟 100
Prot1/A-gal 25 50 120分钟 56
WF(对照) 50 60 120分钟 100
Prot1/A-gal 50 60 120分钟 58
WF(对照) 25 60 120分钟 100
Prot1/A-gal 25 60 120分钟 33
WF(对照) 50 65 120分钟 100
Prot1/A-gal 50 65 120分钟 56
WF(对照) 25 65 120分钟 100
Prot1/A-gal 25 65 120分钟 28

[0168]

[0169] 如可以自表2推出的，所有基于酶的处理(除了具有最高干物质含量(50％w/w)并于最低温度50℃处理的样品外)显示残余胰蛋白酶抑制剂活性降低大于40％。

[0170] 可以将蛋白酶处理与α-半乳糖苷酶一起添加以降低基于碳水化合物的抑制剂如水苏糖(stacchyose)和棉子糖，并提高能含量的利用。因为两种酶具有明显不同的特异性，所以没有期望显著的协同作用。

[0171] 实施例3

[0172] 两种其它真菌胰蛋白酶样蛋白酶的测试

[0173] 已经测试了通过来自镰孢属物种的两种其它真菌胰蛋白酶样蛋白酶使胰蛋白酶抑制剂活性失活，并且与先前实施例中使用的Prot1比较。

[0174] 所使用的酶是：

[0175] 来自尖镰孢的成熟的真菌胰蛋白酶样内肽酶Prot1。这种内肽酶(翻译产物)的氨基酸序列以本申请的SEQ ID NO：1显示。

[0176] 来自腐皮镰孢的成熟的真菌胰蛋白酶样内肽酶Prot2。这种内肽酶(翻译产物)的氨基酸序列以本申请的SEQ ID NO：2显示。

[0177] 来自镰孢属菌种的成熟的真菌胰蛋白酶样内肽酶Prot3。这种内肽酶(翻译产物)的氨基酸序列以本申请的SEQ ID NO：3显示。

[0178] 将1000μl 5％白色薄片悬浮液(在Milli Q水中的50mg/ml，所得的pH为6.5)在Eppendorf管中与50μl酶溶液混合，并在Eppendorf热混合器中于50、60或70℃在有力摇动的情况中温育2小时。包括代替酶溶液添加Milli Q水的参照。将蛋白酶剂量补料以给出250和500μg蛋白酶/g大豆蛋白质的浓度(250和500ppm)。

[0179] 如实施例1中的那样完成胰蛋白酶抑制的测定和残余抑制剂活性(RIA)的计算。

[0180] 已经证实真菌胰蛋白酶样蛋白酶对测量的胰蛋白酶活性的贡献可忽略。

[0181] 结果：

[0182] 在下文表3中，给出残余抑制剂活性结果。看到在给定的酶剂量，Prot1比Prot2或Prot3之任一更有效地使抑制剂失活，尽管这些酶相对于没有添加蛋白酶的参照样品也给出抑制剂活性的显著降低。

[0183] 表3：残余抑制剂活性(RIA)测定法及相对于50℃参照的％结果。

[0184]

[0185] 实施例4

[0186] 来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶(Prot1)与Alcalase和拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)蛋白酶的比较

[0187] 已经测试了通过Alcalase(可获自Novozymes A/S)和拟诺卡氏菌内肽酶(来自拟诺卡氏菌属菌种NRRL 18262，先前记载于例如WO 88/03947，DNA和氨基酸序列先前在例如DK专利申请no.199600013中公布)使胰蛋白酶抑制剂活性失活，并与来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶(Prot1)比较。

[0188] 将1000μl 5％白色薄片悬浮液(在Milli Q水中50mg/ml，所得的pH为6.5)在Eppendorf管中与50μl酶溶液混合，并在Eppendorf热混合器中于60或70℃在有力摇动的情况中温育2小时。在每个温度，包括代替酶添加Milli Q水的样品。将蛋白酶剂量补料以给出250μg蛋白酶/g大豆蛋白质的浓度(250ppm)。

[0189] 如实施例1中的那样完成胰蛋白酶抑制的测定和残余抑制剂活性(RIA)的计算。

[0190] 已经证实Prot1、拟诺卡氏菌蛋白酶和Alcalase对测量的胰蛋白酶活性的贡献可忽略。

[0191] 结果：

[0192] 在下文表4中，给出残余抑制剂活性结果。看到于60和70℃两者，胰蛋白酶样镰孢属内肽酶比Alcalase或拟诺卡氏菌属内肽酶之任一更有效地使抑制剂失活。

[0193] 表4：残余抑制剂活性(RIA)测定法及相对于室温保持的参照(没有酶)的％结果。

[0194]