선형 이동 광학 구배를 발생시키고 이용하는 방법 및 장치

선형 이동 광학 구배를 발생시키고 이용하는 방법 및 장치{METHODS AND APPARATUS FOR GENERATING AND UTILIZING LINEAR MOVING OPTICAL GRADIENTS}

입자의 분리 및 특징화는 공업적 응용에서 생물학적 응용, 환경적 응용까지의 폭넓은 응용 분야를 갖는다. 예를 들면, 생물학 분야에서, 세포의 분리는 의약 및 생명공학에 많이 응용된다. 역사적으로, 분류 기술은 입자 크기 또는 밀도와 같은 총체적인 물리적 특징, 또는 수용체-리간드 상호작용 또는 면역학적 표적과의 반응과 같은 일부의 친화력 상호작용을 이용하는 것에 촛점이 맞추어졌다.

재료의 전자기 반응 특성은 입자 분류 및 특징화에 이용되어 왔다. 예를 들면, 유전영동 분리기는 입자의 분리를 위해 불균일한 DC 또는 AC 전기장을 이용한다 [예를 들면, 미국 특허 제5,814,200호 (Pethig et al., 발명의 명칭: "Apparatus for Separating By Dielectrophoresis") 참조]. 세포 분류에 유전영동을 응용하는 방법이 시도되어 왔다. 벡커 등의 문헌 [Becker (with Gascoyne) et al., PNAS USA, Vol. 92, pp. 860-864, Jan. 1995, Cell Biology, entitled "Separation of Human Breast Cancer Cells from Blood by Differential Dielectric Affinity"]에는, 질병 세포의 유전 특성이 정상 혈구 세포로부터 암 세포를 분리할 수 있을 만큼 충분히 구별되는 것으로 보고되어 있다. 그 시스템은 미세전극 어레이를 함유하는 유전 친화력 컬럼 내에서 세포에 작용하는 유체력 및 유전영동력의 균형을 맞추었다. 더욱 정교한 분리 시스템 개발이 이행되었다 [Cheng, et al., 미국 특허 제6,071,394호, "Channel-Less Separation of Bioparticles on a Bioelectronic Chip by Dielectrophoresis" 참조]. 입자의 분리를 위해 정전력을 이용하는 또다른 방법이 시도되었다 [Judy et al., 미국 특허제4,440,638호, 발명의 명칭: "Surface Field-Effect Device for Manipulation of Charged Species", and Washizu "Electrostatic Manipulation of Biological Objects", Journal of Electrostatics, Vol. 25, No. 1, June 1990, pp. 109-103 참조].

빛을 이용하여 입자를 분류하고 포획하였다. 이 분야에서의 초기 연구자 중의 한 사람은 투명한 ㎛-크기의 라텍스 비드를 조작하기 위해 레이저를 이용하였던 벨 (Bell) 실험실 소속의 아더 애쉬킨 (Arthur Ashkin)이었다. 애쉬킨의 미국 특허 제3,808,550호 (발명의 명칭: "Apparatuses for Trapping and Accelerating Neutral Particles")는 복사압을 통해 입자를 포획하거나 함유하는 시스템을 개시하였다. 간섭성 광 복사선을 발생시키는 레이저는 바람직한 광압원이었다. 애쉬킨 벨 실험실 그룹에서 광 복사를 이용하여 작은 입자들을 포획하는 방법을 연구한 결과, 최종적으로 스티븐 츄를 포함한 그 실험실의 연구원들에게 노벨 상이 수여되었다 [예를 들면, Chu, S., "Laser Trapping of Neutral Particles", Sci. Am., p. 71 (Feb. 1992), Chu, S., "Laser Manipulation of Atoms and Particles", Science 253, pp. 861-866 (1991) 참조].

일반적으로, 집속 광선 빔과 유전 입자 또는 물질의 상호작용은 구배력 및 산란력의 광범위한 범주에 속한다. 구배력은 더 높은 상대 유전 상수를 갖는 물질을 집속 광선 빔 내의 최고 세기 영역 쪽으로 끌어당기는 경향이 있다. 산란력은 광선 빔에서 물질로의 운동량 전달 결과로서 발생하며, 이는 일반적으로 빔과 동일한 방향이다. 입자를 포획하기 위한 빛의 사용은 또한 종종 광학 집게 (opticaltweezer) 장치로서 불리운다. 일반적으로, 포획력은 레일리 (Rayleigh) 방법을 이용하여 다음 방정식으로 표현된다:

상기 식에서, F _g 는 더 높은 세기쪽의 입자에 대한 광학 구배력이고, r은 입자의 반경이고, ε _B 는 배경 매질의 유전 상수이고, ε는 입자의 유전 상수이고, I는 빛의 세기 (W/㎠)이고, ▽는 공간 도함수이다. 도 1은 광학 집게 내의 입자의 도면이다. 광학 집게는 입자쪽으로 고도로 집속되는 빔으로 이루어진다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 집속 빔 (12)은 먼저 입자 (10) 상에 수렴된 다음 발산된다. 세기 패턴 (14)은 수평 차원의 빔 세기의 단면에 관한 것이며, 세기 패턴 (16)은 수직 차원의 세기의 단면이다. 방정식으로부터 알 수 있는 바와 같이, 포획력은 빛의 세기 구배의 함수이다. 따라서, 빛의 세기가 가장 빠르게 변화하는 곳에서는 힘이 더 크고, 반대로 빛의 세기가 균일한 곳에서는 힘이 최소이다.

초기의 안정한 광 트랩은 수직 레이저 빔으로 입자를 부양시켜, 상향 산란력이 하향 구배력에 대해 균형잡히게 한다. 빛의 구배력은 광축 상에 입자를 유지하는 작용을 하였다 [Ashkin, "Optical Levitation by Radiation Pressure", Appl. Phys. Lett., 19(6), pp. 283-285 (1971) 참조]. 1986년에, 애쉬킨은 축을 따르는 빛의 전파와 반대로 고도로 집속된 레이저 빔을 기반으로 하는 트랩을 개시한 바 있다. 고도로 집속된 빔은 세기가 아주 높은 공간 내에 작은 점을 생기게 한다. 고도의 집속은 큰 구배력이 그 점쪽으로 유전 입자를 끌어당기도록 한다. 특정 조건 하에서, 구배력은 산란력을 극복하며, 그로 인해 빛의 방향에 있는 입자가 촛점 밖으로 밀어내어진다. 일반적으로, 그러한 고도의 집속을 실현하기 위해, 레이저 빔을 높은 개구수 현미경 대물렌즈를 통하게 한다. 이러한 배치는 높은 개구수 조명의 상대적인 기여도를 높이는 작용을 하지만, 산란력의 효과를 감소시킨다.

1987년에, 애쉬킨은 단일 빔 구배력 광 트랩 시스템에 의한 생물학적 물질의 광 포획 및 조작을 실험적으로 입증하였다 [Ashkin, et al., "Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria", Science, 20 March, 1987, Vol. 235, No. 4795, pp. 1517-1520 참조]. 미국 특허 제4,893,886호 (발명의 명칭: "Non-Destructive Optical Trap for Biological Particles and Method of Doing Same")에서, 애쉬킨 등은 적외선 광원을 이용하여 단일 빔 구배력 광 트랩 내에 생물학적 입자를 성공적으로 포획하였음을 보고하였다. 0.8 ㎛ 내지 1.8 ㎛인 것으로 언급된, 실질적으로 적외선 파장 범위의 간섭성 빛을 방출하는 적외선 레이저를 사용하여 160 mW의 레이저 출력으로 몇번의 라이프 사이클 동안 포획한 후에도 생물학적 물질이 정상적인 운동성을 계속 재현한 것으로 언급되어 있다. 용어 "옵티큐션 (opticution)"은 생물학적 물질의 광복사 사멸을 나타내는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다.

수많은 연구원들은 생물학적 물질을 연구하기 위해 빛을 사용하여 왔다. 식물 세포 내의 내부 세포 조작이 입증되었다 [Ashkin, et al., PNAS USA, Vol. 86, 7914-7918 (1989), the summary article by Ashkin, A., "Optical Trapping and Manipulation of Neutral Particles Using Lasers", PNAS USA, Vol. 94, pp. 4853-4860, May 1997, Physics. 참조]. 매여있는 편모 주위에 세균을 비틀어 돌려서 세균 편모의 비틀림 순응율을 측정하는 것을 포함한 각종 기계적 측정 및 힘의 측정이 이루어져 왔다 [Block, S., et al., Nature (London), 338, pp. 514-518 (1989) 참조]. 입자의 미세조작이 입증되었다. 예를 들면, 레이저 가위 또는 칼 (scalpel)로서 불리우기도 하는, 마이크로빔 펄스 페이저 절단 기술과 함께 광학 집게를 사용하여 움직이는 세포 및 세포 소기관을 절단하는 것이 입증되었다 [Seeger, et al., Cytometry, 12, pp. 497-504 (1991) 참조]. 광학 집게 및 가위는 모든 광학적 시험관내 발효에 사용되어 왔다 [Tadir, Y. , Human Reproduction, 6, pp. 1011-1016 (1991) 참조]. 각종 기술들에서는 포획을 돕기 위해 생물학적 물질에 구조물을 부착시킨 "핸들"을 사용하였다 [Block, Nature (London), 348, pp. 348-352 (1990) 참조].

각종 측정은 나노미터 이하의 해상도를 가진 광 포획 및 간섭 위치 모니터링을 이용하는 생물학적 시스템으로 이루어졌다 [Svoboda, Nature (London), 365, pp. 721-727 (1993) 참조]. 또다른 측정은 집게 트랩을 이용하는 피드백 시스템을 제시하였다 [Molloy, et al., Biophys. J., 68, pp. 2985-3055 (1995) 참조].

수 많은 연구가들은 생물학적 물질을 변형시키거나 잡아당기려고 시도하였다. 애쉬킨은 적혈구 세포의 형태를 변형시키기 위해 광학 집게를 이용하였다 [Ashkin in Nature (London), 330 pp. 769-771 (1987) 참조]. 적혈구 세포의 형태 회복 시간을 측정하는 분석을 위해 다중 광학 집게를 이용하였다 [Bronkhorst, Biophys. J., 69, pp. 1666-1673 (1995) 참조]. 카스 (Kas) 등은 미국 특허제6,067,859호에서 "광학 신장기"를 제시한 바 있으며, 여기서는 레이저에 의해 발생되는 2개의 역전파 빔 사이의 세포를 포획하고 변형하기 위해 가변파장 레이저의 사용을 제시하였다. 그 시스템을 이용하여 단일 악성 암 세포를 검출하였다. 또다른 검정법은 광학 충돌을 위해 OPTCOL로 불리우는 제어 조건 하에서 2개의 세포 또는 입자를 충돌시키는 것을 제안하였다 [예를 들면, Mammer, Chem & Biol., 3, pp. 757, 763 (1996) 참조].

또다른 연구가들은 물체의 특성을 측정하기 위한 광학력의 이용을 제시하였다 [예를 들면, Guanming, Lai et al., "Determination of Spring Constant of Laser-Trapped Particle by Self-Mining Interferometry", Proc. of SPIE, 3921, pp. 197-204 (2000) 참조]. 또다른 연구가들은 광학 트랩의 힘을 보정하기 위한 방법으로서 유체 항력에 대해 균형잡힌 광학 포획력을 이용하였다. 이 시스템들은 항력, 특히 스톡스 항력에 대한 높은 의존도를 이용한다.

또다른 연구가들은 재료의 위치를 정하기 위해 빛의 세기 패턴을 이용하였다. 미국 특허 제5,245,466호 (Burnes et al., "Optical Matter")에서는, 현미경 편광성 물질에 결합되는 광선 빔을 이용하여 광범위한 결정성 및 비결정성 구조물 어레이를 발생시켰다. 편광성 물질은 이용된 패턴화된 빛의 세기 분포의 패턴에 적용된다 ["Matter Rides on Ripples of Lights", reporting on the Burns work in New Scientist, 18 Nov., 1989, No. 1691 참조]. 또다른 사람들은 정상파 광학 패턴을 이용하여 기판 상에 원자를 부착시키는 방법을 제안하였다. 그 시스템을 이용하여 정상파 패턴을 이동시켜 구조물 어레이를 생성할 수 있다 [Celotta et al.,미국 특허 제5,360,764호, "Method of Fabricating Laser Controlled Nanolithography" 참조].

또다른 사람들은 빛을 이용하여 입자의 운동을 일으키는 방법을 시도하였다. 브라이언 스페이스 (Brian Space) 등에 의해 "광영동 (photophoresis)"으로 불리우는 기술에서는, 편광 빔을 이용하여 분자 회전 운동을 유도하여 분자의 이동을 유도하였으며, 여기서 원하는 목표는 분자의 농도 구배를 형성하는 것이다. 그 기술은 바람직하게는 분자의 유도된 회전 운동이 이동을 일으키도록 프로펠러형 분자를 이용한다.

샘플 제조 및 분류 응용과 같은 여러가지 목적에 적용되는 미세유체 시스템을 형성하기 위한 각종 시도가 이루어졌다 [예를 들면, Ramsey, 미국 특허 제6,033,546호, "Apparatus and Method for Performing Microfluidic Manipulations for Chemical Analysis and Synthesis" 참조]. 아크라라 및 칼리퍼 (Aclara and Caliper)와 같은 수많은 회사들은 '랩 온 어 칩 (lab on a chip)'을 포함하는 마이크로시스템을 형성하고자 하였다.

다른 사람들은 미세가공 장치를 광학 시스템과 조합하고자 하였다. 문헌 ["A Microfabricated Device for Sizing and Sorting DNA Molecules", Chou, et al., PNAS USA, Vol. 96, pp. 11-13, Jan. 1999, Applied Physical Sciences, Biophysics]에는, 형광 성질의 측정을 기초로 하여 현미경 물체를 치수를 재고 분류하는 미세가공 장치가 기재되어 있다. 논문은 DNA 내에 개재된 형광 염료의 양을 비롯한 형광 성질을 측정하여 DNA의 길이를 결정하는 시스템을 설명한다. 문헌["A Microfabricated Fluorescence-Activated Cells Sorter", Nature Biotechnology, Vol. 17, Nov. 1999, pp. 1109-1111]에서는, "T" 미세가공 구조물을 사용하여 세포 분류하였다. 그 시스템은 "T" 교차의 검출 윈도우 업스트림을 이용하고 검출된 성질을 기초로 하여 입자를 분류할 것이다. 새로운 분류 시스템은 검출된 결과에 기초하여 유체 흐름을 전환시켰다. 역 분류 방식에서, 유체 흐름은 모든 입자가 폐기물 수집으로 향하도록 셋팅되었지만, 수집가능한 결과의 검출 시에, 입자가 두번째로 검출될 때까지 유체 흐름을 반전시키고, 그 후에 입자를 수집하였다. 이러한 시스템은 PCT 공보 WO 99/61888호 (Quake et al., "Microfabricated Cell Sorter")에 기재되어 있다.

또다른 사람들은 전자기 복사 관련 특성을 포함한 각종 특성의 측정에 기초하여 생물학적 시스템을 특징화하려고 시도하였다. 마이크로파 범위에서 물질, 특히 생물학적 물질의 유전 특성을 조사하기 위한 각종 노력이 이루어졌다 [예를 들면, Larson et al., 미국 특허 제4,247,815호, "Method and Apparatus for Physiologic Facsimile Imaging of Biologic Targets Based on Complex Permittivity Measurements Using Remote Microwave Interrogation", 및 PCT 공보 WO 99/39190호, Hefti, "Method and Apparatus for Detecting Molecular Binding Events" 참조].

당해 분야에서 이루어진 실질적인 노력에도 불구하고, 포괄적이고, 효과적이며, 고감도인 신뢰성있는 시스템을 얻지 못했다.

발명의 요약

본 발명의 방법 및 장치는 일반적으로 입자로부터 정보를 얻거나 입자에 힘을 가하기 위해 광 에너지를 사용하는 것에 관한 것이다. 입자들은 유전 상수를 갖는 임의의 형태일 수 있다. 이러한 유리한 목적을 위한 빛의 사용은 광영동법 (optophoresis) 분야에서 이루어진다. 세포와 같은 입자는 상태의 지표이며, 또는 입자의 선택, 분류, 특징화 또는 입자와의 독특한 상호작용을 가능하게 하는 광영동 상수 또는 사인을 가질 것이다. 생물학적 조직에서, 입자는 세포, 소기관, 단백질, 또는 원자 수준까지의 임의의 성분을 포함할 수 있다. 그 기술은 또한 모든 무기 물질, 금속, 반도체, 절연체, 중합체 및 기타 무기 물질에 응용될 때를 비롯한 비-생물학적 부문에도 응용된다.

생물학적 부문을 고려하면, 세포는 모든 게놈 정보에 대한 진정한 통합점을 나타낸다. 이러한 정보에 접근하고 해독하는 것은 질환의 진단 및 치료에 중요하다. 기존의 기술들은 이 정보의 지나친 복잡함을 효과적이고 포괄적으로 해결할 수가 없다. 세포 자체의 기본적인 특성을 밝혀냄으로써, 본원에 기재된 방법 및 장치는 세포 특징화, 세포 분석 및 세포 검정을 위한 새로운 변수를 형성한다.

이러한 기술은 바람직하게는, 임의의 염료, 표지 또는 다른 마커 없이 살아있는 세포와 같은 입자의 내부 작용을 탐침하는 실제적인 접근법을 나타낸다. 세포의 "광영동 상수"는 그것이 분석되고 있는 정확한 순간에 세포의 생리적 상태를 특이적으로 반영하여 세포의 내부 작용을 연구할 수 있도록 한다. 이 기술들은 새로운 약물의 선별에서부터, 새로운 유전자의 발현을 연구하고, 새로운 진단 제품을 만들기까지, 심지어는 암 환자를 모니터링하는 것까지의 폭넓은 정보를 간단하고효율적으로 수집할 수 있게 한다. 이 기술은 이러한 독특한 광영동 변수에 기초한 특정 세포의 동시 분석 및 단리를 가능하게 한다. 다르게 말하면, 이 기술은 원자 수준에서의 그의 차이에 기초하여, 특정 입자, 예를 들면 세포를 동시에 분석하고 단리할 수 있다. 단독으로 사용하거나 현대의 분자 기술과 조합하면, 그 기술은 살아있는 세포의 전체 활성을 포함하는 복잡한 메카니즘을 특이적으로 확인가능한 변수와 결합하는 유용한 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 먼저 입자 집단을 제공하고, 물리적 공간 내의 입자 집단을, 가장 바람직하게는 일렬 배열로 편성하기 위해, 입자에 대해 이동하는 세기 프로파일로 입자를 조사하고, 이어서 현재 물리적으로 편성된 입자 집단에 대한 조사를 이동시켜 다른 광영동 특성을 가진 입자를 물리적으로 분리함으로써 입자를 동정, 특징화 및(또는) 분류하는 장치 및 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 2종 이상의 다른 입자, 예를 들면 적혈구 세포 및 백혈구 세포를 포함하는 입자의 집단은 입자 집단에 대해 서서히 이동되는 광선에 의해 조사된다. 입자는 그 집단이 정렬될 때까지 그 선과 함께 이동한다. 다음에, 입자 선은, 예를 들어 입자의 물리적 위치에 대해 조사 선을 빠르게 이동시킴으로써 입자에 대한 빛의 상대 운동의 영향을 받게 된다. 특정 입자들을 뒤에 남겨두기에 충분한 속도로 그 선을 입자로부터 멀어지게 이동시킴으로써, 입자의 효과적인 분리, 특징화 및(또는) 동정이 이루어질 수 있다. 선택적으로, 느린 초기 스캔의 방향은 입자가 정렬된 후의 더욱 신속한 스캔과 반대 방향이다.

또다른 면에서, 본 발명은 입자의 제1 물리적 위치를 관찰하는 단계, 선택적으로 입자가 광학력을 받도록 하기 위해 입자를 조사하는 단계, 입자의 제2 물리적 위치를 관찰하는 단계 및 광학력에 대한 입자의 반응에 적어도 부분적으로 기초하여 입자를 특징화하는 단계에 의해 입자를 특징화하는 방법에 관한 것이다. 특징화는 입자, 예를 들면 세포가 검출된 광영동 상수 또는 사인에 기초하는 특정 질병 상태를 갖는 것일 수 있다.

특징화가 다수 입자의 물리적 분리에 의해 또는 물리적 분리 없이 수행될 수 있지만, 입자를 분리하는 방법은 첫번째로 입자가 광학 구배력을 받게 하고, 두번째로 입자를 이동시키고 세번째로 목적하는 입자를 다른 입자와 분리하는 것으로 이루어질 수 있다. 입자는 추가의 광학력에 의해, 유체력에 의해, 전자기력에 의해 또는 필요한 분리를 일으키기에 충분한 임의의 다른 힘에 의해 다른 것과 분리될 수 있다. 분리는 입자의 격리 및 분류를 포함할 수 있다.

또다른 면에서, 본 발명은 입자를 전기역학적으로 이동시키고, 입자가 분류를 위한 광학력을 받게 하여 입자를 분석하는 방법을 포함한다. 전기역학력은 예를 들면, 전기삼투, 전기영동 및 유전영동을 포함할 수 있다.

특징화 및 분류를 위해 입자의 유전 양상을 이용하는 것 외에도, 본 발명의 특정 방법을 이용하여 입자의 유전 상수를 결정할 수 있다. 한가지 방법은 다른 유전 상수를 갖는 다수의 매질에서 입자가 광학 구배력을 받게 하고, 각종 매질에서 광학 구배력을 받을 때의 입자의 운동을 모니터링하고, 각종 매질에서의 상대 운동량에 기초하여 입자의 유전 상수를 결정하는 것으로 이루어진다.

또다른 방법은 그의 크기에 따라서 입자를 분류하도록 한다. 한가지 방법은입자에 광학 프린지 패턴을 적용하고, 입자에 대해 프린지를 이동시키는 단계를 포함하며, 여기서의 개선점은 크기가 다른 입자에 대해 차별 효과를 갖도록 프린지의 주기를 선택하는 것을 포함하는 것이다. 관련 방법은 광학력을 받을 때 입자 유연성에 기초하여 입자를 분류 또는 분리한다. 한 세트의 예시적인 방법은 비압축된 상태에서 입자 크기 미만의 프린지 간격으로 프린지를 갖는 광학 패턴을 입자에 적용하고, 입자를 함유하는 매질에 대해 프린지를 이동시키고, 그럼으로써 상대적으로 더 높은 유연성을 갖는 입자가 상대적으로 더 낮은 유연성을 갖는 것과 분리되도록 하는 것을 포함한다.

광학 구배력을 이용하는 것 외에, 시스템 및 방법은 광학 산란력을 단독으로 또는 다른 힘과 함께 사용할 수 있다. 광영동 장치에서의 한가지 분리 방법은 1개 이상의 입자를 제공하고, 입자에 빛을 가하여 입자 상에 산란력을 일으키고, 적어도 산란력에 대한 반응에 기초하여 입자를 분리하는 것으로 이루어진다.

시스템의 감도 및 식별력을 향상시키기 위한 각종 기술이 기재되어 있다. 예를 들면, 고감도의 배열은 입자 식별력의 감도를 향상시키도록 선택된 유전 상수를 갖는 매질에서 입자를 분리하고, 매질을 입자를 더 빠르게 분리시키는 유전 상수를 갖는 것으로 변화시킴으로써 제공될 수 있다. 감도를 향상시키기 위한 한가지 방법은 매질의 유전 상수를 입자의 유전 상수에 가깝도록 선택하는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 광학 유전 상수를 갖는 재료를 동정, 특징화, 선택 및(또는) 분류하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 입자를 표지하거나 달리 변형시키지 않고 입자를분류 또는 동정하기 위한 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 비하전된 또는 중성 입자를 분류하거나 특징화할 수 있는 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 입자를 원격 조작하여 연구 중의 시스템 오염을 감소시킬 수 있는 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 광학력과 다른 힘 사이의 간섭 없이 다른 힘과 함께 사용될 수 있는, 입자를 특징화, 이동 및(또는) 분류하기 위한 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명은 적어도 광학력 또는 광자력을 이용하여 재료를 선택, 동정, 특징화 및(또는) 분류하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 일반적으로 광학 유전 상수를 갖는 생체입자와의 상호작용을 위한 광학력의 용도로 간주되는, 생물학적 시스템에서 유용성을 갖는다.

관련 출원

본 출원은 2000년 11월 13일자로 출원된 미국 가출원 제60/248,451호 (발명의 명칭: "Method and Apparatus for Sorting Cells or Particles")의 우선권을 주장하는, 2001년 4월 27일자로 출원된 미국 출원 제09/843,902호 (발명의 명칭: "System and Method for Separating Micro-Particles")와 관련된, 2001년 4월 27일자로 출원된 미국 출원 제09/845,245호 (발명의 명칭: "Methods and Apparatus for Use of Optical Forces for Identification, Characterization and/or Sorting of Particles")의 일부 계속 출원인, 2001년 11월 14일자로 출원된 미국 출원 제09/993,377호 (발명의 명칭: "Methods and Apparatus for Generating and Utilizing a Moving Optical Gradient")의 일부 계속 출원이다. 상기 출원들은 본원에 전체적으로 참고로 인용되어 있다.

도 1은 집속 빔, 입자 및 빔의 세기의 단면을 나타내는, 선행 기술의 광학 집게 시스템에 대한 광학 세기 패턴의 도시이다.

도 2는 거울을 움직여서 가변 경로 길이를 이용하여 두 빔을 간섭시키기 위한 광학 시스템의 단면도이다.

도 3은 위상 변조기를 이용하여 경로 길이를 변화시키는, 두 빔 사이의 간섭을 이용하는 시스템의 개략도이다.

도 4는 위상 변조기에 의해 경로 길이를 조절할 수 있는 간섭계를 이용하는 광학 시스템의 단면도이고, 도 4A는 입자 부양을 위해 역전파 빔을 이용하는 대안적 광학 장치의 측면도이다.

도 5는 광로 길이를 변화시키기 위한 위상 변조기 및 간섭계를 포함하는 광학 시스템의 단면도이며, 시스템에 의해 발생된 파동 패턴의 사진을 포함한다.

도 6은 분리 조사 및 영상화 시스템을 이용하는 광학 시스템의 단면도이다.

도 7은 유체 시스템과 접하는 광학 시스템의 도시이다.

도 8은 이동 스캐닝 시스템을 이용하는 광학 시스템의 단면도이다.

도 9A 및 9B는 세기 패턴의 발생에 의한 마스크를 포함하는 광학 시스템의 단면도이다.

도 10은 기판 또는 지지체를 조사하는, 조명원 어레이의 측면도이다.

도 11A, 11B 및 11C는 본 발명의 예시적인 한 실시양태에서의 위치의 함수로서의, 각각 세기, 힘 및 전위 에너지의 그래프를 나타낸다.

도 12A는 중첩된 광학 패턴 및 제1 위치에 있는 두 입자를 나타낸다.

도 12B는 광학 패턴에 의한 조사 후에 제2 위치에 있는 입자들을 나타낸다.

도 12C는 광학 트랩에 있는 입자 B의 포획을 나타낸다.

도 13A, 13B 및 13C는 입자 분리 기술에 대한 거리의 함수로서의 전위 에너지의 그래프를 나타낸다.

도 14A 및 14B는 일차원적 입자 공급원으로부터의 입자 분류의 도시이고, 도 14A는 입자 흐름을, 도 14B는 유체 흐름에 운반되는 입자를 나타낸다.

도 15는 "T" 통로 분류 구조물의 평면도이다.

도 16은 "H" 분류 구조물의 평면도이다.

도 17은 "Y"형 분류 구조물의 평면도이다.

도 18은 "X" 통로 분류 구조물의 평면도이다.

도 19는 이차원적 분류 구조물의 사시도이다.

도 20은 다차원적 분류 구조물의 평면도이다.

도 21은 광학 구배 패턴을 형성하기 위한 반사 표면을 포함하는 다차원적 분류 구조물의 측면도이다.

도 22는 포획 구조물을 포함하는 분류 구조물의 측면도이다.

도 23은 재순환 경로를 포함하는 미세유체 시스템의 평면도이다.

도 24는 선택 또는 특징화에서 인자로서의 입자 변형성을 이용하는 입자 분석 시스템의 평면도이다.

도 25는 인자로서의 광학 구배 주기성에 대해 입자 크기를 이용하는 분류 또는 특징화 시스템의 평면도이다.

도 26은 분리를 위해 빛의 산란력을 이용하는 입자 분리 시스템이다.

도 27A는 산란력 스위치의 사시도이다.

도 27B는 산란력 스위치의 평면 측면도이다.

도 27C는 빔이 켜져 있는 산란력 스위치의 평면 측면도이다.

도 28은 가변 유전 상수를 가진 각종 유체 매질 내의 입자의 유전 상수를 결정하는 시스템의 개략도이다.

도 29는 입자 및 유전 매질 내의 입자를 분리하기 위한 빛의 세기 프로파일의 단면도이다.

도 30은 광학 집게 어레이의 사시도이다.

도 31은 헤모글로빈-O ₂ 흡수 스펙트럼에 대한 파장의 함수로서의 몰 흡광 계수의 그래프이다.

도 32는 이동 광학 구배장과 크기에 의해 입자를 분리하는 실험의 시간 경과별 사진을 나타낸다.

도 33은 표면 기능화에 의해 입자를 분리하는 실험의 시간 경과별 사진을 나타낸다.

도 34는 이동 광학 구배장을 거치는 입자의 이전, 이후 및 차이 사진을 나타낸다.

도 35는 각종 세포 유형의 경우, 실험에서 측정된 세포 백분율 대 이탈 속도의 그래프이다.

도 36은 미세채널 장치에서의 2종의 세포 유형의 분류 사진을 나타낸다. 1은 이동 광학 구배장에 연속해서 유입되는 적혈구 세포 및 백혈구 세포를 나타낸다. 2는 백혈구 세포가 이동 광학 구배장의 작용에 의해 아래쪽으로 이동하는 반면 적혈구 세포는 이동에서 이탈하였음을 나타낸다. 3 및 4는 적혈구 세포와 백혈구 세포가 별개의 채널로 계속 유동되어 분류가 완결됨을 나타낸다.

도 37A, B 및 C는 위상 1에서 입자 집단의 첫번째 스캐닝 (도 37A), 위상 2에서의 정렬된 입자 집단에 대한 조사의 이동 (도 37B) 및 위상 3에서의 입자의 분리 (도 37C)를 포함하는 스캐닝 방법의 단계를 나타낸다.

도 38은 도 37A, B 및 C에 나타낸 기술에 대한 빛의 세기 및 입자 위치의 일련의 그래프를 나타낸다.

도 39A는 라인 스캐닝 시스템에 사용하기 위한 성분들의 단면도를 나타내고,도 39B는 작동 공간의 평면도를 나타낸다.

도 40A는 하나 이상의 조사 선을 발생시키기 위해 굴절 광학 장치의 단면도이다. 도 40B는 도 40A의 배치의 평면도를 나타낸다. 도 40C는 하나 이상의 조사 선을 발생시키기 위한 주사 거울 배치를 나타낸다. 도 40D는 조사 공간의 평면도를 나타낸다.

도 41은 구역화된 샘플 영역의 평면도를 나타낸다.

도 42는 다중 조사 선을 갖는 샘플 영역의 평면도를 나타낸다.

도 43A, B 및 C는 도 37A, B 및 C에 묘사된 위상에 상응하는, 백혈구 세포 및 적혈구 세포의 효과적인 분리의 영상이다.

정의

다음 정의는 본원에 개시된 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.

"유전 상수"는 단위 전위 구배에 대해 단위 용적 당 저장된 정전 에너지를 결정하는 특성인 것으로 정의된다 (예를 들면, the New IEEE Standard Dictionary Of Electrical And Electronics Terms, ⓒ 1993).

"광학 유전 상수"는 광학 파장에서의 입자 또는 물질의 유전 상수이다. 일반적으로, 광학 파장 범위는 150 Å 내지 30,000 Å이다.

"광학 구배장"은 세기, 파장 또는 주파수, 위상, 분극 또는 광학 에너지와 관련된 기타 변수를 포함한 하나 이상의 변수가 가변적인 광학 패턴이다. 간섭계에 의해 발생될 때, 광학 구배장 또는 패턴은 광학 프린지장 또는 프린지 패턴, 또는 그의 변형으로 불리울 수 있다.

"이동 광학 구배장"은 공간 및(또는) 시간이 시스템의 다른 성분들, 예를 들면 동정, 특징화, 선택 및(또는) 분류될 입자 또는 물체, 매질, 일반적으로 입자와 접하는 유체 매질, 및(또는) 임의의 보유 또는 지지 구조물에 대해 이동하는 광학 구배장이다.

"광학 산란력"은 광자로부터 광학 에너지에 의해 조사되는 재료로의 운동량 전달에 의해 야기되는 입자 또는 물질에 가해지는 힘이다.

"광학 구배력"은 입자 또는 물체가, 입자와 그것이 위치되는 매질 사이의 유전 상수의 차를 기반으로 하는 힘을 받게 하는 것이다.

"광영동" 또는 "광영동의"는 일반적으로 입자에 대한 정보를 얻거나 또는 입자를 공간적으로 이동시키거나 또는 입자와 유용하게 상호작용하기 위해 광자 또는 광 에너지를 이용하는 것에 관한 것이다.

"광영동 상수" 또는 "광영동 사인" 또는 "광영동 지문"은 광학적 선택, 동정, 특징화 또는 분류를 위해 입자를 구별하거나 특징화하는 변수(들)에 관한 것이다.

"광학 집게"는 충분하게 높은 세기의 공간 내의 점으로 고도로 집속되는 빔을 갖는 광 기반의 시스템으로서, 산란력을 극복하기에 충분히 강한 구배력이 유전 입자를 최고 세기의 점쪽으로 끌어당기도록 한다. 가장 일반적으로, 레이저 빔은 높은 개구수의 현미경 대물렌즈를 통하게 되며, 빔은 대략 5,000 내지 20,000 Å, 더욱 일반적으로는 10,000 Å의 파장의 회절 제한된 스팟 크기를 갖는다. 일반적으로, 광학 집게는 촛점면 내에 2 ㎛ 이하, 일반적으로 약 1 ㎛의 빔 폭을 갖는다.

두 물체의 "분리"는 입자가 시간에 지남에 따라 일부 다른 기준 점 또는 물질로부터 상대적으로 공간적 이격되는 것이다.

"분류"는 2종 이상의 입자를 의미있는 방식으로 분리하는 것과 관련이 있다.

예시적인 장치의 설명

광학 성분 - 이동 광학 구배장의 발생

도 2-10은 제한되는 것은 아니지만, 이동 광학 구배장 패턴을 포함하는, 종종 프린지 패턴 또는 광학 프린지 패턴으로 불리우는 광학 패턴을 발생시키기 위한 각종 시스템을 설명한다. 이들 예시적인 실시양태는 제한하기 위한 것이 아니라, 예시적인 것으로서, 다른 장치를 이용하여 광학장 및 광학력을 발생시켜 본 발명의 목적하는 결과를 얻을 수 있다.

특정 실시양태의 논의에서 제기된 사항들은 일반적으로 다른 실시양태의 설명에 응용가능한 것으로 표시되지 않더라도, 응용가능한 것으로 고려될 수 있다.

시스템에 사용하기 위한 광원은 특정의, 일반적으로 목적하는 특성을 갖는다. 파장에 관해서 보면, 파장은 일반적으로 한가지 이상의 사항을 기준으로 선택될 것이다. 특정 응용에서, 세포와 같은 생물학적 물질에 대한 손상을 피하는 것이 바람직할 수 있다. 세포 성분, 대부분 물에 의한 흡수가 최소화되는 범위의 파장을 선택함으로써, 가열의 해로운 영향이 최소화될 수 있다. 약 0.3 ㎛ 내지 약 1.8 ㎛, 더욱 바람직하게는 실질적으로 0.8 ㎛ 내지 실질적으로 1.8 ㎛ 범위의 파장은 생물학적 손상의 감소를 돕는다. 그러나, 생물학적 응용의 경우에도, 에너지의 해로운 흡수가 일어나지 않는 단기간 동안 조사하는 경우와 같이, 일반적으로 생물학적 물질을 손상시키는 것으로 고려되는 파장을 갖는 레이저를 사용할 수 있다. 또다른 응용에서, 고려 중의 입자 또는 물체의 특성을 기준으로 파장을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 특별한 성질을 갖는 입자에 대해 가해진 힘을 증가 (또는 감소)시키기 위해 흡수 밴드에 있는 또는 부근에 있는 파장을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 파장 선택에 대한 또다른 사항은 기존의 기술, 또는 광원에 의해 자연 발생되는 파장과의 적합성일 수 있다. 한가지 예는 1.55 ㎛의 파장의 선택일 것이다. 1.55 ㎛ 파장 영역의 수많은 장치들이 시판되고 있으며 정보통신 응용에 대해 광범위하게 사용된다.

일반적으로, 광원은 간섭성 광원일 것이다. 가장 일반적으로, 간섭성 광원은 레이저로 이루어질 것이다. 그러나, 시스템이 목적하는 결과를 얻는데 필요한 힘을 발생시킬 수 있다면, 비-간섭성 광원도 이용될 수 있다. 라게르-가우스 (Laguerre-Gaussian) 방식의 레이저와 같은 각종 레이저 방식이 이용될 수 있다. 또한, 시스템 내에 1종 이상의 광원이 존재한다면, 이들 광원은 서로에 대해 간섭성이거나 비간섭성일 수 있다.

세기 패턴의 주기성 또는 스팟 크기는 효과적인 조사 결과를 최적화하도록 선택되는 것이 바람직하다. 많은 응용에서, 전체 입자 (세포)의 유전 특성이 결과의 힘에 기여하도록 호출될 입자, 예를 들면 세포에 대해 실질적으로 균일한 구배를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 광범위하게는, 그 범위는 입자 또는 물체의 크기 (직경 또는 평균 크기)의 실질적으로 1 배 내지 실질적으로 8 배로 가변적이며, 더욱 바람직하게는 그 범위는 크기의 실질적으로 2 배 내지 실질적으로 4 배이다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 각종 방법 및 시스템을 이용하여, 예를 들어 소정의 크기를 갖는 비집속 빔 또는 조준된 빔을 이용하여 소정의 스팟 크기 또는 주기성을 얻을 수 있다. 스팟 반경의 전형적인 특징화는 빔 세기의 1/e ² 반경이다. 세포적 응용을 비롯한 많은 응용의 경우, 빔 크기는 10 마이크론 정도일 것이지만, 종종 5 마이크론 정도로 작고, 심지어 다른 경우에는 2 마이크론 정도로 작을 것이다. 특정 응용에서, 입자 또는 물체의 크기 (직경 또는 평균 크기)의 실질적으로 1 배 내지 실질적으로 2 배 범위의 조사 주기성을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 많은 생물학적 응용의 경우, 실질적으로 5 ㎛ 내지 25 ㎛, 더욱 바람직하게는 10 ㎛ 내지 20 ㎛의 주기성을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 특정 응용에서는, 예를 들어 세균의 경우 더 작은 크기를 이용할 수 있으며, 예를 들어 더 큰 입자의 경우 더 큰 크기를 이용할 수 있다. 또다른 응용에서, 예를 들어 세포 이하 영역의 호출이 필요한 경우에는, 입자 또는 물체보다 작은 스팟 크기를 이용하는 것이 바람직할 수 있다.

아래에 기재된 세기 패턴을 형성하기 위한 시스템 뿐만 아니라 본 발명에 유용한 세기 패턴을 형성하기 위한 다른 시스템의 예로는 각종 광학 성분, 및 원하는 패턴, 세기 프로파일 또는 다른 구배, 예를 들면 이동 광학 구배장을 형성하기 위한 제어 시스템이 있다. 각종 광학 시스템은 본원에 기재된 방법을 효과적으로 수행하고 목적하는 결과를 얻도록 본 발명의 시스템에 사용하기에 적합할 수 있다.전체적으로 또는 부분적으로 적합할 수 있는 예시적인 시스템으로는 영의 (Young's) 슬릿, 마이컬슨 (Michelson) 간섭계, 마하-젠더 (Mach-Zender) 간섭계, 하이딩거 (Haidinger) 원형 프린지 시스템, 프레넬 (Fresnel) 거울 간섭계, 평행-평면판 간섭계, 패브리-페로 (Fabry-Perot) 간섭계 및 광학 구배 세기 패턴 또는 프린지 패턴을 형성하기 위한 임의의 다른 시스템이 있다.

이제 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 시스템의 상세한 설명에 대해서 살펴본다. 도 2는 시스템 (20)에 제공된 하나 이상의 입자에 힘을 제공하기 위해 이동 광학 구배장 패턴을 발생시키도록 구성된 시스템 (20)의 광학 성분을 나타낸다. 그후에, 광학력은 입자를 특징화, 동정, 선택 및(또는) 분류하는데 사용될 수 있다. 광원 (22), 바람직하게는 레이저는 빔 분할기 (26)쪽으로 향하는 제1 빔 (24)을 발생시킨다. 빔 분할기 (26)는 본 발명의 목표 및 목적과 일치하는, 프리즘 빔 분할기와 같은 당업계에 공지된 임의의 방식 또는 유형일 수 있다. 제1 투과 빔 (28)은 빔 분할기 (26)를 통과한다. 제1 반사 빔 (30)은 빔 분할기 (26)로부터 반사 표면 (32), 통상적으로 거울로 반사되어 제2 반사 빔 (34)을 발생시킨다. 제1 투과 빔 (28) 및 제2 반사 빔 (34)은 간섭하여 세기 패턴 (38)을 발생시키며, 이러한 세기 패턴은 일반적으로 빛이 당해 입자 또는 물체와 상호작용하는 곳인 슬라이드 또는 지지체 (36)의 작동 부분에 위치하게 된다. 광학 패턴 (38)은 제1 투과 빔 (28)과, 제1 반사 빔 (30) 및 제2 반사 빔 (34)의 조합 사이의 광로 길이의 변화에 의해, 다른 물체, 예를 들면 입자, 기판 및(또는) 입자를 함유하는 유체 매질에 대해 이동한다. 거울 (32)은 조작기 (40)에 의해 이동가능하다. 조작기 (40)의 한가지 예는 거울 (32)을 이동시키기 위해 모터 및 스크류 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들면 압전 시스템, 진동 거울 시스템 등과 같은, 거울 (32)을 이동시키기 위한 수많은 대안적 구조물이 당업계에 공지되어 있다.

도 3은 2-빔 간섭 기반의 시스템을 나타낸다. 레이저 (52)와 같은 간섭성 광원은 빔 분할기 (56)로 향하는 제1 빔 (54)을 발생시킨다. 제1 반사 빔 (58)은 샘플 판 (70)쪽으로 향하고 제1 투과 빔 (60)은 변조기, 예를 들면 위상 변조기 (62)로 향한다. 위상 변조기 (62)는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 유형일 수 있다. 위상 변조기 (62)는 제어 시스템 (64)에 의해 제어되며 거울 (74)로 향하게 되는 변조된 출력 빔 (66)을 형성하게 된다. 변조된 빔 (66)은 거울 (74)로부터 반사되어 샘플 판 (70)으로 향하게 되는 제2 반사 빔 (68)을 발생시킨다. 제1 반사 빔 (54) 및 제2 반사 빔 (68)은 샘플 판 (70)의 작동 계면에서 패턴 (72)을 형성한다. 제어 시스템 (64)은 패턴 (72)이 샘플 판 (70)과 같은, 시스템 (50) 내의 물체에 대해 이동하도록 위상 변조기 (62)에 연결된다.

도 4는 간섭계 시스템 (80)의 광학 성분을 나타낸다. 레이저 (82)와 같은 광원은 빔 분할기 (86)로 향하는 제1 광선 빔 (84)을 발생시킨다. 제1 거울 (88) 및 제2 거울 (90)로 이루어진 간섭계는 원하는 구배 특성을 비롯한 원하는 빔 특성을 갖는 출력 빔 (100)을 발생시킨다. 제1 빔 (84)은 빔 분할기 (86)를 통과하여 제1 거울 (88)로 향하는 제1 투과 빔 (94)을 발생시킨다. 반사된 빔은 빔 분할기 (86)로의 경로 (94)를 되돌아간다. 제1 반사 빔 (96)은 위상 변조기 (92)를 통과하여 제2 거울 (90)로 향하는 제1 변조 빔 (98)을 발생시킨다. 제2 거울 (90)로부터 반사된 빔은 위상 변조기 (92) 및 빔 (96)을 거쳐 빔 분할기 (86)로의 경로 (98)를 되돌아간다. 빔 (100)은 시스템 (80)의 간섭계 부분으로부터 출력되어 현미경 대물렌즈 (104)쪽으로 향한다.

대물렌즈 (104)는 샘플 판 (106)쪽으로 향한다. 선택적으로, 거울 (108), 가장 바람직하게는 평면 거울은 샘플 판 (106) 아래에 배치될 수 있다. 거울 (108)은 시스템 (80)의 분석 또는 작용하에 입자 또는 물체를 지탱하거나 함유하는 샘플 판 (106) 상에 반사된 빛을 제공하도록 배향된다. 초기에 샘플 판 (106)을 조사하면서 빔 (102)에 의해 야기되는 산란력은 거울 (108)로부터 반사된 복사선을 샘플쪽으로 다시 향하게 함으로써, 전체적으로 또는 부분적으로 상쇄될 수 있다. 아래의 표면 효과에 관한 부분에서 더 많이 논의되는 바와 같이, 반사광 및 상향 산란력은 구배력이 더욱 효과적으로 이용될 수 있도록 산란력의 전체 효과를 감소시킨다.

도 4는 선택적인 영상화 시스템을 포함한다. 대물렌즈 (104)로부터의 빛 (102)은 빔 분할기 (120)에 의해 반사되어 영상 광학소자 (112)쪽으로 향하게 되는 제3 반사 빔 (110)을 발생시킨다. 광학소자 (112)는 전하 결합 소자 (CDD) 검출기와 같은 검출기 (114) 상에 빛을 영상화한다. 검출기 (114)의 출력은 영상화 시스템 (116)에 제공될 수 있다. 영상화 시스템 (116)은 선택적으로 디스플레이, 예를 들면 모니터 (CRT, 평면 패널 디스플레이, 플라즈마 디스플레이, 액정 디스플레이 또는 당업계에 공지된 기타 디스플레이)를 포함할 수 있다. 영상화 시스템 (116)은 선택적으로 영상 개선 소프트웨어 및 영상 분석 소프트웨어, (테이프, 광학 메모리 또는 당업계에 공지된 기타 형태의 메모리에 대한) 기록 기능을 포함할 수 있다.

제어 시스템 (118)은 시스템 (80) 내에 원하는 광학력 패턴을 형성하도록 변조기 (92)를 제어한다. 선택적으로, 영상화 시스템 (116)은 제어 시스템 (118)에 결합될 수 있다. 피드백 시스템은 샘플 판 (106)에 대한 입자의 작용이 시스템 (116)을 통해 영상화되고 그후에 제어 시스템 분석에 이용되어 전체 시스템 (80)의 작동을 제어하도록 형성될 수 있다.

도 5는 간섭계 기반의 시스템 (120)을 나타낸다. 레이저 (122)와 같은 광원은 선택적인 공간 필터 (126)쪽으로 향하는 제1 빔 (124)을 발생시킨다. 공간 필터 (126)는 일반적으로 렌즈 (128) 및 공간 필터 개구 (130)를 포함할 것이다. 개구는 일반적으로 둥글다. 공간 필터는 레이저 빔을 조준하고 레이저 빔의 파면에 걸쳐 완만한 세기 프로파일을 나타내는 작용을 한다. 간섭계 (140)는 제1 거울 (146) 및 제2 거울 (144) 뿐만 아니라 빔 분할기 (142)를 포함한다. 위상 변조기 (148)는 간섭계 (140)의 두 아암 중의 하나에 배치된다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 거울 (132)은 빛을 광원 (122)으로부터 간섭계 (140)로 반사시키도록 선택적으로 배치된다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 광학 시스템은 시스템 전체에 빛을 전달하거나 향하게 하도록 설계된 임의 수 또는 방식의 성분들을 포함할 수 있다. 그러한 예 중의 하나는 단지 복사선을 하나의 주요 성분, 예를 들면 공간 필터로부터 다른 주요 성분, 예를 들면 간섭계 (140)로 향하게 하는 작용을 하는 평면 거울 (132)이다. 거울 이외에도, 다른 일반적인 전달 성분들은 섬유 광학소자, 렌즈, 빔 분할기, 확산기, 프리즘, 필터 및 성형 거울을 포함할 수 있다.

빔 (150)은 간섭계 (140)를 빠져나가고 대물렌즈 (152)쪽으로 향하고 샘플 판 (154)에서 또는 부근에서 영상화된다. 도시된 바와 같이, 색선별 거울 (170)은 빛 (150)을 반사하지만, 또한 복사선을 제공하는 섬유와 같은 공급원 (168)으로부터의 빛을 공급원으로부터 색선별 거울 (170) 및 대물렌즈 (152)를 거쳐 통과시켜 샘플 판 (154)의 작동 영역을 조사하게 하는 작용을 한다.

선택적으로, 검출 시스템은 샘플 판 (154)의 작동 부분을 영상화하도록 배치될 수 있다. 도시된 바와 같이, 대물렌즈 (156)는 샘플 판 (154) 아래에 배치되며, 출력 복사선은 거울 (158)을 거쳐 전하 결합 소자 (CCD)와 같은 영상화 장치 (164)로 전달된다. 선택적으로, 적외선 필터 (160)는 검출에 필요한 파장을 선택하기 위해 광로 내에 배치될 수 있다. 검출기 (164)의 출력은 영상화 시스템 (166)에 제공된다. 다른 도면과 관련지어 설명되는 바와 같이, 영상화 시스템 (166)은 영상 개선 및 영상 분석 소프트웨어를 포함하며 사용될 각종 방식의 디스플레이를 제공할 수 있다. 선택적으로, 영상화 시스템 (166)은 피드백에 사용될 때와 같이 제어 시스템 (172)에 결합된다.

도 6은 샘플 판 (194)의 상면측으로부터의 조사 및 하면측으로부터의 영상화를 수행하는 광학 시스템을 나타낸다. 레이저 (180)는 선택적으로 공간 필터 (184)를 통과하는 제1 빔 (182)을 발생시킨다. 도시된 바와 같은 공간 필터는 렌즈 (184) 및 개구 (188)를 포함한다. 공간 필터 (184)의 출력은 대물렌즈 (192)를통과하고 샘플 판 (194) 상에 영상화된다. 샘플 판 (194) 및 그 위에 지지된 재료는 대물렌즈 (196)를 거쳐 영상화될 수 있다. 선택적인 거울 (198)은 복사선을 선택적인 필터 (200)로 가서 영상화 렌즈 (202)를 거쳐 검출기 (204) 상으로 향하게 한다. 검출기 (204)는 영상화 시스템 (206)에 결합된다. 바람직하게는, 영상화 시스템 (206)은 시스템의 각종 광학 성분을 제어하는 제어 시스템 (208)에 정보를 제공한다.

도 7은 유계 구조물을 포함하는 샘플 판과 접하는 광학 시스템을 나타낸다. 시스템 (210)은 미세유체 채널을 선택적으로 포함하는 샘플 판 (212)을 포함한다. 다르게는, 샘플 판 (212)은 미세유체 채널을 함유하는 별개의 구조물을 지지할 수 있다. 미세유체 채널로부터 형성된 한가지 예시적인 구조물로서, 간단하지만 유용한 예에 대해 "T" 분류 장치가 도시되어 있다. 투입 저장소 (216)는 교차점 (220)에서 T로 종결되는 제1 채널 (218)에 연결된다. 제1 출력 채널 (222)은 제1 배출 저장소 (224)에 연결된다. 제2 배출 채널 (226)은 제2 배출 챔버 (228)에 결합된다. 도시된 바와 같이, 투입 챔버는 바닥에 결합되고 제1 배출 챔버 (224) 및 제2 배출 챔버 (228)는 -V에 연결되어 있다. 유체 채널 구조물은 아래에 더욱 상세히 논의된다.

현미경 대물렌즈 (232)는 광학 복사선을 샘플 판 (222)에 제공할 뿐만 아니라 시스템의 영상을 제공하는 작용을 한다. 레이저, 또는 더욱 상세하게는 레이저 다이오드와 같은 광원 (238)은 광학소자 (240)에 의해 영상화될 수 있는 빛을 발생시킨다. 색선별 빔 분할기 (236)는 복사선을 현미경 대물렌즈 (232)로 향하게 한다. 도시된 바와 같이, 대물렌즈는 100의 배율을 갖는다. 생물학적 응용의 경우, 1 내지 200의 배율 범위가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10 내지 100이 바람직하다. 대물렌즈 (232)는 1.25 개구수를 갖는다. 렌즈의 바람직한 개구수 범위는 0.1 내지 1.50이며, 더욱 바람직하게는 0.4 내지 1.25이다. 대물렌즈 (232)로부터의 출력은 빔 분할기 (236)를 통과하고, 선택적인 거울 (242)로부터 광학소자 (예를 들면, 렌즈) (244)를 거쳐, 선택적인 필터 (246)를 거쳐 영상화 장치 (280)로 반사된다. CCD로서 도시된 영상화 장치는 영상화 시스템 (282)에 연결된다. 영상화 시스템 (282)의 출력은 선택적으로 제어 시스템 (284)에 결합된다. 도시된 바와 같이, 제어 시스템 (284)은 광원 (238)에 뿐만 아니라 샘플 판 (212)에 연결된 이동 스테이지 (232)를 모두 제어한다.

도 8은 스캐닝 면 (260) 내에 세기 패턴을 형성하기 위한 시스템을 나타낸다. 레이저와 같은 간섭성 광원으로부터의 입력 빔 (262)은 시스템쪽으로 향하게 된다. 검류계 또는 공명 스캐너와 같은 제1 진동 성분 (264)은 입력 빔 (262)을 차단하고 일차 운동을 빔에 제공한다. 빔은 다중면 (270)을 함유하는 다각형 거울 (268)로 향하게 된다. 다각형 거울 (268)이 축 (272) 주위를 회전할 때, 빛은 스캐닝 면 (260)을 건너 지나간다. 렌즈 (274)는 빛을 스캐닝 면 (260) 내에 적절하게 영상화하기 위해 필요에 따라 제공된다. 선택적으로, 마스크 또는 다른 패턴 (276)은 스캐닝 면 (260) 내의 광학력을 변화시키기 위해 광로 내에 배치될 수 있다. 다각형 거울을 통해 진동 운동 또는 스캐닝을 발생시키기 위한 각종 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.

도 9는 광학력 패턴을 발생시키기 위해 마스크를 이용하는 시스템을 나타낸다. 레이저와 같은 광원 (280)은 마스크 (284)쪽으로 향하는 빔 (282)을 발생시킨다. 선택적으로, 위상 변조기 (290)는 광원 (280)과 마스크 (284) 사이에 배치될 수 있다. 선택적으로, 마스크 (284)는 예를 들면, 모터, 압전 구동 시스템, 미세전기기계적 (MEM) 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 구동 구조물일 수 있는 조작기 (286)에 의해 이동될 수 있다. 광학 마스크 (284)는 샘플 판 (288) 부근에 원하는 빛의 세기 패턴을 형성한다. 광학 마스크 (284)는 그곳을 통과하는 빛의 임의의 또는 모든 성분을 변조할 수 있으며, 이 성분에는 세기, 위상 및 분극이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 마스크 (284)는 사용되는 경우 간섭성 광을 반드시 필요로 하지는 않는 홀로그래픽 마스크일 수 있다. 다른 형태의 마스크, 예를 들면 공간 광 변조기가 광학 변수를 변화시키는데 이용될 수 있다.

또다른 거울 장치에는 미세거울 장치를 이용하는 것이 포함될 수 있다. 그러한 미세거울 구조물 중의 하나는 텍사스 인스트루먼트 디지탈 마이크로미러 제품에 이용되는 것과 같은 거울 어레이를 포함한다.

도 10은 다중 광원 (290)이 샘플 판 또는 표면 (294)쪽으로 향하게 되는 대안적 조사 시스템을 나타낸다. 각 광원 (290)은 제어 시스템에 의해 제어되며, 광원 (290)으로부터의 각종 출력 (292)은 지지체 (294)의 표면을 조사한다.

광원 어레이 (290)은 많은 방식으로 제작될 수 있다. 바람직한 구조물 중의 하나는 수직 공진 표면 발광 레이저 (VCSEL) 어레이다. VCSEL 어레이는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 VCSEL을 포함한 각종 레이저의 제어하에 광학 패턴을 발생시키는 작용을 한다. 마찬가지로, 레이저 다이오드 바아는 광원 어레이를 제공한다. 다르게는, 분리 광원이, 예를 들어 섬유 광학 결합을 통해 표면 (294)쪽으로 향하는 영역에 결합될 수 있다.

영상화 시스템은 시스템의 거울 영상화 이상의 기능을 할 수 있다. 광학 프린지의 세기, 크기 및 형태를 모니터링하는 것 외에, 그것은 보정과 같은 목적에 사용될 수 있다.

광학력

본 발명의 장치 및 방법은 빛에 의해 야기되는 입자에 대한 힘을 적어도 부분적으로 이용한다. 특정 실시양태에서, 광 패턴은 또다른 물리적 구조물, 입자 또는 물체, 입자 또는 물체를 함유하는 매질 및(또는) 입자 또는 물체 및 매질을 지지하는 구조물에 대하여 이동된다. 때로는, 이동 광학 구배장과 같은 이동 광학 패턴이 입자에 대해 이동한다. 일반적으로 약간의 점도를 갖는 매질을 통해 입자에 대하여 빛을 이동시킴으로써, 입자는 적어도 부분적으로 입자에 발휘되는 광학력을 기반으로 하여 분리되거나 특징화된다. 대부분의 설명이 다른 구조물에 대해 빛을 이동시키는 것으로 기재하고 있지만, 광 패턴을 정지된 상태로 유지하고 광학 패턴에 대해 대상 입자, 매질 및(또는) 지지체 구조물을 이동시킴으로써, 상대 운동이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

도 11A, 11B 및 11C는 각각 거리 (x)의 함수로서의 광학 세기 프로파일, 입자 또는 세포 상의 해당 광학력 및 광학 세기 프로파일에서의 입자의 해당 전위 에너지를 나타낸다. 도 11A는 하나 이상의 입자에 대하여 발생되어 적용되는 세기프로파일을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 세기는 비변조 또는 진동 방식으로 변화한다. 도시된 바와 같이, 세기는 균일한 주기성 및 대칭 파를 나타낸다. 그러나, 세기 변화는 대칭 또는 비대칭, 또는 임의의 목적하는 형태일 수 있다. 주기는 고정되거나 가변적일 수 있다. 도 11B는 위치의 함수로서 힘의 절대치를 나타낸다. 힘은 세기의 공간 도함수이다. 도 11C는 위치의 함수로서의 전위 에너지를 나타낸다. 전위 에너지는 거리 전체의 통합된 힘이다.

도 11A-11C의 프로파일은 일반적으로 사인꼴인 것으로 나타내어져 있다. 일반적으로, 그러한 패턴은 간섭 프린지로부터 형성된다. (세기, 힘 및 전위 에너지의) 프로파일을 차별화하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 전위 에너지 우물이 바닥에서 비교적 편평하고 가파른 측면을 갖거나, 그의 형태가 비대칭인 시스템을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

도 12A 및 12B는 "A" 및 "B"로 표시된 두 입자를 나타낸다. 도 12A에서는, 입자가 이차원적 세기 패턴 (300)에 의해 조사되는 것으로 나타내어져 있다. 도 12B는 세기 패턴이 위치 (302)로 이동한 후에 나중 시점에서의 입자 A 및 B의 위치를 나타낸다. 이 예에서, 광학력은 입자 B가 그의 이전의 위치에 비해 이동하도록 하였다. 입자 A에 대한 광학 패턴 (300)의 효과가 입자 B에 대한 것 보다 적으므로, 입자 A 및 B의 상대적인 위치가 도 12A와 도 12B에서 다르다.

시스템의 한가지 양태에서, 도 12A에서 입자 A 및 B의 위치가 확인될 것이다. 그 시스템은 원하는 구배장, 바람직하게는 이동 광학 구배장을 갖도록 조사될 것이며, 그후에 시스템은 도 12B에 도시된 바와 같이 나중 시점에서 영상화된다.운동의 부재, 또는 운동의 존재 (운동량, 운동 방향, 운동 속도 등)가 입자(들)를 특징화하거나 분석하는데 이용될 수 있다. 특정 응용에서, 그것은 특별한 광학 패턴에 대한 단일 입자의 반응을 확인하는데 충분할 수 있다. 따라서, 단지 입자가 특별한 방식으로 또는 특별한 양만큼 이동된다는 사실로부터 입자에 관한 정보가 유도될 수 있다. 그 정보는 다른 입자의 존재 또는 부재와 무관하게 얻어질 수 있다. 또다른 응용에서, 2종 이상의 입자를 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 그 경우에, 도 12A와 도 12B에서와 같이 서로에 대한 상대적인 입자의 위치를 비교함으로써, 입자에 관한 정보가 얻어질 수 있다. 논의할 목적으로, 입자 B가 원하는 입자인 것이 확인되면, 그 입자는 다른 입자로부터 분리될 수 있다. 도 12C에 나타낸 바와 같이, 광학 집게 세기 프로파일 (304)을 이용하여 입자 B를 포획하고 제거할 수 있다. 별법으로, 도 14-19와 관련하여 논의될 바와 같이, 선택된 입자는 다른 수단에 의해, 예를 들면 유체 수단에 의해 제거될 수 있다.

광학 유전 상수와 같은 입자의 특성을 이용함으로써, 광원은 특질이 다른 입자를 동정, 선택, 특징화 및(또는) 분류하는 작용을 한다. 하나 이상의 입자가 광학력에 대해 노출되면, 그 입자의 상태에 관한 정보가 제공될 수 있다. 입자를 다른 입자 또는 구조물로부터 분리할 필요가 없을 수 있다. 또다른 응용에서, 광학력의 적용은 입자 사이의 분리가 추가의 분리를 일으킬 수 있도록 하는 특징을 기반으로 하여 입자의 분리를 야기시킨다. 추가의 분리 방식은 임의의 각종 형태, 예를 들면 유체 분리, 기계적 분리, 예를 들면 기계적 장치 또는 다른 포획 구조물의 사용, 또는 임의로 도 12C에 나타낸 바와 같은 광학 집게의 사용, 이동 광학 구배의 적용, 또는 입자를 제거 또는 분리하는 임의의 다른 방식, 예를 들면 전자기, 유체 또는 기계적 방식에 의한 것일 수 있다.

도 13A, 13B 및 13C는 한가지 예시적인 작동 방식에 대한 거리의 함수로서의 전위 에너지를 나타낸다. 그 도면들은 서로에 대해 x 차원으로 놓여진 입자 1 및 입자 2를 나타낸다. 두 입자의 물리적 위치는 일반적으로 동일한 면에, 예를 들면 동일한 수직 면에 있을 것이다. 도면들은 입자의 전위 에너지를 나타낸다. 도 13A에서, 입자 1 (310)은 전위 에너지 프로파일 (314)을 형성하는 빛의 세기 패턴의 영향을 받는다. 입자 2 (312)는 동일한 빛의 세기 패턴의 영향을 받지만, 제2 전위 에너지 프로파일 (316)의 영향을 받는다. 입자 1 (310)과 입자 2 (312)의 유전 상수가 다르기 때문에, 제2 전위 에너지 프로파일 (316)과 제1 전위 에너지 프로파일 (314)은 상이하다. 전위 에너지 프로파일 (314, 316)이 오른쪽으로 이동할 때, 입자들 (310, 312)은 다른 힘을 받는다. 입자들에 인접한 화살표의 크기에 의해 표시되는 바와 같이, 입자 1 (310)은 입자 2 (312)에 비해 더 작은 힘을 받을 것이다. 입자들이 받는 힘은 전위 에너지의 공간 도함수에 비례한다. 따라서, 전위 에너지 "파"의 비교적 "더 가파른" 부분 위에 있는 입자 2 (312)는 더 큰 힘을 받을 것이다. 도 5A에서, 전위 에너지파의 이동 속도는 입자 1 (310)이 그것이 위치되어 있는 매질을 통해 전진 이동할 수 있는 속도보다 더 빠르게 설정될 수 있다. 그러한 경우에, 입자 1 (310)은 좌측으로 향하는 힘을 받을 수 있으며, 도 13A는 입자 1 (310)의 가능한 후진 또는 역행 운동을 도시하는 화살표를 나타낸다. 전위 에너지 우물은 전위 에너지 패턴 (314, 316)의 운동 또는 이동 없이 입자가가라앉는 최소점 (318)을 갖는다.

도 13B는 각각 제1 전위 에너지 (314) 및 제2 전위 에너지 (316)를 받는 입자 1 (310) 및 입자 2 (312)를 나타낸다. 전위 에너지 패턴 (314, 316)이 오른쪽으로 이동할 때, 입자 (310, 312)는 둘다 오른쪽이긴 하지만, 화살표의 상대적인 크기에 의해 묘사되는 바와 같이 다른 양의 힘을 받는다. 도 13C는 입자 1 (310)과 입자 2 (312) 사이에 전위 에너지 최대점이 놓여지도록 도 13B의 전위 에너지 프로파일이 이동된 후의 전위 에너지 프로파일 (314, 316)을 나타낸다. 세기 프로파일 (314, 316)을 전방으로 빠르게 홱 잡아당김으로써, 입자 1 (310)은 전위 에너지 "파"의 "뒷쪽"에 위치하여 좌측으로의 힘을 받을 것이다. 그후에, 운동 경로는 입자 1 (310)로부터의 점선 화살표로 표시된다. 대조적으로, 입자 2 (312)는 전위 에너지 파 (316)의 "앞쪽"에 남아있어 우측으로의 힘을 받는다. 이러한 배치는 입자 1 (310)과 입자 2 (312) 사이의 추가의 물리적 분리를 일으키는 효과를 나타낸다. 전위 에너지 프로파일 (314, 316)은, 전위 에너지 최대점이 분리될 입자 사이에 위치하도록, 또한 전위 에너지 파의 "뒷쪽"에 있는 입자가 전위 에너지 파의 "앞쪽"에 있는 입자로부터 멀어지게 이동되도록 하기에 충분히 빠르게 전진 이동하여야 한다.

도 37A, B 및 C는 입자를 동정, 특징화 및(또는) 분류하기 위한 기술의 시계열 묘사를 나타낸다. 도 37A에서, 입자 집단은 광선 빔, 바람직하게는 도 37A에서 레이저 빔으로 도시된 광선을 받는다. 조사 방향은 입자 집단의 면 내에 있다. 그 광선은 입자 집단에 대해 이동되어 입자 집단을 물리적으로 편성한다. 선택적으로, 빔은 원하는 모든 입자의 포획을 가능하게 하고 입자를 시스템 내의 원하는 위치로 이동하도록 하기에 충분히 느린 속도로 이동한다. 도 37B는 광선이 현재 물리적으로 정렬된 입자 선에 대해 이동되는 위상 2를 나타낸다. 선택적으로, 위상 1에서 입자에 대한 빛의 상대적인 방향은 한 방향이고, 위상 2에서는 반대 방향이다. 위상 2에서는, 광선이 비교적 빠른 단계적 이동으로 입자에 대해 이동된다. 이동 속도는 적어도 입자를 원하는 대로 분리할 만큼 충분히 빠르다. 더 큰 힘을 받는 입자들은 상 2에서 정렬된 입자의 물리적 위치로부터 선택적으로 이동된다. 도 37C는 적혈구 세포 (상대적으로 더 작은 어두운 타원으로 표시됨)로부터 효과적으로 분리되는 백혈구 세포 입자 (희미한 더 큰 입자로 표시됨)의 조사를 나타낸다.

도 38은 입자 집단에 대한 세기 및 그의 위치의 시계열 그래프이다. 빔 위치 1은 빔이 켜진 후 몇초 내의 세기 프로파일을 나타낸다. 때로는 입자가 세기 최대점으로부터 약간 벗어난 것으로 관찰되었다. 빔 위치 2는 위상 2로 불리우는 단계적 이동을 나타낸다 (도 37B). 알 수 있는 바와 같이, 백혈구 세포는 더 큰 구배력을 받아서, 백혈구 세포가 적혈구 세포보다 빔 위치 2의 말기에 물리적으로 더 많이 이동되는 결과가 생긴다. 빔 위치 3은 백혈구 세포가 다시 더 큰 구배력을 받아서 오른쪽으로 더 많이 이동하게 되는 이후의 이동 단계를 나타낸다. 빔 위치는 계속해서 우측으로 이동하므로, 세기 피크와 뒤에 남아있는 입자, 예를 들면 적혈구 세포 사이의 거리는 더 커지고, 따라서 입자에 의해 경험되는 구배력이 감소된다.

도 39A는 이 기술에 사용하기 위한 단일 라인을 형성하는 단면 배열을 나타낸다. 레이저는 원통형 렌즈를 거쳐 시스템쪽으로 향한다. 집속 광학소자는 본원의 다른 곳에 설명된 바와 같이 이용될 수 있으며, 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다. 도시된 CCD 영상화 시스템과 같은 영상화 시스템은 시스템으로부터의 정보를 획득한다. 광 패턴은 입자에 대하여 이동될 수 있거나, 다르게는 스테이지를 이동함으로써 입자가 빛에 대해 이동될 수 있다. 바람직하게는, 조사 선은 비교적 균일한 세기를 가지며, 그것은 예를 들면 렌즈의 곡률을 변화시킴으로써 얻어질 수 있다.

도 40A 및 40B는 하나 이상의 광선을 발생시키기 위한 대안적 배치 단면을 나타낸다. 회절 광학소자는 입사 빔을 받고, 광학소자를 통해 집속될 때 샘플 영역 내에 하나 이상의 광선을 발생시킨다. 도 40C 및 D는 하나 이상의 광선을 발생시키기 위한 또다른 대안적 배치를 나타낸다. 축이 비평행성인, 일반적으로 거울 면을 통하는 접근부 주위에서 진동하는 2개의 주사 거울을 이용하는 것과 같은 주사 거울 시스템은 하나 이상의 선을 발생시킨다. 일반적으로, 거울 중의 하나는 다른 거울보다 실질적으로 더 빠른 속도로 이동한다. 다중 주사 거울 시스템에 대한 대안, 예를 들면 목적하는 세기 패턴을 발생시키기 위한 음향/광학 소자가 이용될 수 있다.

도 41은 구역화된 샘플 영역의 평면도를 나타낸다. 도시된 바와 같은 샘플 영역은 4 x 4 어레이로서 배열된 16개의 서브영역으로 구역화되었다. 각종 구역은 개별적으로 호출될 수 있다. 일반적으로, 시판되는 광학소자를 이용하여 약 200마이크론 x 15 마이크론의 크기를 갖는 선들을 발생시킬 수 있다. 여기에 명시된 특정의 것에 제한되는 것은 아니지만, 선의 폭은 일반적으로 호출될 세포 또는 입자의 크기 정도이다. 도 41의 구역화된 샘플 영역을 이용함으로써, 비교적 더 짧은 선이 이용될 수 있고, 그 선은 더욱 선형이 된다.

도 42는 다중 선 분리 시스템의 평면도를 나타낸다. 타임라인 분리된 6개의 선들이 도시되어 있다. 일반적으로, 선 분리는 가장 인접한 선의 존재가 인접 입자에 실질적인 효과를 나타내지 않도록 선택된다.

본 발명의 장치 및 방법은 광학력을 단독으로 또는 추가의 힘과 함께 이용하여 입자들의 다른 성질 또는 특질을 기초로 하여 재료를 특징화, 동정, 선택 및(또는) 분류한다. 광학 프로파일은 정적이거나, 위치에 따라 가변적이긴 하지만 동적일 수 있다. 동적일 때, 구배력 및 산란력은 둘다 입자, 입자를 함유하는 매질, 입자 및 매질을 함유하는 지지 구조물에 대해 이동하도록 만들어질 수 있다. 이동 광학 구배장을 이용할 때, 운동은 일정한 속도 (속력 및 방향)로 이루어질 수 있거나, 선형 또는 비선형 방식으로 변화될 수 있다.

광학력은 다른 힘과 함께 이용될 수 있다. 일반적으로, 광학력은 다른 힘을 간섭하거나 다른 힘과 상충되지 않는다. 추가의 힘은 자기력, 예를 들면 영구 자석에 의해 발생되는 정적 자기력, 또는 동적 자기력일 수 있다. 추가의 전기력은 정전력과 같이 정적이거나, 또는 교류 전기장 하에 있을 때와 같이 동적일 수 있다. 교류 전자기장의 각종 주파수 범위는 일반적으로 다음과 같다: DC 주파수는 1 Hz 훨씬 미만이고, 가청 주파수는 1 Hz 내지 50 kHz이고, 무선 주파수는 50 kHz 내지 2 GHz이고, 마이크로파 주파수는 1 GHz 내지 200 GHz이고, 적외선 (IR)은 20 GHz 내지 400 GHz이고, 가시선은 400 THz 내지 800 THz이고, 자외선 (UV)은 800 THz 내지 50 PHz이고, x-선은 5 PHz 내지 20 EHz이고, 감마선은 5 EHz 이상이다 (예를 들면, Physics Vade Mecum 참조). 주파수 범위는 겹치며, 경계는 때로는 약간 다르게 정해지지만, 범위는 실질적으로 항상 동일하다. 유전영동력은 일반적으로 단일 Hz 내지 10 MHz 범위인 교류장에 의해 발생된다. 완전을 기하기 위해, 유전영동력은 특성상 더욱 정전적인 반면, 광영동력은 특성상 전자기적임에 주목한다 (즉, 주파수 범위의 비교는 단지 그들의 주파수 만이 다르다는 것을 암시하려는 것은 아니다). 중력이 광학력과 함께 사용될 수 있다. 장치를 정렬시킴으로써, 중력이 입자의 작용에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 채널은 상향 광학력이 발생된 경우와 같이 입자에 대해 하항력을 제공하기 위해 수직 방향으로 배치될 수 있다. 중력은 입자의 부력을 고려한다. 채널이 수평 방향으로 배치될 때, 다른 힘, 예를 들면 마찰력이 존재할 수 있다. 유체력 (또는 유체소자 공학)이 광학력과 함께 유리하게 이용될 수 있다. 초기 입자 분리를 실시하기 위해 광학력을 이용함으로써, 유체력이 입자를 더 분리하기 위한 메카니즘으로서 이용될 수 있다. 또다른 추가의 힘으로서, 기타 광학력이 입자를 향하여 가해질 수 있다. 상기의 임의의 또는 모든 추가적인 힘이 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 추가로, 힘은 순차적으로 이용되거나 동시에 적용될 수 있다.

도 14A 및 14B는 일차원적 공급원으로부터의 입자 또는 물체의 분류를 나타낸다. 도 14A에 나타낸 바와 같이, 입자 (320)는 화살 표시된 입자 흐름 방향으로일반적으로 공급원으로부터 아래쪽 방향으로 진행한다. 입자는, 접점 (322)에서 또한 아마도 추가로 접점 (322) 전에 광학 분리력을 받는다. 다른 유전 상수와 같은 다른 반응 특성을 갖는 그 입자들은 입자 선으로부터 분리되어 분리된 입자 (326)를 형성하게 된다. 분리되지 않은 입자들은 입자 (324)로서 계속 남아있다. 도 14B는 일차원적 공급원으로부터의 광학 세포 분류를 나타낸다. 세포 (330)는 화살표로 나타낸 바와 같이 상부에서 하부 방향으로의 유체 흐름 내에서 이동한다. 세포 (330)는 접점 (332) 영역에서 광학력을 받는다. 선택된 세포 (336)는 원래 유체 흐름의 경로에서 벗어난다. 남아있는 입자들 (334)은 원래 유체 흐름과 동일한 방향에 계속 남아있다. 본원에 사용된 용어 "선택된" 또는 "비선택된" 또는 유사한 전문용어는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것을 의미함을 이해할 것이다.

본 발명의 기술은 안내되지 않은, 즉 균질한 환경 또는 안내된 환경에서 이용될 수 있다. 안내된 환경은 선택적으로 미세채널을 비롯한 채널, 저장소, 스위치, 처리 영역 또는 기타 소포와 같은 구조물을 포함할 수 있다. 시스템의 표면은 균일하거나 또는 불균질할 수 있다.

도 15는 채널을 포함한 안내된 구조물의 평면도를 나타낸다. 입력 채널 (340)은 매질 내에 함유된 입자 (342)를 수용한다. 광학력은 영역 (344)에 가해진다. 광학력은 바람직하게는 이동 광학 구배장에 있을 것이다. 입자들 (342)이 구배장 (344)을 통해 이동할 때, 특정 입자들은 입자 (346)로서 도시된 바와 같이 채널에서 우측으로 이동하도록 하는 힘을 받을 것이지만, 다른 입자들 (348)은 T 채널의 좌측으로 이동할 것이다. 속도, 배향, 주기성, 세기 및 광학력 구배의 기타변수를 선택함으로써, 입자들은 효과적으로 분리될 수 있다.

채널은 기판 내에 형성되거나 일부 지지체 또는 기판 상에 형성될 수 있다. 일반적으로, 채널의 깊이는 입자의 실질적으로 1 내지 실질적으로 2 직경 정도일 것이다. 많은 생물학적 세포 분류 또는 특징화 응용의 경우, 깊이는 10 내지 20 ㎛ 정도일 것이다. 채널의 폭은 일반적으로 입자의 실질적으로 2 내지 실질적으로 8 직경 정도일 것이며, 이로써 입자 직경 정도의 폭을 가진 광학 구배 최대치를 하나 이상에서 입자 직경 정도의 폭을 가진 광학 구배 최대치를 4 이상까지 갖게 된다. 많은 생물학적 세포 분류 또는 특징화 응용의 경우, 폭은 20 내지 160 ㎛ 정도일 것이다. 채널은 다양한 형태, 예를 들면 수직 벽을 가진 직사각형 채널 구조물, 교차 비-평면 벽을 가진 V-형 구조물, 반원형 또는 타원형 채널과 같은 곡선형 구조물을 가질 수 있다. 채널, 또는 채널이 그 안에 형성되는 기판 또는 기저부는 각종 재료로 제조될 수 있다. 예를 들면, 규소 탄성체 (예를 들면, PDMS), 겔 (예를 들면, 아가로오스 겔) 및 플라스틱 (예를 들면, TMMA)과 같은 중합체, 및 기타 재료, 예를 들면 유리 및 실리카가 사용될 수 있다. 특정 응용의 경우, 임의로 투명한 지지체 재료를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 표면은 하전되거나 비하전될 수 있다. 표면은 그것과 접하여 놓여질 재료와 상용성인 특성을 가져야 한다. 예를 들면, 생물학적 상용성을 가진 표면이 생물학적 어레이 또는 다른 작업에 사용되어야 한다.

일반적으로 유체 내에 포함된 입자가 시스템 내에서 이동되도록 하는데 각종 형태의 동력이 사용될 수 있다. 전기삼투력이 이용될 수 있다. 당업계에 공지된바와 같이, 벽 또는 채널의 각종 코팅은 전기삼투 효과를 증가 또는 억제하는데 이용될 수 있다. 전기영동은 시스템을 통해 재료를 운반하는데 이용될 수 있다. 시스템의 입구 및 출구에 걸쳐 압력 차이가 전해지는 펌핑 시스템이 이용될 수 있다. 시스템을 통해 재료가 이동되도록 하는 모세관 작용이 이용될 수 있다. 중력 급송이 이용될 수 있다. 마지막으로, 회전자, 미세펌프, 원심분리기와 같은 기계 시스템이 이용될 수 있다.

도 16은 입자를 분류하기 위한 "H" 채널 구조물을 나타낸다. H-형 구조물은 2개의 입구 및 2개의 출구를 갖는다. 입구 (350)는 유체 및 분류될 대상 입자 (352) 둘다를 수용한다. 유체는 H 채널의 제2 투입 아암 내에 투입된다. 주요 또는 연결 채널 (356)은 양쪽 투입부로부터의 유체 흐름을 수용한다. 연결 채널 (356)에서, 입자 (354)는 연결 채널을 통해 흐르고 광학 분류력 (358)을 받을 것이다. 이 단계에서, 입자들은 입자의 유전 상수와 같은 구별되는 변수를 기반으로 하여 분리된다. 일차 흐름으로부터 이동되고 있는 입자들은 입자 (360)로서 한 배출부로 이동한다. 광학력 (358)의 작용에 의해 전환되지 않은 입자 (362)는 좌측 출구 (364)에 계속 남아있다. 시스템 내의 층류는 입자 (354)가 주요 채널 (356)을 통해 이동하도록 하며, 채널 폭이 충분히 크다면 입자 (354)가 투입부에 더 가까운 벽에 비교적 가까이 흐르도록 할 것이다. 그후에, 분류 공정은 입자를 좌측벽에 인접한 층류로부터 우측 배출부로 전환될 층류로 전환시키는 것으로 이루어진다.

도 17은 입자 분리를 위한 폭넓은 채널 구조물을 나타낸다. 투입부 (370)는유체 매질 내의 입자 (372)를 수용한다. 입자는 광학 분류력 (374)을 받아서, 전환된 입자 (378)는 출구 (382)쪽으로 흐르고 입자 (376)는 출구 (380)쪽으로 흐른다.

도 18은 분류를 위한 X-채널 구조물을 나타낸다. 투입부 (390)는 유체 매질 내의 입자 (392)를 수용한다. 제2 투입부 (394)는 유체를 수용한다. 입자 (392)는 그후에 광학 분류력 (396)을 받는다. 전환된 입자 (402)는 출구 (404)로 흐른다. 입자 (398)는 출구 (400)로 흐른다.

도 19는 이차원적 분류 시스템의 사시도이다. 세포 (410)의 유입원은 선 (412)을 따라 광학 분류력과 교차한다. 분류력 (412)은 일차원에서, 일반적으로 한 평면에서 표적 세포 (414)의 유출을 일으키고, 다른 면에서 비-표적 세포 (416)의 유출을 일으킨다. 표적 세포 (414)의 유출 면은 비-표적 세포 (416)의 유출면과 동일면이 아니다.

도 20은 삼차원적 세포 분류 배치를 포함하는 배치를 나타낸다. 용적 (420), 가장 바람직하게는 실질적으로 삼차원적 용적은, 효과가 낮은 차원성의 용적이긴 하지만 입자 (422)를 함유한다. 광학력 구배 (428)는 용적 (420) 내에서 발생되어 입자 분류를 실시한다. 광학 구배장 (428)을 발생시키기 위한 한가지 실시양태는 제1 빔 (424)과 제2 빔 (426)을 간섭시키는 것이다. 제1 빔 (424) 및 제2 빔 (426)은 간섭하여 힘의 패턴 (428)을 발생시킨다. 도시된 바와 같이, 제1 입자 (430)는 하부에서 상부 방향으로 힘을 받는 반면, 제2 입자 (432)는 상부에서 하부로 힘을 받는다. 다르게는, 광학 패턴 (428)은 동일한 방향이지만, 힘의 양은다르게 입자 (430, 432)에 대해 힘을 일으킬 수 있다.

도 21은 다 자유도, 바람직하게는 3 자유도를 갖는 실시양태를 나타낸다. 용적 (440)은 거울 (450)의 내측으로 배치된 표면 부근에서, 표면에 인접하여 배치된 입자 (442)를 함유한다. 표면에 있는 입자 (446) 중 선택된 것이 입자 (446)와 같이 용적 (440) 내로 이동되도록 하는 광학 구배력 (444)이 발생된다. 광학력 구배 (444)는 광학 빔 (448)을 거울 (450) 위로 비추어서 빔 (448)과 그의 반사된 빔 사이에 간섭을 일으킬 수 있다.

도 22는 용적 (450)이 입자들을 분리하는데 이용되는 다차원적 시스템을 나타낸다. 제1 입자 (452)는 슬라이드 (454)의 표면에 인접하여 배치된다. 빛의 세기 패턴 (456)은 선택된 입자의 전위를 일으킨다. 그후에, 전위된 입자는 점착성 또는 접착성 매트 (460)에 부착될 수 있으며, 입자 (458)를 포함하게 된다.

도 23은 분류, 특징화 또는 분급을 위한 복합 채널 기반 시스템의 평면도를 나타낸다. 투입물 (470)은 채널 (472)을 거쳐 제1 광학 분류 영역 (474)으로 유도된다. 주어진 채널에서의 분류는 전에 설명된 바와 같다. 배출물 분류로 제1 세트 입자 (478) 및 제2 세트 입자 (476)가 형성된다. 제1 세트 입자 (478)는 제2 광학 분류 영역 (480)으로 흐른다. 앞에서와 같이, 입자들은 제1 입자 (484) 및 제2 입자 (482)로 분류된다. 다음 광학 분류 영역 (486)에서 분류된 입자가 배출되고 그후에 제1 배출 (488) 및 제2 배출 (490)이 추가로 수집, 집계 또는 분석된다. 한 면에서, 복합 시스템은 하나 이상의 순환 또는 피드백 탭 (490)을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 광학력 영역 (492)으로부터의 배출은 배출 (7) 뿐만아니라 채널 (472)에 결합되는 투입부 (496)로 유도되는 재순환 경로 (494)를 포함한다. 그러한 재순환 시스템은 농축 시스템에 사용될 수 있다.

본원에 기재된 시스템, 및 특히 더욱 복잡한 시스템은 추가의 각종 구조물 및 기능성을 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 센서와 같은 센서는 각종 채널, 예를 들면 채널 (742)에 인접하여 위치될 수 있다. 용량식 센서, 광학 센서 및 전기 센서를 비롯한 각종 유형의 센서가 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 복합 시스템은 원료 또는 수집 재료를 위해 사용되거나, 또는 중간 보유 저장기로서 사용되는, 각종 보유 용기 또는 소포를 더 포함할 수 있다. 복합 시스템은 증폭 시스템을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 증폭 시스템이 그 시스템 내에 이용될 수 있다. 당업계의 숙련자에게 공지된 다른 선형 또는 지수의 생물학적 증폭 방법이 통합될 수 있다. 복합 시스템은 검정 또는 다른 검출 방식을 더 포함할 수 있다. 계수기가 시스템 내에 통합될 수 있다. 예를 들면, 계수기는 배출을 통해 흐르는 입자 또는 세포의 수를 기록하기 위해 배출부에 인접하여 배치될 수 있다. 본 발명의 시스템은 미세전기기계적 (MEM) 기술과 함께 사용가능하다. MEM 시스템은 예를 들어, 스위치, 펌프 또는 기타 전기 또는 기계적 장치의 발동 작용을 위해 마이크로 크기의 전기 및 기계적 장치를 제공한다. 시스템은 미세채널 위에 유동 셀 또는 커버 슬립과 같은 각종 보유 구조물을 임의로 포함할 수 있다.

컴퓨터화된 워크스테이션은 활성 유체공학에 의한 소형화 샘플 스테이션, 레이저 (예를 들면, 생물학적 응용을 위한 근적외선 레이저)를 포함하는 광학 플랫폼 및 데이타 분석과 해석을 위한 필수 시스템 하드웨어를 포함할 수 있다. 그 시스템은 전체 컴퓨터 제어되는 실시간 분석 및 시험을 포함할 수 있다.

본원의 발명은 단독으로, 또는 다른 세포 분리 방법과 함께 사용될 수 있다. 세포 분리 및 분석을 위한 현재의 방법으로는 유세포 분석, 밀도 구배, 항체 패닝법, 자기 활성화 세포 분류법 ("MACS ^TM "), 현미경 검사, 유전영동법 및 각종 생리학적 및 생화학적 검정법이 있다. MACS 분리는 작은 세포 집단 만을 연구 대상으로 삼으며 유세포 분석 순도를 달성하지 못한다. 형광 활성화 세포 분류 ("FACS ^TM ")로서 공지된 유세포 분석법은 표지화를 필요로 한다.

또다른 면에서, 본 발명의 시스템은 샘플 제조 단계 및 그것을 수행하기 위한 구조물을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들면, 샘플 제조는 이후의 광학 분류를 위해 균일한 크기, 예를 들면 반경, 입자를 얻는 예비 단계를 포함할 수 있다.

시스템은 일회용 성분을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들면, 설명된 채널 구조물은 분리가능한 일회용 판에 형성될 수 있다. 일회용 성분은 일반적으로 제어 전자공학, 광학 성분 및 제어 시스템을 포함하는 대형 시스템에 사용하기에 적합할 것이다. 유체 시스템은 부분적으로 일회용 성분 뿐만 아니라 비-일회용 시스템 성분에 포함될 수 있다.

도 24는 변형성과 같은 물체의 물리적 변수를 기준으로 하는 광학 분류 시스템을 나타낸다. 광학 구배 (500)는 입자 (502, 504)를 조사할 수 있다. 입자 (504)는 입자 (502)보다 더욱 변형성이다. 결과적으로, 광학력 패턴 (500)의 주기성이 제공되면, 변형성 입자 (504)는 상대적으로 더 큰 힘을 받을 수 있으며, 광학장 (500) 하에서 더 많이 이동한다. 바람직하게는, 광학장 (500)은 이동 광학 구배장이다. 별법으로, 입자 (502, 504)는 광학력 (500)을 받을 수 있으며, 입자 (502, 504)의 구조가 모니터된다. 이러한 식으로, 광 패턴 (500)에 상대적인 입자의 변형성을 관찰함으로써, 입자는 동정, 분급 또는 분류될 수 있다.

도 25는 크기를 기준으로 한 입자의 분류 방법을 나타낸다. 광학 세기 패턴 (510)은 더 큰 입자 (512) 및 더 작은 입자 (514)를 조사한다. 다른 크기의 입자들 (512, 514)은 다른 힘을 받는다. 예를 들어, 더 큰 입자 (512)가 광학 구배 (510)의 2개 이상의 세기 피크에 걸쳐 있다면, 입자는 그것에 가해진 순 힘을 갖지 않을 수 있다. 대조적으로, 광학 세기 패턴 (510)의 주기보다 더 작은 크기를 갖는 더 작은 입자 (514)는 상대적으로 더 큰 힘을 받을 수 있다. 분류될 입자 크기에 대해 광학 패턴 (510)의 주기를 선택함으로써, 시스템은 크기 기준으로 효과적으로 분류할 수 있다. 한 방법에서, 한 세트의 입자들은 더 작은 입자가 먼저 제거되고, 이어서 상대적으로 더 큰 입자가 나중에 제거되도록 빛의 세기의 증가하는 주기에 놓여질 수 있다. 이러한 식으로, 입자들은 크기에 의해 효과적으로 분류될 수 있다.

힘을 감소 또는 변화시키는 방법

시스템 및 방법은 힘을 감소 또는 변화시키는 각종 기술을 포함할 수 있다. 특정 힘은 특정 응용에서 바람직할 수 있지만, 다른 응용에서는 바람직하지 않을 수 있다. 바람직하지 않은 힘을 감소 또는 최소화하는 기술을 선택함으로써, 바람직한 힘은 원하는 입자 또는 상태를 더욱 효과적으로, 민감하게 또한 특이적으로분류 또는 동정할 수 있다. 입자의 브라운 운동은 특정 응용을 위해 바람직한 상태일 수 있다. 시스템을 냉각시킴으로써 브라운 운동량이 감소될 수 있다. 시스템 자체가 냉각되거나, 유체 매질이 냉각될 수 있다.

특정 응용에서 불필요할 수 있는 또다른 힘은 마찰 또는 다른 형태의 점착력이다. 표면 효과가 최소화된다면, 각종 기술이 이용될 수 있다. 예를 들면, 역전파 빔 배치를 이용하여 입자를 포획하고 불필요한 표면과의 접촉에서 이동시킬 수 있다. 다르게는, 입자들은 예를 들어, 반사된 빛을 사용함으로써 부양될 수 있다 (예를 들면, 도 4, 거울 (108) 참조). 도 4A는 입자 부양을 위한 대안적 배치를 나타낸다. 2개의 역전파 광학 빔의 대향력은 입자를 부양시켜 표면 마찰 항력을 감소시키는데 사용될 수 있다.

세포 및(또는) 입자의 이동성을 저해할 수 있는 마찰, 정지마찰, 정전 및 기타 표면 상호작용을 해결하기 위한 또다른 기술이 존재한다. 예를 들면, 표면은 마찰 및(또는) 접착력을 완화시킬 수 있는, 공유 또는 비공유 화학을 이용하여 처리될 수 있다. 표면은 더 양호한 출발 표면을 제공하기 위해 예비처리될 수 있다. 그러한 예비처리법으로는 플라즈마 에칭 및 세정, 용매 세척 및 pH 세척을 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 표면은 또한 마찰 및 접착력을 억제 또는 최소화하는 제제로 기능화될 수도 있다. 단일 단계 또는 다단계, 다층 화학이 이용될 수 있다. 예로써, 표면을 소수성으로 만드는 플루오로실란이 단층 배열에 이용될 수 있다. 2단계, 2층 화학은, 예를 들면 아미노프로필실란이고, 다음에 카르복시-PEG일 수 있다. CYTOP ^TM 또는 파릴렌 ^TM 과 같은 테플론 형식의 코팅 시약이 사용될 수도 있다. 특정 코팅은 표면 불규칙성을 감소시키는 추가의 이점을 가질 수 있다. 특정 경우에, 작용기를 기판 자체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 고분자 기판은 작용성 단량체를 포함할 수 있다. 또한, 표면은 다른 촉발인자에 대해 반응성인 표면을 제공하도록 유도화될 수 있다. 예를 들면, 유도화된 표면은 전기장과 같은 외력에 대해 반응할 수 있다. 다르게는, 표면은 그들이 친화력 또는 다른 상호작용을 통해 선택적으로 결합하도록 유도화될 수 있다.

표면 상호작용을 감소시키는 또다른 기술은 세포 또는 입자가 계면에서 유지되게 하는 2상 매질을 이용하는 것이다. PEG-덱스트란과 같은 그러한 수성 중합체 용액이 2상으로 분배된다. 세포가 층 중의 하나로 선택적으로 분배된다면, 광학 구배 하에서 세포는 계면에서 효과적으로 유동될 것이다.

유전 상수를 증가 또는 변화시키는 방법

임의로, 본 발명의 장치 및 방법에 적용되는 입자는 표지 또는 비표지될 수 있다. 표지된다면, 그 표지는 전형적으로 입자 또는 새로운 입자의 유전상수를 변화시키거나 유전상수에 영향을 주는 것일 것이다 (즉, 초기 입자 및 표지는 하나의 새로운 입자로서 작용할 것이다). 예를 들면, 금 표지 또는 다이아몬드 표지는 입자의 가장 전형적인 유전 상수를 효과적으로 변화시킬 것이다.

또다른 시스템은 유전 상수의 명백한 변화를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 유전자 서열은 존재할 수 있거나, 또는 발현될 때 세포 또는 시스템의 유전 상수를변화시키는 발현가능한 단백질 또는 다른 재료를 함유하도록 변형될 수 있다. 매질의 유전 상수를 조정하는 또다른 방법은 온도를 변화시키거나, 전기장을 인가하거나, 광학장을 인가함으로써 유전 상수를 변화시킬 수 있는 유체 챔버 내에 단일 매질을 갖는 것이다. 다른 예로는 매질을 수용성 액정, 나노입자, 양자 점 등과 같은 고도의 복굴절 분자로 도핑하는 것이다. 복굴절 분자의 경우에, 광학 빔이 나타낼 굴절율은 전기장의 진폭 및 방향을 변화시킴으로써 조절될 수 있다.

감도를 증가시키는 방법

일정한 세기 구배를 위해 입자에 대한 힘을 최대화하는 것은 입자와 매질 사이의 유전 상수의 차이가 최대화되어야 함을 제시한다. 그러나, 감도가 응용에 필요할 때, 매질은 그의 유전 상수가 분류될 입자(들)의 유전 상수에 가까운 것으로 선택되어야 한다. 예로서, 분류될 입자 집단이 1.25 내지 1.3 범위의 유전 상수를 갖는다면, 그 범위에 가까운 (또는 심지어는 그 범위 내에 속하는) 유전 상수를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 세포의 경우, 유전 상수의 전형적인 범위는 1.8 내지 2.1일 것이다. 10% 이내의, 또는 더욱 특별하게는 5% 이내의 유전 상수가 유리할 것이다. 입자 집단에 대한 힘의 크기의 절대값은 유전 상수가 매질의 유전 상수와 현저하게 다른 경우에서보다 적을 수 있긴 하지만, 입자의 결과 운동의 차이는 매질의 유전 상수가 집단 내의 입자의 유전 상수의 범위에 가까울 때 더 클 수 있다. 처음에는 이 기술의 증가된 감도를 이용하지만, 일단 분리가 시작되면, 매질의 유전 상수를 입자 또는 입자 집단의 유전 상수와 더욱 실질적으로 차이나게 변화시킴으로써 힘이 증가될 수 있다. 언급한 바와 같이, 매질의 유전 상수가 입자 집단의 유전 상수의 범위 내에 들도록 선택할 수 있다. 그 경우에, 매질의 유전 상수 이상의 유전 상수를 갖는 입자는 한 방향으로 힘을 받을 것이지만, 매질의 유전 상수 미만의 유전 상수를 갖는 입자는 반대 방향으로 이동하는 힘을 받을 것이다.

산란력 시스템

입자의 분리를 위해 산란력을 단독으로 또는 이동 광학장 구배에 의해 공급되는 바와 같이 광학 구배력과 함께 이용할 수 있다. 도 26은 광학 빔을 조준하는 레이저 (520) 및 렌즈 (522)를 포함하는 시스템의 이전과 이후의 도시를 나타낸다. 모세관 (524)은 바람직하게는 그의 축을 따라서 조사된다. 한 세트의 입자, 제1 입자 (526) 및 제2 입자 (528)은 광선 빔에 의해 조사되며 그의 다른 산란 특성에 따라서 다른 산란력을 받는다. 두번째 도면에 도시된 바와 같이, 제1 입자 (526')는 다른 힘 때문에 제2 입자 (528')보다 더 짧은 거리를 이동한다. 이러한 식으로, 광학력, 특히 광학 산란력이 입자를 분리하는데 이용될 수 있다.

도 27A, 28B 및 27C는 산란력 스위치를 도시한다. 제1 투입부 (530)는 채널을 통해 제1 배출부 (536)에 결합한다. 제2 투입부 (532)는 채널을 통해 제2 배출부 (538)에 결합한다. 두 채널은 그들 사이의 유체 연결을 제공함으로써 겹쳐진다. 작동 시에, 투입부 1 (530)에 유입되는 입자는 산란력 스위치 (540)에 의해 투입부 1 (530)에 결합된 채널로부터 배출부 2 (538)를 함유하는 채널로 입자를 편향시킴으로써 전환될 수 있다. 산란력 스위치는 광학 구배력 시스템, 특히 본원에 기재된 이동 광학 구배력과 함께 이용될 수 있다.

정적 시스템

도 28은 입자의 유전 상수의 측정 시스템을 나타낸다. 유전 상수를 갖는 입자 (558)는 다른 유전 상수를 갖는 다른 매질에 놓여질 수 있다. 도시된 바와 같이, 제1 용기 (550), 제2 용기 (552) 내지 말단 용기 (554)는 각각 다른 유전 상수 ε ₁ , ε ₂ , ... ε _n 을 갖는 매질을 함유한다. 광학 구배력 (556)으로 입자 (558)를 조사하고 그 운동을 관찰함으로써, 입자의 유전 상수가 확인될 수 있다. 매질의 유전 상수가 입자의 유전 상수와 동일하다면, 광 조사 (556)에 의해 힘이 가해지지 않는다. 대조적으로, 입자의 유전 상수와 매질의 유전 상수가 상이하다면, 광 조사 (556)에 의해 광학력이 입자에 가해질 것이다. 도 28에 도시된 바와 같이, 즉 다수의 용기 (550, 552 ... 554)가 제공될 때 다른 유전 상수 매질이 공급될 수 있다. 다르게는, 입자는 적정 시스템을 사용하여 경시적으로 가변적인 유전 상수의 영향을 받을 수 있다. 이행 시에, 적정은 입자를 함유하는 관에서 유체의 유전 상수를 경시적으로 변화시켜, 예를 들어 다른 유전 상수를 갖는 유체를, 바람직하게는 관 입구에서 혼합함으로써, 또는 가변 유전 상수 프로파일, 예를 들면 단계 프로파일을 제공함으로써 이루어질 수 있다. 추가로, 입자의 유전 상수는 다른 매질 내의 입자에 대한 힘에 대해 2개 이상의 데이타 점이 얻어지는 경우에 내삽에 의해 입자의 유전 상수가 어림되고, 그후에 힘이 존재하지 않는 예상 유전 상수가 결정될 수 있다.

도 29는 분리가 일어날 수 있는 정적 시스템을 나타낸다. 광 패턴 (560)은제1 입자 (562) 및 제2 입자 (564)를 조사한다. 제1 입자 (562)의 유전 상수가 매질의 유전 상수 미만이라면, 입자는 더 낮은 세기 영역쪽으로 이동한다. 대조적으로, 제2 입자 (564)가 매질의 유전 상수보다 더 큰 유전 상수를 갖는다면, 입자는 더 높은 세기 영역쪽으로 이동할 것이다. 결과적으로, 제1 입자 (562) 및 제2 입자 (564)는 반대 방향의 힘을 받는다. 근접한 것으로 도시된다면, 그들은 서로로부터 멀어지게 이동할 것이다.

도 30은 재료를 이동시키기 위해, 다수의 광학 집게, 바람직하게는 광학 집게 어레이를 사용하는 시스템을 나타낸다. 기판 (570)은 재료가 놓여질 수 있는 하나 이상의 위치 (572)를 포함할 수 있다. 그 재료는 선택 또는 이동될 입자, 세포 또는 임의의 다른 재료를 포함할 수 있다. 광학 집게 어레이는 광 궤도 (576)로서 도시된 바와 같이 재료를 선택적으로 이동시키고, 그 재료를 기판 (570)의 다른 부분, 예를 들면 어레이 (574)로 이동할 수 있다. 다르게는, 광학 집게 어레이는 전체 어레이 (572)를 조사하고, 그후에 광학 집게 어레이가 입자 (576, 578)를 기판 (570) 상의 어레이 (572)로부터 분리시키기에 충분한 힘을 제공하면서 재료를 선택적으로 이동시킬 수 있다. 예를 들면, 입자들은 그들을 기판 (570)에 선택적으로 결합시키는 상보적 핵산과 같은 부착 메카니즘을 가질 수 있다.

도 31은 헤모글로빈-O ₂ 흡수에 대한 파장의 함수로서의 몰 흡광 계수의 그래프를 나타낸다. 특정 분류 응용의 경우, 흡수 피크에 있는 또는 그 부근에 있는 조사 파장을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 500,000 몰 흡광 계수피크에서 파장을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 다르게는, 제2 피크, 예를 들면 실질적으로 560 ㎚에서 또는 실질적으로 585 ㎚에서 피크를 선택하는 것이 바람직할 수 있다.

첫번째 장치는 광영동법 실험을 위한 이동 프린지 워크스테이션이다. 고출력, 2.5 와트, Nd-YAG 레이저 (A)는 근적외선, 1064 ㎚ 파장 광원이다. 프린지 패턴은 거울 (1)로부터의 조준된 레이저 빔을 프리즘 빔 분할기 (2) 및 조심스럽게 정렬된 거울 (3)에 의해 형성된 마이컬슨 (Michelson) 간섭계에 통과하게 함으로써 형성된다. 가변 위상 지연기 (4)는 프린지 패턴이 연속적으로 이동되도록 한다. 이러한 프린지 패턴은 잠망경 (5)에 의해 망원경 (5a 및 5b)에 직행되어 패턴이 크기 분류되어 현미경 대물렌즈의 후면 촛점면을 채우고, 그후에 색선별 빔 분할기 (6)에 의해 20x 현미경 대물렌즈 (7)에 직행되어 분류될 샘플을 보유하는 유체 챔버에 이동 프린지 패턴의 영상을 발생시킨다. 두번째 60x 현미경 대물렌즈 (8)는 CCD 카메라 상에 유동 세포를 영상화하여 분류 실험을 가시화한다. 섬유-광학 조사기 (9)는 색선별 빔 분할기 (6)를 거쳐 유체 챔버 내의 샘플을 조사한다. 유체 챔버는 XYZ-이동 스테이지에 의해 두 현미경 대물렌즈 사이에 위치된다.

당해 분야의 숙련가에게는 임의 수의 추가의 또는 다른 성분이 포함될 수 있음이 자명할 것이다. 예를 들면, 추가의 거울 또는 기타 광학 루팅 성분이 빔을 필요한 곳으로 "향하게" 하는데 이용될 수 있다. 필요에 따라, 빔을 확장시키거나 조준하기 위한 각종 광학 성분이 이용될 수 있다. 도 5를 이행하는 장치에서, 레이저는 레이저 빔을 공간 필터로 향하게 하기 위해 추가의 거울을 사용하였으며,그로 인해 잘 조준된 가우스 (Gaussian) 빔이 형성되고 그후에 그것은 마이컬슨 간섭계로 안내된다.

두번째 장치는 광원으로서 600 mW, 초-저 노이즈 Nd-YAG 레이저 (B)를 사용하여 근적외선 광학 주파수에서 세포 및 입자의 유전 특성을 측정하고 비교하기 위한 워크 스테이션이다. 광학 장치의 나머지는 이동 프린지를 생산하는 간섭계가 없는 것을 제외하고는 이동 프린지 워크 스테이션과 유사하다. 대신에, 단일의, 부분적으로 집속된 조사 스팟이 유체 챔버 내에서 영상화된다. 세포와 이러한 조사장과의 상호작용으로 근적외선 광학 주파수에서의 세포의 유전 상수를 측정하게 된다.

예시적 응용

고처리량 생물학

본원의 방법 및 장치는 제약 및 생명과학 연구에서 고처리량 생물학에 사용하기에 적합한 견고한 세포 분석 시스템을 제공한다. 이 시스템은 고성능의 저비용 광학 장치를 시스템 내에 사용함으로써 제조될 수 있다. 완전 통합된 고처리량 생물학, 세포 분석 워크스테이션은 신약 개발, 독성학 및 생명과학 연구에 사용하기에 적합하다. 이 시스템들은 진보된 광학 기술을 이용하여 본질적인 광학 유전 특성을 비롯한 본질적인 특성을 기초로 한 특정 세포의 신속한 동정, 선택 및 분류를 위해 광영동 기술을 장치에 적용시킴으로써 신약 개발 과정 및 세포 특징화, 분리 및 분석에 대변혁을 일으킬 수 있다. 또한, 그러한 기술은 본질적인 특성의 인지를 기초로 하므로, 표지가 필요하지 않고, 그 결과 시험 과정이 크게 단축되고가속화된다. 이용된 레이저는 바람직하게는 생물학적 적합성 적외선 파장 내에 있으므로, 세포 자체에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않고 정확한 세포 특징화 및 조작을 할 수 있다. 이 기술은 게놈 시대에 적합하며, 여기서 세포의 분자 설계/구성 (DNA, RNA 및 단백질)의 상호작용 및 특정 세포 변화 (성장, 분화, 조직 형성 및 사멸)는 건강 및 질환을 근본적으로 이해하는데 결정적인 중요성을 갖는다.

광영동 기술은 세포 분석의 본질을 변화시킨다. 응용 분야에는 모든 세포 특징화 및 분류 방법이 포함될 것이다. 이 기술은 또한 분자 및 세포 생리학 분야에서 다양하게 응용된다. 광영동 기술은 광학 유전 특성을 포함한 세포 자체의 기본적인 특성에 역점을 둔다. 세포의 광영동 특성은 세포 유형에 따라서 또한 외부 자극에 반응하여 변화한다. 이 특성들은 세포의 전체 생리학적 상태를 반영한다. 활성 세포는 동일한 유형의 휴지 세포와 다른 유전 특성을 갖는다. 암 세포는 그의 대응하는 정상 세포와 다른 광영동 특성을 갖는다. 거의 모든 약물이 세포 자체에 대해 직접적인 효과를 나타내는 것을 궁극적인 목표로 하므로, 상기한 세포 특성들도 신약 개발 및 제약 연구에 효과적으로 사용될 수 있다. 이를 테면, 특정 분자 표적을 얻도록 설계된 약물은 그들이 세포의 순 유전 전하를 변화시킬 때 궁극적으로 세포 특성에 대해 효과를 나타낼 것이다. 그러므로, 약물 활성 또는 독성에 대한 세포의 신속한 선별은 이러한 기술의 응용이며, 고처리량 생물학으로서 불리울 수 있다. 다른 주요 응용 분야는 신약 개발 및 제약 연구를 포함한다.

인간 게놈 프로젝트 및 기타 관련 게놈 프로그램들은 신약 개발 및 선별 기술의 향상을 위한 수많은 요구를 제공할 것이다. 정교한 세포 접근법이 새로운 약물 표적의 비용 효율적이고 기능적인 선별에 필요할 것이다. 마찬가지로, 게놈 프로젝트에서의 정보는, 잘 특징화된 세포 재료로의 접근을 필요로 하는 조직 및 기관 공학의 개선된 방법에 대한 요구를 만들어낼 것이다. 또한, 정보 및 통신 산업으로부터의 광학 기술은 개선된 광학 세포 선택 및 분류를 위한 시스템 하드웨어를 제공할 것이다. 원래 통신 응용을 위해 개발된 고전력 근적외선 및 적외선 레이저에 대한 가격/성능 비는 계속 향상되고 있다. 또한, 기존의 버젼보다 훨씬 더 고출력을 나타내는 새로운 각종 파장을 갖는 고체 다이오드 레이저가 사용될 수 있다. 수직 공진 표면 발광 레이저 ("VCSEL")는 매우 합리적인 비용으로 전력 출력이 증가되는 다이오드 레이저 어레이를 제공한다.

컴퓨터화된 워크스테이션은 활성 유체공학에 의한 소형화 샘플 스테이션, 근적외선 레이저를 포함하는 광학 플랫폼 및 데이타 분석과 해석을 위한 필수 시스템 하드웨어로 구성될 수 있다. 그 시스템은 전체 컴퓨터 제어되는 실시간 분석 및 시험을 포함한다. 기술의 주요 응용 분야는 특히 복합적인 배경으로부터 얻은 다른 세포들을 동정하고 선택하기 위한 세포 특징화 및 선택을 포함한다.

중요하게는, 비표지된, 생리학적으로 정상인, 온전한 시험 세포가 시스템에 이용될 것이다. 샘플은 광학장에 의해 세포 분급 및 분류되며, 빠르게 분석됨으로써, 약물 반응을 특징화하고 약물 효능의 독성 또는 다른 척도를 확인할 수 있게 된다. 각종 약물 시험 결과 및 질병 상태와 특이적으로 관련된 세포 광영동 특성을 특징화하는 것은 본 발명의 일부이다. 이들 새로운 변수의 확인은 유용한 정보를 구성한다.

통합 시스템은 다양한 면에서 표지를 사용하지 않고 세포를 손상시키지 않으면서 세포를 동정, 선택 및 분리하고; 용이하고 효율적으로 복합 세포 분석 및 분리 과제를 수행하고; 세포들이 시험되고 조작될 때 실시간으로 그것을 관찰하고; 이후의 사용을 위해 통례의 세포 분류 프로토콜을 만들고; 복합 배경으로부터 희귀 세포를 단리하고; 희귀 세포 (예를 들면, 줄기 세포, 연약 세포, 종양 세포)를 정제하고 농축하고; 세포 표현형을 유전자형으로 더욱 쉽게 연결하고; 정밀하고 광학적인 제어하의 세포-세포 상호작용을 연구하고; 샘플 가공 및 분석을 처음부터 끝까지 제어할 수 있도록 한다.

상기 기술은 현재의 검정법을 소형화하고, 처리량을 증가시키고 단위 비용을 감소시킬 수 있는 구성 세포 어레이에 대한 특이적이고 유용한 접근법을 제공한다. 단일 세포 (또는 작은 세포군) 검정은 소형화를 가능하게 할 것이며, 세포 기능 및 약물 및 다른 자극에 대한 그의 반응의 더욱 상세한 연구를 가능하게 할 것이다. 이로써 세포 어레이 또는 세포 칩이 단일 세포 검정의 동시 고처리량 프로세싱을 수행할 수 있게 된다. 또한, 세포 칩 제작의 표준화가 가능해지므로, 다른 각종 세포 유형에 적용가능한 세포 칩을 형성하는 더욱 효율적인 방법이 만들어진다.

포유동물의 세포 배양은 연구 (예를 들면, 새로운 세포-생산된 화합물의 발견 및 특정 단백질을 생산할 수 있는 새로운 세포주의 생성) 및 개발 (예를 들면, 추가 연구 및 시험을 위한 고도로 특이적인 단백질을 생산할 수 있는 모노클로날 세포주의 개발) 분야 모두에 있어서 중요한 영역 중 하나이다. 포유동물의 세포 배양은 또한 상업적 규모의 신규 생물약제의 생산에 있어서 핵심적인 기술이다.

연구원들이 일단 약물 표적, 화합물 또는 백신을 확인한 다음에는, 포유동물의 세포 배양이 추가 연구 및 개발에 필요한 양을 생산하는데 있어서 중요한 기술이 된다. 현재까지 70종 이상의 생물공학 약제가 승인되었으며 시험중인 화합물이 350종 이상에 달하고 200종 이상의 질병이 그 대상이 되고 있다.

광학적 세포 특징화, 분류 및 분석 기술은 포유동물의 세포가 신규 단백질 또는 생물약제학적 화합물을 생산하는지에 따라서, 또한, 단백질 또는 화합물의 산출량에 따라 포유동물의 세포주를 선택하고 분리하는데 있어서 유용할 수 있다. 세포 산출량은 신규의 생물공학적 약물을 상업적 양으로 생산하도록 설계되어야 하는 생산 설비의 크기를 결정하는데 있어서 중요한 인자이다.

본 발명자들은 이후 응용예에 대해서 더욱 상세하게 논의하고자 한다. 먼저, 본 발명자들은 분리 응용예를 다루고, 이어서 모니터링 응용예를 다루고자 한다.

분리 응용예

적혈구 세포로부터 백혈구 세포. 백혈구 세포는 신체를 통하여 산소를 운반하는 적혈구 세포와 비교하여 면역 반응에 관여하는 혈액의 구성 성분이다. 백혈구 세포는 내성을 더욱 좋게 하고 감염 위험을 감소시키기 위하여 수혈 전에 적혈구 세포로부터 제거되어야할 필요가 있다. 또한 분석 또는 조작을 위한 농축된 백혈구 세포 집단을 얻기 위하여 적혈구 세포를 제거하는 것이 통상적으로 중요하다. 광영동법은 단일 집단이 필요한 경우의 응용예에 사용하기 위하여 이들 2종의 별개 세포 집단을 서로 분리할 수 있도록 한다.

성숙 적혈구 세포로부터 망상적혈구. 통상적으로 매우 낮은 수준으로 발견되는, 미성숙 적혈구 세포인 망상적혈구는 이들이 증가된 수준으로 발견되는 경우의 질병 상태의 지표일 수 있다. 본 응용예는 전혈로부터 망상적혈구를 분리하고 이의 수준을 계수하기 위하여 광영동법을 사용한다.

임상적 케어 응용, 예를 들어, 모체 순환으로부터 태아 줄기 세포. 임상적 케어 응용예는 세포 처치법 및 임상적 진단을 포함한다. 모체 혈액으로부터 태아 세포의 성공적인 단리는 비-침입 방식으로 얻을 수 있는 태아 DNA 공급원을 나타낸다. 이제는 수많은 전세계의 연구원들이 태아 세포가 모체 순환에 존재하며 유전자 분석을 위하여 구할 수 있다는 것을 증명하였다. 태아 세포 단리에 있어서 현재 주요 임무는 표적 태아 세포 유형의 선택, 상기 세포의 선택과 단리 및 세포를 일단 단리한 다음 유전자 분석 방법이다. 모체 혈액 샘플을 이용하여, 상기 시스템이 엄마의 혈액내에서 순환하는 희귀한 태아 세포임을 확인할 수 있으며 태아기 유전적 비정상의 95%에 달하는 유전자 질환, 예를 들면 다운 증후군의 진단을 가능케 한다. 세포 처치법이란 진단 절차와 유사하지만, 임상 목적이 약간 더 넓은 절차를 언급한다. 임신중, 소수의 태아 세포가 모체 순환에 들어온다. 광영동법을 이용하여 이들 세포를 정제함으로써 단일 모체 혈액 샘플로부터 여러가지 유전적 비정상을 태아기에 진단할 수 있다.

임상적 케어 응용, 예를 들어, 줄기 세포 단리. 줄기 세포 단리 목적은 이식용 줄기 세포 조직이식물로부터 줄기 세포를 정제, 즉, 이종유전자 조직물 (여기서 공여자와 수여자는 동일인이 아니다) 중 T-세포와 자가 조직물 (여기서 공여자와 수여자는 동일인이다) 중 암세포를 제거하는 것이다. 현재까지의 줄기 세포 기술에는 몇가지 단점이 있다. 예를 들어, 현재 입수가능한 시스템을 사용하여 얻은 줄기 세포의 회수 효율은 65 내지 70% 정도이다. 또한, 현재 방법은 이식 절차에 유리한 100% 순도를 제공하지 못한다.

혈액으로부터의 종양 세포. 최소 잔류 질병 (MRD) 시험. 국립 암 연구소 (NCI)는 현재 생존하는 미국인 중 대략 8백 4십만명이 암 병력을 갖고 있으며, 2000년에 1백 2십만명의 새로운 암 환자가 진단된 것으로 추산하고 있다. NCI는 또한 1990년 이래로 비침입성 및 세포린 피부암을 제외하고, 대략 천300백만명의 새로운 암 환자가 진단된 것으로 추산하였다. 광영동법 기술은 전이된 암세포를 검출하고 정량하며 특징화할 수 있는, 정확하고, 재현가능하며 표준화된 기술; 고도로 특이적이고 감응성인 면역세포학 기술; 더욱 빠른 속도의 세포 분류; 및 추가 분석을 위하여 생존성 암세포를 특징화하고 단리할 수 있는 기술을 포함하여, 암 선별을 더욱 좋게 하기 위한 중요한 만족되지 않은 필요성의 일부에 맞추어져 있다.

암세포는 다양한 형태의 질병, 특히 전이가 일어난 경우의 환자의 혈액내에서 순환하는 적은 수로 발견될 수 있다. 혈액중 종양 세포의 존재는 암의 진단에 사용할 수 있거나, 여러가지 치료 프로토콜의 성공 또는 실패 여부를 결정할 수 있다. 그러한 종양 세포는 극히 희귀하여, 정확한 진단을 위하여 검출에 충분한 세포를 얻기 위해서는 광영동법과 같이 혈액으로부터 농축하는 방법을 이용할 필요가 있다. 이에 대해서 광영동법에 대한 다른 응용예는 암환자의 경우 자가 조직이식을 수행하는데 사용하기 전에 혈액 또는 줄기 세포 생성물로부터 종양 세포를 제거하는 것이다.

제대혈로부터의 태아 줄기 세포. 신생아로부터의 제대는 일반적으로 줄기 세포가 풍부한 혈액을 함유하고 있다. 제대혈 물질은 통상적으로 출생시 폐기되지만, 학술 및 개인적 관점에서 제대혈을 보관하는 경우가 있어 상기와 같이 폐기되는 물질을 자가 또는 이종유전자 줄기 세포 대체용으로 사용할 수 있다. 광영동법으로 제대혈 줄기 세포를 농축시킴으로써 더 적은 양으로 물질을 저장할 수 있도록 하며, 이는 환자 또는 다른 숙주에게 용이하게 되돌려 줄 수 있도록 한다.

간, 신경 조직, 골수 등으로부터의 성인 줄기 세포. 수많은 성숙 조직이 작은 집단의 불멸 줄기 세포를 갖는다는 것은 점점 더 자명해지고 있는데, 이들 불멸 줄기 세포는 생체외에서 조작될 수 있으며 이후 환자에 다시 도입시켜 손상된 조직을 재생시킬 수 있다. 광영동법을 이용하여 이들 극히 희귀한 성인 줄기 세포를 정제할 수 있으며 이들을 세포 치료용으로 사용할 수 있다.

췌장으로부터의 섬세포. 인슐린 생산을 못하게 된 당뇨병 환자의 경우, 건강한 췌장으로부터 인슐린 생산 베타 섬세포를 이식하여 당뇨 환자에게 상기 기능을 회복시키는 것이 제안된 바 있다. 이들 세포는 전체 공여체 췌장 중 작은 분획만을 이루고 있다. 광영동법은 이들 섬세포를 농축시키는 방법을 제공하며 이런 특정 유형의 이식용 세포를 제조하는데 유용할 수 있다.

활성화된 B 또는 T 세포. 면역 반응중에 특정 항원을 표적으로 하는 T 또는 B 백혈구 세포 서브세트는 활성이 된다. 이들 특정의 활성화된 세포는 생체외 팽창에 사용하기 위하여 별개의 성분으로 요구될 수 있으며, 이후, 활성화된 B 또는 T 세포가 기관 거부반응, 또는 루푸스 또는 류머티스성 관절염과 같은 자기면역 질환과 같은 환자에 있어서 원치않는 면역 반응을 일으킬 수 있기 때문에, 면역요법 생성물로서 적용되거나 제거될 수 있다. 광영동법은 세포를 농축시켜 환자에게 다시 제공하거나 병리학적 파괴를 일으키는 세포를 폐기시키기 위하여 활성화된 세포를 얻는 방법을 제공한다.

수지상 세포. 수지상 세포는 T-세포 매개된 면역 반응을 정립시키는데 있어서 중요한 백혈구 세포의 서브세트이다. 생물공학 및 제약 회사들은 수지상 세포를 수확하여 이들을 적절한 항원과 관련하여, 특이적인 활성화된 T 세포 반응을 일으키기 위하여 생체외 사용하기 위한 방법을 연구하고 있다. 광영동법은 그러한 연구를 위하여 많은 수의 수지상 세포의 단리를 가능케 한다.

HPRT-세포. 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT)는 수많은 혈액 세포에 존재하는 효소이며 뉴클레오시드 소거 (scavenging) 경로에 연관되어 있다. 내인성 유전자 돌연변이 또는 돌연변이 유발물질에 대한 외인성 노출로 인하여 돌연변이율이 높은 사람은 이 유전자에서 돌연변이가 일어났음을 나타내는 HPRT 결핍 세포 (HPRT-)에 대해 선별할 수 있다. 광영동법에 이어 HPRT 시스템에 통과하는 화합물로 선별하는 방법을 사용하여 HPRT 마이너스 세포를 용이하게 선택하고 이들의 수를 정량할 수 있다.

생존가능 또는 이동성 정자 세포. 부부의 대략 12%는 일정 형태의 도움 또는 치료없이는 임신할 수 없다. 이들 경우의 약 30%는 남성쪽에 원인이 있는 것으로 나타났다. 상기 경우의 추가 20%는 남성과 여성 둘다 원인이 있는 것으로 확인될 수 있다. 따라서, 불임의 대략 50% 정도는 부분적으로 남성쪽에 책임이 있다. 15세에서 44세의, 가임 능력이 손상된 여성의 수는 6백만명이 훨씬 넘는다. 요즈음에는 여러가지 시험법을 사용하여 정액 분석을 수행하며 정자수, 양, pH, 점도, 운동성 및 형태를 포함한 수많은 변수를 기본으로 한다. 오늘날, 정액 분석은 주관적이고 수동적인 공정이다. 정액 분석 결과가 남성이 부부의 불임에 책임이 있는지에 대해 항상 명확하게 나타내는 것은 아니다. 이동성 정자를 단리하기 위한 구배식 원심분리법은 비효율적인 공정이다 (회수율이 10 내지 20%이다). 정자 선택은 IUI (In Utero Insemination) 및 IVF (In Vitro Fertilization)에 사용되는 이동성 정자를 단리시키기 위한 구배식 원심분리법 또는 IVF 및 ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection)에 사용되는 형태학적으로 정확한 정자를 단리시키기 위한 시각적 검사법 및 선택법을 사용하여 수행한다. 미국에서는 매년, 600,000명의 남성이 불임에 대해 의학적 도움을 찾고 있다.

남성 불임에 대한 원인 중 하나는 생존성 및(또는) 운동성 정자 세포 비율이 충분히 높지 못하다는 것이다. 생존성 및(또는) 운동성 정자 세포는 광영동법을 사용하여 선택할 수 있으며 정자수를 증가시킴으로써, 수정율을 더 높일 수 있다. 이런 적용은 또한 Y 함유 정자로부터 X를 선택하거나 그 반대를 선택하는데 사용할 수 있으며, 따라서 이는 경제적인 이유로 한가지 성의 동물이 크게 바람직한 경우 (예를 들어, 낙농용 소의 경우 암컷이 필요하고, 고기를 생산하는 소의 경우 수컷이 바람직하다) 동물에서 선택적으로 임신을 유발시키는데 사용된다.

여러가지 화합물이 부하된 리포좀. 약제품을 치료적으로 운반하는 최근의 방식은 운반 비히클로서 리포좀을 사용하는 것이다. 리포좀내 약물의 수준이 상이한 리포좀을 분리하고 약물이 가장 많이 농축되어 있는 리포좀이 풍부해지도록 광영동법을 사용할 수 있다.

조직 공학, 예를 들어 지방 세포로부터의 연골 전구체. 조직 엔지니어링은 전통적이 합성 이식물 대신 사용할 수 있는 조직 대체용 생물학적 대체물을 개발하기 위하여 살아있는 세포를 사용하는 것이다. 인간의 조직 또는 기관 기능의 소실은 환자와 가족을 황폐화시키기 때문에 문제가 된다. 조직 공학의 목표는 몸 밖에서 새로운 조직을 설계하고 성장시켜 이를 체내에 이식할 수 있도록 하는 것이다.

최근의 보고서는 사람의 지방 조직에서 발견되는 세포를 생체외적으로 사용하여 사람의 관절 손상을 치료하기 위한 이식 물질로서 사용할 수 있는 연골을 발생시킬 수 있다고 증명하였다. 광영동법을 사용하여 생체외 팽창 및 궁극적으로 조직 공학 요법을 위하여 지방 조직중에서 연골 형성 세포를 다른 세포로부터 정제할 수 있다.

소수의 세포의 나노조작. 최근의 수많은 실험 공정의 소형화로 많은 실험 분석이 점점 더 작은 플랫폼으로 되어, "랩-온-어-칩 (lab-on-a-chip)" 연구법으로 발전되고 있다. 용액중 생체분자의 조작은 이러한 환경에서 일상적인 일로 되어가는데, 미세채널 및 다른 나노-장치 중에서 소수의 세포 조작은 아직 널리 이루어지고 있지 않다. 광영동법은 세포가 미세채널로 이동하도록 하여 칩상에서 적절한 공정이 이루어지는 영역으로 배향되도록 할 수 있다.

세포 소기관; 미토콘드리아, 핵, ER, 미소체. 세포의 내부 구성성분은 세포질과 많은 소기관, 예를 들면, 미토콘드리아, 핵 등으로 이루어져 있다. 이들 소기관의 수 또는 물리적 형태에서의 변화를 이용하여 세포 자체의 생리학적 변화를 모니터할 수 있다. 광영동법은 특정 소기관의 특정한 유형, 형태 또는 수를 갖는 세포를 선택하여 이들이 농축되도록 할 수 있다.

BSE 검정을 위한 소의 망상적혈구. 망상적혈구의 세포 성분인, EDRF가 BSE (소의 해면상 뇌증)에 감염된 소의 망상적혈구에서 높은 수준으로 발견되는 것으로 보고된 바 있다. 망상적혈구는 일반적으로 혈액내에서 낮은 수준으로 발견되며, 따라서, 광영동법을 사용하여 이들을 농축시켜 EDRF mRNA 또는 단백질의 정량화를 기준으로 하는 진단 시험의 정확도를 증가시킬 수 있다.

모니터링

성장/분화 세포 대 휴지 세포. 세포는 여러가지 성장 인자 또는 성장 조건에 의해 성장이 자극될 수 있다. 세포 성장에 대한 현존하는 대부분의 검정법에서는 외부 표지화 시약의 첨가 및(또는) 세포 성장을 증명할 수 있기까지 현저한 배양 시간을 필요로 한다. 광영동법을 사용함으로써, 분화되기 시작한 세포를 동정하여, 제시된 세포 집단이 어느 정도의 성장 상태에 있는지에 대한 신속한 계산 방법을 제공한다. 세포 주기가 상이한 세포는 상이한 광학 특성을 가지며 따라서 이들을 사용하여 세포가 속해 있는 세포 주기를 기준으로 하여 세포를 분류할 수 있을 뿐만 아니라, 전체 세포 집단중 각 단계에 전체 세포 집단의 분획이 어느 정도인지 측정할 수 있다.

세포자살 세포 (apoptotic cells). 프로그램된 세포 사멸 또는 세포자살을 수행하는 세포를 사용하여 이런 현상으로 이끄는 특정 약물 또는 기타 현상을 확인할 수 있다. 광영동법을 사용하여 세포자살을 수행하는 세포를 동정할 수 있으며 이런 지식을 이용하여 세포자살을 촉진하는 신규 분자 또는 세포 조건 또는 상호작용을 선별할 수 있다.

막 채널 개방부가 있는 세포; 막 전위에서의 변화. 여러가지 유형의 세포의 외부막은 이온과 소분자가 세포 내부와 외부로 통과하는 것을 용이하게 하는 채널을 함유한다. 그러한 분자가 이동하게 되면 전기적 전위에서의 변화, 제2 메신저의 수준에서의 변화 등과 같이 세포에서 추가로 변화가 일어날 수 있다. 이런 변화의 지식은 막 채널 활성을 조절하는 화합물에 대한 약물 선별에 유용할 수 있다. 광영동법을 사용하여 막 채널이 외인성 화합물에 의해 교란되는 때를 표시할 수 있다.

살아있는 세포 대 죽은 세포. 살아있는 세포 대 죽은 세포의 동정과 정량화를 필요로 하는 수많은 용도가 있다. 광영동법을 사용하여 죽은 세포를 동정하여 계수할 수 있다.

바이러스 감염된 세포. CMV, HIV 등을 포함하여, 바이러스를 함유하는 세포를 측정하는 것이 중요한 진단 용법이 많이 있다. 광영동법을 사용하여 바이러스를 함유하는 세포와 그러하지 않은 세포를 구분할 수 있다.

비정상적인 핵을 갖거나 DNA 함량이 높은 세포. 종양 세포의 특징 중 하나는 과량의 DNA를 함유하여, 핵이 비정상적인 크기 및(또는) 형태로 되는 것이다.비정상적인 양의 DNA 및(또는) 핵 구조를 갖는 세포 집단의 핵 함량에 맞춘 광영동법을 사용하여 동정할 수 있으며 이 정보를 사용하여 암 환자에 대한 진단 또는 예후 지표로 사용할 수 있다.

항체가 달려 있는 세포. 세포의 독특한 단백질 및(또는) 유형을 규정하는 세포 마커에 대한 특이성을 갖는, 상업적으로 입수가능한 항체를 많이 선택할 수 있다. 수많은 진단 용법은 항체가 세포의 표면에 결합하는가를 확인함으로써 세포 유형을 특징화하는 것이다. 광영동법을 사용하여 세포가 이들에 결합하는 특이적 항체를 갖는 때를 검출할 수 있다.

결합되어 있는 리간드, 펩타이드, 성장 인자가 있는 세포. 여러가지 화합물과 단백질은 특정 세포 유형의 표면상의 수용체에 결합한다. 상기와 같은 리간드는 이후 세포 내부에서 변화를 야기시킬 수 있다. 수많은 약물 선별법은 이러한 상호작용을 찾는 것이다. 광영동법은 외인성의 크고 작은 분자가 세포의 외부에 결합하는 가에 대한 모니터 뿐만 아니라, 화합물 결합의 결과로서 나타나게 되는 세포 내부에서의 생리학적 변화를 측정하는 수단을 제공한다.

항생제 노출후 생존성에 대한 세균. 미생물을 통상적으로 항체 스펙트럼에 대한 감응도에 대해 시험하여 감염성 유기체를 궤멸시키는데 적절한 요법을 결정할 수 있다. 광영동법을 사용하여 항생제 노출 후 생존성 및 성장 정지에 대해 세균 세포를 모니터할 수 있다.

NCI 60 패널상에서의 약물 선별. 60종의 종양 세포주 패널은 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 화학요법제로 사용할 수 있을 정도의 특성을 가질 수 있는 화합물을 결정하기 위한 선별 도구로 확립된 것이다. 광영동법을 사용하여 모두 60개의 세포주를 정렬시킨 다음 공지 및 신규 화학물질을 이들에 시도하여 화학물질에 대한 반응에 대해 세포주들을 모니터할 수 있다.

세포골격 변화용 세포. 세포골격은 세포 본연의 내부 구조를 유지하는 구조 단백질의 복합체이다. 택솔, 빈크리스틴 등과 같은 수많은 약물, 뿐만 아니라 온도와 같은 기타 외부 자극이 세포골격의 파괴 및 붕괴를 일으키는 것으로 알려져 있다. 광영동법은 세포골격에서의 교란에 대한 세포 집단의 모니터 수단을 제공한다.

세포 표면 또는 다른 비드와의 상호작용을 측정하기 위한, 화합물이 결합되어 있는 비드. 세포 또는 다른 화합물과 미세구의 상호작용은 수많은 시험관내 진단용으로 사용되고 있다. 화합물을 비드에 부착시킬 수 있으며 비드와 세포 또는 다른 화합물을 갖고 있는 비드와의 상호작용을 광영동법으로 모니터할 수 있다.

조상 세포/콜로니 형성 검정법. 조상 세포는 동일한 조직의 더욱 성숙한 세포를 많이 발생시킬 수 있는 제공된 조직의 세포이다. 조상 세포를 측정하기 위한 전형적인 검정법은 이들 세포를 배양물 중에 남겨두고 적절한 성숙 세포 유형의 콜로니가 주어진 시간내에 얼마나 많이 형성되는지 계수하는 것이다. 이런 유형의 검정법은 느리고 번거로우며 때로는 수행하는데 수 주가 소요되기도 한다. 단일 세포의 성장을 모니터하는데 광영동법을 사용함으로써, 조상 세포 증식을 나노-스케일로 측정할 수 있으며 훨씬 더 짧은 시간내에 결과를 얻어야 한다.

투여량 제한 독성 선별법. 거의 모든 화합물은 일정 수준에서 독성이며, 특정 수준의 화합물 독성은 화합물이 살아있는 세포와 유기체를 사멸시키는 농도를 측정함으로써 확인한다. 화합물의 투여량을 서서히 증가시키면서 광영동법으로 살아있는 세포를 모니터함으로써, 세포 손상 및(또는) 사멸의 광학 특성 지표 수준을 확인할 수 있다.

세포 중 지질 조성/막 유동성 모니터. 모든 세포의 막은 지질로 구성되어 있으며 지질은 적절한 정도의 막 유동성과 동시에 기본적인 세포막 강도를 모두 유지하여야 한다. 광영동법은 막의 유동성을 측정할 수 있으며 막이 더욱 유동적으로 되거나 덜 유동적이 되도록, 막 유동성을 변화시킬 수 있는 화합물 및 조건에 대한 정보를 제공할 수 있다.

응혈/혈소판 응집 측정. 혈소판 및 응혈 단백질과 같은 혈액내에서 발견되는 성분은 적당한 상황하에서 응혈 형성을 촉진시키는데 필요하다. 통상적으로 응혈을 모니터하여 질병 상태를 측정하거나 기본적인 혈액 생리학을 평가할 수 있다. 광영동법은 혈소판 응집 및 응혈 형성에 대한 정보를 제공할 수 있다.

본원에 보고된 특정 데이타는 다음과 같은 장치로 발생시킨 것이었다. 광학 구배장은 마이컬슨 간섭계를 사용하여 발생시킨 것으로 150 ㎽, 812 ㎚ 레이저 (812 시스템) 또는 2.5 W, 1064 ㎚ 레이저 (1064 시스템) 중 하나이다. 812 시스템은 100X (1.25 NA) 유침 (oil immersion) 렌즈를 사용하여 프린지 패턴에 집속시키고 샘플을 가시화하였다. 1064 시스템은 20X 대물 렌즈를 사용하여 프린지에 집속시키고 60X 대물 렌즈를 사용하여 샘플을 가시화하였다. 일반적으로 샘플 세포는 코팅된 현미경 슬라이드 및(또는) 바셀린으로 밀봉한 커버슬립이다. 커버슬립스페이서는 대략 150 ㎛에서 세포의 높이를 조절하였다.

표면의 코팅; Rain-X™, 아가로오스, CYTOP, 플루오로실란 산란력은 입자 또는 세포를 샘플 세포의 표면을 향하여 밀어내는 경향이 있다. 따라서, 다수의 표면 코팅은 비특이적 접착과 마찰력이 최소화되도록 정하였다. 소수성/친수성 및 공유결합/비공유결합 표면 처리에 대해 평가하였다.

공유결합/소수성 유리 슬라이드와 커버슬립을 퍼플루오로 옥틸트리클로로실란 (Aldrich, Milwaukee, WI)으로 용액 침착법 또는 증착법을 사용하여 처리하였다. 용액 침착법은 다음과 같다: 에탄올중 2 내지 5% 실란 용액을 실온에서 30분간 인큐베이션시킨 다음, 에탄올로 3회 세정하여 공기 건조시켰다. 증착법은 같은 용적의 실란과 물을 별개의 미세원심분리관에 넣고 진공 챔버내에서 처리할 기판으로 밀봉시켰다. 50 ℃로 15시간 가열하였다.

비공유결합/소수성 -- 폴리실록산을 함유하는 시판되는 발수제, Rain-X를 제조업자의 지침에 따라 도포하였다.

액체 테플론, CYTOP (CTL-107M, Wilmington, Delaware)을 마이크로퓨즈 (microfuge)를 사용하여 스핀 코팅시켰다. CYTOP을 플루오로옥탄중에 10% (v/v) 로 희석시키고 50 ㎕를 피펫팅하여 5초간 스핀시켰다. 이를 2회 반복한 다음 공기 건조시켰다.

비공유결합/친수성 -- 아가로오스 하이드로겔 코팅물을 다음과 같이 제조하였다: 물에 2% 아가로오스를 용융시키고, 100 ㎕를 기판에 피펫팅하여, 5초간 스핀시키고 37 ℃에서 30분간 베이킹시켰다.

상기 코팅물은 모두 입자와 작업시 효과적이었다. CYTOP는 생물학적 세포와 작업시 접착을 방지하는데 있어서 더욱 효과적이었다.

크기에 의한 분리 -- 상이한 크기 (1, 3 및 5 ㎛ 직경)의 폴리스티렌 입자 (Bangs Labs, Fishers, IN)를 이동 광학 구배장을 사용하여 분리하였다. 3 및 5 ㎛ 직경의 입자를 증류수에 1/500으로 희석하고 10 ㎕를 Rain-X 코팅된 슬라이드상에 피펫팅하였다. 812 시스템을 사용하여 4-5 프린지 주기로 이루어져 있으며 초당 15 ㎛로 움직이는, 25 내지 30 ㎛ 크기의 스팟을 발생시켰다.

도 32는 3 및 5 ㎛ 폴리스티렌 입자에 대해 1-초 간격의 분류 순차를 나타낸다. 더 작은 3 ㎛ 직경의 입자가 구배장에 의해 용이하게 이동한 반면, 더 큰 5 ㎛ 직경의 입자는 영향을 받지 않았다. 더 큰 입자는 여러 프린지에 걸쳐 있어 구배력이 효과적으로 소멸되기 때문에 이동하지 않는다. 1 및 3 ㎛ 직경 입자에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다.

굴절율에 의한 분리 -- 유사한 크기 (∼5 ㎛ 직경, Bangs Labs)를 가지며 각각의 굴절율이 1.59, 1.49 및 1.37인 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트 및 실리카 입자를, 이동 광학 구배장에 의해 분류하였다. 폴리스티렌, PMMA 및 실리카에 대해 관찰된 이탈 속도는 각각 44, 47 및 32 ㎛/초였다. 간략하면, 입자는 프린지에 정렬되며 프린지는 입자가 미끄러질 때까지 증가되는 속도로 이동하게 된다. 이는 입자에 의해 경험하게 되는 전체적인 힘, 즉, 광자성, 수력적 및 마찰에 의한 힘의 반-정량적 측정을 가능케 한다. 당해 분야의 숙련가들에게는 이탈 속도의 절대치는 시스템 조건, 예를 들어, 레이저 동력에 따라 상이하다는 것이 숙지되어 있다. 본원에 제공되는 수치상 결과는 실제로 사용되는 시스템에 대해 측정된 데이타를 제공하는 것이며, 상이한 시스템에서 있을 수 있는 수치에 대한 제한으로 간주되어서는 안된다.

입자를 증류수에 1/500으로 희석시켰다 (n = 1.33). 812 시스템을 사용하여 프린지 주기가 10 ㎛인 구배장을 발생시켰다. 대략 40 ㎛/초의 역치로 구배장을 이동시켜 폴리스티렌과 PMMA 입자를 실리카 입자로부터 분류시켰다.

표면 기능화 및 도핑에 의한 분리 -- 블루 또는 핑크색 염료로 착색시킨 폴리스티렌 입자 (∼6 ㎛ 직경)를 폴리사이언스, 인크. (Polysciences, Inc.)로부터 구입하였다. 핑크색 입자는 또한 입자 표면상에 카르복실기를 갖는다. 상기 입자를 증류수에 1/500으로 희석시키고 10 ㎕를 Rain-X 코팅시킨 슬라이드상에 피펫팅시켰다. 812 시스템을 사용하여 프린지 주기가 대략 12 ㎛인 이동 광학 구배장을 발생시켰다. 프린지에서, 핑크색 입자가 우선적으로 이동하였다.

도 33은 입자의 실제적인 이동을 나타낸다.

다른 실험으로, 바이오틴으로 표지된 1 ㎛ 라텍스 비드를 사용하여 상이한 리간드가 부착되었을 때 이탈 속도의 변화를 측정하였다. 바이오틴 표지된 비드를 PBS 완충액에 1/100으로 희석시켰다. 50 ㎕ 분취량을 과량의 스트렙트아비딘 또는 10 ㎚ 콜로이드상 금-스트렙트아비딘 공액체와 함께 10분간 인큐베이션시켰다. 상기 비드를 원심분리시켜 펠릿화하고 PBS 완충액에 다시 현탁시켰다. 1064 시스템을 사용하여 이탈 속도를 측정하면, 바이오틴 표지시킨 비드, 스트렙트아비딘과 비드 및 스트렙트아비딘-콜로이드상 골드와 비드의 속도는 각각 5.3, 4.3 및 3.6 ㎛/초였다.

파장 공명에 의한 분리 (812 대 1064 ㎚) -- 상기 착색시킨 폴리스티렌 입자에 의한 실험을 1064 시스템을 사용하여 반복하여 결과를 역전시켰다. 블루 입자가 먼저 이동하게 되었다. 1064 시스템을 2.5 W 보다는 150 ㎽로 맞출 때 유사한 결과가 얻어졌다. 이는 파장 조정이 식별 공정을 향상시킬 수 있음을 제시하는 것이다.

지수 매칭에 의한 분리 -- 실리카와 폴리스티렌 입자 (각각 직경이 3 및 5 ㎛)를 친수성 실리콘 (디메틸실록산-에틸렌 옥사이드 블럭 공중합체; Gelest, Inc., Tullytown, PA)에 1/500으로 희석시켰다. 매질의 굴절율 (n=1.44)은 실리카 (n=1.37)와 폴리스티렌 (n=1.59) 입자의 중간치였다. 입자 크기는 본 실험에서 중요하지 않다.

1064 시스템을 사용하여, 구배력을 직경이 대략 15 ㎛인 확산 스팟에 집속시켰다. 더욱 일반적으로, 본 명세서에 기재된 모든 시스템 및 응용에 있어서, 비집속된 레이저 빔과 같은 비집속된 빔을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 스팟 또는 빔의 크기가 입자 크기 정도가 되도록 빔을 비집속시켰다. 세포의 경우, 크기는 대략 10 내지 20 μ이다. 폴리스티렌 입자는 구배장쪽으로 이동하는 반면 실리카는 이로부터 멀어지게 이동하였다. 이는 현탁 매질이 분리의 최적화에 변화를 일으킬 수 있음을 입증하는 것이다.

적혈구 세포 대 망상적혈구 세포의 분리

망상적혈구 대조물 (Rectic-Chex)은 스트렉 랩 (Streck Labs)으로부터 입수하였다. 6%의 망상적혈구를 함유하는 샘플을 뉴 메틸렌 블루 (New Methylene Blue)로 15분간 염색시키고, 핵산은 망상적혈구 대 비핵화 적혈구 세포가 차등하게 염색되도록 염색시켰다. 상기 샘플을 PBS에 1/200으로 희석시키고 플루오로실란 코팅된 슬라이드 상에 올려놓았다. 812 시스템을 사용하여 광학 구배장을 발생시켰다. 프린지 주기는 15 ㎛로 조정하고 15 ㎛/초의 속도로 이동시켰다. 망상적혈구가 적혈구 세포에 비해 우선적으로 이동하였다.

백혈구 세포 대 적혈구 세포의 분리

전혈 대조물 (Para12 Plus)은 스트렉 랩으로부터 입수하였다. 샘플을 뉴 메틸렌 블루로 15분간 염색시키고, 핵산은 핵화된 백혈구 세포 대 비핵화 적혈구 세포가 차등하게 염색되도록 염색시켰다. 상기 샘플을 PBS에 1/200으로 희석시키고 플루오로실란 코팅된 슬라이드 상에 올려놓았다. 812 시스템을 사용하여 광학 구배장을 발생시켰다. 프린지 주기는 15 ㎛로 조정하고 22 ㎛/초의 속도로 이동시켰다. 백혈구 세포는 프린지에 의해 이동하였지만 백혈구 세포는 그렇지 않았다.

백혈병 세포 대 적혈구 세포의 분리

백혈병 세포주 U937 현탁액 1 ㎖를 펠릿화하여 1% BSA를 함유하는 PBS 100 ㎕에 재현탁시켰다. 등 용적의 U937과 적혈구 세포의 1/200 희석액을 함께 혼합하여 10 ㎕를 CYTOP 코팅된 슬라이드 상에 놓았다. 이동 프린지 장에 의한 각각의 측정치는 각각 60 및 23 ㎛/초로, U937 세포인 경우에 이탈 속도가 적혈구 세포의 경우에 이탈 속도보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 1064 시스템을 사용하여 프린지 주기가 대략 30 ㎛이고 45 ㎛/초의 중간 프린지 속도로 이동하는 광학 구배장을 발생시켰다. 예상되는 바와 같이, U937 세포는 프린지를 따라 이동하고 적혈구 세포는 그러하지 않다. 하나의 양태로, 이동 프린지는 단일 피크로 축소될 수 있다. 피크가 선 (line)의 형태인 것이 바람직하다. 작동시, 호출될 영역을 가로질러 완만한 굴곡 (즉, 입자 집단의 이탈 속도보다 작게)이 만들어진다. 이는 입자가 정렬되도록 한다. 다음, 프린지가 신속하게 이동하는데 (즉, 집단 중 적어도 일부 입자의 이탈 속도 보다 더 빠른 속도로), 완만한 굴곡과 반대 방향으로 이동하는 것이 바람직하다. 이는 이탈 속도가 더 높은 입자와 이탈 속도가 더 낮은 입자를 선택적으로 분리시켰다. 임의로, 나머지 라인의 입자를 중간 프린지 속도로 다시 호출할 수 있다. 이 기술은 본원에 기재된 모든 응용예 및 시스템에 일반적인 응용 가능성을 갖지만, U937 세포와 적혈구 세포의 분리를 성공적으로 수행하였다. 도 43A, 43B 및 43C는 백혈구 세포 (더 큰 세포)와 적혈구 세포의 분리를 나타낸다. 도 43A, B 및 C의 영상은 도 37A, B 및 C에 묘사된 위상 1, 2 및 3에 상응한다.

미세채널에서의 적혈구 세포 대 폴리스티렌 입자의 분류

"H" 형태의 유리 미세채널 (도 16 참조)을 사용하여 적혈구 세포와 6 ㎛ 폴리스티렌 입자의 분류를 증명하였다. 상기 채널은 에이질런트 (Agilent) (DNA 500 LabChip)로부터 구입하는데 폭이 40 ㎛이고 깊이는 10 ㎛였다. 원치않거나 사용하지 않는 채널과 저장소 부분을 노를랜드 (Norland) 61 광학 접착제로 배면충전시켜 차단시킨 다음 UV 및 열경화시켰다. 상기 채널을 에탄올로 프라이밍시킨 다음 물, 마지막으로 1% BSA를 함유하는 PBS 완충액으로 프라이밍시켰다. 입구 저장소는 출구 저장소보다 약 1 ㎜ 더 높게 만들었다. 압력과 전기동력을 조합하여 유속을 조절하였다. 케슬리 (Keithley) 236 동력 공급기를 사용하여 5 내지 10 V/㎝의 전기장을 인가하였다.

PBS 완충액, 1% BSA 중 적혈구 세포와 입자의 1/200 혼합물을 입구 저장소에 가하고 동일 용적의 PBS 완충액, 1% BSA를 다른 입구 저장소에 가하였다. 구배장이 다운스트림 접점 근처 "H"의 횡선에 위치하게 된다. 1064 시스템에 원통형 렌즈를 장착하여 구배장의 종횡비를 증가시켰다. 발생된 구배장은 대략 폭이 40 ㎛이고 길이가 80 ㎛이며 프린지 주기가 12 ums이고 30 ㎛/초로 이동하였다.

비이동 광학 구배장의 부재 또는 존재하에서, 세포와 입자는 "H" 채널의 상부 절반에 잔류하며 상부 배출구를 통하여 배출된다. 이동 광학 구배장의 존재하에서, 상기 입자는 하부 배출 아암 쪽으로 전환되어 적혈구 세포로부터 분류되었다.

유속은 대략 80 ㎛/초로 조정하였다. 분류 공정은 디지탈식으로 기록하여 이후에 분석하였다. 132개의 분류 중에서 (적혈구 세포 121개 및 입자 11개), 적혈구 세포 2개만이 잘못 분류되었으며 입자는 잘못 분류된 것이 없었다. 분류 속도는 대략 2개/초였다.

미세채널에서의 적혈구 세포 대 백혈구 세포의 분류

도 36은 미세채널 장치에서의 2종의 세포 유형의 분류 사진을 나타낸다. 1은 이동 광학 구배장으로 연속해서 유입되는 적혈구 세포 및 백혈구 세포를 나타낸다. 2는 백혈구 세포가 이동 광학 구배장의 작용에 의해 아래쪽으로 이동하는 반면 적혈구 세포는 이동에서 이탈하였음을 나타낸다. 3 및 4는 적혈구 세포와 백혈구 세포가 별개의 채널로 계속 유동되어 분류가 완결됨을 나타낸다.

리포좀의 구배력 조작

직경이 대략 0.2 ㎛인, 형광 표지된 리포좀을 BD Q시험 스트렙 키트로부터 구입하였다. 10 ㎕를 Rain-X 코팅된 슬라이드에 놓고 1064 시스템을 사용하여 광학 구배장을 발생시켰다. 15 ㎽ 532 ㎚ 다이오드 레이저를 또한 대물 렌즈를 통하여 집속시켜 리포좀 형광을 가시화하였다. 정치 구배장을 샘플 상에 투영시켰을 때, 이 영역에서 형광이 더욱 강하였다. 이는 리포좀이 구배장 쪽으로 이동하고 있음을 제시하는 것이다.

차동 운동 영상화

폴리스티렌과 실리카 입자를 증류수에 희석시켰다. 도 34의 사진에 나타낸 바와 같이, "이전" 영상을 CCD 카메라와 이미지 프로 익스프레스 (Image Pro Express) 소프트웨어를 사용하여 캡처하였다. 1064 시스템에 의해 발생된 이동 광학 구배장을 입자 상에 스캐닝하였다. 다른 영상 ("이후" 영상)을 캡처하고 "이전" 영상을 뺐다. 생성된 영상 (표지된 "차이")은 폴리스티렌 입자가 이동하였음을 명확하게 확인시켜 준다.

상이한 세포 유형의 이탈 속도

CYTOP 코팅된 커버슬립 상에서 1064 시스템으로 발생시킨 구배장을 사용하여 이탈 속도를 측정하였다.

세포 유형 이탈 속도 (㎛/초)

적혈구 세포 5.6 ± 0.4

백혈구 세포 11.0 ± 1.8

닭의 혈액 (망상적혈구 모델) 7.3 ± 1.4

K562 세포, 택솔 처리 안함 10.0 ± 0.7

K562 세포, 26시간, 택솔 처리 8.2 ± 0.4

K562 세포: 만성 골수성 백혈병, 임파구

도 35는 이탈 속도 (㎛/초)의 함수로 측정한 세포 백분율 (%)의 그래프를 나타낸다.

처리 및 비처리된 백혈병 세포의 분리

PMA를 에탄올에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 보충물질이 함유되어 있는 RPMI 1640 매질에서 성장시킨 U937 세포 3 ㎖를 배양 플라스크로부터 회수하여 1 ㎖를 3개의 에펜도르프관에 넣었다. 제1 관으로부터의 세포를 4분간 10,000 rpm으로 펠릿화하고 이탈 속도 측정을 위하여 250 ㎕ PBS/1% BSA 완충액에 재현탁시켰다. PMA를 나머지 2개의 관의 U937 세포에 최종 농도 5 ㎍/㎖로 가하였다. 이들 관을 와동시키고 37 ℃ 수조 중에 1시간 또는 6시간 동안 놓았다. 상기 시점 말기에, 관을 회수하고, 세포를 펠릿화한 다음 상기한 바와 같이 재현탁시켜 이탈 속도를 측정하였다. 6시간 동안 처리한 세포의 이탈 속도는 비처리 세포와 비교하여 훨씬 더 높았다.

바람직한 양태와 방법을 나타내고 기술하였지만, 당해 분야의 숙련가들에게는 본 발명의 취지 또는 영역으로부터 벗어나지 않고 수많은 변화를 일으킬 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 다음 특허 청구의 범위에 따르는 것을 제외하고는 제한되지 않는다.